Burhenne, Matthias: Biotestsystem mit Bodenalgen zur ökotoxikologischen Bewertung von Schwermetallen und Pflanzenschutzmitteln am Beispiel von Cadmium und Isoproturon

20

Kapitel 2. Material und Methoden

2.1 Bodenproben

Es wurden fünf Orte ausgewählt, um Bodenalgen zu isolieren. Dabei wurde darauf geachtet, daß die Böden keine Schadstoffbelastungen aufwiesen. Dadurch war gewährleistet, daß die isolierten Algen keine Toleranzen oder Resistenzen gegenüber Schadstoffen entwickeln konnten. Nur in einem Fall wurde eine belastete Fläche beprobt, um die Sensibilität von Algen gegenüber Blei und Cadmium im Boden zu untersuchen. Von den untersuchten Versuchsflächen wurden folgende zwei mit mehreren Bodenproben auf ihre Algenabundanzen und Bodenparameter untersucht:

1.

Schwermetallversuchsfläche: Gelände der Biologischen Bundesanstalt in Berlin.

2.

  1. Darßer Ort: Nahe dem Ostseebad Prerow.

Für die weiteren Flächen wurden nur punktuell Bodenproben entnommen und Algen isoliert.

3.

Erdbeerbeet- und Gemüsebeetfläche: Gelände der Biologischen Bundesanstalt in Berlin. Diese Flächen wurden seit drei Jahrzehnten nicht mehr mit Pflanzenschutzmitteln bearbeitet und nur mit Stallmist gedüngt.

4.

Insel Vilm: Boden eines ca. 300 Jahre alten Waldes. Dieser Boden konnte als unbelastet eingestuft werden, da der Wald dieser Insel naturbelassen und unbewirtschaftet ist.

5.

Insel Hiddensee: Boden von einer Abbruchkante der Steilküste auf Hiddensee bei Kloster. An dieser Stelle war die Erde grünlich gefärbt und sehr feucht, da in diesem Bereich versickertes Regenwasser aus der Steilküste austrat. Eine Schadstoffbelastung des Bodens konnte aufgrund der Tiefe (ca. 15 m), aus der der Boden stammte, ausgeschlossen werden.

In dieser Arbeit werden alle isolierten Algen aus den verschiedenen Versuchen, die zur Reinkultur aufgearbeitet wurden, in Tab. 10 (s. S. 41) aufgeführt. Eine Beschreibung der Isolierungsversuche wird nur für die Schwermetallflächen und die Böden vom Darßer Ort gegeben.

2.2 Isolierung von Bodenalgen

Material für die Probenahme


21

Material für die Untersuchungen im Labor

Medium

Bold's Basal Medium (BBM, Bischoff & Bold 1963); Stammlösungen:

1.

NaNO3

10,0 g

2.

K2HPO4

3,0 g

3.

CaCl2 · 2H2O

1,0 g

4.

KH2PO4

7,0 g

5.

MgSO4 · 7H2O

3,0 g

6.

NaCl

1,0 g

Die 6 Stammlösungen werden mit je 400 ml Aqua dest. angesetzt. 10 ml von jeder Stammlösung werden mit 940 ml Aqua dest. vermengt und jeweils 1 ml der folgenden 4 Spurenelementelösungen dazugegeben.

Spurenelementelösungen:

1.

50,0 g EDTA und 31,0 g KOH in 1 000 ml Aqua dest. gelöst;

2.

4,98 g FeSO4 · 7 H2O gelöst in 1 000 ml angesäuertem Aqua dest. (1,0 ml H2SO4 konz. ad 1 000 ml Aqua dest.);

3.

11,42 g H3BO3 gelöst in 1 000 ml Aqua dest.;

4.

Folgende Salze gelöst in 1 000 ml Aqua dest.:

   

ZnSO4 · 7H2O

8,82 g

   

MoO3

0,71 g

   

Co(NO3) · 6H2O

0,49 g

   

MnCl2 · 4H2O

1,44 g

   

CuSO4 · 5H2O

1,57 g

Das Flüssigmedium wird mit ca. 1,5 % Agar verfestigt und bei 121 °C und 0,12 MPa = 1,2 bar 20 min autoklaviert. Der pH-Wert liegt bei 6,4 ± 0,2.


22

Methode

Mit der Agarplattenmethode kann ein großes Spektrum der im Boden vorkommenden Algen erfaßt und Zellmaterial zur Kultivierung von Reinkulturen zur Verfügung gestellt werden.

  1. Entnahme einer definierten Menge Boden. Dabei ist darauf zu achten, für welche Fläche man einen Wert bzw. Durchschnittswert für die Algenabundanz erhalten möchte. Grundsätzlich gilt für die mikrobiologische Charakterisierung eines Bodens, daß die Zahl der Einzelproben pro Untersuchungsfläche gar nicht groß genug sein kann (Alef 1991). Für viele chemische und physikalische Parameter geben Weitz et al. 1993 einen Stichprobenabstand von ca. 30 m für größere Flächen an. Für die mikrobiologische Untersuchung geht Alef (1991) bei Flächen von z. B. 500 m2 von ca. 100 Stichproben aus. Für kleinere Flächen ist je nach Bodenbeschaffenheit (z. B. Ackerfläche oder Waldboden) der Stichprobenumfang im Verhältnis zur Fläche größer, da der Abstand zwischen den Stichproben sich verringern muß. In vorliegender Arbeit lagen aufgrund der kleinen Versuchsflächen die Stichproben in Abständen von wenigen Zentimetern (s. Kap. 2.3.2, S. 25 und Fototafel 1, Bild 1, S. 24). Eine Anleitung zur Probenahme für die Feststellung der Bodenbeschaffenheit gibt die DIN ISO 10381-1 und für die Probenahme, Behandlung und Lagerung von Boden für die Bestimmung aerober mikrobieller Prozesse unter Laborbedingungen die DIN ISO 10381-6.
  2. Die Proben wurden bei ca. 4 °C ins Labor transportiert und innerhalb von 48 h weiterverarbeitet.
  3. Jede Bodenprobe wurde 10 min mit einem Löffel homogenisiert. Anschließend wurden im naturfeuchten Zustand ca. 150 g Boden dreimal durch ein 2 mm-Sieb gesiebt.
  4. Von dieser naturfeuchten gesiebten Erde wurden pro Boden jeweils zweimal 10,0 g abgenommen und in Bechergläsern aufbewahrt. Aus diesen Bodenproben wurden der Trockensubstanzwert und der Wassergehalt bestimmt. Dies war nötig, um die mit der Agarplattentechnik bestimmte Algenzellzahl (bzw. Zahl der koloniebildenden Einheiten, auch: colony forming units = cfu) auf die Algenzellzahl pro kg TS Boden umzurechnen.
  5. Für die mikrobiologische Untersuchung der Böden wurde in einem Vorversuch die ungefähre Algendichte ermittelt. Dadurch konnte beim Ansetzen der Bodensuspension eine Verdünnung ausgewählt werden, die zu einer auszählbaren Algenkolonieanzahl von ca. 100 bis 1 000 pro Petrischale führte. Diese Zahl konnte auf ca. 1 500 erhöht werden, wenn Kenntnisse darüber bestanden, daß keine intensiv zoosporenbildenden Algen in diesem Boden vorkamen, die zum Zerlaufen und Überwachsen anderer Kolonien hätten führen können.
  6. Je nach Algendichte im Boden wurden 2,5 g bis 10,0 g (bei sandigen trockenen Böden bis 30,0 g) naturfeuchter Boden je Bodenprobe in 125 ml BBM-Flüssigmedium in einen Erlenmeyerkolben gegeben.
  7. Die Bodensuspension wurde zwei Stunden im Überkopfschüttler bei Stufe 5 (ca. 15 U/min) geschüttelt und anschließend durch einen sterilen Goldfilter (Kaffeedauerfilter)

    23

    gegeben. Anschließend wurde mit 125 ml BBM-Medium nachgespült, so daß der Boden insgesamt in 250 ml BBM-Medium verdünnt war.
  8. Die Bodensuspension wurde mit einem sterilen Magnetrührer durchmischt und aus dieser aufgewirbelten Lösung immer an derselben Stelle im Wirbel 50 µl bis 1 000 µl abgenommen und auf einer Petrischale mit BBM-Agar vorsichtig mit einem sterilen Drigalskispatel ausplattiert. Ab 500 µl bis 1 000 µl wurde die Suspension nur durch Schwenken der Petrischale auf dem Agar verteilt und ca. 30 min unter der Clean Bench der Agar „getrocknet“.
  9. Pro Bodenprobe wurden 4 bis 8 Petrischalen beimpft und bei 15 °C in einem Kulturraum mit ca. 2 500 lx, Warmton, mit 12 Stunden-Rhythmus hell-dunkel kultiviert.

Auswertung

Nach ein bis zwei Wochen waren die Algenkolonien als kleine Punkte erkennbar, und nach drei bis vier Wochen fand die Auswertung statt, für die alle Algenkolonien, die mit Hilfe einer Stereolupe bei 10facher Vergrößerung zu erkennen waren, gezählt wurden. Fototafel 1, Bild 3 (s. S. 24) gibt einen Eindruck des Wachstums von Algenkolonien auf Agarpetrischalen.

Es wurde die Gesamtalgenkoloniezahl (ohne Cyanobakterien, aber mit Kieselalgen) und zusätzlich die Anzahl der Kieselalgenkolonien und der Cyanobakterienkolonien bestimmt. Die Auszählung der Cyanobakterienkolonien (s. Fototafel 1, Bild 2, S. 24) fand nach ca. 6 bis 8 Wochen statt.

Zur statistischen Auswertung der Ergebnisse wurden SAS <1>-Programme zur Varianzanalyse und zum Dunett-Test genutzt.

Zur Bestimmung einzelner Arten wurde aus der Vielzahl von Kolonien Algenmaterial mit einer Impföse abgenommen und die Algenzellen per Verdünnungsausstrich auf Agarpetrischalen vereinzelt. Nach mehrmaliger Wiederholung dieses Verfahrens konnten die vorliegenden Klonkulturen mikroskopisch bestimmt werden. Die mikroskopische Bestimmung bzw. Nachbestimmung der Kulturen wurde teilweise am Institut für Botanik der Universität Innsbruck durchgeführt, zu dem eine der europaweit größten Bodenalgensammlungen gehört.


24

Fototafel 1 Bild 1: Abbildung einer Beprobungsparzelle mit einem schwermetallhal-tigen Boden.

Fototafel 1 Bild 2: Foto eines Teils einer Cyanobakterienkolonie auf Agar.

Fototafel 1 Bild 3: Kolonien von Bo-denalgen auf Agar. Die Kieselalgen sind durch ihre bräunliche Färbung erkennbar.


25

2.3 Bodenalgen aus belasteten und unbelasteten Böden

2.3.1 Bodenanalytische Methoden

Folgende bodenanalytische Untersuchungen wurden für die Böden der Schwermetallparzellen und die Böden am Darßer Ort durchgeführt:

Folgende Untersuchungen wurden nur im Schwermetallversuch 1996 und im Isolierungsversuch Darßer Ort durchgeführt:

Die genannten Untersuchungen wurden überwiegend von Mitarbeitern des Institutes für ökologische Chemie der BBA durchgeführt.

2.3.2 Isolierungsversuche von schwermetallhaltigen Böden

1995 und 1996 wurde je ein Versuch durchgeführt.

Versuchsfläche

Die Versuchsfläche war eine Versuchsanlage, die 1982 in Parzellen mit der Größe 1 m2 angelegt und künstlich mit Schwermetallen belastet wurde. Seitdem wurden verschiedene Pflanzen angebaut und die Fläche wie ein Feld bewirtschaftet.

Probenahme

Die Daten der Probenahme von den beiden Versuchen sind in Tab. 2 dargestellt.


26

Tab. 2 : Beschreibung der Probenahme

Versuch

Probenahmezeitpunkt und
-bedingungen

beprobte Parzellen und Tiefen

Bemerkungen

1995

  • Ende Oktober
  • trockene sonnige Witterung
  • ca. 3 Wochen Brachzeit vor Probenahme

  • je zwei Parzellen pro Belastungsstufe
  • zwei Tiefen (0 cm bis 1 cm und 0 cm bis 5 cm)

  • nur für die Kontrolle wurden vier Parzellen beprobt
  • ca. 1 kg Boden pro Probe entnommen

1996

  • Anfang November
  • trockene Witterung
  • ca. 3 Wochen Brachzeit vor Probenahme

  • je vier Parzellen einer Belastungsstufe
  • eine Tiefe (0 cm bis 5 cm)

  • ca. 1 kg Boden pro Probe entnommen

Die Beprobung für die Tiefe von 0 cm bis 1 cm wurde mit einer kleinen Schaufel (Breite ca. 10 cm) mit geradem Boden in einem 10 cm breiten Streifen diagonal über die Parzelle durchgeführt (s. Fototafel 1, Bild 1, S. 24).

Die Beprobung für 0 cm bis 5 cm Bodentiefe wurde mit einem Bodenstecher (Durchmesser 2,5 cm) ebenfalls diagonal in zwei Reihen über die Parzelle mit 40 Einstichen 1995 und 20 Einstichen 1996 durchgeführt (s. Fototafel 3, Bild 3, S. 45). Die 20 bis 40 Einstiche wurden jeweils zu einer Mischprobe vereint.

Die Versuchsdaten zur mikrobiologischen Aufarbeitung des Bodens sind in Tab. 3 dargestellt.

Tab. 3 : Versuchsdaten zur mikrobiologischen Aufarbeitung des Bodens

Versuch

Erdsuspension – naturfeuchter Boden in 250 ml BBM-Medium

Beimpfungsmenge pro Petrischale

ausgewertete Petrischalen

1995

 

5,0 g

 

1 000 µl

 

8

1996

 

2,5 g

 

1 000 µl

 

4

Bodencharakterisierung

Der Versuchsboden in den Parzellen war ein schluffiger Sand und wies folgende Bodenparameterwerte auf: 5,7 Ton, 21,2 Schluff, 73,1 Sand, 2,5 organische Substanz und pH-Wert 5 bis 6. In die ausgewählten Parzellen wurden 1982 Cadmium als Cadmiumchlorid (CdCl2  · H2O) und Blei als Bleichlorid (PbCl2) in je zwei Konzentrationsstufen eingebracht (Cd I: 50 mg/kg und Cd II: 200 mg/kg und Pb I: 1 000 mg/kg und Pb II: 4 000 mg/kg). Je Schwermetall und Konzentrationsstufe wurden vier Parzellen angelegt.

In vorliegender Arbeit wurden die Schwermetallgehalte sowie weitere Bodenelemente und Bodenparameter für die Parzellen mit Cadmium und Blei zum gegenwärtigen Zeitpunkt bestimmt. Aus Übersichtlichkeitsgründen sind die Ergebnisse für Cadmium und Blei nicht im Ergebnisteil, sondern hier aufgeführt (Tab. 4). Die detaillierten Ergebnisse für weitere Schwer


27

metalle, die Bodenelemente und Bodenparameter befinden sich in Tab. A1 und A2 (s. S. 113 und 114).

Tab. 4 : Gesamtschwermetallgehalte (Königswasseraufschluß) und CaCl 2 -lösliche Fraktionen in mg/kg TS Boden (Tiefe: 0 cm bis 5 cm). Fett gedruckt sind die erhöhten Schwermetallkonzentrationen, K l und K r (Kontrollparzellen im linken und rechten Bereich der Versuchsanlage).

Cd

Pb

Cd

Pb

Parzelle

Gesamt

CaCl 2

K l/1

6,3

30,0

0,7

0,0

K l/2

7,0

31,0

0,4

0,0

K r/1

5,9

28,0

1,0

0,0

K r/2

6,7

34,0

0,7

0,0

Cd I/1

46,3

30,0

6,9

0,1

Cd I/2

39,8

28,0

4,9

0,1

Cd II/1

181,0

29,0

23,7

0,1

Cd II/2

169,0

29,0

17,3

0,1

Pb I/1

7,1

951,0

0,6

0,3

Pb I/2

5,9

905,0

0,9

0,3

Pb II/1

6,2

3 890,0

0,5

0,5

Pb II/2

5,8

3 329,0

1,2

1,3

Bis auf die Blei- und Cadmiumwerte lagen die Konzentrationen anderer Schwermetalle im üblichen Rahmen für Böden. Im Durchschnitt betrug in allen Parzellen der Wassergehalt 11,5 %, die Leitfähigkeit 48 µS, der Gesamtstickstoffgehalt 1 070 mg/kg TS Boden, der mineralische Stickstoffgehalt ca. 470 mg/kg TS Boden, die organische Substanz 2,8 %, der pH-Wert 5,8 und das Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis 13. Die Schwankungen der Werte zwischen den einzelnen Parzellen waren gering (s. Tab. A2 und A3, S. 114 und 115).

2.3.3 Isolierungsversuch am Darßer Ort

Versuchsfläche

Der Darßer Ort ist die nördlichste Landzunge auf dem Darß westlich von Prerow und Zingst. Diese Landzunge hat sich über die Jahrhunderte durch die Strömungsbedingungen der Ostsee und deren Sandfrachten, die sich in diesem Bereich ablagerten, gebildet. Die zwei beprobten Stellen D5 und D6 sind überwiegend mit Kiefern, Heide, Gräsern und Flechten bewachsen.

Probenahme

Die Bodenproben wurden an einem warmen (25 °C) Apriltag genommen. An den Tagen davor lagen die Temperaturen um den Gefrierpunkt. Die Böden waren ausgetrocknet und die obersten Zentimeter bestanden überwiegend aus Sand.


28

An jedem Probenahmeort wurden aus einem 2 m langen und ca. 12 cm schmalen Rechteck 8 im Abstand von ca. 20 cm liegende rechteckige Erdquader (Breite ca. 12 cm, Länge ca. 7 cm und Tiefe ca. 5 cm) entnommen.

Die Versuchsdaten zur mikrobiologischen Aufarbeitung des Bodens sind in Tab. 5 dargestellt. Es wurden 8 Petrischalen in zwei Konzentrationsstufen beimpft, aber nur je 4 einer Konzentrationsstufe ausgewertet.

Tab. 5 : Versuchsdaten zur mikrobiologischen Aufarbeitung des Bodens

Bodenproben

Erdsuspension – naturfeuchter

Boden in 250 ml BBM-Medium

Beimpfungsmenge pro Petrischale

ausgewertete Petrischalen

D 5/1-8

 

30,0 g

 

50 und 100 µl

 

4

D 6/1-8

 

10,0 g

 

50 und 100 µl

 

4

Bodencharakterisierung

In vorliegender Arbeit wurden die Schwermetallgehalte sowie weitere Bodenelemente und Bodenparameter für die beprobten Stellen untersucht. Aus Übersichtlichkeitsgründen sind die Ergebnisse nicht im Ergebnisteil, sondern hier aufgeführt. In Tab. 6 sind die Gesamtschwermetallgehalte (Königswasseraufschluß), die calciumchloridextrahierbaren Schwermetallgehalte und weitere Bodenelemente aus je 2 Mischproben (z. B. D 5/1-4 und D 5/5-8) pro Probenahmeort dargestellt. Arsen war in keiner Probe nachweisbar.

Tab. 6 : Ergebnisse der Bodenanalytik des Isolierungsversuchs Darßer Ort; n. n. (nicht nachweisbar), * (Meßwerte im Bereich des Blindwertes)

Hg

Cd

Pb

Zn

Cr

Co

Ni

Cu

Mn

Fe

V

B

K

Ca

Mg

P

Probe

Königswasseraufschluß in mg/kg TS Boden

D 5/1-4

0,020

0,05

2,9

5,0

*1,0

0,2

*0,5

*5,0

12,0

509,0

1,0

1,0

93,0

351,0

182,0

54,0

D 5/5-8

0,007

0,06

3,1

7,0

*1,0

n.n.

*0,4

*5,0

11,0

552,0

1,2

0,9

94,0

293,0

173,0

52,0

D 6/1-4

0,003

0,06

n.n.

5,0

4,0

0,2

0,6

*5,0

19,0

650,0

1,4

4,8

111,0

1 159,0

302,0

105,0

D 6/5-8

0,005

0,11

2,8

8,0

2,0

0,3

0,6

6,0

19,0

764,0

1,5

1,7

122,0

862,0

307,0

119,0

CaCl 2 -Extraktion in mg/kg TS Boden

D 5/1-4

n.n.

0,01

0,20

1,0

n.n.

n.n.

0,02

0,08

2,4

1,28

n.n.

*0,03

6,0

/

10,0

2,0

D 5/5-8

n.n.

0,01

0,40

1,6

n.n.

n.n.

0,03

0,04

2,1

1,97

n.n.

*0,04

8,0

/

11,0

2,0

D 6/1-4

n.n.

n.n.

n.n.

0,1

n.n.

n.n.

n.n.

n.n.

1,0

0,45

n.n.

0,44

11,0

/

64,0

1,0

D 6/5-8

n.n.

0,03

n.n.

1,0

n.n.

n.n.

0,02

0,07

1,7

0,88

n.n.

0,30

22,0

/

72,0

1,0

In Tab. 7 sind weitere Ergebnisse der Bodenanalytik dargestellt. Bei Leitfähigkeit, organischer Substanz und Wassergehalt (Ww) wurden Doppelbestimmungen durchgeführt.


29

Tab. 7 : Ergebnisse der Bodenanalytik des Isolierungsversuchs Darßer Ort 1996; Ww (Wassergehalt), C/N (Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis)

Probe

Leitfähigkeit in µS

N-Gesamt in mg/kg TS Boden

C/N

org. Sub.
in

Ww

in

pH-CaCl 2

D 5/1

18,0

507,0

14,4

1,5

3,17

4,1

D 5/2

17,0

220,0

13,2

0,6

2,07

4,3

D 5/3

17,5

441,0

15,6

1,4

2,96

4,2

D 5/4

19,5

545,0

15,2

1,7

2,77

4,3

D 5/5

17,0

486,0

14,8

1,4

2,78

4,3

D 5/6

15,0

465,0

15,1

1,4

2,65

4,0

D 5/7

19,0

693,0

16,2

2,2

3,00

4,0

D 5/8

16,5

443,0

15,1

1,3

2,90

3,8

D 6/1

37,0

536,0

13,4

1,4

7,82

6,5

D 6/2

42,5

539,0

12,4

1,3

7,12

6,7

D 6/3

36,0

458,0

11,8

1,1

5,91

6,7

D 6/4

30,0

199,0

11,1

0,4

4,46

6,5

D 6/5

23,5

365,0

11,2

0,8

1,89

6,5

D 6/6

25,0

276,0

11,6

0,6

1,38

6,6

D 6/7

27,0

173,0

10,4

0,4

2,75

6,2

D 6/8

42,0

2 877,0

12,7

7,3

10,25

5,0

Die Schwermetallgehalte und Gehalte weiterer Bodenelemente lagen bei beiden Probenahmeorten in niedrigen Bereichen und teilweise unterhalb der Nachweisgrenze. Der Boden des Probenahmeortes D 5 (s. Fototafel 2, Bild 1 und 2, S. 30) war ein sandiger und schnell austrocknender Boden, der geringe Werte an organischer Substanz aufwies und dessen pH-Wert im sauren Bereich lag (s. Tab. 7). Dieser Boden war aufgrund seiner geringen Nährstoff- und Spurenelementgehalte als nährstoffarmer Boden einzustufen. Im Boden des Probenahmeortes D 6 waren teilweise die Nährstoff- und Spurenelementgehalte etwas höher als in D 5. Dieser Boden war stärker mit Gräsern bewachsen (s. Fototafel 2, Bild 3, S. 30). Der pH-Wert lag zwischen 6 und 7, mit Ausnahme bei Probe D 6/8. Probe D 6/8 wies einen höheren organischen Substanzgehalt auf, und es waren gegenüber den sieben anderen Bodenproben der N-Gesamtgehalt, die Leitfähigkeit und der Wassergehalt erhöht. Der pH-Wert lag bei 5.

Diese Untersuchung zeigte, daß in kleinräumigen Bereichen von ca. 12 cm x 2 m teilweise höhere Schwankungen der Bodenparameter (z. B. pH-Schwankungen von ca. 2 bei Standort D 6) vorkamen, obwohl bei der Probenahme darauf geachtet wurde, daß die Probenahmenbereiche keine großen Unterschiede in Bewuchs und Streu aufwiesen.


30

Fototafel 2 Bild 1: Probenahmeort D 5. Links neben dem Zollstock befinden sich die 8 Probeneinstiche.

Fototafel 2 Bild 2: Einstichstellen von D 5. Sandiger Boden mit schwachem Bewuchs.

Fototafel 2 Bild 3: Probenahmeort D 6. Sandiger Boden mit stärkerem Bewuchs gegenüber D 5. Links neben dem Zollstock liegen die 8 Probeneinstiche.


31

2.4 Der Gel- und Boden-Biotest

Material für den Gel-Biotest

Material für den Boden-Biotest

Der BBA-Versuchsboden kommt vom Gelände der Biologischen Bundesanstalt in Berlin und ist ein schwach humoser schluffiger Sand. Die organische Substanz beträgt 1,8 , Ton 9,6 , Schluff 38,2 , Sand 52,2 , pH-Wert 7,5 und die maximale Wasserkapazität 22,8 ml/100 g TS Boden. Der Boden wurde auf Pflanzenschutzmittelrückstände und Schwermetalle untersucht und konnte als unbelastet eingestuft werden (Pestemer & Pucelik-Günther 1999).

Medien für den Gel- und Boden-Biotest

Das OECD-Medium aus dem OECD 201 Biotest entspricht dem in der DIN 28 692 bzw. dem in der EU Richtlinie L 383 A, C3 beschriebenen Testmedium.

Vorratslösungen für OECD-Medium:

Lsg. 1

NH4Cl

1,5

g

 
 

KH2PO4

0,16

g

 
 

MgSO4 · 7 H2O

1,5

g

 
 

MgCl2 · 6 H2O

1,2

g

 
 

CaCl2 · 2 H2O

1,8

g

 

ad 1 000 ml Aqua dest.

     

Lsg. 2

FeCl3 · 6 H2O

80,0

mg

 
 

Na2-EDTA · 2 H2O

100,0

mg

 

ad 1 000 ml Aqua dest.

     

Lsg. 3

H3BO3

185,0

mg

 
 

MnCl2 · 4 H2O

415,0

mg

 
 

ZnCl2

3,0

mg

 
 

Na2MoO4 · 2 H2O

7,0

mg

 
 

CoCl2 · 6 H2O

1,5

mg

 
 

CuCl2 · 2 H2O

0,01

mg

(dazu 1 mg CuCl2 · 2 H2O in 100 ml Aqua

 

dest. lösen und von dieser Lösung 1 ml verwenden)

ad 1 000 ml mit Aqua dest.

     

Lsg. 4

NaHCO3

50,0

mg

 

ad 1 000 ml Aqua dest.

     

Die Lösungen 1, 2 und 3 werden durch Autoklavieren (20 min bei 121 °C, 0,12 MPa = 1,2 bar) oder durch Sterilfiltrieren (Porengröße des Filters 0,2 µm) sterilisiert. Lösung 4 muß sterilfiltriert und darf nicht autoklaviert werden.


33

Ansetzen des OECD-Mediums für die Vorkultur und Testkultur:

Lösung 1:

10

ml

Lösung 2:

1

ml

Lösung 3:

1

ml

Lösung 4:

1

ml

ad 1 000 ml Aqua dest.

   

Der pH-Wert des Mediums liegt bei 8,0 ± 0,2. Das OECD-Medium wird mit Hilfe einer Agarzugabe von 0,6 g/l Agar in ein schwach gelartiges Medium verändert.

Teststoffkonzentrationen für den Gel- und Boden-Biotest

Als Testsubstanzen in diesen Biotests wurde Cadmiumchlorid als CdCl2 ·2 ½ H2O und Arelon (Wirkstoff: Isoproturon) verwendet. Die Angabe der Konzentrationen wurde auf Cadmium und Isoproturon umgerechnet.

Beim Ansetzen wurde berücksichtigt, daß die Cadmium- und Isoproturonkonzentrationen beim Boden-Biotest um das 10fache höher sein mußten, damit z. B. die erste Cadmiumkonzentration vom Gel-Biotest mit der ersten Cadmiumkonzentration im Boden-Biotest verglichen werden konnte (s. Tab. 8, S. 34). Schließlich wurden im Boden-Biotest nur 125 µl der Teststoffkonzentration auf 1 125 mg Substrat gegeben. Demgegenüber wurden im Gel-Biotest nur 250 µl Teststoffkonzentration in eine Kavität gegeben und nicht weiter verdünnt. Um einen Vergleich zwischen den Ergebnissen der beiden Biotests trotz unterschiedlicher Medienzusammensetzungen zu ermöglichen, wurde im Boden-Biotest davon ausgegangen, daß der Boden ebenso verdünnende Effekte aufweist wie ein Flüssigmedium. In anderer Form ist der Vergleich von Konzentrationen eines Teststoffes in Wasser und Boden kaum möglich.


34

Tab.  8 :Teststoffkonzentrationen für Cadmium (Cd) und Isoproturon (IPU), die in beiden Biotests verwendet wurden

Cadmium in

mg/l OECD-Medium

Isoproturon in

mg/l OECD-Medium

Gel-Biotest

Boden-Biotest

Gel-Biotest

Boden-Biotest

K

Cd-1

Cd-2

Cd-3

Cd-4

Cd-5

Cd-6

Cd-7

Cd-8

Cd-9

0,0

0,01563

0,03125

0,0625

0,125

0,25

0,5

1,0

2,0

4,0

K

Cd-2

Cd-4

Cd-6

Cd-8

Cd-10

0,0

0,3125

1,25

5,0

20,0

80,0

K

IPU-1

IPU-2

IPU-3

IPU-4

IPU-5

IPU-6

IPU-7

IPU-8

IPU-9

0,0

0,0195

0,0390

0,0781

0,1562

0,3125

0,625

1,25

2,5

5,0

K

IPU-1

IPU-3

IPU-5

IPU-7

IPU-9

0,0

0,195

0,781

3,125

12,5

50,0

Die physikalisch-chemischen Parameter der beiden Teststoffe sind im Anhang (s. S. 124 bis 125) aufgeführt.

Methode des Gel- und Boden-Biotests

Im Gel- und Boden-Biotest werden das Wachstumsverhalten von sechs bzw. vier verschiedenen Algenarten über vier Tage bzw. am Ende der vier Tage gegenüber Teststoffen unter standardisierten Laborbedingungen in einem Flüssigmedium und einem naturnahen Boden beobachtet. In Vorversuchen zeigte sich, daß das Wachstum nach vier Tagen nur noch langsam ansteigt. Einen Eindruck davon geben die Wachstumskurven über die ersten vier Tage, die in Abb. 6 (s. S. 51) dargestellt sind.

Es können innerhalb eines Versuches die Wachstumsreaktionen der fünf bzw. drei Bodenalgenarten untereinander und mit der Süßwasseralge Scenedesmus subspicatus verglichen werden. Einen tabellarischen Vergleich der Methoden beider Biotests zeigt Tab. 9.


35

Tab.  9 :Methodischer Aufbau des Gel- und Boden-Biotests.

 

Gel-Biotest

Boden-Biotest

Biotestorganismen

Bodenalgen:

  • Xanthonema tribonematoides
  • Stichococcus bacillaris
  • Klebsormidium flaccidum
  • Xanthonema montanum
  • Chlamydomonas noctigama

Süßwasseralge:

  • Scenedesmus subspicatus

Bodenalgen:

  • Xanthonema tribonematoides
  • Xanthonema montanum
  • Chlamydomonas noctigama

Süßwasseralge:

  • Scenedesmus subspicatus

Reaktionsraum

  • fünf 96-Kavitäten-Mikrotiterplatten
  • je Konzentration vier Kavitäten mit je 250 µl OECD-Medium

  • eine 48-Kavitäten-Mikrotiterplatte
  • je Konzentration eine Kavität mit 1 250 mg OECD-Bodenmediumgemisch

Konzentrationszahl pro Teststoff

  • neun und Kontrolle

  • fünf und Kontrolle

Kulturbedingungen

  • 22 °C, Dauerbelichtung 8 000 lx (120 µE*m-2*s-1)

Prüfkriterium

  • Hemmung des Algenwachstums

Messung

  • Photometrisch mit 800 nm Filter

  • Zellzahlbestimmung über Zählkammerverfahren mit Mikroskop

Wiederholungen/ Parallelen

  • 4 Parallelen in 4 Kavitäten pro Versuch für einen Teststoff

  • 3 Wiederholungen des gesamten Versuches pro Teststoff

Auswertung

  • Ermittlung des EC10- und EC50-Wertes für 96 h

Kontaminationspfad

  • über die Wasserphase

  • über die Gasphase
  • über die Wasserphase
  • über die Festphase

Adsorptionseffekte im Boden werden nachempfunden

2.4.1 Versuchsdurchführung für den Gel-Biotest

A) Vorkultur

Die Vorkultur der sechs Algenarten wurde sieben Tage (sechs bis acht) vor Beginn des eigentlichen Versuches bei Dauerlicht (8 000 lx, bzw. 120 µE · m-2 · s-1, ca. 22 °C) auf OECD-Medium angesetzt. Die Algen wurden je Art auf zwei Petrischalen mit ca. 20 Strichen


36

angeimpft. Die Stammkulturen waren nicht älter als zwei bis drei Monate und wuchsen auf BBM-Medium.

B) Vorbereitung der Testmedien

Das OECD-Medium wurde in 100 ml Kolben mit je 100 ml Medium aufgeteilt. Danach wurden je Kolben 0,6 g/l Agar und anschließend die jeweiligen Schwermetallkonzentrationen dazugegeben und bei 121 °C und 0,12 MPa 20 min lang autoklaviert. Vor dem Autoklavieren wurden die Kolben im Dampftopf kurz erhitzt, damit sich die geringe Agarmenge gleichmäßig im Medium verteilt.

Da beim Pflanzenschutzmittel das Erhitzen eine Verflüchtigung oder Veränderung der Testsubstanz bewirken könnte, wurde die jeweiligen Arelonkonzentration erst nach dem Autoklavieren dem Medium zugegeben. Arelon ist in der handelsüblichen Konzentration steril, wie ein Test auf Peptonagar bestätigte.

Die zehn Kolben pro Teststoff mit den verschiedenen Teststoffkonzentrationen und der Kontrolle wurden als Vorratskolben für weitere Versuche im Kühlschrank aufbewahrt.

C) Versuchsdurchführung

Für die Durchführung des Gel-Biotests, in dem eine Testsubstanz mit sechs Algen bewertet wird, wurden folgende Arbeitsschritte unternommen:

  1. Sechs Kolben mit jeweils 3 ml OECD Medium wurden mit den sechs Algenarten angeimpft (Animpfkolben). Die Trübung in den Kolben lag ungefähr bei einer Optischen Dichte (Absorption) von 1,0 ± 0,2 in 250 µl Zellsuspension (800 nm Filter). Um dies zu erreichen, mußten 2 Impfösen voll Algen in jeden Erlenmeyerkolben gegeben werden.
  2. Pro Teststoff wurden 3 mlder neun verschiedenen Teststoffkonzentrationen und der Kontrolle aus den Stammlösungen in 54 100 ml Kolben für die sechs Algen pipettiert.
  3. Pro Teststoffkonzentration wurden aus sechs Kolben jeweils 250 µl in sechs Kavitäten (Leerwerte) gegeben.
  4. Aus den Animpfkolben wurden nach Homogenisierung der Zellsuspension jeweils 100 µl entnommen und in die 54 Kolben mit ihren jeweils noch ca. 2,75 ml der verschiedenen Teststoffkonzentrationen pipettiert.
  5. Nach Homogenisierung der Zellsuspension mit den Teststoffkonzentrationen wurden aus den Kolben 250 µl in die Kavitäten gegeben. Je Konzentration und Algen sind vier Wiederholungen angesetzt worden (s. Abb. 1).
  6. Alle Randkavitäten wurden mitsterilem Aqua dest.befüllt. Randeffekte (verstärkte Verdunstung) wurden dadurch verringert. Zusätzlich wurden die Mikrotiterplattendeckel mit Parafilm doppelt abgedichtet.


37

Abb. 1: Befüllungsschema der Mikrotiterplatten. Exemplarisch sind die erste und fünfte Mikrotiterplatte dargestellt. LK (Leerwert Kontrolle, Medium ohne Zellen und ohne Cadmium); LCd1 (Leerwert, Medium ohne Zelle mit Cadmiumkonzentration 1); CdK (Kontrolle); Cd1 (erste Cadmiumkonzentration mit Zellen); H2O (steriles Aqua dest.).

  1. Die Messungen der optischen Dichte mit einem 800 nm Filter wurden alle 24 Stunden über vier Tage durchgeführt. Die erste Messung fand ca. zwei Stunden nach dem Befüllen der Mikrotiterplatte statt. Der 800 nm Filter wurde für die Messung der Optischen Dichte ausgewählt, da dieser Filter Partikel bzw. Zellen in einer Lösung am besten mißt und durch Farbstoffeinwirkungen nur geringfügig beeinflußt wird.
  2. Die Mikrotiterplatten wurden bei 22,0 ± 3,0 °C und ca. 8 000 lx, bzw. 120 µE · m-2 · s-1 Dauerlicht kultiviert.
  3. Nach DIN 28 692 wurden zu Beginn und am Ende des Versuches die pH-Werte der Medien mit den verschiedenen Teststoffkonzentrationen überprüft, um pH-Wert-Veränderungen über die Versuchszeit oder schon bei der Zugabe eines Teststoffes verfolgen zu können. Veränderungen von ca. 1,5 hätten dokumentiert werden müssen und sollten bei deutlicher Überschreitung dieses Wertes zum Abbruch des Versuches führen. Die pH-Wert-Messung führt man mit dem entsprechenden Indikatorpapier (pH-Bereich 7,5-8,5) oder mit pH-Meßgeräten mit einer Mikroelektrode durch.


38

D) Auswertung

Für die Auswertung wurden die Meßdaten nach jeder Messung mit Hilfe einer Input/Output- Routine direkt in einen PC übertragen und dort mit dem Tabellenkalkulationsprogramm Excel verrechnet. Die vier Parallelen für jede Konzentration wurden zu einem Mittelwert zusammengefaßt und der Mittelwert der sechs Leerwerte für jede Konzentration abgezogen. Der resultierende Wert beschrieb das Algenwachstum. Zur Darstellung der Wachstumskurven wurden für jede Konzentration und die Kontrollen die vier Mittelwerte der fünf Messungen (vier Meßtage) gegenüber der Zeit (0 h bis 96 h) aufgetragen (s. Tab. 6, S. 51).

Die weitere Auswertung wird in Anlehnung an den „Wachstumshemmtest mit der Alge Scenedesmus subspicatus und Selenastrum capricornutum“ (DIN 28 692) durchgeführt. Sie basiert darauf, daß die mit dem Mikrotiterplattenphotometer gemessenen Werte der Optischen Dichte auf Zellzahl/ml umgerechnet werden können. Als Grundlage dazu mußten für alle Algenarten Eichversuche durchgeführt werden, in denen die Optischen Dichten Zelldichten der entsprechenden Art zugeordnet wurden (s. Tab. A10 bis A15, S. 126 bis 128). Zwischen der Zunahme der Zelldichte und der Erhöhung des Wertes der Optischen Dichte gibt es innerhalb der ersten 96 h einen linearen Zusammenhang.

Für die Berechnung des Konzentrations-Wirkungs-Verhältnisses wurde ein Verfahren eingesetzt, in dem zuerst die durchschnittlichen spezifischen Wachstumsraten (µ) berechnet wurden. Die durchschnittliche spezifische Wachstumsrate für Kulturen mit einem exponentiellen Wachstum wurde ermittelt als:

     

µ

=

ln Nn – ln N0 / tn – t0

t0

=

Zeitpunkt zu Prüfbeginn

Nn

=

gemessene Optische Dichte (Anzahl der Zellen/ml) zum Zeitpunkt tn

N0

=

Optische Dichte (Anzahl der Zellen/ml) zum Zeitpunkt t0

tn

=

Zeitpunkt der n. Messung nach Prüfbeginn

Anschließend wurde die prozentuale Verminderung der durchschnittlichen spezifischen Wachstumsrate bei den einzelnen Konzentrationen gegenüber dem Kontrollwert gegen den Logarithmus der Konzentration aufgetragen. Der EC10- und EC50-Wert lassen sich jeweils aus der daraus entstehenden Kurve ableiten. Dies wurde mit einem SAS Programm zur Probitanalyse vorgenommen.

2.4.2 Versuchsdurchführung für den Boden-Biotest

A) Vorkultur

Wie beim Gel-Biotest (s. Kap. 2.4.1, S. 35).

B) Vorbereitung der Testmedien

Wie beim Gel-Biotest (s. Kap. 2.4.1).


39

Der BBA-Bodenwurde vor Vermischung mit dem OECD-Flüssigmedium durch ein 2 mm Sieb gegeben und bei 105 °C (DIN 19 683 Teil 4) getrocknet.

Auch bei diesem Biotest wurde mit einem Agarzusatz gearbeitet, um das Durchsickern der Algen durch kleine Spalten im Boden zu verhindern. Zusätzlich wurde damit auch eine bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse mit dem Gel-Biotest möglich.

Je Testsubstanz wurden fünf Konzentrationsstufen und die Kontrolle angesetzt. Aufgrund der aufwendigeren mikroskopischen Auswertung des Boden-Biotests wurden nicht alle neun Konzentrationen wie beim Gel-Biotest getestet.

C) Versuchsdurchführung

Für die Durchführung des Boden-Biotests, in dem eine Testsubstanz mit vier Algen bewertet wird,

wurden folgende Arbeitsschritte durchgeführt:

  1. Die äußeren Kavitäten der Mikrotiterplatte wurden mit je 1 ml sterilem Aqua dest. befüllt und in die verbleibenden 24 Kavitäten wurden je 1,0 g getrockneter BBA-Boden gegeben.
  2. Es wurden 125 µl der vorbereiteten Teststoffkonzentrationen pro Kavität auf die Erde gegeben und mit einer sterilen Impfnadel mit dem Boden gut durchmischt (s. Abb. 2). Anschließend wurde die Erde mit dem stumpfen sterilen Ende einer Impfnadel gleichmäßig festgedrückt, so daß die Oberfläche eine glatte Ebene ergab. Es wurde darauf geachtet, daß keine Risse oder Löcher auf der Bodenoberfläche vorhanden waren, da durch diese die Algensuspension hätte nach unten in die Kavität fließen können. Diese Arbeiten wurden unter der Clean Bench durchgeführt.

Abb. 2: Befüllungsschema der Mikrotiterplatte für den Boden-Biotest. K 1 bis 4 (Kontrolle); Cd 1/1 (Cadmiumkonzentration 1 mit Alge 1), H2O (steriles Aqua dest.).

  1. Von den Agarplatten (Vorkultur) wurden je Alge 3 Impfösen voll Algenmaterial abgenommen und in jeweils 3 ml OECD-Medium resuspendiert. In der Animpflösung wurde eine Optische Dichte in 250 µl von 1,5 ± 0,2 (800 nm Filter) erreicht.
  2. Aus den Animpfkolben wurden 125 µl der jeweiligen Algensuspension vorsichtig auf die Oberfläche der glattgedrückten Erde gegeben, ohne diese dabei aufzuwirbeln.
  3. Anschließend wurde der sterile Deckel aufgelegt und mit Parafilm einmal abgedichtet. Damit wurden Verdunstungseffekte am Rande der Mikrotiterplatten verringert.

    40

  4. Die Mikrotiterplatten wurden bei 22,0 ± 3,0 °C und ca. 8 000 lx, bzw. 120 µE · m-2 · s-1 Dauerlicht kultiviert.
  5. Der gesamte Versuch wurde dreimal wiederholt, da es innerhalb des Versuches keine Wiederholungen gab.

D) Auswertung

  1. Nach 96 h wurde mit einem dünnen sterilen Spatel die Erde vorsichtig aus jeder Kavität gehoben und jeweils in einen Erlenmeyerkolben gegeben. Anschließend wurde mit 2 ml OECD-Medium die Kavität nachgespült und damit die Resterde in den Erlenmeyerkolben pipettiert. Diese wurden jeweils bis auf 7 ml OECD-Medium aufgefüllt.
  2. Die Erde wurde mit den 7 ml OECD-Medium 2 Stunden bei 15 U/min im Überkopfschüttler geschüttelt.
  3. Anschließend wurde mit Hilfe eines seitlich angelegten Alupapiers durch einen Goldfilter filtriert, mit 4,25 ml OECD-Medium nachgespült und das Filtrat erneut durch den Goldfilter gegeben.
  4. Mit einem Magnetrührer wurden dann die Algen-Boden-Suspensionen jeweils in einem kleinen Becher durchmischt und immer an der gleichen Stelle aus dem Wirbel mit einer 100 µl Pipette ca. 20 µl entnommen und auf eine Neubauer Zählkammer gegeben. Mit deren Hilfe wurde die Algenkonzentration in der Bodensuspension bestimmt. Bei der Berechnung auf Zellzahl pro ml wurde der Verdünnungsfaktor durch die Herstellung einer Bodensuspension berücksichtigt, der meistens den Faktor 10 hatte.
  5. In der Neubauer Zählkammer wurde ein Quadrat mit 16 Kleinquadraten ausgezählt, wobei je vier Kleinquadrate als ein Zählwert definiert wurden. Dieser Vorgang wurde viermal mit immer neu entnommenen ca. 20 µl Bodensuspension durchgeführt.
  6. Die Berechnung des EC10- und EC50-Wertes verlief analog zur Auswertung des Gel-Biotests (s. Kap. 2.4.1, S. 38).
  7. Die pH-Wert-Überprüfung fand wie im Gel-Biotest statt.

Beim Boden-Biotest ist es erst am Ende der vier Tage möglich, eine Bestimmung der Algendichte im Substrat vorzunehmen. Die Zellzahlzählung eines Teils des Bodens in den Kavitäten alle 24 h würde zu stark in den Biotest eingreifen und das Wachstum der Algen beeinflussen. Aus diesem Grund konnten keine Wachstumskurven über alle vier Tage erstellt werden.

Darstellung der Ergebnisse für den Gel- und Boden-Biotest


Fußnoten:

<1>

SAS® ist eingetragenes Warenzeichen von SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA


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Wed Aug 7 11:00:41 2002