Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies

• 1. Zusammenfassung

• 2. Einleitung

  • 2.1  Retroelemente

  • 2.2 Retroviren

  • 2.3 Humane endogene Retroviren (HERV)

    • 2.3.1  Humanes Endogenes Retrovirus K (HERV-K)

    • 2.3.2 Biologische Bedeutung von HERV-K

  • 2.4  Malignes Melanom

  • 2.5  Embryonale Stammzellen

  • 2.6  Zielsetzung der Arbeit

• 3. Material und Methoden

  • 3.1  Chemikalien

  • 3.2 Zellbiologische Methoden

    • 3.2.1  Melanomgewebe

    • 3.2.2 Zellen und Medien

    • 3.2.3 Kulturbedingungen für immortalisierte Zelllinien

    • 3.2.4 Einfrieren und Auftauen von Zellen

    • 3.2.5 Bestimmung der Vitalität und der Zellzahl mit Trypanblau

    • 3.2.6 Transfektion von Zellen

    • 3.2.7 Infektion von Zellen mit HERV-K

  • 3.3 Molekularbiologische Methoden

    • 3.3.1  RNA-Aufreinigung

    • 3.3.2 DNA-Aufreinigung

    • 3.3.3 Quantifizierung und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren

    • 3.3.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

    • 3.3.5 one-step Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR)

    • 3.3.6 Agarosegelelektrophorese von DNA

    • 3.3.7 Reverse Transkriptase real-time PCR

  • 3.4  Proteinchemische Methoden

    • 3.4.1  Protein-Aufreinigung

    • 3.4.2 Quantifizierung von Proteinen

    • 3.4.3  SDS-Page

    • 3.4.4  Klonierung, Expression und Aufreinigung von rekombinanten Proteinen

    • 3.4.5 Test zur Aktivität von Reverser Transkriptase

  • 3.5  Immunologische Methoden

    • 3.5.1  Herstellung von Immunseren in der Ziege

    • 3.5.2 Epitop-Kartierung mit einer Pepspot®-Membran

    • 3.5.3 Westernblot mit Immunseren

    • 3.5.4 Immunfluoreszenz

    • 3.5.5 Immunhistologie von Melanommetastasen

• 4. Ergebnisse

  • 4.1  Generierung neuer Methoden zur Analyse der HERV-K Expression

    • 4.1.1  RT-PCR zum semiquantitativen Nachweis der HERV-K Expression

    • 4.1.2 RT-PCR zum quantitativen Nachweis der HERV-K Expression

    • 4.1.3  Charakterisierung neuer Antiseren zur Analyse der HERV-K Expression

  • 4.2 Expression von HERV-K in Melanomen

    • 4.2.1  Expression von HERVs in Melanomgeweben und -zellen

    • 4.2.2 Bestimmung exprimierter HERV-K Proviren

    • 4.2.3 Semiquantitativer Nachweis der Expression von HERV-K

    • 4.2.4 Real-time RT-PCR zur quantitativen Bestimmung der Expression von HERV-K

    • 4.2.5 Expression von HERV-K Proteinen

    • 4.2.6 HERV-K spezifische Antikörper in Seren von Melanompatienten

    • 4.2.7  Infektionsversuche mit HERV-K Partikeln

  • 4.3  Expression von HERV-K in humanen embryonalen Stammzellen

    • 4.3.1  Expression von HERV-K in humanen embryonalen Stammzellen

    • 4.3.2 Veränderung der HERV-K Expression während der Differenzierung

    • 4.3.3  Expression von HERV-K Proteinen in embryonalen Stammzellen

• 5. Diskussion

  • 5.1  HERVs: Junk-DNA oder Träger einer biologischen Funktion?

  • 5.2 Entwicklung neuer Methoden zur Analyse der Expression von HERV-K

  • 5.3 Expression von HERV-K im malignen Melanom

  • 5.4 Mögliche biologische Funktionen von HERV-K

  • 5.5 HERV-K Expression in humanen embryonalen Stammzellen

  • 5.6  Ausblick

• Abkürzungsverzeichnis

• Literaturverzeichnis

• Anhang

• Danksagung

• Publikationen

• Erklärung

• Tabelle 1: verwendete Zelllinien

• Tabelle 2: Expression von HERVs

• Tabelle 3: Expression von HERV-K

• Tabelle 4: relative Expression von HERV-K in Melanomgeweben

• Tabelle 5: Relative Expression von HERV-K in Melanomzelllinien

• Tabelle 6: Immunhistologie von HERV-K Proteinen in Primärtumoren und Metastasen

• Tabelle 7: Klinische Daten von Patient LAN

• Tabelle 1: verwendete Pimer und Sonden

• Tabelle 1: verwendete Pimer und Sonden

• Tabelle 2: Expression in Melanomgeweben und -zellen

• Tabelle 3: verwendete Antikörper

• Tabelle 4: verwendete Patientenseren

• Abb. 2.1: Klassifizierung der Retroelemente. Elemente, die über ein RNA-Zwischenprodukt übertragen werden, werden als Retroelemente bezeichnet und in Elemente mit und ohne LTR unterteilt. Retroelemente ohne RT werden als Pseudogene (ohne eigenen Promotor) oder als Retrogene (mit eigenem Promotor) bezeichnet, Retroposons besitzen kein LTR aber eine eigene RT. Retroelemente viralen Ursprungs sind Retrotransposons (ohne env Gen) und Retroviren (mit env Gen).

• Abb. 2.2.: Aufbau eines Retroviruspartikels.

• Abbildung 2.3: Organisation des RNA-Genoms von Retroviren. Dargestellt sind die Volllängen-mRNA und die env -mRNA mit ihren flankierenden Sequenzen. Die Abkürzungen sind dem Text zu entnehmen. SA = Spleißakzeptor, PA = Polyadenylierungssignal, PBS = Primerbindestelle, LRV = Leserasterverschiebung [modifiziert aus Vogt 1997a].

• Abb. 2.4: Genomische Organisation von HERV-K und gespleißte mRNA Transkripte. Organisation von HERV-K Proviren des Prototyps und ΔHERV-K. Exprimierte Transkripte der HERV-K Proviren: Vollängen mRNA und gespeißtes env , rec , np9 und das 1,5kb Transkript. Die Kodierung für die entsprechenden Proteine Gag, Protease, Polymerase, Env, Rec und Np9 sind gekennzeichnet [modifiziert nach Löwer et al 1995].

• Abb. 2.5: Envelope Vorläufer Protein und prozessiertes TM-Peptid von HERV-K. Schematische Darstellung des Envelope Vorläuferproteins, aus dem durch proteolytische Spaltung das Oberflächenprotein und das Transmembranprotein entstehen. Bei dem TM-Protein ist die Anordnung der strukturellen Domänen, Fusionspeptid, Cysteinschleife und Transmembrandurch-gang, dargestellt.

• Abb. 2.6: Schematische Darstellung des Rec- und Np9-Proteins von HERV-K.  Schematische Darstellung der exprimierten Proteine Rec und Np9. Dargestellt sind die funktionellen Domänen. NLS Nukleus Lokalisations Signal, NES Nukleus Export Signal, PLZF Promyelozytische Leukämie Zinkfinger Protein, CKII Casein Kinase II Phosphorylierungsstelle (siehe Text).

• Abb. 4.1: Lokalisation der Primer für HERV-K. Organisation von HERV-K auf DNA-Ebene und die Lokalisation der einzelnen HERV-K spezifischen Primer P1 bis P7 auf mRNA-Ebene.

• Abb. 4.2: RT-PCR mit HERV-K Primern. Agarosegel der RT-PCR mit dem Primerset von GH, 293 und SK-MEL-28 Zellen, M Marker, 1 P2+P3, 2 P4+P5, 3 P2+P5, 4 P2+P6, 5 P1+P7 und 6 GAPDH; * unspezifisch

• Abb. 4.3: Lokalisation der Primer für den real time RT-PCR Nachweis. Organisation der HERV-K DNA im humanen Genom und Lokalisation der Sonde sowie der einzelnen TaqMan Primer auf mRNA-Ebene.

• Abb. 4.4: Bestimmung der optimalen Sondenkonzentration. Der CT in Abhängigkeit der Sondenkonzentration für die einzelnen Nachweise der HERV-K Transkripte

• Abb. 4.5: Bestimmung der optimalen Primerkonzentration in Abhängigkeit von MgSO₄.Der CT in Abhängigkeit der Primerkonzentration bei verschiedenen MgSO4- Konzentrationen für den Nachweise der HERV-K Volllänge und env .

• Abb. 4.6: Bestimmung der optimalen Primerkonzentration. Der CT in Abhängigkeit der Primerkonzentration für die einzelnen Nachweise der HERV-K Transkripte.

• Abb. 4.7: Bestimmung der Effizienz der real time RT-PCR Reaktion am Beispiel des Nachweises der Volllänge von HERV-K. (A) Ausverdünnung der RNA von GH, dargestellt ist die Fluoreszenz in Abhängigkeit der Zyklenzahl. (B) Standardgerade der Ausverdünnung, dargestellt sind die CT-Werte in Abhängigkeit der eingesetzten Templatemenge, gestrichelte Linie: Konfidenzintervall bei 99%

• Abb. 4.8: Klonierungsstrategie der Ektodomäne des Transmembranproteins gp36 von HERV-K. Schematische Darstellung der Lage der Klonierungsprimer auf DNA-Ebene sowie der Klonierungsstrategie und das entsprechende Agarosegel der RT-PCR mit GH Gesamt-RNA.

• Abb. 4.9: Sequenzvergleich der rekombinanten gp36 Proteine. Dargestellt sind die Sequenzen der Klone C6-5 und HETM2 [Phelps 1997] im Vergleich zu verschiedenen HERV-K Sequenzen der NCBI Datenbank (Accnrs. P61566, AAD51798, Q69384 und Q902F9).

• Abb. 4.10:10 Epitopkartierung der Ziegenseren 7 und 26 spezifisch für HERV-K gp36. (A) Pepspotmembran zur Epitopkartierung am Beispiel für Ziegenserum 26. (B) Dargestellt ist die Sequenz von gp36 sowie die mittels Pepspot ermittelten Epitope der Ziegenseren 7 und 26 im Vergleich. Die Sequenz des zur Immunisierung verwendeten Anteils ist schwarz
  dargestellt, die Sequenz der Cysteinschleife fett.

• Abb. 4.11: Klonierungsstrategiedes HERV-K Np9 Proteins. Schematische Darstellung der Lage der Klonierungsprimer auf DNA-Ebene sowie der Klonierungsstrategie und das entsprechende Agarosegel der RT-PCR mit GH Gesamt-RNA.

• Abb. 4.12: Sequenzvergleich der rekombinanten Np9 Proteine. Dargestellt sind die Sequenzen der Klone rNp9 2, 3 und 5 im Vergleich zu den veröffentlichen Sequenzen von Armbrüster et al. 2002.

• Abb. 4.13: Westernblotanalyse des für rNp9 spezifischen Ziegenserum 29. Dargestellt sind verschiedene Verdünnungen von Präimmunserum (1), Immunserum (2) sowie über eine IgG-Säule aufgereinigtes Immunserum (3) von Ziege 29 nach der dritten Immunisierung.

• Abb. 4.14: RT-PCR zur Überprüfung der RNA-Integrität und DNA-Kontamination.   M Marker, 1 GH, 2 293, 3 SK-MEL-28, 4 KLM und 5 SC (Gewebe), 6 AN und 7 AP (Zellen), siehe Anhang Seite IV und V

• Abb. 4.15: RT-PCR zur Überprüfung der Integrität der RNA der Melanomgewebeproben.
  M Marker, 1 bis 24 Gewebeproben, die Zahlen korrespondieren mit Tabelle 2, Anhang Seite IV

• Abb. 4.16: RT-PCR zur Überprüfung des Melanomcharakters bei Melanom-Zelllinien.  M Marker, a MEWO, b 293, c SK-MEL-28, d SK-MEL-1, e GR-M und f GH;
  32 bis 42 Melanom-Zelllinien, die Zahlen korrespondieren mit Tabelle 2, Anhang Seite V.

• Abb. 4.17:Expression von HERV-R, -W und -H in Melanomzellinien. (A) Expression von HERVs in 293- und GH- Zellen; M Marker, R HERV-R, W HERV-W, H HERV-H. (B) Expression von HERVs in Melanomzellen; M Marker, c SK-MEL-28,d SK-MEL-1, 0 H ₂ O, 32 bis 47 Melanom-Zelllinien, die Zahlen korrespondieren mit Tabelle 2, Anhang Seite V.

• Abb. 4.18: Agarosegel der RT-PCR mit normalen Melanozyten. RT-PCR mit dem HERV-K Primern von normalen Melanozyten; M Marker, 1 P2+P3, 2 P4+P5, 3 P2+P5, 4 P2+P6, 5 P1+P7, 6 GAPDH und 7 DNA Kontrolle.

• Abb. 4.19: Exemplarisches Agarosegel der RT-PCR mit Melanomproben. RT-PCR mit dem HERV-K Primern von Melanomgewebe SCHM und -zelllinie GL (Anhang Seite IV und V); M Marker, 1 P2+P3, 2 P4+P5, 3 P2+P5, 4 P2+P6, 5 P1+P7, 6 GAPDH und 7 DNA Kontrolle.

• Abb. 4.20: Relative Expression von HERV-K. Dargestellt ist die relative Expression der HERV-K Transkripte in SK-MEL-28-, 293-, C8166-Zellen und PBMCs in Bezug auf GH.

• Abb. 4.21:Relative Expression von HERV-K. Dargestellt ist die relative Expression der HERV-K Transkripte in FE-, FM-, KLM-, MA-, SC-, TB-, AA- und AB- Melanomgeweben, AB zeigte in der semiquantitativen PCR nur eine schwache Bande und LAN-Gewebe war negativ für gespleißte HERV-K mRNA (siehe Anhang Seite IV). Jeweils in Bezug auf GH-mRNA.

• Abb. 4.22: Relative Expression von HERV-K. Dargestellt ist die relative Expression der HERV-K Transkripte in BA-, LAU-, SCHM-, SCHW-, ZO- und AC-Melanomzellen, RA- Zellen waren in der semiquantiativen PCR negativ für gespleißtes HERV-K mRNA (siehe Anhang Seite V). Jeweils in Bezug auf GH mRNA.

• Abb. 4.23: Relative Expression von HERV-K in Ausgangsgeweben und korrespondierenden Zelllinien. Dargestellt ist die relative Expression der HERV-K Transkripte in AS- und AT Melanomen und Zelllinien. Jeweils in Bezug auf GH mRNA.

• Abb. 4.24: Westernblotanalyse zur HERV-K gp36 Expression. Westernblot mit je 20µg Gesamtprotein von GH-, 293- und SK-MEL-28-Zellen und Ziegenserum 26 spezifisch für HERV-K TM. Vorläuferprotein und gp36 sind markiert. GAPDH und β-Aktin zeigen die gleichmäßige Beladung.

• Abb. 4.25: Westernblotanalyse zur HERV-K gp36 Expression in normalen Geweben.   Westernblot mit je 50µg Gesamtprotein aus 1 Herz-, 2 Leber-, 3 Pankreas-, 4 Testis-, 5 Prostata- und 6 Plazentagewebe mit Ziegenserum 26 spezifisch für HERV-K TM/gp36. β-Aktin zeigt die gleichmäßige Beladung.

• Abb. 4.26: Westernblotanalyse zur HERV-K gp36 Expression in Melanomgeweben und -zelllinien. Westernblot mit je 30µg Gesamtprotein aus den entsprechenden Geweben bzw. Zelllinien (siehe Anhang Seite IV und V) mit Ziegenserum 26 spezifisch für HERV-K TM/gp36. GAPDH zeigt die gleichmäßige Beladung des Gels.

• Abb. 4.27: Immunfluoreszenz mit GH-, SK-MEL-28- and 293-Zellen. Die Zellen wurden mit HERV-K gp36/TM spezifischem Ziegenserum 26 (a, c und e) und mit Präimmunserum (b, d und f) gefärbt.

• Abb. 4.28: Immunfluoreszenz mit SK-MEL-28 Zellen. Die Zellen wurden nicht permeabilisiert und mit HERV-K gp36/TM spezifischen Ziegenserum 26 gefärbt.

• Abb. 4.29: Immunfluoreszenz mit GH-Zellen. Die Zellen wurden mit spezifischen Seren gegen die HERV-K Proteinen Rec (Kaninchen 4) und Np9 (Ziege 29) sowie den entsprechenden Präimmunseren gefärbt.

• Abb. 4.30: Immunhistologische Färbung von Melanommetastasen. Schnitte wurden mit Antikörpern spezifisch für verschiedene HERV-K Proteine und den entsprechenden Präimmun-seren gefärbt, um die Expression von HERV-K Proteinen zu untersuchen.

• Abb. 4.31: Westernblot Analyse mit rekombinantem HERV-K TM. Serum von Patient LAN über den Verlauf der Zeit getestet auf Antikörper gegen HERV-K TM.

• Abb. 4.32: Bestimmung der Aktivität von Reverser Transkriptase in Zellkulturüberständen und Nachweis viraler HERV-K RNA im Viruspellet. (A) Bestimmung der RT-Aktivität im Zellkulturüberstand (schwarz) und im Viruspellet der Ultrazentrifugation von Zellkultur-überständen (grau) von SK-MEL-28-, 293- und GH-Zellen. (B) RT-PCR Nachweis viraler HERV-K Volllängen-RNA im Viruspellet aus GH-, 293-, und SK-MEL-28-Zellen. 1 keine RT zur Kontrolle von kontamin.ierender (zellulärer) DNA; 2 HERV-K Vollängen Nachweis mit Primer-paar P2 und P3 (siehe Seite 47).

• Abb. 4.33: HERV-K Partikel im Pellet aus dem Überstand von SK-MEL-28-Zellen. Dargestellt sind pleiomorphe Strukturen, die retroviralen Partikeln ähnlich sehen, aber defekt zu sein scheinen. 150nm sind angezeigt.

• Abb. 4.34: Relative Expression von HERV-K in humanen embryonalen Stammzellen. Dargestellt ist die relative Expression der HERV-K Transkripte in humanen embryonalen Stamm-zelllinien in Bezug auf GH-Zellen. Stammzelllinien H9, H9.2 und I3 jeweils mit humanen (HFF) bzw. murinen (MEF) Feederzellen kultiviert.

• Abb. 4.35: Relative Expression von HERV-K in undifferenzierten ES-Zellen und differenzierten neuronalen Vorläuferzellen. HERV-K Expression in humanen ES Zellen und den jeweilig daraus differenzierten Zellen. Die Expression der differenzierten Zellen ist jeweils auf die hES-Ursprungszelllinie bezogen.

• Abb. 4.36: Westernblotanalyse zur HERV-K gp36 Expression in humanen embryonalen Stammzellen und daraus differenzierten neuronalen Progenitorzellen. Westernblot mit je 30µg Gesamtprotein pro Spur (Beschriftung siehe Text Seite 83), gefärbt mit Ziegenserum 26 spezifisch für HERV-K TM. Gp36/TM ist jeweils markiert.