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II.  Material und Methoden

1 Peptide

Die in den Versuchen auf ihre LPS-Bindungsfähigkeit hin untersuchten zyklischen Peptide wurden freundlicherweise von Dr. Enrique Pérez-Payá (Universität Valencia, Spanien) synthetisiert und zur Verfügung gestellt. Es wurden zwei Peptide entworfen, welche mit 8 bzw. 12 Aminosäuren Länge die schleifenförmige Bindungs­sequenz des LALF-Proteins für LPS repräsentieren (LALF 38-45: Aminosäuren 38-45; LALF 36-47: Amino­säuren 36-47). Um die Peptide mittels Disulfidbrücke in eine Ringform über­führen zu können, wurden am N-terminale Ende die Aminosäuren Glycin und Cystein und am C-teminale Ende Cystein und Glycin hinzugefügt. Weitere vier Peptide (LALF 36-47p39, -p41, -p42 und -p43) besitzen den gleichen Grundaufbau wie LALF 36-47, jedoch wurde an unter­schiedlichen Stellen die D-Aminosäure Prolin (p) eingeführt, um die Bindungs­eigen­schaften der Peptide zu modifizieren. Die Peptide D-LALF 36-47 und D-LALF 36-47p43 bestehen komplett aus D-Aminosäuren und ent­sprechen in ihrer Sequenz den jewei­ligen nicht-D-Peptiden. Zusätzlich wurden zwei weitere Peptide (DB1 und DB2) aus einer Peptid-Bibliothek syntheti­siert, deren Struktur anhand eines Screening-Programms der konformation­sorien­tierten Proteindatenbank ermittelt wurde und nicht mit der des LALF-Proteins ver­wandt ist (Abbildung 5).

Die Herstellung der Peptide wurde mit Hilfe eines automatisierten Festphasen-Peptid-Syntheti­sierers (ABI 433A) unter Nutzung eines Standardprotokolls zum Schutz der Amino-Gruppe der einzelnen Aminosäuren durch eine Fmoc-(9-fluorenylmethoxy­carbonyl-)Gruppe durchgeführt. Die Synthese erfolgte linear, die einzelnen Amino­säuren wurden nach Ent­fernung der schützenden Fmoc-Gruppe und Aktivierung der Carboxyl-Gruppe nach­einander anein­ander gekoppelt. Die vollständige Aminosäure-Kette wurde anschlie­ßend durch „reverse-phase high pressure liquid chromatography“ (r-HPLC) gereinigt, mittels Laser-Massen-Spektroskopie charakterisiert und durch 24-stündige Inku­bation in 15 % DMSO in Ringform gebracht. Danach wurden die nun zyklischen Peptide erneut mittels analy­tischer r-HPLC auf ihre Reinheit überprüft und im Anschluss für Lagerung und Transport lyophilisiert. Hier im Labor wurden die Peptide in steri­lem Aqua dest. wieder gelöst und bei 4 °C gelagert.


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Abbildung 5: Aminosäuresequenz und Schema der synthetisierten zyklischen Peptide. Die dritte bis zehnte Aminosäure des Peptides LALF 38-45 bzw. die dritte bis zwölfte Aminosäure von LALF 36-47 entsprechen der LPS-Bindungsstelle des LALF-Proteins. Bei den Peptiden LALF 36-47p39, -p41, -p42 und –p43 ist in die Sequenz des Peptides LALF 36-47 zusätzlich die D-Aminosäure Prolin (durch den kleinen Buchstaben p repräsentiert) an verschiedenen Stellen des Peptides eingefügt. Die Peptide
D-LALF 36-47 und D-LALF 36-47p43 bestehen komplett aus D-Aminosäuren (durch kleine Buchstaben dargestellt). Die Aminosäuresequenz der Peptide DB1 und DB2 entstammt einer Proteindatenbank. Die angegebene Originalsequenz LALF zeigt die Aminosäuren 30 bis 53 des LALF-Proteins, die in LALF 36-47 verwendeten Aminosäuren sind unterstrichen. Darunter ist schematisch die Ringstruktur der von LALF abgeleiteten Peptide dargestellt.

Dargestellte Aminosäuren

C

Cys

Cystin

hydrophob

L

Leu

Leucin

hydrophob

 

F

Phe

Phenylalanin

hydrophob

P

Pro

Prolin

hydrophob

 

G

Gly

Glycin

hydrophob

R

Arg

Arginin

hydrophil

 

H

His

Histidin

hydrophil

T

Thr

Threonin

hydrophil

 

I

Ile

Isoleucin

hydrophob

W

Tpr

Tryptophan

hydrophob

 

K

Lys

Lysin

hydrophil

Y

Tyr

Tyrosin

hydrophob

 


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2  Chemikalien

Soweit nicht anders angegeben, wurden Puffergrundsubstanzen, Lösungsmittel, weitere Laborchemikalien und Grundsubstanzen zur Zellkultur von den Firmen Roth (Karls­ruhe), Sigma (Deisenhofen), Life Technologies Ltd (Praisley, UK), PAA (Linz, Öster­reich), Pharmingen (Hamburg), PAN (Aidenbach), Gibco Life Technologies (Eggen­stein) und Boehringen (Mannheim) bezogen.

3 Materialien

Verwendete Plastikmaterialien stammten von den Firmen Nunc (Wiesbaden), Falcon (Heidelberg), Eppendorf (Hamburg), Greiner (Frickenhausen) und Sigma (Deisen­hofen).

4 LPS-ELISA

Zum Nachweis der Bindung der zu untersuchenden Peptide an LPS und ihre Kon­kur­renz mit LBP um die Bindungsstelle am LPS wurde ein modifizierter LPS-ELISA ver­wendet, der ursprünglich der Quantifizierung von LBP-Konzentrationen diente. Hierfür wurde vor Zugabe einer bekannten Menge von murinem oder humanem LBP die mit LPS (Salmonella minnesota Re 595) beschichtete ELISA-Platte mit den Peptiden vorin­ku­biert, so dass ein Teil der Bindungsstellen für LBP an den LPS-Molekülen durch die Peptide blockiert wurde. Die – in Abhängigkeit von der Affinität der Peptide zum LPS - dennoch gebundene LBP-Menge wurde mit Hilfe polyklonaler Anti­körper markiert, mit Streptavidin-Peroxidase detektiert und durch die enzymatische Umwandlung von o-PD in einen photometrisch quantifizierbaren Farb­stoff sichtbar gemacht. Der Versuch wurde in verschiedenen Ansätzen mit murinem (im eigenen Labor hergestellt) und humanem LBP (Xoma) durchgeführt. Der Versuchsablauf blieb dabei grundlegend unverändert.


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Pufferlösungen:

Coating-Puffer: 100 mM Na2CO3; 20 mM EDTA; mit HCl auf pH 9,6 eingestellt

Inkubationspuffer (IK): 0,05 M HEPES; 0,15 M NaCl; mit HCl auf pH 7,4 eingestellt

Blockierungspuffer: IK mit 5 % BSA

Verdünnungs- und Waschpuffer: IK mit 0,1 % BSA

Für die Beschichtung der ELISA-Platten wurden diese mit 100 µl LPS-Lösung je Vertiefung/„well“ (LPS Salm. m. 3 µg/ml in Coating-Puffer) für drei Stunden bei Raum­temperatur inku­biert, anschließend dreimal gründlich mit Aqua dest. gewaschen, über Nacht an der Luft getrocknet und dann bei Raumtemperatur gelagert. Zur Blockierung freier Bindungs­stellen wurde die Platte mit 200 µl Blockierungspuffer je well bei 37 °C im Schüttelinkubator für 30 Minuten inkubiert. Alle weiteren Inkubations­schritte erfolg­ten unter gleichen Bedingungen. Nach Ausklopfen der Flüssigkeit aus der Platte wurden die Peptide in 50 µl Verdünnungspuffer (bzw. 50 µl Verdünnungs­puffer ohne Peptid als Kontrollreihe) in die wells pipettiert und für 30 Minuten inku­biert. Danach erfolgte die Zugabe des in Verdünnungspuffer auf eine Konzentration von 0,4 µg/ml (murin) bzw. 0,8 µg/ml (human) verdünnten LBP mit weiteren 50 µl pro well und erneute zwei­stündige Inkubation. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer für je zwei Minuten bei 37 °C wurde ein biotinylierter anti-m- bzw. anti-hLBP-Anti­körper (freund­licherweise zur Verfügung gestellt von S. Carroll, XOMA Corp., Berkley, CA, USA) mit 0,5 µg/ml zugegeben und unter bereits beschrie­benen Bedingungen für eine Stunde inkubiert. Nach drei Waschschritten wurde die Platte für eine weiter Stunde mit Strepta­vidin-Peroxidase (1 µg/ml) inkubiert und erneut dreimal gewaschen, bevor 100 µl des Farbstoffes o-PD zugegeben wurden. Der Umsatz des Substrates in ein detektier­bares Farbprodukt erfolgte unter licht­geschützten Bedingungen und wurde mit 50 µl 2M Schwefelsäure gestoppt. Die Farbstoffkonzentration wurde abschließend bei 490 nm im ELISA-Reader (SpectraFluor Plus, Tecan) gemessen.


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5  Zellkultur

Alle Zellkulturarbeiten wurden unter sterilen Bedingungen an Zellkulturbänken mit lami­narer Strömung durchgeführt. Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Medien bzw. Flüssigkeiten vor Verwendung im Wasserbad auf 37 °C erwärmt.

5.1 Zell-Linie RAW 264.7

Die Zellen der adhärenten Mausmakrophagen-Linie RAW 264.7 wurden in RPMI-Medium mit 10 % FCS, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin bei 37 °C unter 5 % CO2 kultiviert. Konfluente Zellen wurden zur Passage mit PBS gewaschen und mit einer der Zellkulturflasche angepassten Menge 2,5 %-igem Trypsin vom Boden der Kulturflasche gelöst. Nach dreiminütiger Inkubation im Brutschrank wurde der Vorgang durch Zugabe von FCS-haltigem Medium beendet. Die Zellen wurden anschließend für 7 Minuten bei 167xG und 20 °C zentrifugiert, der Überstand dekantiert und das Zell­pellet in einer hierfür benötigten Menge Medium resuspendiert. Für die Stimulations­versuche wurden 2,5 Mio. Zellen pro ml in einer 96-Loch-Kultur­platte mit 100 µl je well ausgesät und bis zur Stimulation am näch­sten Morgen bei 37 °C und 5 % CO2 im Brut­schrank kultiviert.

5.2 Monozyten

Zur Isolation von humanen Monozyten wurde das periphervenös entnommene und heparinisierte Blut gesunder Probanden mit einer gleichen Menge auf 20 °C erwärm­ten RPMI Medium verdünnt. In 50 ml Plastikröhrchen wurden je 15 ml Pancoll (Lymhoprep) mit 30 ml des Blut-Medium-Gemisches überschichtet und bei 20 °C und 300xG (ohne Bremse) für 15 Minuten zentrifugiert. Im Trennmedium im unteren Teil des Gefäßes sammelten sich hierbei die Erythrozyten, das Serum verblieb darüber im oberen Gefäßbereich. Die Interphase zwischen Serum und Trenn­medium, in der sich neben Granulozyten und Lymphozyten auch die Monozyten anreichern, wurde vor­sichtig mit einer Pasteurpipette abgesaugt, in ein neues Röhrchen überführt und mit RPMI Medium auf 50 ml aufgefüllt. Zur Reinigung wurde die Zellsuspension zwei mal bei 300xG für 5 Minu­ten zentrifugiert, jeweils der Überstand dekantiert und die Zellen in
[Seite 27↓]50 ml Medium resuspendiert. Eine dritte Zentrifugation für 15 Minuten bei 117xG diente der Ent­fernung verbliebener Thrombozyten, die mit dem Überstand verworfen wurden. Das Zellpellet wurde mit einer geringen Menge RPMI Medium erneut resus­pendiert, die Zellen im Lichtmikroskop mittels Zählkammer gezählt und die Zellsuspen­sion anschlie­ßend mit einer Menge Medium verdünnt, die eine Anzahl von ca. 2,7 Mio. Zellen pro ml ergab. Die Zellen wurden nun analog zu den RAW-Zellen in 96-Loch-Kulturplatten aus­gesät und über Nacht im Brutschrank kultiviert. Nicht adhärente Zellen, wie Granulo- und Lymphozyten, wurden vor Versuchsbeginn durch Waschen mit Medium entfernt.

5.3 Zellstimulation

Nach zweimaligem Waschen der Zellen und Entfernung des zum Waschen verwen­deten Mediums (RPMI ohne weitere Zusätze) aus den wells wurden in jede Ver­tiefung 50 µl eines mit 4 % FCS (RAW-Zellen) bzw. 4 % ABS (Monozyten) ange­reicherten RPMI-Mediums gegeben, was im Gesamtvolumen von 100 µl nach Zugabe des Sti­mu­la­tionsmediums eine Konzentration von 2 % FCS bzw. ABS ergab. Im Anschluss wurden je well 50 µl eines Stimulationsmediums zugegeben, in dem zuvor 5 ng/ml LPS (Salmonella minnesota Re 595, Sigma) und verschiedene Konzentrationen der zu unter­suchenden Peptide bei 37 °C vorinkubiert wurden. Die Zellkulturplatten wurden nun für 4 bzw. 20 Stunden bei 37 °C und 5 % CO2 im Brutschrank inkubiert und anschlie­ßend die Überstände der RAW-Zellen und Monozyten zur sofortigen Be­stim­mung von TNF-α- oder LDH-Konzentration nach jeweils 4 h bzw. für die Stickstoff­oxid-(NO)-Messung nach 20 h abgenommen und auf entsprechend vorbereitete Platten übertragen.

6 Toxizitätstest

LDH-Bestimmung: Zur Feststellung eventueller Toxizität der verwendeten Stimulanzien auf die Zellen wurden nach 4 Stunden Inkubation mit den maximal verwendeten Peptid- und LPS-Konzen­trationen die Laktatdehydrogenase-Menge in den Zellkulturüber­ständen mit Hilfe eines kommerziellen Testkits (Cytotoxicity Detection Kit, Boehringer, Mannheim) ermittelt. Durch Extinktionsmessung der bei der Farbreaktion entstandenen Absorp­tionsunter­schiede bei 492 nm wurde die LDH-Konzentration semiquantitativ be­[Seite 28↓]stimmt. Da LDH in allen Zellen vorkommt und nur bei Schädigung dieser in nennens­werten Mengen nach außen abgegeben wird, ist LDH ein guter Parameter für eine Zell­schädigung.

7 Assays zur Ermittlung der Stärke der Zellstimulation

Das Ausmaß der Stimulierung der Zellen durch LPS bzw. die Abschwächung dieser Stimulation durch den Einsatz der Peptide wurde über die Bestimmung der Konzen­tra­tion von TNF-α und Stichstoffoxid (NO) ermittelt.

7.1 NO-Konzentrationsbestimmung

Die Konzentration von Stickstoffoxid (NO) in den Kulturüberständen der RAW-Zellen wurde nach 20-stündiger Inkubation mit Hilfe eines Farbreaktionstests bestimmt. Hierzu wurde in der Platte durch serielle Verdünnung einer NO-haltigen Lösung bekannter Konzentration mit Kulturmedium eine Standardreihe (Doppelwerte) erstellt. In die übrigen wells der Messplatte wurden die Kulturüberstände der Versuche über­führt und anschließend in jedes well 50 µl Griess-Reagent (SIGMA, Deisenhofen) zugegeben. Nach 15-minütiger Farbreaktion wurden die Extinktionen der Proben bei 540 nm im ELISA-Reader gemessen und anhand der Standardkurve die NO-Konzentrationen in µmol/l ermittelt.

7.2 TNF-α-ELISA

Die TNF-α-Konzentrationen in den Kulturüberständen der RAW-Zellen und Monozyten wurden mit Hilfe von „Sandwich-Enzyme-Linked-Immunoabsorbent-Assays“ (Sand­wich-ELISA) bestimmt. Hierzu wurden rekombinante Antikörper ver­wendet, von denen der jeweils erste zur Bindung selbst geringer TNF-α-Mengen an die ELISA-Platte dient, während der zweite, biotinylierte Antikörper den Nachweis des auf der Platte immobili­sierten TNF-α erlaubt. An den zweiten Antikörper gebun­den befindet sich Streptavidin (proportional zur vorhandenen TNF-α-Menge), an welches Streptavidin-Peroxidase gekoppelt wird. Das Enzym katalysiert die Um­wandlung des Substrates Ortho-Penylen­[Seite 29↓]dihydrid-Dihydrochlorid (o-PD, Sigma) in einen photochemisch quantifizier­baren Farb­stoff.

7.2.1 Bestimmung von murinem TNF-α

Pufferlösungen:

Waschpuffer: PBS, 0,05 % Tween20

Blockie­rungs­puffer: PBS, 0,05 % Tween20, 10 % FCS

Die ELISA-Platten für die mTNF-α-Bestimmung wurden über Nacht bei 4 °C mit 3 µg/ml anti-mTNF-α-Antikörpern (Pharmingen, Heidelberg) in 50 µl Na3PO4 je well be­schich­tet. Am nächsten Tag wurden nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer die freien Bindungsstellen auf der Platte mit 200 µl Blockie­rungs­puffer für eine Stunde bei Raum­temperatur blockiert und anschließend die Platte erneut dreimal gewaschen. Durch serielle Ver­dünnung wurde in der Platte aus mTNF-α-Standards bekannter Konzen­tration (R&D Systems, Wiesbaden) eine Eichreihe in Doppelwerten erstellt und die Kultur­über­stände der stimulierten RAW-Zellen 1:10 mit Blockierungspuffer verdünnt aufgetragen. Nach Inkubation über Nacht bei 4 °C wurde die Platte viermal gewaschen und 100 µl des biotinylierten Anti­körpers (0,5 µg/ml, Pharmingen) zuge­geben. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur und 5-maligem Waschen wurde der zweite Antikörper mit Hilfe von 100 µl/well Streptavidin-Peroxidase (1 µg/ml) während einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur detektiert. Unmittelbar nach weite­ren 5 Waschschritten wurde durch Zugabe des in Aqua dest. gelösten
o-PD-Substates die Farbreaktion gestartet und je nach Farbintensität nach 30 bis 60 Minuten durch Zugabe von 50 µl 2M H2SO4abgestoppt. Die Extinktion wurde im Anschluss bei 450 nm im ELISA-Reader gemessen und die Konzentrationen anhand der Stan­dard­kurve ermittelt.

7.2.2 Ermittlung der hTNF-α-Konzentration

Pufferlösungen:


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Waschpuffer: PBS, 0,05 % Tween20

Blockie­rungs­puffer: PBS, 10 % FCS

Die Beschichtung der ELISA-Platten erfolgte analog zum mTNF-α-ELISA über Nacht bei 4 °C mit 2 µg/ml des ersten Antikörpers (Pharmingen), anschließend wurde die Platte dreimal mit Waschpuffer gewaschen und mit 200 µl/well Blockierungs­puffer für eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Nach drei­fachem Waschen wurde eine Eichreihe durch serielle Verdünnung eines hTNF-α-Standards (Pharmingen) erstellt, in die restlichen wells die Proben der stimulierten Monozyten 1:2 mit Blockie­rungspuffer verdünnt von den Zellkulturplatten übertragen und die Platte über Nacht bei 4 °C inku­biert. Nach vier Waschschritten wurden 100 µl des biotinylierten 2. Anti­körpers (Pharmingen) mit 2 µg/ml für 45 Minuten zugegeben und die Platte danach fünfmal gewaschen. Im Anschluss wurde die Platte mit 100 µl/well Streptavidin-Peroxi­dase
(1 µg/ml) weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneuten 5 Wasch­schritten wurde die Farbreaktion wie bei der mTNF-α-Bestim­mung be­schrie­ben durch­geführt.

8 pp38- und pp42/44-Kinase-Assay

Pufferlösungen:

Lysispuffer: 20 mM Tris Acetat [pH 7,5], 0,1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM Na-o-Vandat, 10 mM Na2-o-Glycerophosphat, 50 mM NaF, 5 mM Na-Pyrophosphat, 1 % Triton X-100, 1 mM Benzamidin, 0,27 M Saccharose, 1 mM PMSF und 20 µM Leu­peptin

Loadingpuffer: 200 mM Tris-HCl [pH 6,8], 400 mM DTT, 8 % SDS, 40 % Glycerin,
0,4 % Bromphenolblau

Laufpuffer: 25 mM Tris-Base, 200 mM Glycin, 0,1 % SDS

Transpuffer: 25 mM Tris-HCl, 200 mM Glycerol, 20 % Methanol

Waschpuffer: PBS, 0,1 % Tween20

Blockierungspuffer/ Verdünnungspuffer: PBS, 0,1 % Tween20, 5 % Trockenmilchpulver

Stripping-Puffer: 62,5 mM Tris-HCl, 100 mM Mercaptoethanol, 2 % SDS


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8.1  Zellstimulation und Proteingewinnung

Zur Bestimmung des Aktivierungsgrades der p38- und p42/44-Kinasen in RAW-Zell-Lysaten wurden für beide Versuche jeweils die RAW 264.7 Zellen mit 2,5 Mio. Zellen pro ml in 12-well-Zellkulturplatten ausgesät und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte nach drei­maligem Waschen mit RPMI 1640 eine dreistündige Inkubation in FCS-freiem Medium (RPMI) und anschließend die Stimu­la­tion mit LPS (E. coli 0111 B4) in RPMI mit 2 % FCS. Bestimmte LPS-Verdünnungen wurden vor der Stimulation mit den zu unter­suchenden Peptiden für 5 Minuten bei
37 °C im Wasserbad vorinkubiert. Nach 20-minü­tiger Stimulation wurden die Zellen mit eiskaltem PBS (1 mM Na-o-Vandat) gewa­schen. Zur Gewinnung der Zelllysatüber­stände wurden die Zellen für 15 Minuten mit 50 µl Lysispuffer bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen abgeschabt und die Zellsuspension für 30 Minuten bei 217xG zentrifugiert. Die Über­stände, in denen u.a. die nukleären Proteine enthalten sind, wurden in 1,5 ml-Eppen­dorfgefäße über­führt und dabei aliquotiert. In jeweils einer Probenportion pro Well wurde die Protein­konzentration nach Bredford (Bio-Rad-Protein-Assay, Bio Rad, München) mittels Extinktionsmessung bei 595 nm und Konzentrationsberechnung anhand einer Eichreihe bestimmt. Die restlichen Proben­portionen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur endgültigen Verwendung bei –80 °C gelagert.

8.2 p42/44-Kinase-Assay

Die Bestimmung der Aktivierung der p42/44-MAP-Kinasen in den RAW-Zelllysatüber­ständen erfolgte mittels modifiziertem p42/44-Kinase-Assay (Kit von Amersham Life Science, Buckinghamshire, England). Durch Stimulation über ligandenbindende Rezep­toren aktivierte p42/44-Kinasen katalysieren den Transfer der γ-phospho-Gruppe von ATP auf die Threonin-Gruppe spezifischer Proteine der Zelle. Im Amers­ham-Ki­nase-Assay wird radioaktives ³²P von [³²P]-ATP selektiv und im gemessenen Bereich linear zur Kinasen-Aktivität auf ein synthetisches Peptid übertragen. Hierzu wurden
5 µg der Proteinproben und zwei Kontrollansätze ohne Protein ad 15 µl Lysis­puffer mit
10 µl Peptid-Substratlösung kurz zentrifugiert und danach durch Zugabe von 5 µl ATP-Mix zu jedem Ansatz die Reaktion gestartet. Nach 30-minütiger Inku­bation bei 37 °C [Seite 32↓]wurden jeweils 10 µl Stopplösung zugegeben und die Ansätze nochmals kurz zentri­fugiert. Anschließend wurden je 30 µl der Lösungen auf Peptid-bindendes Filterpapier getropft, kurz antrocknen gelassen und dann das Papier erst zweimal für 2 Minuten in
1 %-igem Essigwasser und danach zweimal für zwei Minuten in Aqua dest. gewaschen, um nicht-peptidgebundenes ³²P zu entfernen. Die feuchten Filterpapier­plättchen wurden nun in zuvor mit 5 ml Szintillationsflüssigkeit aufgefüllte Messröhrchen gegeben und die Menge des gebundenen ³²P per Szintillationszählung in counts per minute gemessen.

8.3 Elektrophorese und p38/pp38-Western-Blot

Die Bestimmung der Phosphorylierung der p38-Kinasen erfolgte mittels Elektrophorese und Western-Blot-Technik. Je 30 μg der Proteinproben und eine Markerprobe wurden in Loadingpuffer für fünf Minuten auf 95 °C erhitzt und anschließend mit Laufpuffer in einem 12 %-igen SDS-Polyacrylamid-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Dann wurde das Gel kurz mit Methanol gespült und zusammen mit einer mit Methanol benetzten Hybond-C-Membran (Amersham Life Science, Buckinghamshire, England) für 10 Minuten in einem Transpuffer inkubiert und danach beide für 90 Minuten in eine Blotting-Apperatur (Hölzel GmbH, Dörfen) gegeben und die Proben bei 12-14 V vom Gel auf die Membran übertragen.

Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer wurden die freien Proteinbindungsstellen auf der Membran mit Blockierungspuffer blockiert. Im Anschluss wurde nach drei weite­ren Wasch­schritten mit Waschpuffer ein 1:1000 in Verdünnungspuffer verdünnter Kaninchen-anti-Phospho-p38-Antikörper (Biolabs) zu­gegeben, bei 4 °C über Nacht inkubiert und am nächsten Morgen nach erneuten drei Waschschritten der erste Anti­körper mit Hilfe eines zweiten, peroxidase-konjugierten und 1:10000 in Verdünnungs­puffer verdünnten anti-Kaninchen-IgG-Antikörpers (Sigma, Deisenhofen) durch ein­stündige Inkubation bei Raumtemperatur detektiert. Nach erneuten drei Wasch­schritten (2x mit Waschpuffer, 1x mit PBS) wurde nun die Membran mit einem ECL-Lösungs-System (Amersham Life Science) nach den Anga­ben des Herstellers behan­delt und anschließend damit ein Hyperfilm-ECL-Film be­lichtet.

Als Ladekontrolle wurden danach auf der selben Membran die p38-Kinasen semi­quanti­tativ ermittelt. Hierzu wurde nach Auswaschen der Antikörper mit Stripping-Puffer für 20 [Seite 33↓]Minuten bei 50 °C ein p38-Western-Blot in Analogie zur pp38-Bestimmung durch­geführt.

9 Statistische Auswertung

Die in den Abbildungen 6 bis 13 dargestellten Ergebnisse entsprechen – wenn nicht anders angegeben – den Mittelwerten und Standardabweichungen von 4-fach-An­sätzen eines repräsentativen Versuches von mindestens drei unabhängigen Experi­menten mit jeweils nahezu identischen Ergebnissen. Die Berechnung erfolgte mittels Exel 2000 (Version 9.0, Microsoft Corp. Redmont, Ca. USA).


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11.03.2005