5. Diskussion

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Ein Schwerpunkt des Humanen Genom Projektes lag in der Identifikation neuer Gene, [Venter et al. 2001, Lander et al. 2001]. Es eröffnete aber zudem die Möglichkeit, die Teile des Genoms zu untersuchen, die augenscheinlich keine genetischen Informationen enthalten. Die Eigenschaften dieser nicht kodierenden DNA, zu der auch die endogenen retroviralen Sequenzen zählen, sind bis heute nicht gut verstanden. Zwei Hauptfragen „Wie ist sie dort hin gekommen?“ und „Was ist die jetzige Funktion?” sind zur Zeit Gegenstand der Forschung. Seit mehreren Jahren gelten retroviralen Sequenzen im Genom ein verstärktes Interesse. Die Tatsache, dass ihre exogenen Verwandten Krankheiten auslösen und die Aufrechterhaltung von offenen Leserahmen über den langen Zeitraum seit ihrer Endogenisierung bis heute, machte sie zum Studienobjekt. Seit der Verfügbarkeit der Daten des humanen Genomprojektes ist klar, dass der Anteil nicht kodierender und eben auch retroviraler Sequenzen im Genom höher ist, als zuvor geschätzt wurde. Dieser große Anteil in einem ansonsten hoch organisierten Genom und die exprimierten viralen Proteine lassen stark vermuten, dass den retroviralen Sequenzen doch eine Funktion zugrunde liegt.

5.1  HERVs: Junk-DNA oder Träger einer biologischen Funktion?

Die meisten retroviralen Sequenzen in unserem Genom kommen in vielfachen Kopien vor. Dies wirft unter anderem die Frage auf, ob sie einen Vorteil für den Wirt mit sich bringen [Best et al. 1997]. Der überwiegende Teil der retroviralen Sequenzen im Genom ist defekt und inaktiviert, dennoch haben einige Proviren offene Leserater für Proteine aufrecht-erhalten und werden unter bestimmten Umständen exprimiert [Wilkinson et al. 1994, Löwer et al. 1996]. So kann die Expression von humanen endogenen retroviralen Sequenzen mit funktionellen Aspekten, wie der Beteiligung des HERV-W env Proteins Syncytin an der Bildung des Synzytiotrophoblasten während der Schwangerschaft in Verbindung gebracht werden [Mi et al. 2000]. Andererseits wird auch die Beteiligung an Autoimmunerkrankungen und bei der Entstehung von Tumoren, wenn auch kontrovers, diskutiert [Nakagawa und Harrison 1996, Conrad et al. 1997, Löwer et al. 1998, Posnet und Yarilina. 2001]. Weitere Funktionen, auch nur einiger dieser doch recht zahlreich vorhandenen endogenen Sequenzen, konnten bis heute nicht geklärt werden.

HERV-R oder auch ERV-3 liegt im Gegensatz zu anderen endogenen Retroviren nur mit einer Kopie auf Chromosom 7 vor [O´Connell et al. 1988]. Die Expression intakter env-Transkripte wurde in verschiedenen normalen Geweben und den korrespondierenden Tumorgeweben nachgewiesen [Sibata et al. 1997, Andersson et al. 1998]. Im Vergleich zwischen normalen und kanzerogenem Magen- und Lungengewebe konnte aber kein Unterschied in der Expression von HERV-R env-Transkripten gezeigt werden. Lediglich ein Hinweis auf eine erhöhte Expression in epithelialen Geweben und Geweben wie Plazenta, Testis und Prostata ergab sich [Andersson et al. 1998 und 2002]. Jedoch lässt sich eine Expression von endogenen Sequenzen häufig in Reproduktionsgeweben finden [Löwer 1999, Rote et al. 2004]. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Sibata [1997] und Anderson [1998], lässt sich in den hier untersuchten Melanomgeweben und -zelllinien sowie allen Nicht-Melanomzelllinien Transkripte von HERV-R env nachweisen (siehe Ergebnisse Tabelle 2 Seite 58). Auch hier lässt sich kein Unterschied in der Expression zwischen normalen und tumorösen Proben feststellen. Da es sich hier jedoch um eine semiquantitative RT-PCR handelt, kann über das Niveau der Expression keine Aussage getroffen werden.

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Die Expression von HERV-W ist ebenfalls gut untersucht, da der env-Bereich eines HERV-W Provirus für Syncitin kodiert [Blond et al. 2000]. Es sind 140 HERV-W Sequenzen beschrieben, darunter 39 Proviren, 40 Volllängen-Retroposons und 61 deletierte Sequenzen [Costas et al. 2002]. Eine Expression des pol-Gens verschiedener Proviren lässt sich in normalen sowie in Tumorgeweben feststellen, interessanterweise jedoch nicht in der Zelllinie LOX-IMVI (Melanom) [Yi et al. 2004]. In den hier untersuchen Nicht-Melanomzelllinien lässt sich, außer bei U87 (Astrozytom), bei allen eine Expression von HERV-W pol feststellen. In den untersuchten Melanomgeweben lässt sich HERV-W pol nur bei 23% nachweisen (siehe Ergebnisse Tabelle 2 Seite 58). Auch bei Yi et al. [2004] konnte in der Melanomzellinie LOX-IMVI-Zellen HERV-W pol nicht nachgewiesen werden. Daher ist es nicht verwunderlich, dass auch hier nur ca. ein Viertel der Proben eine Expression von HERV-W aufweist. Im Gegensatz dazu steht die mit 80% relativ hohe Anzahl der HERV-W pol exprimierenden Melanomzelllinien. Die Diskrepanz zwischen Melanomzellinien und -geweben ließ sich nicht weiter klären. Hier wäre die Unterscheidung der Expression von HERV-W gag-pol und env hilfreich.

Die Expression von HERV-H gag ließ sich in 83% der Melanomgewebe und in 61% der Zelllinien zeigen. Wie bei den anderen untersuchten HERV lässt sich HERV-H Volllängen-mRNA in fast allen Nicht-Melanomzelllinien nachweisen (siehe Ergebnisse Tabelle 2 Seite 58). Dies ist im Einklang mit den Beobachtungen, dass Transkripte von HERV-H in verschiedenen normalen und Tumorgeweben nachweisbar sind, hohe Expressionslevel sich aber vor allem in Testis und Plazenta zeigen [Stauffer et al. 2004, Forsman et al. 2005]. HERV-H Transkripte wurden bis jetzt vor allem mit T-Zell Leukämie und Multipler Sklerose in Zusammenhang gebracht [Patzke et al. 2002, Christensen 2005] und immunsuppressive Eigenschaften des Env-Protein wurden nachgewiesen [Mangeney et al. 2001]. Auch hier wäre eine PCR zur Unterscheidung von Volllängen- und gespleißten Transkripten hilfreich, um eine Beteiligung des Transmembranproteins Env im malignen Melanom genauer zu untersuchen.

5.2 Entwicklung neuer Methoden zur Analyse der Expression von HERV-K

Semiquantitative und quantitative RT-PCR

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Die von Phelps [1997] entwickelte semiquantitative PCR ermöglicht eine Unterscheidung zwischen Volllängen und den verschiedenen gespleißten mRNAs von HERV-K, zudem kann Volllängen-mRNA des Prototyps von HERV-K und deletierter Proviren unter-schieden werden (siehe Ergebnisse Seite 45). Eine semiquantitative PCR lässt allerdings keine Rückschlüsse auf die Menge transkribierter mRNA zu. Im Hinblick auf eine Rolle von HERV-K im malignen Melanom wurde deshalb im Rahmen dieser Arbeit ein real-time RT-PCR Assay zur Quantifizierung exprimierter HERV-K mRNA etabliert. Dem Assay wurde die gleiche Strategie wie der semiquantitativen Bestimmung zu Grunde gelegt. Er ermöglicht ebenfalls die unabhängige Bestimmung von Volllängen-mRNA und gespleißte env-, rec- und np9-mRNA (siehe Ergebnisse Seite 47). Bei der Quantifizierung von mRNA ist es nötig, einen festen Bezug zu haben, über den die Expression normalisiert wird. Aufgrund unterschiedlicher PCR-Bedingungen kann eine mRNA-Quantifizierung nicht über einen Plasmidstandard normalisiert werden. Daher wird oft die relative Expression eines so genannten Haushaltsgens, ein Gen, welches in allen untersuchten Proben gleichermaßen exprimiert wird, herangezogen [Livak 1997]. Neuere Studien haben allerdings ergeben, dass für das verwendete Haushaltsgens evaluiert werden muss, ob unter den gegebenen Bedingungen eine stabile Expression gegeben ist [Vandesompele et al. 2002, Stahlberg et al. 2004, Tricarico et al. 2002, Bustin 2002]. Vor allem in Tumorgeweben findet häufig eine tiefgreifende Änderung der Expression statt, so dass nicht immer eine stabile Expression der Haushaltsgene wie GAPDH oder β-Aktin gegeben ist. Aufgrund dieser Voraussetzugen wurde die Expression von HERV-K in dieser Arbeit auf gleiche Mengen eingesetzter Gesamt-RNA und in Bezug zu der Expression in GH-Zellen bestimmt. Bei den verwendeten Melanomzelllinien dürfte diese Methode auch hinreichend genau sein, zumal immer der selbe Stock an GH-RNA verwendet wurde. Die Gewebeproben enthalten jedoch außer den Melanomzellen noch weiteres Gewebe und Lymphozyten, dessen Anteil nicht weiter bestimmt werden kann. Hier ist die Quantifizierung somit nicht zuverlässig. Für die Verbesserung des quantitativen Nachweises der HERV-K Expression wäre es in Zukunft hilfreich, zusätzlich zur Quantifizierung in Bezug auf die Expression in GH-Zellen ein weiteres Gen zur Normalisierung einzusetzen. Die Expression dieses Gens muss spezifisch für Melanozyten sein und in normalen sowie malignen Melanozyten gleichermaßen exprimiert werden.

Nachweis von HERV-K Proteinen

Zusätzlich zum Nachweis der Expression von HERV-K RNA in Melanomen wurden im Rahmen dieser Promotionsarbeit neue Methoden zum Nachweis von HERV-K Proteinen entwickelt. Hierfür wurden spezifische Antiseren gegen das transmembrane Hüllprotein gp36 und gegen Np9 hergestellt und charakterisiert. Das neu generierte Ziegeserum 26 wurde mit dem früher erstellten Ziegeserum 7 [Phelps 1997], welches unter anderem in der Studie von Muster et al. [2003] verwendet wurde, verglichen. Für beide Seren wurden die erkannten Epitope zum Vergleich mittels Pepspot kartiert. Interessanterweise liegt das erkannte Hauptepitop beider Ziegeseren in der Cysteinschleife (siehe Ergebnisse Seite 53). Die Daten stimmen mit Erfahrungen bei anderen retroviralen Infektionen (zBsp. HIV) überein. Die Cysteinschleife als immundominantes Epitop kann nach retroviralen Infektionen häufig nachgewiesen werden und wird zu diagnostischen Zwecken eingesetzt. Das transmembrane Hüllprotein gp41 von HIV enthält eine solche immundominante Cysteinschleife [Gnann et al. 1987], die von 99% der Seren infizierter Patienten erkannt wird [Denner et al. 1994]. Im Gegensatz dazu enthielten Seren von Ratten oder Ziegen, die mit dem transmembranen Hüllprotein vom porzinen endogenen Retrovirus (PERV) oder des felinen Leukämievirus (FeLV) immunisiert wurden, keine Antikörper gegen die Cysteinschleife [Fiebig et al. 2003, Langhammer et al. 2005], ebenso wie Tiere, die mit HIV-gp41 immunisiert wurden [Fiebig in Vorbereitung]. Daher war es schon überraschend, eine derart starke Antwort gegen dieses immundominante Epitop zu erreichen.

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Transkribierte HERV-K Proviren

Welche der ca. 30 HERV-K Loci im Genom aktiv transkribiert werden, wurde noch nicht untersucht. Aufgrund der hier verwendeten semiquantitativen PCR lässt sich sagen, dass in allen untersuchten Proben zumindest Proviren beider HERV-K Typen transkribiert werden. Eine Aussage über HERV-K im malignen Melanom im Vergleich zum Teratokarzinom lässt sich jedoch nur treffen, wenn ähnliche Proviren exprimiert werden. Um besser einschätzen zu können, welche Proviren in Melanom- und GH-Zellen transkribiert werden, wurden Volllängen- und env-Transkripte in GH-, SK-MEL-28- und 293-Zellen miteinander verglichen. Die Primer für den Nachweis der Volllängen-mRNA von HERV-K liegen in einem konservierten Bereich des gag-Gen. Das Alignment der exprimierten Sequenzen zeigt daher wie erwartet große Übereinstimmungen und nur Variationen in einzelnen Nukleotiden. Somit kann davon ausgegangen werden, dass ähnliche Proviren in allen drei Zelllinien transkribiert werden. Gleiches gilt für die gespleißten env-Transkripte aus GH- und SK-MEL-28-Zellen. Da da ähnliche Proviren transkribiert werden (siehe Ergebnisse Seite 59), wird die env-mRNA von dem Prototyp-Anteil der transkribierten Volllängensequenzen gespleißt. Zusätzlich treten in GH-Zellen noch weitere, deletierte env-Transkripte auf, die somit von einem weiteren transkibierten aber deletierten Provirus stammen. In SK-MEL-28-Zellen treten diese env-Transkripte nicht auf.

5.3 Expression von HERV-K im malignen Melanom

Die Expression von verschiedensten endogenen Retroviren ist meist vor dem Hintergrund einer Beteiligung oder als auslösende Ursache von Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose oder Diabetes sowie verschiedener Tumorerkrankungen [Rasmussen et al. 1995, Andersson et al. 1998, Stauffer et al. 2001, Johnston et al. 2001, Forsman et al. 2005] untersucht worden. Die Unterscheidung zwischen Volllängen und gespleißter mRNA war dabei meist zweitrangig, das korrekte Spleißen der env-mRNA ist jedoch essentiell für die Expression des transmembranen Hüllproteins und somit dessen Präsenz und Zugänglichkeit auf der Zelloberfläche. Auch wenn einige HERVs im Genom exprimiert werden [Wilkinson et al. 1994, Löwer et al. 1996], stellt die Expression eines env-Gens eine Besonderheit dar, da die env-Sequenzen häufig defekt oder nicht mehr vorhanden sind. Die Proviren der HERV-K HML2 Familie besitzen jedoch offene Leserahmen für alle viralen Proteine. Zudem werden zusätzlich zur Polymerase, Protease sowie den Strukturproteinen Gag und Env zwei akzessorische Proteine, Rec und Np9, gebildet, für die tumorigenes Potential nachgewiesen wurde. Von HERV-K konnte zumindest ein anscheinend vollständig intaktes Provirus im Genom lokalisiert werden [Turner 2001]. Weitere Proviren mit offenen Leserastern für alle retroviralen Gene gag, pol und env sind im Genom verteilt und werden exprimiert [Löwer et al 1993, Tönjes et al. 1999]. Analysen zeigen, dass funktionelle Proteine gebildet werden [Mueller-Lantzsch et al. 1993], andere aufgrund inaktivierender Mutationen jedoch nicht mehr funktionell sind [Tönjes et al. 1999].

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Vorangegangene Untersuchungen zeigen, dass durch UV B-Strahlung die Expression retroviraler Sequenzen, zu denen HERV-K, ERV-9 und HERV-L gehörten, in Keratinozyten aktiviert werden konnte [Hohenadl et al. 1999]. Weitere Hinweise auf die Expression eines HERV-K Provirus im Melanom gab es 2002, als beschrieben wurde, dass zytotoxische T-Zellen eines Melanompatienten ein Antigen erkennen, welches von einer HERV-K env-Sequenz gebildet wird. Die entsprechende Sequenz (HERV-K-MEL) gehört zu einem HERV-K Provirus auf Chromosom 16 (Accnr. AC092357) und ist defekt in allen viralen Genen. Eine Analyse des antigenen Peptides ergab jedoch, dass es aufgrund der Mutationen in einem anderen Leseraster gebildet wird und somit mit HERV-K Env nicht übereinstimmt. Die quantitative Bestimmung der Expression von HERV-K-MEL in verschiedenen Geweben zeigte, dass es sowohl in Melanom-Primärtumoren, als auch Metastasen hoch exprimiert wird. In normaler Haut dagegen war die Expression nur in drei von fünf Proben nachzuweisen und 300fach geringer [Shiavetti et al. 2002]. Jedoch konnte hier nicht zwischen der Volllängen- und gespleißter RNA unterschieden werden. Obwohl die Expression der Volllängen-mRNA von HERV-K in den meisten humanen Geweben nachgewiesen werden kann [Phelps 1997, Sugimoto et al. 2001], wurde die Expression von gespleißter env- und rec-mRNA nur in Teratokarzinomen und Melanomen nachgewiesen [Löwer et al. 1993, Muster et al. 2003]. In der Brustkrebszelllinie T47 und in einigen Brustkrebsgewebeproben ließen sich ebenfalls gespleißte env-Transkripte, nicht aber rec-Transkripte detektieren [Etkind et al. 1997, Wang-Johannig et al. 2003].

Die Arbeitsgruppe um Muster et al [2003] konnte mit einer pol-spezifischen Sonde in 60-90% der untersuchten Zellen eine Expression des pol-Gens von HERV-K nachweisen, dies lässt jedoch zunächst keinen Schluss auf gespleißte Transkripte zu. Der verwendete Nachweis basiert auf einer fluoreszenzmarkierten Sonde und es liegt keine zusätzliche Ampifikation vorhandener Sequenzen vor. Daher ist diese Methode weniger sensitiv als das in dieser Arbeit verwendete RT-PCR System. Im Einklang mit Muster et al. [2003] konnte auch in dieser Arbeit die Volllängen-mRNA von HERV-K, welche für die Polymerase kodiert, in allen untersuchten humanen Proben einschließlich der Nicht-Melanomzelllinien und der normalen PBMCs nachgewiesen werden (siehe Ergebnisse Tabelle 3 Seite 61). Zudem zeigen die Ergebnisse der quantitativen RT-PCR, dass sich die Expression der Volllängen-mRNA in den Melanomen zum Teil erheblich unterscheidet, in den meisten Fallen jedoch mindestens um den Faktor 5 höher ist, als bei den Kontrollen wie 293-, C8166-Zellen und PBMCs (siehe Ergebnisse Seite 62f). Die Abweichungen, 60-90% bei Muster et al. [2003] und 100% in dieser Arbeit lässt sich mit der besseren Sensitivität der hier verwendeten Nachweismethode erklären. Eine weiterer Unterschied besteht in den untersuchten Proben (siehe Anhang Seite IV und V). In dieser Arbeit wurden hauptsächlich Metastasen untersucht, jedoch keine Primärtumore. In der Arbeit von Muster et al. [2003] dagegen wurden Primärtumore und kutane Metastasen untersucht, dies könnte ebenfalls die Unterschiede in der HERV-K Expression erklären.

Gespleißte env, rec und np9-Transkripte von HERV-K

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In dieser Arbeit konnte mit Hilfe der RT-PCR gespleißtes env und rec nur in 35% bzw. 39% der getesteten Metastasen-Gewebe nachgewiesen werden. Eine ähnliche Häufigkeit fand sich mit 36% bzw. 40% auch in den etablierten Melanomzelllinien (siehe Tabelle 3, Ergebnisse Seite 61). Der Anteil der Melanomgewebe und -zelllinien, die eine Expression von np9-Transkripten aufweisen, ist mit 29% bzw. 21% geringer als bei Melanomgeweben und -zelllinien mit env- oder rec-Transkripten. Von den kommerziellen Zelllinien, welche schon in der Melanomforschung etabliert sind, weisen lediglich SK-MEL-28 und MEWO und G-361 gespleißte env- und rec-mRNA auf, nicht aber SK-MEL-1 und GR-M. Die Expression von HERV-K Volllänge und gespleißter env- und rec-mRNA ähnelt somit der Expression in Teratokarzinomen. Dies geht konform mit den Daten von Muster et al. [2003], dort konnte nur in ca. 20% der Zellen Rec und in nur etwa 10% Env nachgewiesen werden. Es ist daher naheliegend, dass nicht alle Zellen eines Tumors Env und Rec gleichermaßen exprimieren.

Interessanterweise sind rec-Transkripte auch in normalen Melanozyten nachweisbar, nicht aber env-Transkripte (siehe Ergebnisse Seite 60). Zwar ist mit der quantitativen PCR eine basale rec-Expression auch in normalen Zellen nachzuweisen (siehe Ergebnisse Seite 62 f), jedoch sind rec-spezifische Banden in der semiquantitativen PCR sonst nur in Verbindung mit einer env-Expression zu detektieren. In der real-time RT-PCR ließ sich allerdings keine erhöhte Expression gegenüber dem Level in normalen Zellen nachweisen. Ob es eine Funktion des Rec-Proteins in normalen Zellen gibt, ist bis heute allerdings nicht geklärt.

In der Veröffentlichung von Muster et al. [2003], konnte zudem eine Proteinexpression in allen untersuchten Melanomgeweben (9/9 Primärtumore und 12/12 Metastasen) gezeigt werden. Im Gegensatz dazu konnte in dieser Arbeit die Expression von HERV-K gp36/TM in der Immunhistochemie nur in ca. der Hälfte der getesteten Primärtumore und Metastasen nachgewiesen werden (siehe Tabelle 6, Ergebnisse Seite 72). Zusätzlich wurden die beiden akzessorischen Proteine Rec und Np9 in den Melanomen untersucht. Das Rec-Protein konnte nur in drei von 21 untersuchten Geweben detektiert werden, Np9 konnte gar nicht nachgewiesen werden. Diese geringe Anzahl bleibt unter dem Prozentsatz mit dem eine HERV-K mRNA Expression nachgewiesen werden konnte und deutet darauf hin, dass die Proteinexpression unter der Detektionsgrenze des Westernblots, der eine geringere Sensitivität als die RT-PCR hat, liegt.

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Serumantikörper gegen HERV-K Proteine in Melanompatienten

Der Nachweis spezifischer Antikörper im Serum von Patienten ist eine gängige Diagnosemethode. Eine HIV-Diagnose zum Beispiel wird im Hauptteil über HIV-1-spezifische Antikörper gestellt. Die Anzahl der getesteten Seren von Melanompatienten, welche eine positive Reaktion mit dem rekombinanten transmembranen Hüllprotein von HERV-K zeigen, liegt mit 22% deutlich niedriger als die Anzahl der Patienten, welche eine Expression von HERV-K env aufweisen (siehe Ergebnisse Seite 72). Wie die Daten der Quantifizierung zeigen, liegt die Expression der env-mRNA in den Melanomproben nur bei ca. 10% im Vergleich zu den GH-Zellen. Daraus resultiert eine geringe Präsenz des Env-Proteines auf der Zelloberfläche und macht eine Anfärbung in der Immunfluoreszenz schwierig. Somit ist die Konzentration auf den Tumorzellen wahrscheinlich zu gering, um in allen Fällen eine Immunantwort gegen HERV-K Env auszulösen. Im Vergleich lassen sich dagegen bei 85% der Seren von Patienten mit Seminomen und anderen Keimzelltumoren diese Antikörper nachweisen [Sauter et al. 1996]. Dass auch in Seren von normalen Blutspendern keine Antikörper gegen HERV-K Env detektierbar sind [Denner et al. 1995], steht im Einklang mit der Beobachtung, dass eine HERV-K Expression in normalen Geweben nicht nachweisbar ist.

Alle Seren wurden zudem auf spezifische Antikörper gegen HERV-K Rec und Np9 getestet, jedoch zeigte keines der Seren eine Reaktion gegen Rec oder Np9 (siehe Ergebnisse Seite 72 und Anhang Seite VII f). Im Gegensatz dazu können in 20% bis 47% der infizierten HIV-Patienten Antikörper gegen das verwandte Rev nachgewiesen werden [Devash et al. 1990, Reiss et al. 1990]. Allerdings ist der Nachweis von Rev im Vergleich mit anderen HIV-1 Proteinen relativ schwach. Rev und vermutlich auch Rec scheinen entweder gering exprimiert oder schlechte Antigene zu sein. Die fehlenden Antikörper gegen Rec und Np9, trotz einer nachweisbaren Expression von mRNA, legen den Schluss nahe, dass auch hier, wie schon bei dem transmembranen Hüllprotein, zu wenig Protein exprimiert wird, um eine Immunantwort auszulösen. Zudem besitzt Np9 in vivo eine sehr kurze Halbwertzeit [Armbrüster et al. 2004]. Zwar sind beide Proteine im Nukleus lokalisiert [Magin et al. 2000, Armbrüster et al. 2002] und somit dem Immunsystem nicht direkt zugänglich, aber durch die Haupthistokompatibilitätskomplexe Klasse I (major histo compatibility complex I, MHC-I) sollten ihre Peptide auf der Oberfläche HERV-K exprimierender Zellen präsentiert werden.

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Infektion von Zellen mit HERV-K.

Endogene Retroviren anderer Spezies, wie zum Beispiel PERVs oder MuLVs sind im Gegensatz zu humanen ERVs infektiös [Patience et al. 1997, Specke et al. 2001]. Auch wenn eine Partikelbildung für HERV-K gezeigt wurde [Boller et al. 1993, Löwer et al. 1993], konnte eine produktive Infektion mit HERV-K noch nicht nachgewiesen werden. Auch bei mehrfacher Infektion oder einer Kokultivierung mit virusproduzierenden Zellen, wenn Zell-Zell-Kontakte möglich sind und somit ein sehr effizienter Weg der Infektion möglich ist, kam es zu keiner Übertragung von HERV-K (siehe Ergebnisse Seite 74). Positive PCR-Nachweise infizierter Zellen verloren sich nach einigen Passagen wieder, so dass entweder die Ausverdünnung infizierter Zellen einer nicht produktiven Infektion unter der Detektionsgrenze stattgefunden hat oder die Signale aufgrund kontaminierender DNA der virusproduzierenden Zellen auftraten. Im Gegensatz hierzu konnte von Muster et al. [2003] die Infektion von bovinen Nierenzellen (MDBK) nach Behandlung mit virus-haltigem Überstand einer Melanomzelllinie gezeigt werden, jedoch fehlt ein Nachweis des integrierten und replizierenden Provirus in den bovinen MDBK-Zellen. Im Überstand von SK-MEL-28-Zellen konnten mit Hilfe der Elektronenmikroskopie Strukturen, ähnlich den aus GH-Zellen isolierten HERV-K Partikeln [Boller et al. 1993], dargestellt werden. Allerdings erscheinen diese pleiomorph und defekt zu sein. Zum Teil kann dies auf mechanischen Stress bei der Aufreinigung zurückzuführen sein. Die defekten, nicht infektiösen Partikel erklären jedoch die negativen Ergebnissen der Infektion mit Überständen von GH-und SK-MEL-28-Zellen (siehe Ergebnisse Seite 74).

5.4 Mögliche biologische Funktionen von HERV-K

Es gibt verschiedene biologische Ursachen für die Expression retroviraler Proteine in Tumoren. Zunächst wäre es möglich, dass die Expression während der Transformation und dem Fortschreiten des Tumorwachstums eine Folge der vermehrt vorhandenen Transkriptions- oder anderer Faktoren ist, welche die Expression der retroviralen Sequenzen unspezifisch aktivieren. Zudem könnten sie aber auch aktiv an der malignen Transformation beteiligt sein. Normalerweise enthalten Retroviren keine Onkogene, eine Transformation kann jedoch über Insertionsmutationen induziert werden. Hierbei können virale Promotoren und/oder Enhancer der LTR zelluläre Onkogene aktivieren oder aber das offene Leseraster eines Tumor-Supresssor Gens zerstören. Ein murines Retrovirus (MelARV) ist derart mit der Entstehung von Melanomen in C57Bl/6 Mäusen assoziiert. Die Sequenzierung der Integrationsorte des MelARV-Provirus zeigte, dass es in den 3´-Bereich des c-maf Proto-Onkogens inseriert ist und zu einer erhöhten Expression von c-maf in BL6 Melanomzellen führt [Li et al. 1999]. HERV-K ist ein komplexeres Retrovirus als das murine Leukämievirus und kodiert für zwei zusätzliche Proteine: Rec und Np9. Beide Proteine sind mit onkogenen Eigenschaften in Verbindung gebracht worden. Rec ist ein regulatorisches Protein und funktional dem Rev- und Rex-Protein von HIV-1 und HTLV ähnlich [Löwer et al. 1995, Magin et al. 1999, Yang et al. 1999]. Seine Beteiligung an der Zelltransformation und die Induktion von Tumoren wurde in Nacktmäusen gezeigt. Nacktmäuse, welche Rec-exprimierende Zellen erhielten, entwickelten Tumore. Unterstützt wird dies durch den Umstand, dass auch drei Mäuse Tumore entwickelten, welche eigentlich mit Env transformierte Zellen erhielten aber eine Splicevariante von Rec anstelle des Env exprimierten [Boese et al. 2000]. Zudem zeigten Mäuse, die für HERV-K Rec transgen sind und dies exprimieren, eine gestörte Keimzellentwicklung und entwickelten Veränderungen, die an Vorläuferstadien von Seminomen erinnern [Galli et al. 2005]. Np9 ist ebenfalls im Nukleus lokalisiert, eine spezifische Expression in Tumorgeweben und transformierten Zelllinien konnte nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Daten ist eine Beteiligung der beiden Proteine an der Entwicklung von Melanomen ist denkbar und war Gegenstand der Untersuchungen dieser Arbeit.

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Ein Grund für die Expression des transmembranen Hüllproteins auf der Oberfläche von Tumoren könnte ein selektiver Vorteil im Schutz gegenüber dem Immunsystem sein. Für die transmembranen Hüllproteine von MuLV [Mangeney und Heidmann 1998], des Mason-Pfizer Affenvirus [Blaise et al. 2001] und HERV-H [Mangeney et al. 2001] wurde tumorigenes Potential nachgewiesen. Zellen, die diese Proteine auf den Zelloberfläche exprimierten, bildeten in immunkompetenten Mäusen Tumore. Die Arbeitsgruppe um T. Heidmann [Mangeney et al. 2005] konnte zeigen, dass die Expression des env-Gens des MelARV-Provirus (siehe auch Seite 88) den Tumor vor der Erkennung des Immun-systems schützt. Zellen, deren retrovirales env-Gen experimentell ausgeschaltet wurde, waren nicht mehr in der Lage in immunkompetenten Mäusen Tumore zu bilden. Da dieser Effekt reversibel ist und die tumorigenen Eigenschaften in vitro sowie in immun-defizienten Mäusen erhalten blieben, ist es das retrovirale Env, welches hier den Schutz vor dem Immunsystem vermittelt [Mangeney et al. 2005].

Zudem konnte gezeigt werden, dass eine konservierte Domäne im transmembranen Hüllprotein von HIV-1 gp41 [Denner et al. 1996] und p15E von FeLV die Proliferation von Lymphozyten inhibiert und die Cytokinproduktion moduliert [Denner 1998, Tacke et al. 2000]. So wird das Verhältnis von Typ I zu Typ II Zytokinen verschoben, hierbei werden IL-2, IL-12, Interferon γ (IFNγ) und Tumor Nekrose Faktor α (TNFα) herab-geregelt, IL-10 dagegen wird vermehrt exprimiert [Haraguchi et al. 1995 a und b, Denner 1998]. IL-10 ist als Regulator der Immunsupression bekannt [Seo et al. 2001, Steinbrink et al. 1999 und 2002]. Die Wächterlymphknoten (die Lymphknoten, die dem Primärtumor lokal am nächsten liegen) von Melanompatienten weisen ein verändertes Zytokinprofil auf. Diese Veränderungen werden möglicherweise vom Primärtumor vermittelt, da sie mit der vollständigen Entfernung des Melanoms reversibel sind [Lee et al. 2005]. Die Ursachen der Induktion dieser Veränderungen durch den Primärtumor sind noch unklar.

Bei einem Vergleich der klinischen Daten der im Rahnem dieser Arbeit untersuchten Melanompatienten mit der Expression von HERV-K waren keine eindeutigen Unterschiede auszumachen. Patienten, die eine HERV-K Expression aufwiesen, unterschieden sich in ihren klinischen Daten nicht von Melanompatienten ohne HERV-K Expression. Weder Tumorstadium oder Tumordicke, noch geschlechtsspezifische Unterschiede oder das Alter der Patienten bei der ersten Tumordiagnose ließen sich mit der Expression von gespleißtem HERV-K korrelieren. Ebenso ließ sich keine Verbindung zwischen der Expression von HERV-K env- oder rec-Transkripten und der Art der Metastase, kutan oder lymphoid, herstellen. Auch wenn vor dem Hintergrund der Daten von Lee et al. [2005] und vor allem von Mageney et al. [2005] ein Zusammenhang zwischen der Expression von HERV-Sequenzen, im besonderen von HERV-K TM und Rec und einem Schutz von (Melanom-) Tumoren vor dem Immunsystem oder einer beobachteten Immunsuppression denkbar sind, sind jedoch weitere Studien nötig, um zu entscheiden, ob die HERV-K Expression in einigen Formen der Melanomentwicklung eine Rolle spielt oder als diagnostischer Marker genutzt werden kann.

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Auch wenn es denkbar ist, dass Rec oder Np9 an der Tumorentwicklung beteiligt sind und es Hinweise auf eine Beteiligung von HERV-K Env gibt, so ist HERV-K nicht in allen oder zumindest einem Großteil der Melanome exprimiert, wie es bei Teratokarzinomen der Fall ist. Jedoch ist die Melanomdiagnose eine Sichtdiagnose beruhend auf immunhistologischen Schnitten des Primärtumors. Eine immunologische Charakterisierung oder ein Expressionsprofil wird nicht erstellt. Es kann daher zwischen verschiedenen Entitäten nicht unterschieden werden und eine Korrelation der HERV-K Expression an einer bestimmten Form von malignen Melanom letztlich nicht ausgeschlossen werden. Dass ein klinisches Krankheitsbild ein breites Spektrum von Erscheinungsbildern aufgrund einer entsprechenden biologischen Heterogenität umfasst, ist für maligne Erkrankungen wie Leukämie oder Brustkrebs bekannt. Die molekulare Klassifikation von Brustkrebs basiert auf dem Expressionsprofil der verschiedenen Subtypen. Für die Subtypen gelten verschiedene Prognosen und es konnten fünf Gene identifiziert werden, die offensichtlich auf ein gutes Ansprechen der Chemotherapie hindeuteten [Rouzier et al. 2005]. Ob Ähnliches für maligne Melanome gilt, ist noch zu klären.

5.5 HERV-K Expression in humanen embryonalen Stammzellen

Die Expression von HERVs, inbesondere HERV-K, wurde immer wieder im Zusammenhang mit Tumorerkrankungen diskutiert. Da bis jetzt jedoch eine kausale Beteiligung nicht schlüssig gezeigt werden konnte, ist auch die Möglichkeit der Aktivierung als ein sekundärer Effekt diskutiert worden. Während der tumorigenen Transformation finden tiefgreifende Änderungen in Chromatinstruktur und Methylierung des Genoms statt. Dieser Kontrollverlust führt zur Fähigkeit der unlimitierten Teilung und beinhaltet eine teilweise Dedifferenzierung der betroffenen Zellen. Die ungehinderte Expression normalerweise reprimierter retroviraler Sequenzen könnte so eine Folge dieses Kontrollverlustes sein [Mager 1999]. Die Aktivierung einer retroviralen Sequenz konnte zum Beispiel in Individuen mit einer unzureichenden Methylierung der DNA gezeigt werden [O`Neill et al. 1998].

Vor dem Hintergrund dieser Vermutungen wurde in einem zweiten Teil dieser Arbeit, die Expression von HERVs in embryonalen Stammzellen untersucht. Eine erhöhte Expression von gespleißter HERV-K RNA konnte in den untersuchten Stammzelllininen festgestellt werden, zusätzlich konnte die Expression des transmembranenen Hüllproteins gezeigt werden (siehe Ergebnisse Seite 78). Der Nachweis der Expression des transmembranen Hüllproteins von HERV-K ist von besonderer Bedeutung. Ähnlich wie schon bei der Expression in malignen Melanomen diskutiert, könnte es zu einem selektiven Schutz gegenüber dem Immunsystem und zur Bildung von Teratomen aus undifferenzierten Stammzellen beitragen. Bei allen bis heute durchgeführten Trans-plantationen von embryonalem Stammzellen, egal ob in einem syn- oder xenogenen Wirt, kam es zur Ausbildung von Teratomen und letztlich zur Zerstörung des behandelten Organs [Damjanov 1993, Brüstle et al. 1997, Erdo 2003, Wakitani 2003, Teramoto 2005, Fujikawa 2005]. Diese Studien zeigen, wie wichtig es ist, den Status der Differenzierung genau zu überwachen und sicherzustellen, dass keine undifferenzierten Zellen im Transplantat verbleiben.

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Zum anderen könnte die HERV-K Expression aber auch als Marker für einen undifferenzierten Zustand fungieren. Bei humanen embryonalen Stammzellen sind einige Gene bekannt, die zur Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustands exprimiert werden. OCT4 ist aus dem Mausmodell bekannt. Dessen Expression ist auf pluripotente Zellen beschränkt. Zudem wurden drei weitere Gene identifiziert NANOG, STELLAR (auch developmental pluripotency associated -3, DPPA3) und GDF3 (growth and differentiation factor 3), die ähnlich OCT4 in pluripotenten Zellen exprimiert werden und deren Expression während der Differenzierung herabgeregelt wird [Clark et al. 2004]. In einer weiteren Studie dieser Arbeitsgruppe konnte die Expression der Stammzellmarker in Keimzelltumoren und Brustkrebsgeweben nachgewiesen werden [Ezeh et al. 2005]. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die Expression von gespleißten HERV-K Transkripten ähnlich verhält. Auch hier wird die Expression mit der Differenzierung in Embryoid Bodies, unabhängig von der später induzierten Differenzierung in neuronale Vorläuferzellen, herabgeregelt. Die Dedifferenzierung der Zellen in Tumoren, die ebenfalls ein erhöhtes Level an HERV-K Expression aufweisen, lässt so auf eine Aktivierung von HERV-K in undifferenzierten Zellen schließen. Ob die Expression von HERV-K im un- bzw. dedifferenzierten Zustand ein Nebeneffekt oder eine funktionelle Aktivierung ist, bleibt zu untersuchen.

5.6  Ausblick

Die in dieser Arbeit entwickelten diagnostischen Methoden zur Bestimmung der Expression verschiedener mRNAs von HERV-K, vor allem die Möglichkeit die Expression zu quantifizieren sowie die entwickelten Antiseren gegen HERV-K Proteine, stellen eine gute Basis für weitergehende Versuche dar.

HERV-K scheint in den verschiedenen Entitäten des malignen Melanoms keine einheitliche Expression zu erfahren, wie dies von Teratokarzinomen bekannt ist. Die Frage ob HERV-K überhaupt eine Rolle im malignen Melanom spielt, ließ sich vor allem aufgrund der unzureichenden Datenlage seitens des malignen Melanoms nicht eindeutig klären. Analysen von Melanomen mit Hilfe von Mikroarray und die bessere Charakterisierung sind Voraussetzung für weitergehende Untersuchungen.

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Oft sind Untersuchungen an endogenen Retroviren aufgrund der hohen Kopienzahl der einzelnen retroviralen Sequenzen schwierig, da sich die verschiedenen Loci meist durch einzelne Mutationen unterscheiden. Neuere Methoden wie die Mikroarrayanalysen werden hier die Untersuchungen vereinfachen und schnell einen Überblick über den Expressions-status verschiedener normaler und veränderter Gewebe geben. Dies ließe sich mit dem Expressionsstatus von HERVs zusammenbringen, um eventuelle Zusammenhänge zu erkennen und dann eine mögliche Funktion zuordnen zu können. Jedoch weisen die Studien von Lee et al. und Mangeney et al. auf eine Beteiligung eines retroviralen Env im malignen Melanom hin.

Zudem wäre interessant, ob sich die in Keimzelltumoren und Brustkrebsgewebe exprimierten Stammzellmarker auch in malignen Melanomen nachweisen lassen, und sich ihre Expression mit der gespleißter HERV-K Transkripte korrelieren lässt. Ob die Expression von HERV-K im un- bzw. dedifferenzierten Zustand jedoch ein Nebeneffekt oder eine funktionelle Aktivierung ist, bleibt zu untersuchen.


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01.12.2006