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IV.  Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob und in welchem Ausmaß die vom LPS-Bindungsbereich des LALF-Proteins abgeleitete zyklische Peptide in der Lage sind, LPS zu binden und dessen Einfluss auf Zellen zu inhi­bieren. Weiterhin wurde analy­siert, welchen Einfluss Veränderungen der Peptid­struktur, insbesondere die Verwen­dung von D-Aminosäuren, auf die Effektivität der Peptide haben. Die Versuche sind noch einmal schematisch in Abbildung 14 zusammengefasst.

Abbildung 14: Peptid-LPS-Interaktion und verwendete Untersuchungsmethoden. Die von der LPS-Bindungsregion des LALF-Proteins abgeleiteten zyklischen Peptide wurden mittels LPS-Bindungsassay, Bestimmung der Aktivierung nukleärer Proteine LPS-stimulierter Zellen und durch TNF-α- bzw. NO-Assays auf ihre Fähigkeit hin untersucht, LPS zu binden und so die – durch LBP verstärkte – Aktivierung der intrazellulären Signaltransduktion via p38 / p42/44 und die daraus resultierende Ausschüttung der Mediatoren NO und TNF-α zu inhibieren.

1 Interaktion von LPS mit LALF und mit davon abgeleiteten Peptiden

Dem Lipopolysaccharid (LPS oder Endotoxin), einem Hauptbestandteil der äußeren Zellwand Gram-negativer Bakterien, wird eine Schlüsselrolle in Pathogenerkennung und Induktion der angeborenen Immunität zugeschrieben. LPS liegt in wässriger Umgebung in micellärer Form vor und entwickelt seine immunstimulatorischen und toxischen Effekte erst durch die Inter­aktion mit den Serumproteinen LBP und sCD14 sowie dem zellulären CD14/TLR4/MD-2-Rezeptorkomplex auf der Oberfläche von Immunzellen wie Makrophagen und Mono­zyten. Die Aktivierung dieser Zellen führt zu [Seite 49↓]einer vermehrten Ausschüttung pro­inflammatorischer Zytokine wie TNF-α, IL-1 und
IL-6 (Chow et. al. 1999, Alexander und Rietschel 2001). Eine überschießende und unbalan­cierte Zytokinaus­schüttung kann möglicherweise an der Pathogenese von Sepsis und septischem Schock beteiligt sein (Glauser et. al. 1991, Hack et. al. 1997). Da für diese hochdramatischen Krankheitsbilder bisher keine effektive kausale Thera­pie zur Ver­fügung steht, besteht großes Interesse daran, neue Therapie­möglichkeiten zu ent­wickeln und auf ihre Wirksamkeit hin zu untersuchen.

Es wurden bisher zahlreiche natürliche und synthetische Proteine und Peptide beschrieben, die in der Lage sind, LPS oder Lipid A als dessen biologisch aktiven Teil zu binden. LBP, BPI, CAP 18, Polymyxin B und LALF weisen bezüglich der Ladungs­verteilung strukturelle Ähnlichkeiten in der jeweiligen LPS-Bindungsregion auf, die zwischen den in Säugern vorkommenden Proteinen LBP und BPI und dem LALF-Protein des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus besonders auffallend sind (Dankesreiter et. al. 2000, Hoess et. al. 1993).

Im Pfeilschwanzkrebs führt LPS zur Aktivierung einer aus zahlreichen Proteinen be­stehenden Koagulationskaskade. Der Limulus-anti-LPS-Faktor (LALF), auch Endo­toxin-neutralisierendes Peptid (ENP) genannt, ist ein kleines basisches Protein von 101 Aminosäuren Länge und 12 kDa Größe, welches in vivo diese Gerinnungskaskade inhi­biert und in der Lage ist, LPS hochaffin zu binden, dessen biologische Aktivität zu neutrali­sieren und das Wachstum Gram-negativer Bakterien zu hemmen (Tanaka et. al. 1982, Morita et. al. 1985, Muta et. al. 1987).

LALF wird in der Medizin schon seit längerer Zeit zur zuverlässigen Detektion geringer LPS-Mengen eingesetzt. Seine Fähigkeit, LPS zu binden und dessen Effekte in vitro und in vivo zu inhibieren, wurde eingehend untersucht und vor einigen Jahren wurde die LPS-Bindungssequenz identifiziert (Levin et. al. 1972, Warren et. al. 1992, Hoess et. al. 1993).

Im Rahmen dieser Arbeit wurde u.a. die LPS-Bindungsaffinität zweier von der LALF-Bindungs­sequenz für LPS abgeleiteter Peptide mit der von 1996 beschriebenen Peptiden gleicher Aminosäuresequenz verglichen (Ried et. al. 1996). Die dort erzielten Ergeb­nisse bezüglich der LPS-Neutralisierungsfähigkeit konnten hier bestätigt werden. Weiterhin wurde der Einfluss der Peptide auf die LPS-LBP-Interaktion und die LPS-abhängige Stimulation von Immunzellen untersucht und die Auswir­kungen von Verän­[Seite 50↓]derungen in der Aminosäuresequenz durch das Einfügen der D-Amino- (bzw. Imino-) säure Prolin auf die Struktur und Wirksamkeit der Peptide analy­siert. Völlig neu im Vergleich mit anderen Arbeiten war auch die Verwendung von D-Aminosäuren für den Aufbau von zwei ausgewählten Peptiden, was sich als vorteilhaft für deren Aktivität erwies.

2 Einfluss von LALF und LALF-Peptiden auf die LPS-induzierte Mediator­synthese von Immunzellen

Nach der Postulierung der LPS-Bindungsregion des LALF-Proteins im Bereich einer exponierten Schleifenstruktur konnte die genaue Bindungssequenz durch synthe­tische Peptide dieser Region eingegrenzt werden. Battarfarno konnte mit einem Peptid von 27 Aminosäuren Länge die TNF-α-Produktion LPS-stimulierter Makrophagen inhibieren und die bakterizide Wirkung des Peptides zeigen (Battafarno et. al. 1995). Kurz darauf gelang es, die minimale zur Bindung von LPS benötigte Sequenz auf 8 Aminosäuren (LALF-10 von Ried : AS 38-45) einzugrenzen. Es wurde jedoch festgestellt, dass Peptide mit etwas erweiterter Länge von 12 (LALF-14: AS 36-47) bzw. 20 Aminosäuren (LALF-22: AS 31-52) eine höhere Affinität zu Lipid A auf­weisen. Es konnte durch den Vergleich von linearen und zyklischen Peptiden auch gezeigt werden, dass die räum­liche Struktur entscheidend für die Bindungseigen­schaften ist. Nur die zyklischen Peptide zeigten die gewünschte Affinität zu LPS und waren in ihrer Bindungsstärke vergleichbar mit Polymyxin B (PmB), einem ringförmigen Peptidantibiotikum mit hoher Affinität zu LPS. Das Peptid von 12 Aminosäuren Länge (LALF-14 = LALF 36-47) war weiterhin in der Lage, die LPS-induzierte TNF-α-Ausschüttung in Mäusen ähnlich stark zu unterdrücken wie PmB (Ried et. al. 1996, Vallespi et. al. 2000).

Das in der vorliegenden Arbeit verwendete Peptid LALF 36-47 entspricht in seiner Amino­säuresequenz den Peptid LALF-14 von Ried und LALF 38-45 dem Peptid LALF-10. In den hier durchgeführten in vitro Versuchen konnte die starke inhibitorische Wirkung des Peptides LALF 36-47 auf die TNF-α-Ausschüttung LPS-stimulierter muriner Makro­phagen bestätigt werden. Bei Experimenten mit aus Blut isolierten humanen Mono­zyten war dieser Effekt sogar noch stärker ausgeprägt als bei den Zellen der Maus­makrophagenlinie RAW 264.7. Im Gegensatz zu Beobachtungen an nativen murinen Peritonealmakrophagen (Vallespi et. al. 2000) war hier das Peptid [Seite 51↓]jedoch auch in der Lage, die Stickstoffoxid-(NO) Aus­schüttung der Zellen der Makrophagenlinie ebenso stark wie deren TNF-α-Synthese zu reduzieren.

Dem Zytokin TNF-α wird in der Pathogenese der Sepsis eine bedeutende Rolle zuge­schrieben. Seine Synthese wird u.a. durch LPS induziert. Bei übermäßiger Produktion kann es starke systemische Reaktionen hervor­rufen (s. Kapitel I.1.4.1.). NO wirk im Organismus vasodilatierend und kardio­depressiv und kann im septischen Schock entscheidend zu Zirkulations- und Per­fusionsstörungen beitragen (Vasalli 1992, Parillo 1993, Hack et. al. 1997).

3 Die intrazelluläre Signaltransduktion

LPS aktiviert über den Rezeptorkomplex CD14/TLR4/MD-2 verschiedene intrazelluläre Signalwege, die über mehrere Zwischenstufen, wie der Aktivierung des Transkrip­tions­faktors NFκB sowie der extrazellulär regulierten Kinasen (ERK 1/2 = p44/42 MAPK), p38 MAP Kinasen und der cJun-N-terminal-Kinasen (JNK’s), zur vermehrten Synthese von proinflammatorischen Zytokinen führen (Liu et. al. 1994, van der Bruggen et. al. 1999). Die Beteiligung von p42/44 MAPK an der vollständigen Induk­tion der TNF-α-Gen-Expression konnte von Tsai et. al. nachgewiesen werden (Tsai et. al. 2000).

Im Rahmen dieser Arbeit wurde exemplarisch für die Peptide LALF 38-45, LALF 36-47 und LALF 36-47p41 mit Hilfe von Aktivitätsbestimmungen sowohl der p38- als auch der p42/44-MAPKinasen in LPS-aktivierten RAW-Zellen nachgewiesen, dass die ver­min­derte TNF-α-Ausschüttung der Zellen bei der Zugabe von LPS zu den Zellen in Anwesenheit der Peptide im Vergleich zur Stimulation mit LPS allein tatsächlich auf eine verminderte Aktivierung der intrazellulären Signaltransduktion zurückzuführen ist.

4 Die Rolle von LBP bei der Inhibition von LPS-Effekten durch LALF-Peptide

Das Lipopolysaccharid bindende Protein (LBP) ist in der Lage, durch eine katalytische Reaktion einzelne LPS-Moleküle aus LPS-Aggregaten herauszulösen und zu seinen zellulären Rezeptoren zu transportieren, was zu einer Verstärkung der immun­stimula­torischen Effekte des LPS um das 100- bis 1000-fache führt (Schumann et. al. 1990 und 1996). In zahlreichen Versuchen wurde die Affinität von LALF und von LALF abgeleiteter Peptide zu Lipid A bzw. LPS untersucht (Wainwright et. al. 1990, Warren [Seite 52↓]et. al. 1992, Ried et. al. 1996, Dankesreiter et. al. 2000, Weiss et. al. 2000). Es wurden jedoch bisher noch keine Ergebnisse über die Kompetition von LALF-Peptiden mit LBP um die Bindung am LPS veröffentlicht.

In einem hier verwendeten Versuchsaufbau wurde LPS in Mikrotiterplatten immo­bili­siert und die Bindung von LBP in Kompetition zu den Peptiden bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass LBP durch die einzelnen Peptide in unterschiedlich starkem Ausmaß und konzentrationsabhängig an der Interaktion mit LPS gehindert wurde. Dies läßt vermuten, dass die Peptide an die gleiche Stelle am LPS-Molekül binden wie LBP und somit den Transfer von LPS durch LBP zu den zellulären Rezeptoren und die daraus folgende Zellstimulation und Zytokinausschüttung verhindern.

Dankesreiter et. al. konnte zeigen, dass LALF-14 auch in der Lage ist, die Bindung von LPS an CD14 zu inhibieren, was ebenfalls zu einer verminderten Zellstimulation führt (Dankesreiter et. al. 2000). Nach Versuchen mit Mäusen, denen LPS und LALF injiziert wurde, vermutete Roth, dass LALF zwar die biologische Aktivität von LPS blockiert, jedoch nicht dessen beschleunigte Elimination aus dem Kreislauf bewirkt (Roth et. al. 1998). Dies würde durch eine „Blockierung“ von LPS für die Interaktion mit LBP und CD14 durchaus zu erklären sein.

5 Einfluss struktureller Veränderungen auf die Funktion der LALF-Bindungs­region für LPS

Erste Hinweise auf die genaue LPS-Bindungsstruktur brachte die 3-dimensionale Analyse von LALF durch Kristallographie (Hoess et. al. 1993). Hoess postulierte eine exponierte Schleifenstruktur als Bindungsdomäne für LPS. Die beiden Seiten der haar­nadelförmigen Schleife werden durch eine β-Faltblattstruktur gebildet, die über die gesamten Länge des Moleküls verläuft. Diese ist aus einer alternierenden Serie von positiv geladenen und hydro­phoben Aminosäuren aufgebaut, deren Reste durch die
β-Konformation der Schleife in ent­gegengesetzte Richtungen weisen. An ihrem unteren Ende sind die gegen­läufigen Aminosäureketten mit einer Disulfidbrücke zwischen den Aminosäuren Cystein 31 und Cystein 52 verbunden und die exponierte Spitze der Schleife wird durch eine positiv geladene Typ-1-Biegung gebildet. Die Außenseite des β-Faltblatts und die eine Seite der Haarnadelschleife sind durch 10 basische Amino­säuren (hauptsächlich Lysin und Arginin) positiv geladen, wohingegen die gegenüber­[Seite 53↓]liegende Seite der Schleife durch die Reste von Phenylalanin 39, Leucin 42 und Tryptophan 44 hydrophob ist. Durch die β-1-Biegung weisen die beiden neben­ein­ander­liegenden positiven Ladungen der basischen Aminosäuren Arginin 40 und 41 an der Spitze der Schleife in die selbe Richtung und verstärken den amphiphilen Charakter der Bindungssequenz (Abbildung 15 B).

Vergleiche der Aminosäuresequenz mit eine Datenbank erbrachten zwar keine genaue Sequenzübereinstimmung mit anderen Proteinen, es konnten jedoch mit LBP und BPI zwei Proteine gefunden werden, die ein ähnliches Muster aus alter­nierenden hydro­philen und hydrophoben Aminosäuren aufweisen und von denen die Fähigkeit an LPS zu binden bekannt war. Ebenso wurde das Peptidantibiotikum Polymyxin B bei der Datenbankanalyse gefunden, welches LPS hochaffin bindet, therapeutisch jedoch wegen seiner Toxizität nicht systemisch verwendbar ist (Hoess et. al. 1993). Die identi­fizierten Bereiche der Proteine LALF, LBP und BPI konnten kurze Zeit später durch Versuche mit 27 Amino­säuren langen Peptiden dieser Regionen als LPS-Bindungs­domäne bestätigt werden (Battafarno et. al. 1995). Ried zeigte mit Hilfe von linearen Peptiden der Bindungsregion des LALF-Proteins für LPS und zyklischen Äquivalenten, die durch eine Disulfidbrücke zwischen den an Anfang und Ende der Peptidkette ange­hängten Cystein-Aminosäuren die Haarnadelschleife im LALF imitieren, die Bedeu­tung der Schleifenstruktur für die LPS-Bindung und er grenzte die Bindungssequenz auf die Aminosäuren 36 bis 47 ein. Als minimal benötigte Peptidlänge wurden die Amino­säuren 38 bis 45 festgestellt, jedoch zeigten Peptide mit 12 bzw. 20 Aminosäuren eine höhere Affinität zu LPS (Ried et. al. 1996).


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Abbildung 15: Aminosäuresequenz und schematische Darstellung der von LALF abgeleiteten Peptide. Die LPS-Bindungsregion des LALF-Proteins ist aus einer alternierenden Serie hydrophober und hydrophiler Aminosäuren aufgebaut, deren Reste in entgegengesetzte Richtungen der schleifenförmigen Struktur weisen (Abb. B). Diese Anordnung ist vermutlich auch in den ringförmigen Peptiden erhalten geblieben (Abb. C-D). Die Auswirkungen der D-Aminosäuren (durch kleine Buchstaben dargestellt und in Abb. A grau hinterlegt) auf die Struktur der Peptide kann jedoch nur vermutet werden, ebenso wie der Einfluss der in einigen Peptiden zusätzlich eingeführten D-Aminosäure Prolin (p) (Abb. E-J).


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Bei den synthetisierten zyklischen Peptiden der LALF-Bindungsregion bleibt der amphi­phile Charakter mit der gegensätzlichen Anordnung der basischen und hydro­phoben Aminosäuren erhalten (Abbildung 15) und imitiert die Originalstruktur der LALF-Schleife erfolgreich genug, um LPS vergleichbar mit PmB zu binden. Das hier verwendete Peptid LALF 36-47 mit 12 Aminosäuren Länge war in der Lage, die Bindung von LBP an LPS und die Aktivierung von Monozyten und Makrophagen um über 70% zu inhi­bieren. Das kürzere Peptid LALF 38-45 mit nur 8 Aminosäuren Länge zeigte hingegen eine deutlich geringere Effektivität bei der Kompetition mit LBP um LPS.

Um den Einfluss von Konformationsänderungen in der Schleifenstruktur zu unter­suchen, wurde bei dem hier untersuchten Peptid LALF 36-47 an verschiedenen Stellen der Schleifenspitze die D-Iminosäure Prolin eingeführt (Abbildung 15 F-J), die durch ihren schwach basischen Charakter keinen großen Einfluss auf die Ladungsverteilung im Molekül haben sollte, jedoch ein Abknicken der Peptidkette bewirkt. Dies scheint zu einer für die Peptid-LPS-Interaktion ungünstigen Konformation zu führen, die bei den Peptiden LALF 36-47p39, -p41 und -p42 einen weitgehenden Verlust der LPS-Bindungs- und Neutralisationsfähigkeit zur Folge hat. Bei LALF 36-47p43 liegt das eingefügte D-Prolin etwas weiter vom Scheitelpunkt der Schleifenstruktur mit den beiden positiv geladenen Aminosäuren Arginin 40 und 41 entfernt. Hier hat an­scheinend eine Änderung der räumlichen Anordnung der Amino­säurereste einen weniger störenden Einfluss auf die Peptidfunktion. Die Affinität zu LPS ist in diesem Fall nur gering beeinträchtigt. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die Anordnung der Ladungen im Bereich der Spitze der Schleife für die Interaktion von LALF mit LPS von besonderer Bedeutung ist.

Aufgrund der räumlichen Struktur der Bindungsschleife und der Verteilung der posi­tiven Ladungen wird vermutet, dass LPS-bindende Proteine wie LALF, LBP, BPI und CAP 18 bzw. davon abgeleitete Peptide über elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den positiven Aminosäureresten der Proteine und den negativ geladenen Phosphatgruppen des Disaccharids des Lipid A an LPS binden (Tobias et. al. 1988, Gazzano-Santoro et. al. 1992). Computerberechnungen für den α-helikalen LPS-Bindungsbereich von CAP 18, bei dem hydrophobe Aminosäurereste zur einen und hydrophile zur ande­ren Seite der Helix weisen, konnten zeigen, dass der Abstand der positiven Ladungen des Moleküls dem der beiden Phosphatgruppen im Lipid A ent­spricht (Chen et. al. 1995). [Seite 56↓]Die Be­deutung der positiven Ladungen für die Bindung von Proteinen oder Peptiden an LPS konnte anhand von LBP-Mutanten auf Proteinebene gezeigt werden, indem dort die posi­tiven Aminosäuren Arginin und Lysin der Bindungsregion durch neutrale oder nega­tive Aminosäuren ersetzt wurden. Dies führte zur Abschwächung bzw. zum Verlust der LPS-Bindungsfähigkeit (Lamping et. al. 1996). Weiterhin hat sich LPS, dem eine der beiden Phosphatgruppen fehlt, als biologisch inaktiv erwiesen (Heimann et. al. 1990), was wahrscheinlich darauf zurück­zuführen ist, dass auch hier die Interaktion mit LBP gestört ist.

6 Die zeitliche Wirkung von LALF und LALF-Peptiden auf LPS und Immunzellen

Das LALF-Protein ist in in vivo Versuchen bei alleiniger Gabe nur für wenige Minuten im Plasma nachweisbar. Bei gleichzeitiger Anwesenheit von LPS ist es jedoch deutlich länger im Blutkreislauf anzutreffen (ca. zwei Stunden), eventuell in Form von LPS-LALF-Komplexen (Roth et. al. 1998).

Von LALF abgeleitete zyklische Peptide mit 10 bzw. 14 Aminosäuren Länge zeigten in vitro eine Serumhalbwertzeit von rund 80 Minuten (Ried et. al. 1996). Genaue Daten über die in vivo Halbwertzeit der hier verwendeten LALF-Peptide stehen derzeit nicht zur Verfügung, sie dürfte aufgrund der geringen Molekülgröße jedoch nicht sehr groß sein. Da Peptide, die aus D-Aminosäuren aufgebaut sind (Abbildung 15 E und J), in geringerem Ausmaß durch proteolytische Prozesse abgebaut werden als Peptide aus L-Aminosäuren, ist bei ihnen eine vergleichsweise längere Halbwertzeit anzunehmen, vielleicht sogar Werte wie bei dem im Körper nur langsam abbaubaren Glykopeptid Teicoplanin mit einer Halbwertszeit von 72 Stunden.

In Zellversuchen zeigten die Peptide D-LALF 36-47 und D-LALF 36-47p43 auch nach 120-minütiger Vorinkubation mit LPS noch ihre vollständige Wirkung bei der Unter­drückung der TNF-α-Induktion in humanen Monozyten. Bei gleichzeitiger Zugabe von LPS und Peptid zu den Zellen ist bei 10 µg/ml D-LALF 36-47 bereits eine über 50 %-ige Neutra­lisation der LPS-Wirkung zu beobachten und nach Vorinkubation von 20 µg/ml Peptid mit 5 ng/ml LPS für 5 Minuten ist das LPS fast vollständig neutralisiert.

Die Wirksamkeit von LALF und davon abgeleiteten Peptiden scheint jedoch über die halbwertzeit-abhängige Bindung von LPS hinauszugehen. Zum einen sind LALF und [Seite 57↓]LALF-22 (AS 31-52) auch bei der Gabe Stunden nach LPS oder ganzen Bakterien noch in der Lage, die Letalität bei Mäusen deutlich zu senken, auch wenn die TNF-α-Antwort ihren Maximalwert schon überschritten und die Clearance von LPS bereits eingesetzt hat (Roth et. al. 1998, Vallespi et. al. 2003). Zum anderen bewirkt eine prophylaktische Gabe von LALF-22 bereits 20 Stunden vor einer bakteriellen Sepsis­simulation – also weit über die ange­nommene geringe Halbwertzeit des Peptides hinaus – eine höhere Überlebensrate und niedrigere TNF-α-Level bei Pseudomonas-infizierten Mäusen als bei unbeha­ndelten Kontrolltieren (Vallespi et. al. 2000 und 2003).

Da sich LALF-14 (LALF 36-47) in seiner Fähigkeit, LPS zu binden und die TNF-α-Antwort in LPS-stimulierten Zellen zu unterdrücken, nicht wesentlich von LALF-22 unter­scheidet, ist eine ähnliche in-vivo-Wirkung auch hier zu erwarten. Gleiche Effekte sind auch bei homologen Peptiden aus D-Aminosäuren anzunehmen. Roth vermutete, dass eine erhöhte Überlebensrate von Mäusen bei LALF-Gabe bis zu 24 Stunden nach LPS durch mehr als rein LPS-neutralisierende Effekte ver­ursacht wird (Roth et. al. 1998). Vallespi et. al. konnten zeigen, dass eine prophy­laktische Behandlung mit LALF-22 in vitro und in vivo zu einer veränderten Zytokin­expression führt. Es konnte eine vermehrte Synthese von IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-12 und IL-13, jedoch nicht von IL-4 und IL-10 gezeigt werden. Die Peptide scheinen so auch über ihre eigentliche Halb­wertzeit hinaus immunmodulatorisch auf die Wirts­abwehr einzuwirken und antimikro­bielle Prozesse zu aktivieren (Vallespi et. al. 2000 und 2003).

Ob vergleichbare oder wirksamere immunmodulatorische Effekte auch für die hier verwendeten Peptide nachweisbar sind, ist in weiterführenden in vitro und in vivo Versuchen zu prüfen.

7 Schlussfolgerung und Ausblick

Eine moderate Stimulation von Makrophagen durch Pathogene wie LPS führt zur Syn­these und Sekretion von proinflammatorischen Mediatoren mit dem Ziel, ein­dringende Mikroorganismen zu neutralisieren (Baumann und Gauldie 1994). Wenn es im Orga­nismus zum Übertritt von LPS oder Bakterien ins Blut kommt, kann es zur Stimulation von Immunzellen im ganzen Körper und dadurch zur überschießen­den Zytokinproduk­[Seite 58↓]tion kommen, was zur Sepsis führen kann (Glauser et. al. 1991, Parillo 1993, Abbildung 16).

Abbildung 16: Therapieansätze zur Behandlung der Sepsis. Schematische Darstellung der Angriffs­punkte ausgewählter bisheriger Therapiestrategien bei Sepsis (violett hinterlegt), ineffektiver Therapie­versuche (grün hinterlegt) und des möglichen Einsatzes der von LALF abgeleiteten Peptide (rot hinter­legt).

Die Sepsis ist trotz potenter Antibiotika und bedeutender Fortschritte in der Intensiv­therapie noch immer ein schweres klinisches Krankheitsbild mit hoher Sterblichkeit. Kausale Therapieversuche beschäftigen sich zum großen Teil mit den beiden am besten untersuchten Mediatoren in der Sepsispathogenese, dem TNF-α und IL-1. Versuche, durch Hemmung dieser Zytokine in den Verlauf der Sepsis einzugreifen, verliefen bisher enttäuschend, was z.T. darauf zurückzuführen ist, dass antiinflamma­torische Therapieansätze zwar in der hyperinflammatorischen Phase der Sepsis von [Seite 59↓]Nutzen sein könnten, in der hypoinflammatorischen Phase jedoch nutzlos oder gar gefährlich sind und eine klinische Unterscheidung der beiden Phasen bisher selten erfolgte oder möglich war. Eine gezielte Blockade einzelner pro- oder antiinflammato­rischer Mediatoren ist somit ein kompliziertes Unterfangen, da es ein genaues Verständnis der komplexen Vorgänge des Immunsystems voraussetzt (Zeni et. al. 1997, Vincent 1998, Kox et. al. 2000, Volk et. al. 2000).

Das LPS Gram-negativer Bakterien ist der Hauptsimulator der Zytokinsynthese in der Pathogenese der Sepsis. Mit Hilfe von Antikörpern wurde versucht, LPS zu neutrali­sieren. O-spezifische Antikörper binden LPS zwar zuverlässig, sie sind jedoch spezi­fisch für das LPS einer Bakterienart und es müsste so vor einer Therapie mit diesen Antikörpern die jeweilige Spezies bekannt sein, der die Sepsis zugrunde liegt. Studien mit anti-Lipid-A-Antikörpern brachten nicht die gewünschten Erfolge und die Kernregion von LPS scheint wenig immunogen zu sein (Baumgartner et. al. 1990, Zeni et. al. 1997, Vincent 1998).

Da zur Zeit noch keine effektive kausale Therapie speziell der Gram-negativen Sepsis zur Verfügung steht, besteht großes Interesse daran, wirksame LPS-neutralisierende Substanzen zu finden. In diesem Zusammenhang könnten einzelne der hier unter­suchten Peptide von Bedeutung sein. Da diese in der Lage sind, LPS hochaffin zu binden und dessen Effekte in vitro zu unterdrücken (Abbildung 16) und weiterhin in den verwendeten Konzentrationen keine toxischen Effekte auf die Zellen zeigten, ergeben sich Ansatz­punkte für deren Weiterentwicklung und mögliche prophylaktische oder therapeutische Nutzung. So könnten sie bei Patienten, die besonders gefährdet sind, an Sepsis zu erkranken, die Antwort des Immunsystems auf LPS reduzieren und so über­schießende Reaktionen verhindern. Andererseits könnte sich auch der von Vallespi beschriebene immunmodulatorische Einfluss der von LALF abgeleiteten Peptide – so dieser auch bei den hier verwendeten Peptiden vorhanden ist – positiv bei Patienten in der antiinflammatorischen Phase auswirken (Vallespi et. al. 2003).

Hierfür sind jedoch weiterführende Versuche nötig, um die Effektivität und Sicher­heit der Peptide auch in vivo zu prüfen, da in vitro Versuche die Reaktion im Organis­mus nur begrenzt wiederspiegeln können.


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11.03.2005