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III.  Ergebnisse

1 Peptid-LBP-Kompetition an immobilisiertem LPS

LBP katalysiert den Transfer von LPS-Monomeren aus LPS-Aggregaten zu den endo­toxinerkennenden Rezeptoren von Zellen. Um zu prüfen, ob die von LALF abgeleiteten Peptide spezifisch mit LBP um die gleiche Bindungsstelle am LPS-Molekül kompe­ti­tieren, wurde deren Konkurrenz um die Bindung an immobilisiertem LPS untersucht. Dieser Versuch wurde in Form eines Bindungsassays für m- und hLBP mit leichten Modifikationen eines im Labor etablierten ELISA-Protokolls für mLBP durch­geführt. Abweichend von diesem Protokoll wurde LBP hier in einer festgelegten Konzentration eingesetzt, um so indirekt die Peptide auf ihre Fähigkeit hin zu untersuchen, die Bindung von LBP an LPS zu beeinträchtigen. Die Peptide wurden in Ver­dünnungs­reihen von 5 bis 100 µg/ml für 30 Minuten bei 37 °C in LPS-beschichteten Mikro­titer­platten vorinkubiert und anschließend LBP in einer Endkonzentration von 0,2 µg/ml (murin) bzw. 0,4 µg/ml (human) zugegeben. Die Platten wurde dann für weitere zwei Stun­den bei 37 °C inkubiert, gewaschen und anschließend das in Konkurrenz zu den Peptiden an LPS gebundene LBP mit biotinylierten Antikörpern detektiert. Als Kontrolle wurde jedes Peptid nochmals ohne LBP untersucht und in gleicher Weise behandelt wie die mit LBP inkubierten Proben. Weiterhin wurden zur Quantifizierung des Kompe­titions­effekts LBP-Proben ohne Peptid inkubiert.

Wie in Abbildung 6 zu erkennen ist, zeigen die Peptide LALF 38-45, LALF 36-47 und LALF 36-47p39-p43 eine konzentrationsabhängige Verdrängung des mLBP vom immobili­sierten LPS, während DB1 keine Aktivität in diesen Assay aufwies. Es ist zu sehen, dass die Peptide LALF 36-47 und LALF 36-47p43 die verhältnismäßig stärkste Aktivität bei der Bindung von LPS zeigten. Sie ver­mindern die Bindung von mLBP um 78,5 % bzw. 66,9 %.


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Abbildung 6: Beeinflussung der Bindung von LBP an immobilisiertes LPS durch die untersuchten Peptide. Peptide steigender Konzentration wurden in LPS-beschichteten Mikotiterplatten für 30 min bei
37 °C inku­biert, anschließend 0,2 µg/ml mLBP zugegeben und beides für weitere 2 h inkubiert. In Kompe­tition zu den Peptiden gebundenes LBP wurde mit einem polyklonalen anti-LBP-Antikörper und einer enzyma­tischen Farbreaktion nachgewiesen. Als Kontrolle wurde mLBP ohne Peptid verwendet und gleich 100 % gesetzt. Dargestellt sind die Mittelwerte von 5-fach-Werten, in Abbildung A) für die Peptide LALF 38-45, LALF 36-47 und DB1 und in Abbildung B) für LALF 36-47p39, -p41, -p42, -p43 und DB1.


Ähnliche Resultate zeigt Abbildung 7 für die Konkurrenz der Peptide mit hLBP. Auch hier blockierten die verschiedenen Peptide in höheren Konzentrationen in unter­schiedlich starkem Ausmaß die Bindung von LBP an LPS. Am wirksamsten war auch hier LALF 36-47, welches die LPS-LBP-Interaktion um 71,5 % reduziert. Das Peptid [Seite 36↓]DB1 zeigte auch in diesem Ansatz keinerlei LPS-bin­dende Aktivität, hier erreichte LBP seine volle Bindungskapazität an das LPS.

Abbildung 7: In Konkurrenz zu den Peptiden an immobilisiertes LPS gebundenes LBP. Analog zu Abb. 6 wurden Verdünnungsreihen der Peptide in LPS-beschichteten Mikrotiterplatten für 30 min bei
37 °C inkubiert. Nach Zugabe von 0,4 µg/ml hLBP erfolgte eine weitere Inkubation für 2 h. In Kon­kurrenz zu den Peptiden an LPS gebundenes hLBP wurde mit einem hLBP-Antiserum detektiert und mittels Farb­reaktion nachgewiesen. Als Vergleich wurde LBP ohne Peptid inkubiert und der Mittelwert gleich 100% gesetzt. Abgebildet sind die Mittelwerte von 5-fach-Ansätzen für die Peptide LALF 38-45, LALF 36-47 und DB1 in Abbildung A) und für LALF 36-47p39-p43 und DB1 in Abbildung B).



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Die Werte der nur mit Peptid ohne LBP-Zusatz inkubierten Proben lagen um den Leer­wert, was eine Bindung der Antikörper an die Peptide ausschließt (Ergebnisse nicht abge­bildet).

2 Einfluss der Peptide auf die Stimulation von RAW Zellen und Monozyten

Zellen der murinen Makrophagenlinie RAW 264.7 reagieren auf die Stimulation durch LPS u.a. mit der Ausschüttung von TNF-α und NO. Humane Monozyten lassen sich eben­falls durch LPS zu einer TNF-α-Synthese stimulieren, sie produzieren jedoch keine im Ver­suchsaufbau nachweisbaren Mengen an Stickstoffoxid (NO). Im Folgen­den wurde der Einfluss der synthe­tisierten Peptide auf die Stimulation der RAW-Zellen und Mono­zyten durch LPS anhand der gebildeten TNF-α- bzw. NO-Menge untersucht. Für den Versuch wurden die Zellen mit 5 ng/ml LPS stimuliert, das z.T. zuvor mit steigen­den Konzentrationen der zu untersuchenden Peptide für 5 Minuten bei 37 °C vo­rinku­biert wurde. Die Zellen wurden mit LPS bzw. den LPS-Peptid-Gemischen für
4 Stunden inkubiert, die Zellkultur­überstände abgenommen und anschließend die h- bzw. mTNF-α-Konzentration darin mittels ELISA ermittelt. Zur NO-Konzentrations­bestimmung wurden die Kulturüber­stände der RAW-Zellen nach 20-stündiger Inku­bation ab­ge­nommen und die gebildete NO-Menge mit Hilfe einer Farb­reaktion quan­tifiziert. Zusätzlich zu den im LPS-Assay verwendeten Peptiden wurden für die Zell­versuche von den beiden im LPS-Assay effektivsten Peptiden (LALF 36-47 und LALF 36-47p43) zwei komplett aus D-Aminosäuren bestehende Äquivalente synthetisiert.

2.1 Hemmung der LPS-induzierten TNF-α-Synthese bei RAW Zellen

Bei den RAW 264.7-Zellen lag die TNF-α-Konzentration des Kontrollansatzes ohne Peptid durchschnittlich bei 5,2 ng/ml. Da die Absolutwerte jedoch z.T. von Versuchs­ansatz zu Versuchsansatz variierten, wurden im Folgenden die jeweiligen Mittelwerte der nur mit LPS stimulierten Zellen gleich 100 % gesetzt und die übrigen Werte in Bezug auf diesen Wert ebenfalls in %-Zahlen umgerechnet. Soweit es nicht anders angegeben ist, gilt dies für alle folgenden Versuche. Die Zugabe der Peptide LALF
36-47, D-LALF 36-47, LALF 36-47p43, D-LALF 36-47p43, LALF 36-47p39, LALF 36-47p41 und LALF 36-47p42 zu LPS führte zu einer dosisabhängigen Reduktion der [Seite 38↓]mTNF-α-Produktion (Abbildung 8). Zwischen den verschiedenen Peptiden konnten jedoch große Unterschiede bezüglich ihres LPS-neutralisierenden Potentials fest­gestellt werden. Bereits bei Zugabe von 1 µg/ml der Peptide LALF 36-47, D-LALF 36-47 und D-LALF 36-47p43 kommt es zu einer deut­lichen Verminderung der gebildeten TNF-α-Menge um 28,4 % (LALF 36-47), 35,6 % (D-LALF 36-47) bzw. 38,7 % (D-LALF 36-47p43) (Abbildung 8A). Diese Reduktion ließ sich durch Zugabe höherer Peptid-Mengen noch erheblich verstärken. Bei der höchsten verwen­deten Peptid­konzen­tration von 20 µg/ml, in der neben den oben genannten auch die restlichen Peptide eingesetzt wurden (Abbildung 8B), liegt die TNF-α-Konzentration nur noch bei 12,1 % (D-LALF 36-47) bis 75,7 % (LALF 36-47p39) der ursprünglichen Menge. Für die Peptide DB1 und DB2 hingegen weichen die TNF-α-Werte nicht relevant vom Kontroll­wert ab. Das ganz aus D-Aminosäuren bestehende Peptid D-LALF 36-47 zeigte in diesem Assay die stärkste Aktivität. Die bereits hohe Fähigkeit des Peptids LALF
36-47, die LPS-indu­zierte TNF-α-Freisetzung zu blockieren, wurde durch die Ver­wendung von D-Amino­säuren noch erheblich gesteigert.

Abbildung 8 A: Einfluss der zyklischen Peptide auf die TNF-α-Sekretion von RAW Zellen. RAW 264.7 Zellen wurden mit zuvor für 5 min vorinkubierten LPS-Peptid-Gemischen verschiedener Peptid­konzen­tration der Peptide LALF 36-47, D-LALF 36-47, LALF 36-47p43 und D-LALF 36-47p43 oder LPS (5 ng/ml) allein in Gegenwart von 2 % FCS stimuliert. Nach 4 h wurde die mTNF-α-Konzentration in den Überständen mittels ELISA ermittelt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standard­abweichungen von 4-fach-Werten eines repräsentativen Versuches, der insgesamt dreimal mit nahe­zu identischen Ergebnissen wiederholt wurde. Der Mittelwert der nur mit LPS stimulierten Zellen wurde als Kontrollwert gleich 100 % gesetzt.


Abbildung 8 B: Einfluss der zyklischen Peptide auf die TNF-α-Sekretion von RAW Zellen. RAW 264.7 Zellen wurden mit zuvor für 5 min vorinkubierten LPS-Peptid-Gemischen (LPS 5 ng/ml, Peptide
20 µg/ml) oder LPS allein in Gegenwart von 2 % FCS stimuliert. Auswertung und Darstellung erfolgte wie in Abb.8 A beschrieben.

2.2 Beeinflussung der NO-Synthese LPS stimulierter RAW Zellen

Wie in Abbildung 9 zu erkennen ist, zeigte sich bei der NO-Produktion der RAW-Zellen eine ähnliche Effektivitätsverteilung der verschiedenen Peptide wie bei der TNF-α-Reduktion. Die NO-Werte der Kontroll­stimulation ohne Peptid schwanken hier um
14,5 µmol/l. Die Peptide D-LALF 36-47 und D-LALF 36-47p43 vermochten bei einer Konzentration von 20 µg/ml die NO-Ausschüttung um 92,7 % bzw. 87,6 % zu senken. Auch die Peptide LALF 36-47 und LALF 36-47p43 waren in der Lage die NO-Konzen­tration um 76,6 % und 63,4 % zu reduzieren, allerdings ist ihr Effekt, ebenso wie der der Peptide LALF 36-47p39, -p41 und –p42 schwächer als bei den D-Peptiden. DB1 und DB2 zeigten auch hier keine erkenn­bare Hemmung der Zellstimulation durch LPS. Aktivstes Peptid in der NO-Blockade war erneut D-LALF 36-47, das bereits bei einer [Seite 40↓]Konzentration von lediglich 1 µg/ml die LPS-induzierte NO-Synthese um über 50 % blockieren konnte (Abbildung 9A).

Abbildung 9: Einfluss der zyklischen Peptide auf die NO-Ausschüttung LPS-stimulierter RAW Zellen. RAW 264.7-Zellen wurden mit zuvor für 5 min mit den Peptide vorinkubiertem LPS (5ng/ml) stimuliert. Die NO-Konzentration in den Überständen wurde mittels Farbreaktion nach Griess bestimmt und der Mittelwert der nur mit LPS stimulierter Zellen gleich 100 % gesetzt. Die Ergebnisse wurden in
4-fach-Werten in drei unabhängigen Versuchen für jedes Peptid ermittelt. Die abgebildeten Werte (Mittel­wert und Standardabweichung) entsprechen einem repräsentativen Versuch. A) Hemmung der LPS-vermittelten NO-Ausschüttung durch steigende Konzentrationen der Peptide LALF 36-47, D-LALF 36-47, LALF 36-47p43 und D-LALF 36-47p43 bei RAW-Zellen. B) Unterschiede der NO-Freisetzung LPS-stimu­lierter RAW-Zellen durch Zugabe von 20 µg/ml der LPS-bindenden Peptide.

2.3 Einfluss der Peptide auf die TNF-α-Freisetzung LPS-stimulierter humaner Monozyten

Nachdem für die als sehr LPS-sensitiv bekannte murine Makrophagen-Zellinie RAW 264.7 sehr eindrucksvolle Ergebnisse für die untersuchten Peptide erzielt worden waren, wurde ein ähnlicher Versuchsaufbau für frisch isolierte humane Monozyten ent­wickelt. Aus dem Blut freiwilliger Spender isolierte Monozyten wurden in Gegenwart von 2 % AB-Serum mit LPS, welches zuvor mit den hier untersuchten Peptiden vorinkubiert war, zur TNF-α-Synthese angeregt. Auch in diesem Versuch war die LPS-neutrali­sierende Wirkung der Peptide LALF 36-47, D-LALF 36-47, LALF 36-47p43 und D-LALF 36-47p43 am stärksten (Abbildung 10). Alle vier Peptide hemmten bei einer Konzen­tration von 20 µg/ml die hTNF-α-Ausschüttung der Monozyten in ähnlich starkem Ausmaß (LALF 36-47 um 86,9 %, D-LALF 36-47 um 98,3 %, LALF 36-47p43 um
93,7 % und D-LALF 36-47p43 um 97,7 %). Die Peptide LALF 36-47p39-p42 zeigten zwar ebenfalls eine leichte Reduktion der TNF-α-Werte in den Überständen, jedoch war diese wesentlich schwächer ausgeprägt als die der vorgenannten Peptide. Für die Peptide DB1 und DB2 liegen die Werte auch in diesem Versuch um den Kontrollwert, der durchschnittlich ca. 4,6 ng/ml betrug. Die Diskrepanz zwischen den hochaktiven Peptiden LALF 36-47, D-LALF 36-47, LALF 36-47p43 und D-LALF 36-47p43 auf der einen Seite und den weniger aktiven restlichen Peptide auf der anderen erscheint im Versuch mit humanen Monozyten deutlich stärker ausgeprägt als bei Verwendung der murinen Zellinie. Die D-Peptide scheinen hier lediglich bei Verwendung der höchsten Konzen­trationen eine Aktivitätssteigerung gegenüber den Peptiden aus L-Amino­säuren zu bieten.

Da der Verlauf der Messwerte bei steigender Konzen­tration der Peptide bis zu
20 µg/ml auch bei noch höheren Konzentrationen keinen wesentlich stärkeren Hemmeffekt mehr erwarten lässt und eine probeweise durch­geführte Erhöhung der Konzentration der Peptide D-LALF 36-47 und D-LALF 36-47p43 auf 500 µg/ml keine [Seite 42↓]weitere relevante Senkung der synthetisierten TNF-α-Menge mehr zeigte (Daten nicht gezeigt), wurde für die folgenden Zellversuche eine Maxi­mal­konzentration von
20 µg/ml als ausreichend erachtet.

Abbildung 10: Einfluss der zyklischen Peptide auf die TNF-α-Synthese mit LPS stimulierter humaner Monozyten. Die Peptide wurden in unterschiedlichen Konzentrationen nach 5-minütiger Vor­inkubation mit 5 ng/ml LPS (ABS 2 %) humanen Monozyten zugesetzt. Die Bestimmung der TNF-α-Ausschüttung erfolgte nach 4 h Stimulation mittels ELISA. Nur mit LPS stimulierte Zellen dienten als Kontrolle, deren mittlere TNF-α-Ausschüttung gleich 100 % gesetzt wurde. Dargestellt sind Mittelwert und Standardab­weichung. Die Ergebnisse wurden in 4-fach-Werten in drei unabhängigen Versuchen für jedes Peptid ermittelt, die abge­bildeten Werte entsprechen einem repräsentativen Versuch. A) Inhibition der LPS-vermittelten TNF-α-Ausschüttung durch steigende Konzentrationen der Peptide LALF 36-47,
D-LALF 36-47, LALF 36-47p43 und D-LALF 36-47p43 bei humanen Monozyten.B) Unterschiede der TNF-α-Freisetzung LPS-stimulierter humaner Monozyten durch Zugabe von 20µg/ml der LPS-bindenden Peptide.

Um auszuschließen, dass die Peptide selbst einen stimulierenden Einfluss auf die Zellen haben, wurden alle Peptide zum Vergleich in einer Konzentration von 20 µg/ml ohne LPS mit den Zellen inkubiert. Hierbei ergaben sich in allen Fällen Werte, die um den Wert von unstimulierten Zellen lagen (Daten nicht gezeigt). Ein eigenstimula­to­rischer Effekt ist somit auszuschließen.

3 Einfluss der Inkubationsdauer von LPS und Peptiden auf die TNF-α-Aus­schüttung humaner Monozyten

In den bisherigen Versuchen wurden die verwendeten Peptide jeweils für 5 Minuten mit LPS vorinkubiert. Um zu untersuchen, ob eine längere Vorinkubation die Hemmung der LPS-Wirkung verstärken konnte, wurde im folgenden Versuch die Dauer der Inkubation der Peptide mit LPS variiert. LPS wurde in einer Konzentration von 5 ng/ml ent­weder zeitgleich mit den Peptiden D-LALF 36-47 und D-LALF 36-47p43 oder nach einer Vorinkubation mit diesen Peptiden von 5, 30 oder 120 Minuten Dauer zu den Mono­zyten zugegeben und die Stimulation der Zellen anhand der TNF-α-Freisetzung er­mittelt (Abbildung 11). Die Peptide wur­den in Konzentrationen von 1, 10 und 20 µg/ml ver­wendet. Als Vergleich wurden die Zellen mit 5 ng/ml LPS ohne Peptidzusatz stimuliert. Wurden LPS und Peptid ohne Vorinkubation den Monozyten zugefügt, ergab sich eine Reduktion der gebildeten TNF-α-Menge um maximal 56,7 % für D-LALF
36-47 und 32,7 % für D-LALF 36-47p43. Bereits bei einer 5-minütigen Vorinkubation sank die TNF-α-Ausschüttung für 20 µg/ml Peptid fast bis auf die Ausgangswerte un­stimu­lierter Zellen ab und führte auch bei 10 µg/ml Peptid zu einer 81,7 %-igen
(D-LALF 36-47) bzw. 85,7 %-igen (D-LALF 36-47p43) LPS-Neutrali­sation. Bei
30-minütiger Vor­inku­bation zeigt sich nur für die 1 µg/ml-Werte und bei 10 µg/ ml
D-LALF 36-47 noch eine weitere Reduktion der TNF-α-Menge. Eine längere Vorinkubation über 30 min hinaus brachte keine weiteren Vorteile.


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Abbildung 11: Einfluss der Vorinkubation der Peptide mit LPS auf die TNF-α-Ausschüttung humaner Monozyten. LPS-Peptidgemische mit 5 ng/ml LPS und steigender Konzentration der Peptide
D-LALF 36-47 (A) und D-LALF 36-47p43 (B) wurden bei 37 °C für 120, 30 und 5 min vorinkubiert. Anschließend wurden humane Monozyten für 4h mit den Gemischen bzw. mit nicht vorinkubiertem LPS und Peptid oder mit LPS allein stimuliert. Die Werte ohne Peptid dienten als Kontrolle. Nach der Stimu­lation wurde die TNF-α-Konzen­tration in den Zellüberständen mittels ELISA gemessen (n=4).

4 Ausschluss toxischer Effekte der untersuchten Peptide auf die RAW-Zellen bzw. Monozyten

Da in den vorangegangenen Versuchen inhibitorische Aktivitäten der untersuchten Peptide auf die Stimulation von humanen Monozyten und RAW 246.7 Zellen durch LPS [Seite 45↓]untersucht wurden, musste geklärt werden, ob die Reduktion der TNF-α- und NO-Frei­setzung durch vermehrten Zelluntergang bedingt sein könnte. Hierzu wurde die LDH-Konzentration in den Zellkulturüberständen der stimulierten Zellen bestimmt und spe­ziell die Werte unstimulierter bzw. nur mit LPS stimulierter Zellen mit den Werten der Zellen verglichen, denen die höchsten verwendeten Konzentrationen (10 und 20 µg/ml) der in den vorangegangenen Versuchen effektivsten Peptide zugegeben wurden. An­hand der gemessenen LDH-Konzentrationen waren keine zytotoxischen Wirkungen festzustellen (Daten nicht abgebildet). Die gemessenen LDH-Konzentrationen zeigten keinen Zusammenhang mit der TNF-α- oder NO-Ausschüttung, womit ein vermehrter Zelluntergang als Ursache für die beob­achteten Effekte der Pepti­de auf die syntheti­sierte TNF-α- bzw. NO-Menge ausgeschlossen werden konnten.

5 Einfluss einzelner Peptide auf die LPS-induzierte Aktivierung der p38- und p42/44-MAP Kinasen von RAW Zellen

Um zu untermauern, dass die vorangehend beschriebene Differenz der TNF-α- bzw. NO-Ausschüttungen tatsächlich auf einer verringerten Aktivierung der Zellen durch LPS basiert, wurde im Folgenden die Beeinflussung der Aktivität der p38- und p42/44-Kinasen, zweier zentraler Signalübertragungsmoleküle bei der LPS-Stimulation, durch LPS allein bzw. durch exemplarisch mit den Peptiden LALF 38-45, LALF 36-47 und LALF 36-47p41 vorinkubiertem LPS untersucht. Die Aktivierung der MAP-Kinasen wurde mittels spezifischer Assays in den nukleären Über­ständen stimulierter und anschlie­ßend lysierter RAW 246.7 Zellen bestimmt. Hierfür wurden die RAW-Zellen entweder mit 10 ng/ml LPS allein oder mit vorinkubierten LPS-Peptidmischungen (LPS 10 ng/ml, Peptide 20 und 1 µg/ml) stimuliert. Zur Kontrolle wurden RAW-Zellen in Medium ohne Stimu­lanzien inkubiert.

5.1 p42/44-MAP-Kinase-Assay

Abbildung 12 zeigt die Aktivität der p42/44-MAP-Kinasen in LPS-stimulierten RAW-Zellen ohne und mit Zugabe der LALF-Peptide 38-45, 36-47 und 36-47p41 in zwei Konzentrationen. Es ist zu erkennen, dass eine geringe Peptidkonzentration von
1 µg/ml fast keinen Einfluss auf die Aktivität der MAP-Kinasen hat. Bei hohen Peptid­[Seite 46↓]konzentrationen (20 µg/ml) zeigte sich jedoch eine deutliche Reduktion der LPS-indu­zierten p42/44-Kinase-Aktivität.

Abbildung 12:Beeinflussung der LPS-induzierten MAP-Kinasen-Aktivierung durch einzelne Peptide. RAW 264.7-Zellen wurden jeweils in doppelten Ansätzen mit LPS-Peptidgemischen, die zuvor für 5 min vorinkubiert wurden bzw. mit LPS ohne Peptid stimuliert (LPS 5 ng/ml, Peptide 1 und 20 µg/ml). Nach 20-minütiger Stimulation wurden die Zellen lysiert und in den nukleären Überständen die Aktivität der p42/44 MAPK mit Hilfe eines spezifischen p42/44 Kinase-Assays ermittelt. Im Assay proportional zur Aktivität gebundenes ³²P wurde per Szintillationszählung in „counts per minute“ gemessen. Dargestellt sind Mittelwert und Standard­ab­weichung.

5.2 p38-Western-Blot

LPS induziert die Tyrosin-Phosphorylierung der p38-MAP-Kinasen, was mit einem Phospho-p38-Westen-Blot untersucht werden kann. Die Bestimmung des Aktivierungs­grades der p38-MAP-Kinasen in LPS-stimulierten RAW-Zellen und der Einfuss der Ring­peptide auf diese Stimulation zeigt vergleichbare Ergebnisse wie im p42/44-Kinase-Assay (Abbildung 13). Auch hier bewirkt eine geringe Peptidkonzentration von
1 µg/ml keine hemmende Wirkung auf die Aktivität der MAP-Kinasen, während
20 µg/ml der Peptide LALF 36-47 und LALF 36-47p41 deren Aktivität fast bis auf den Ausgangswert unstimulierter Zellen reduzierten.


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Abbildung 13: Einfluss der Peptide LALF 36-47 und LALF 36-47p41 auf die LPS-indu­zierte Akti­vierung der p38-MAP-Kinasen. Nach Vorinkubation von 5 ng/ml LPS mit 1 und 20 µg/ml Peptid wurden RAW 264.7-Zellen mit LPS allein bzw. den LPS-Peptid-Gemischen für 20 min stimuliert und anschließend nach Lyse der Zellen die p38-Aktivität in den nukleären Überständen mittels Western-Blot-Technik bestimmt. Der ermittelte Wert der aktivierten phospho-p38-Kinasen wurde hierzu durch den Wert der p38-Lade­kontrolle dividiert.


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11.03.2005