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V.  Zusammenfassung

Das aus der Zellwand Gram-negativer Bakterien freigesetzte Lipopolysaccharid (LPS) ist ein potenter Stimulator des Immunsystems. Das LPS bindende Protein (LBP) erkennt LPS und moduliert dessen Effekte, indem es den Transfer von LPS zu seinem zellulären Rezeptorkomplex CD14/TLR4/MD-2 bzw. in Lipoproteine katalysiert. Der LPS-Rezeptor­komplex wird hauptsächlich auf Monozyten und Makrophagen exprimiert. Die Bindung von LPS an den Rezeptor bewirkt eine Aktivierung der Zelle mit darauf folgender Ausschüttung pro­inflamma­torischer Zytokine wie dem Tumor­nekrosefaktor-(TNF-)α und der Inter­leukine (IL-) 1 und 6. Die von diesen Mediatoren ausgelöste Entzündungs­reaktion dient der Bekämpfung einge­drungener Mikro­organismen. Im Rahmen schwerer Infektionen und dem Übertritt von Bakterien oder LPS in die Blut­bahn kommt es meist zu einer systemischen Immun­antwort. Eine übermäßige zelluläre Stimulation kann hierbei zu einer überschießenden oder dys­balancierten Zytokin­frei­setzung führen, was für die Entstehung der Sepsis als ursäch­lich angesehen wird. Durch eine von Media­toren wie Stickstoffoxid (NO) vermittel­ten Vasodilation kann es dann zum septischen Schock mit schwer beherrschbarer Hypotonie und hoher Lethalität kommen, für die es noch immer keine effektive kausale Therapie gibt.

Der Limulus-anti-LPS-Faktor (LALF) des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus und von diesem abgeleitete Peptide sind in der Lage, LPS zu binden und zu neutralisieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Auswirkungen von struktu­rellen Veränderungen der LPS-Bindungsregion des LALF-Proteins mit Hilfe von synthetischen Peptiden analysiert. Hierzu wurde in die bekannte Bindungssequenz des Proteins an verschie­dene Lokalisationen an der Spitze der schleifenförmigen Peptide die D-Amino­säure Prolin eingeführt. Dies führt zum Abknicken der Aminosäurekette und somit zu einer Änderung der räumlichen Konformation der Peptide. Zwei der Peptide wurden zusätz­lich komplett aus D-Aminosäuren synthetisiert. In der vorliegenden Arbeit wurden diese Peptide hinsichtlich ihrer Neutralisationsfähigkeit von LPS untersucht. In einem experi­mentellen Ansatz wurde zunächst der Einfluss der Peptide auf die Interaktion von LBP mit immobilisiertem LPS analysiert. Die Peptide waren in der Lage, die Bindung von LBP an LPS in unterschiedlich starkem Ausmaß zu hemmen. Die Einfügung des D-Prolins in die Spitze der Bindungsschleife führte hierbei zu einem deutlichen Effektivi­tätsverlust. In einem weiteren Versuchsansatz wurde außerdem anhand der Be­stim­[Seite 61↓]mung der TNF-α-Freisetzung LPS-stimulierter humaner Monozyten und der TNF-α- und NO-Synthese muriner Makrophagen der Zellinie RAW 264.7 die LPS-neutrali­sie­renden Eigenschaften der zyklischen Peptide in vitro bestimmt. Die Stärke dieser Inhibition korrelierte mit der entsprechenden Wirksamkeit der Peptide im LPS-Bindungs-Assay. Die voll­ständig aus D-Aminosäuren aufgebauten Peptide waren dabei im Vergleich wirksamer als die Originalpeptide aus L-Aminosäuren. Mit Hilfe der Aktivitäts­bestimmung der p38- und p42/44-MAP-Kinasen in RAW-Zellen konnte exemplarisch für drei bzw. zwei der Peptide die verminderte Aktivierung der Zellen durch LPS auch auf intra­zellulärer Ebene gezeigt werden. Da sich die Peptide aus D-Aminosäuren als wirksamer erwiesen haben als ihre „natür­lichen“ Korrelate und sie zudem Proteolyse-stabiler sind als diese, bietet sich hier ein neuer Ansatzpunkt für die Entwicklung experimen­teller Therapie­möglichkeiten der Sepsis.


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11.03.2005