Aus dem Institut für Mikrobiologie und Hygiene
der Medizinischen Fakultät der Charité - Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Synthetische LPS-bindende Peptide
in vitro Untersuchungen zur Peptid-LPS-LBP-Interaktion

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Mirjam R. Büttner
geboren am 9.3.1978 in Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. M. Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. Ralf R. Schumann
2. Dr. rer. Nat. U. Seydel
3. Prof. D. R. Jack

Datum der Promotion: 24.01.2005

Abstract deutsch

Die meisten Lebewesen nutzen zur Abwehr von pathogenen Mikroorganismen u.a. ein weites Spektrum von antimikrobiellen, oft kationischen Peptiden. Etliche dieser natür­lichen und künstlichen Peptide sind in der Lage, Bakterienprodukte wie das Lipopoly­saccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien zu binden. LPS ist als potenter Stimulator des Immunsystems ein bedeutender Faktor bei der Entstehung von Infektion und Entzündung. LPS-bindende kationische Peptide, zu denen auch von der LPS-Bindungssequenz des Limulus-anti-LPS-Faktors (LALF) abgeleiteten Ringpeptide gehören, wirken synergistisch zu den klassischen Antibiotika, ohne jedoch wie diese zu einer vermehrten LPS-Freisetzung zu führen. LALF-Peptide zeigten in bisher veröffent­lichten Versuchen vielversprechende Ergebnisse bei der Bindung von LPS und in murinen Sepsismodellen. In der vorliegen­den Arbeit wird in Versuchen mit humanen Monozyten und murinen Makrophagen gezeigt, dass neuartige LALF-Peptide eine durch LPS induzierte Ausschüttung des Zytokins TNF-alpha und des vasoaktiv wirksamen Stickstoffoxids wirkungsvoll unter­drücken können. Ferner wird in LPS-Bin­dungsassays nachgewiesen, dass dies durch eine Blockierung der LPS-Erkennung durch das LPS bindende Protein (LPB) verur­sacht wird. Die Verwendung von D-Ami­nosäuren verspricht dabei in ersten in vitro Experimenten eine Optimierung der Peptid-Eigenschaften. Die Entschlüsselung der Wirkmechanismen dieser neuartigen Peptide könnte Auswirkungen auf die Entwicklung neuer therapeutischer Interventionsstrate­gien bei Infektion und Sepsis haben.

Eigene Schlagworte: Peptide, LALF, LPS, Sepsis, Therapie

Abstract English

In host defense against pathogenic microorganisms most organisms employ a broad spectrum of antimicrobial, often cationic peptides. Several of these natural or synthetic peptides are able to bind bacterial products like Lipopolysaccharide (LPS) of Gram-negative bacteria. As a potential stimulator of the immune system LPS is an important pathogenetic factor for infection and inflammation. Cationic LPS-binding peptides like cyclic peptides corresponding to the LPS-binding domain of the Limulus-anti-LPS-factor (LALF) have been shown to act synergistic to classic antibiotics. An advantage of these compounds, however, may be their lack of induction of LPS release. In previous studies LALF-peptides have shown promising results for binding LPS, and in murine sepsis models. Here we show in experiments with human monocytes and murine macro­phages that novel LALF-derived peptides are able to effectively block the LPS-induces release of the cytokine TNF-alpha and of the vasoactive nitric oxide. In addition it is shown here by employing an LPS-binding assay that this activity is caused by inhi­bition of LPS-recognition brought about by the LPS binding protein (LBP). In first in vitro experiments the use of D-amino acids looks promising as they improve peptide quality. To further elucidate the mode of action of these novel peptides could lead to the deve­lopment of new therapeutic strategies against infection and sepsis.

Keywords: peptides, LALF, LPS, sepsis, therapy

Inhaltsverzeichnis

• I.  Einleitung
  • 1 Abwehrmechanismen des Körpers
    • 1.1 Das angeborene Immunsystem
    • 1.2 Das erworbene Immunsystem
    • 1.3 Mechanismen der angeborenen Immunität
    • 1.4  Zytokine – Mediatoren des Immunsystems
      • 1.4.1 Proinflammatorische Zytokine
      • 1.4.2 Zytokine mit antiinflammatorischer Wirkung
    • 1.5 Die Akutphase-Reaktion
  • 2  Sepsis – Pathogenese, Definition, Epidemiologie und Lethalität
    • 2.1 Neue Therapieansätze
  • 3 Struktur der Lipopolysaccharide
  • 4 Erkennung von LPS durch das angeborene Immunsystem
    • 4.1 Das Lipopplysaccharid bindende Protein (LBP)
    • 4.2 Die Familie der Lipidtransfer/LPS-bindenden Proteine
    • 4.3 CD14
    • 4.4 Toll-like-Rezeptoren
    • 4.5 Lipopolysaccharid-abhängige intrazelluläre Signaltransduktion
    • 4.6 Weitere Lipopolysaccharid-bindende Proteine
  • 5 Das LALF-Protein
    • 5.1 Die LPS-Bindungsregion von LALF, LBP und BPI
  • 6 Peptide in der Medizin
  • 7 Zielsetzung der Arbeit
• II.  Material und Methoden
  • 1 Peptide
  • 2  Chemikalien
  • 3 Materialien
  • 4 LPS-ELISA
  • 5  Zellkultur
    • 5.1 Zell-Linie RAW 264.7
    • 5.2 Monozyten
    • 5.3 Zellstimulation
  • 6 Toxizitätstest
  • 7 Assays zur Ermittlung der Stärke der Zellstimulation
    • 7.1 NO-Konzentrationsbestimmung
    • 7.2 TNF-α-ELISA
      • 7.2.1 Bestimmung von murinem TNF-α
      • 7.2.2 Ermittlung der hTNF-α-Konzentration
  • 8 pp38- und pp42/44-Kinase-Assay
    • 8.1  Zellstimulation und Proteingewinnung
    • 8.2 p42/44-Kinase-Assay
    • 8.3 Elektrophorese und p38/pp38-Western-Blot
  • 9 Statistische Auswertung
• III.  Ergebnisse
  • 1 Peptid-LBP-Kompetition an immobilisiertem LPS
  • 2 Einfluss der Peptide auf die Stimulation von RAW Zellen und Monozyten
    • 2.1 Hemmung der LPS-induzierten TNF-α-Synthese bei RAW Zellen
    • 2.2 Beeinflussung der NO-Synthese LPS stimulierter RAW Zellen
    • 2.3 Einfluss der Peptide auf die TNF-α-Freisetzung LPS-stimulierter humaner Monozyten
  • 3 Einfluss der Inkubationsdauer von LPS und Peptiden auf die TNF-α-Aus­schüttung humaner Monozyten
  • 4 Ausschluss toxischer Effekte der untersuchten Peptide auf die RAW-Zellen bzw. Monozyten
  • 5 Einfluss einzelner Peptide auf die LPS-induzierte Aktivierung der p38- und p42/44-MAP Kinasen von RAW Zellen
    • 5.1 p42/44-MAP-Kinase-Assay
    • 5.2 p38-Western-Blot
• IV.  Diskussion
  • 1 Interaktion von LPS mit LALF und mit davon abgeleiteten Peptiden
  • 2 Einfluss von LALF und LALF-Peptiden auf die LPS-induzierte Mediator­synthese von Immunzellen
  • 3 Die intrazelluläre Signaltransduktion
  • 4 Die Rolle von LBP bei der Inhibition von LPS-Effekten durch LALF-Peptide
  • 5 Einfluss struktureller Veränderungen auf die Funktion der LALF-Bindungs­region für LPS
  • 6 Die zeitliche Wirkung von LALF und LALF-Peptiden auf LPS und Immunzellen
  • 7 Schlussfolgerung und Ausblick
• V.  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Verzeichnis häufig verwendeter Abkürzungen
• Danksagung
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1:Familie der Lipidtransfer/LPS-bindenden Proteine. LBP (Lipopolysaccharid bindendes Protein), BPI (bactericidal/permeability increasing protein), PLTP (Phospholipid-Transfer-Protein), CETP (Cholesterinester-Transfer-Protein).

Bilder

• Abbildung 1: LPS-abhängige Induktion proinflammatorischer Abwehrmechanismen in Monozyten, Makrophagen und Endothelzellen. Das Lipopolysaccharid (LPS) Gram-negativer Bakterien wird durch das LPS bindende Protein (LBP) monomerisiert und von LBP und sCD14 zu seinem zellulären CD14/TLR4/MD2-Rezeptorkomplex transportiert. Das sCD14 ermöglicht die Stimulation CD14-negativer Zellen. Über die intrazelluläre Domäne von TLR4 kommt es zur Aktivierung intrazellulärer Signaltrans­duktionskaskaden, die u.a. die Synthese proinflammatorischer Zytokine bewirken. Die systemische Wirkung dieser Zytokine zieht im Körper die Akutphase nach sich. Sie dient unter anderem der anti­mikro­biellen Abwehr. Bei einer zu starken oder unbalancierten Zytokinausschüttung kann es jedoch durch die Überstimulation des Immunsystems zu fehlerhaften Reaktionen bis hin zur Sepsis kommen.
• Abbildung 2: Schematische Struktur der Lipopolysaccharide (LPS, Endotoxine). Der in der Zell­wand Gram-negativer Bakterien verankerte Lipid-A-Teil ist aus einem biphosphorylierten Disaccharid aus Glucosaminen (GlcN) und meist 6 Fettsäuren aufgebaut und besitzt die größten immunstimulatorischen Eigenschaften im LPS-Molekül. Der kovalent an das Lipid A gebundene Polysaccharidanteil ragt aus der Bakterienhülle heraus und enthält in der inneren Kernregion den Zucker Kdo sowie L- oder D-glycero-D-manno-heptosen (Hep) und weitere Phosphatgruppen. Die äußere Kernregion besteht vorwiegend aus Hexosen (Hex). Das O-Antigen ist aus bis zu 50 sich wiederholenden Oligosaccharideinheiten aufgebaut, die in Anzahl und Aufbau zwischen den einzelnen Bakterienspezies stark variieren oder auch ganz fehlen können.
• Abbildung 3: Röntgenstrukturanalyse des Limulus-anti-LPS-Faktors (LALF) und schematische Struktur der LPS-Bindungsdomäne. Die einer Publikation von Hoess entnommene und modifizierte Abbildung A des LALF-Proteins wurde von Norbert Lamping zur Verfügung gestellt und weiter bearbeitet. Abbildung B wurde nach einer Publikationsabbildung von Ried gefertigt. Die im 3D-Modell der Röntgen­strukturanalyse nach oben weisende „Schleifenstruktur“ der LPS-Bindungsregion des LALF ist aus einer Serie alternierender hydrophober und hydrophiler Aminosäuren aufgebaut, deren Reste wie in Abbildung B dargestellt in entgegengesetzte Richtungen der Haarnadelschleife weisen.
• Abbildung 4: Aminosäuresequenz der LPS-Bindungsdomäne des LALF-Proteins und der Familie der Lipidtransfer/LPS-bindenden Proteine. Dargestellt ist die alternierende Folge hydrohpiler und hydrophober Aminosäuren der LPS-Bindungssequenz der Proteine LALF (Limulus-anti-LPS-Faktor), LBP (Lipopolysaccharid bindendes Protein) und BPI (bactericidal/permeability increasing protein).
• Abbildung 5: Aminosäuresequenz und Schema der synthetisierten zyklischen Peptide. Die dritte bis zehnte Aminosäure des Peptides LALF 38-45 bzw. die dritte bis zwölfte Aminosäure von LALF 36-47 entsprechen der LPS-Bindungsstelle des LALF-Proteins. Bei den Peptiden LALF 36-47p39, -p41, -p42 und –p43 ist in die Sequenz des Peptides LALF 36-47 zusätzlich die D-Aminosäure Prolin (durch den kleinen Buchstaben p repräsentiert) an verschiedenen Stellen des Peptides eingefügt. Die Peptide  D-LALF 36-47 und D-LALF 36-47p43 bestehen komplett aus D-Aminosäuren (durch kleine Buchstaben dargestellt). Die Aminosäuresequenz der Peptide DB1 und DB2 entstammt einer Proteindatenbank. Die angegebene Originalsequenz LALF zeigt die Aminosäuren 30 bis 53 des LALF-Proteins, die in LALF 36-47 verwendeten Aminosäuren sind unterstrichen. Darunter ist schematisch die Ringstruktur der von LALF abgeleiteten Peptide dargestellt.
• Abbildung 6: Beeinflussung der Bindung von LBP an immobilisiertes LPS durch die untersuchten Peptide. Peptide steigender Konzentration wurden in LPS-beschichteten Mikotiterplatten für 30 min bei  37 °C inku­biert, anschließend 0,2 µg/ml mLBP zugegeben und beides für weitere 2 h inkubiert. In Kompe­tition zu den Peptiden gebundenes LBP wurde mit einem polyklonalen anti-LBP-Antikörper und einer enzyma­tischen Farbreaktion nachgewiesen. Als Kontrolle wurde mLBP ohne Peptid verwendet und gleich 100 % gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte von 5-fach-Werten, in Abbildung A) für die Peptide LALF 38-45, LALF 36-47 und DB1 und in Abbildung B) für LALF 36-47p39, -p41, -p42, -p43 und DB1.
• Abbildung 7: In Konkurrenz zu den Peptiden an immobilisiertes LPS gebundenes LBP. Analog zu Abb. 6 wurden Verdünnungsreihen der Peptide in LPS-beschichteten Mikrotiterplatten für 30 min bei  37 °C inkubiert. Nach Zugabe von 0,4 µg/ml hLBP erfolgte eine weitere Inkubation für 2 h. In Kon­kurrenz zu den Peptiden an LPS gebundenes hLBP wurde mit einem hLBP-Antiserum detektiert und mittels Farb­reaktion nachgewiesen. Als Vergleich wurde LBP ohne Peptid inkubiert und der Mittelwert gleich 100% gesetzt. Abgebildet sind die Mittelwerte von 5-fach-Ansätzen für die Peptide LALF 38-45, LALF 36-47 und DB1 in Abbildung A) und für LALF 36-47p39-p43 und DB1 in Abbildung B).
• Abbildung 8 A: Einfluss der zyklischen Peptide auf die TNF-α-Sekretion von RAW Zellen. RAW 264.7 Zellen wurden mit zuvor für 5 min vorinkubierten LPS-Peptid-Gemischen verschiedener Peptid­konzen­tration der Peptide LALF 36-47, D-LALF 36-47, LALF 36-47p43 und D-LALF 36-47p43 oder LPS (5 ng/ml) allein in Gegenwart von 2 % FCS stimuliert. Nach 4 h wurde die mTNF-α-Konzentration in den Überständen mittels ELISA ermittelt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standard­abweichungen von 4-fach-Werten eines repräsentativen Versuches, der insgesamt dreimal mit nahe­zu identischen Ergebnissen wiederholt wurde. Der Mittelwert der nur mit LPS stimulierten Zellen wurde als Kontrollwert gleich 100 % gesetzt.
• Abbildung 8 B: Einfluss der zyklischen Peptide auf die TNF-α-Sekretion von RAW Zellen. RAW 264.7 Zellen wurden mit zuvor für 5 min vorinkubierten LPS-Peptid-Gemischen (LPS 5 ng/ml, Peptide  20 µg/ml) oder LPS allein in Gegenwart von 2 % FCS stimuliert. Auswertung und Darstellung erfolgte wie in Abb.8 A beschrieben.
• Abbildung 9: Einfluss der zyklischen Peptide auf die NO-Ausschüttung LPS-stimulierter RAW Zellen. RAW 264.7-Zellen wurden mit zuvor für 5 min mit den Peptide vorinkubiertem LPS (5ng/ml) stimuliert. Die NO-Konzentration in den Überständen wurde mittels Farbreaktion nach Griess bestimmt und der Mittelwert der nur mit LPS stimulierter Zellen gleich 100 % gesetzt. Die Ergebnisse wurden in  4-fach-Werten in drei unabhängigen Versuchen für jedes Peptid ermittelt. Die abgebildeten Werte (Mittel­wert und Standardabweichung) entsprechen einem repräsentativen Versuch. A) Hemmung der LPS-vermittelten NO-Ausschüttung durch steigende Konzentrationen der Peptide LALF 36-47, D-LALF 36-47, LALF 36-47p43 und D-LALF 36-47p43 bei RAW-Zellen. B) Unterschiede der NO-Freisetzung LPS-stimu­lierter RAW-Zellen durch Zugabe von 20 µg/ml der LPS-bindenden Peptide.
• Abbildung 10: Einfluss der zyklischen Peptide auf die TNF-α-Synthese mit LPS stimulierter humaner Monozyten. Die Peptide wurden in unterschiedlichen Konzentrationen nach 5-minütiger Vor­inkubation mit 5 ng/ml LPS (ABS 2 %) humanen Monozyten zugesetzt. Die Bestimmung der TNF-α-Ausschüttung erfolgte nach 4 h Stimulation mittels ELISA. Nur mit LPS stimulierte Zellen dienten als Kontrolle, deren mittlere TNF-α-Ausschüttung gleich 100 % gesetzt wurde. Dargestellt sind Mittelwert und Standardab­weichung. Die Ergebnisse wurden in 4-fach-Werten in drei unabhängigen Versuchen für jedes Peptid ermittelt, die abge­bildeten Werte entsprechen einem repräsentativen Versuch. A) Inhibition der LPS-vermittelten TNF-α-Ausschüttung durch steigende Konzentrationen der Peptide LALF 36-47,  D-LALF 36-47, LALF 36-47p43 und D-LALF 36-47p43 bei humanen Monozyten.B) Unterschiede der TNF-α-Freisetzung LPS-stimulierter humaner Monozyten durch Zugabe von 20µg/ml der LPS-bindenden Peptide.
• Abbildung 11: Einfluss der Vorinkubation der Peptide mit LPS auf die TNF-α-Ausschüttung humaner Monozyten. LPS-Peptidgemische mit 5 ng/ml LPS und steigender Konzentration der Peptide  D-LALF 36-47 (A) und D-LALF 36-47p43 (B) wurden bei 37 °C für 120, 30 und 5 min vorinkubiert. Anschließend wurden humane Monozyten für 4h mit den Gemischen bzw. mit nicht vorinkubiertem LPS und Peptid oder mit LPS allein stimuliert. Die Werte ohne Peptid dienten als Kontrolle. Nach der Stimu­lation wurde die TNF-α-Konzen­tration in den Zellüberständen mittels ELISA gemessen (n=4).
• Abbildung 12:Beeinflussung der LPS-induzierten MAP-Kinasen-Aktivierung durch einzelne Peptide. RAW 264.7-Zellen wurden jeweils in doppelten Ansätzen mit LPS-Peptidgemischen, die zuvor für 5 min vorinkubiert wurden bzw. mit LPS ohne Peptid stimuliert (LPS 5 ng/ml, Peptide 1 und 20 µg/ml). Nach 20-minütiger Stimulation wurden die Zellen lysiert und in den nukleären Überständen die Aktivität der p42/44 MAPK mit Hilfe eines spezifischen p42/44 Kinase-Assays ermittelt. Im Assay proportional zur Aktivität gebundenes ^³²P wurde per Szintillationszählung in „counts per minute“ gemessen. Dargestellt sind Mittelwert und Standard­ab­weichung.
• Abbildung 13: Einfluss der Peptide LALF 36-47 und LALF 36-47p41 auf die LPS-indu­zierte Akti­vierung der p38-MAP-Kinasen. Nach Vorinkubation von 5 ng/ml LPS mit 1 und 20 µg/ml Peptid wurden RAW 264.7-Zellen mit LPS allein bzw. den LPS-Peptid-Gemischen für 20 min stimuliert und anschließend nach Lyse der Zellen die p38-Aktivität in den nukleären Überständen mittels Western-Blot-Technik bestimmt. Der ermittelte Wert der aktivierten phospho-p38-Kinasen wurde hierzu durch den Wert der p38-Lade­kontrolle dividiert.
• Abbildung 14: Peptid-LPS-Interaktion und verwendete Untersuchungsmethoden. Die von der LPS-Bindungsregion des LALF-Proteins abgeleiteten zyklischen Peptide wurden mittels LPS-Bindungsassay, Bestimmung der Aktivierung nukleärer Proteine LPS-stimulierter Zellen und durch TNF-α- bzw. NO-Assays auf ihre Fähigkeit hin untersucht, LPS zu binden und so die – durch LBP verstärkte – Aktivierung der intrazellulären Signaltransduktion via p38 / p42/44 und die daraus resultierende Ausschüttung der Mediatoren NO und TNF-α zu inhibieren.
• Abbildung 15: Aminosäuresequenz und schematische Darstellung der von LALF abgeleiteten Peptide. Die LPS-Bindungsregion des LALF-Proteins ist aus einer alternierenden Serie hydrophober und hydrophiler Aminosäuren aufgebaut, deren Reste in entgegengesetzte Richtungen der schleifenförmigen Struktur weisen (Abb. B). Diese Anordnung ist vermutlich auch in den ringförmigen Peptiden erhalten geblieben (Abb. C-D). Die Auswirkungen der D-Aminosäuren (durch kleine Buchstaben dargestellt und in Abb. A grau hinterlegt) auf die Struktur der Peptide kann jedoch nur vermutet werden, ebenso wie der Einfluss der in einigen Peptiden zusätzlich eingeführten D-Aminosäure Prolin (p) (Abb. E-J).
• Abbildung 16: Therapieansätze zur Behandlung der Sepsis. Schematische Darstellung der Angriffs­punkte ausgewählter bisheriger Therapiestrategien bei Sepsis (violett hinterlegt), ineffektiver Therapie­versuche (grün hinterlegt) und des möglichen Einsatzes der von LALF abgeleiteten Peptide (rot hinter­legt).