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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1 Isolierte Bodenalgen

In dieser Arbeit wurden Algen aus unbelasteten und belasteten Böden isoliert.

Tab. 10: Algen, die in die Stammsammlung aufgenommen werden konnten

Isolierungscode		Isolierungsort	Klasse		Gattung, Art
	Ge 2	Gemüsebeet, BBA		Ulvophyceae		Trebouxia cf. aggregata
	Ge 3	„		Chlorophyceae		Oocystis cf. minuta
	Ge 4	„		Chlorophyceae		Oocystis cf. minuta
	Ge 7,1	„		Xanthophyceae		cf. Pleurochloris
	Ge 7,2	„		Xanthophyceae		cf. Pleurochloris
	Ge 10	„		Chlamydophyceae		Chlamydomonas spec.
	K 0	„		Chlamydophyceae		Cystomonas spec.
	K 3	Erdbeerbeet BBA		Xanthophyceae		Xanthonema tribonematoides
	MEA 7	„		Chlamydophyceae		Chlamydomonas noctigama
	K ½	Schwermetallv. BBA		Chlorophyceae		Chlorella minutissima
	V1L2	„		Xanthophyceae		Xanthonema solidum
	V1L9	„		Charophyceae		Stichococcus bacillaris
	Hidd 1	Hiddensee, Steilküste		Chlorophyceae		Chlorella vulgaris
	Hidd 4	„		Chlorophyceae		Chlorella luteoviridis
	Hidd 5	„		Chlorophyceae		Chlorella vulgaris
	Hidd 10	„		Chlamydophyceae		Chlorococcum spec.
	Hidd 11	„		Charophyceae		Stichococcus bacillaris
	Hidd 13	„		Chlamydophyceae		Chlamydomonas spec.
	Hidd 14	„		Chlorophyceae		Oocystis cf. asymmetrica
	Hidd 15	„		Chlamydophyceae		Chlorococcum spec.
	Vilm 1,1	Insel Vilm, Wald		Charophyceae		Stichoccocus bacillaris
	Vilm 1,2	„		Chlorophyceae		Coccomyxa spec.
	Vilm 2,2	„		Charophyceae		Stichococcus minutus
	Vilm 3,1	„		Chlorophyceae		Chlorella minutissima
	Vilm 3,4	„		Charophyceae		Stichoccocus minutus
	Vilm 3,5	„		Chlorophyceae		Coccomyxa spec.
	Darß 1,23	Darßer Ort		Chlorophyceae		Coccomyxa cf. confluens
	Darß 2,20	„		Chlamydophyceae		Chlamydomonas spec.
	Darß 4,1	„		Xanthophyceae		Xanthonema spec.
	Darß 4,3	„		Charophyceae		Stichoccocus bacillaris
	Darß 6/1/2	„		Charophyceae		Klebsormidium flaccidum
	Darß 6/1/8	„		Charophyceae		Xanthonema montanum
	Darß 6/1/9	„		Charophyceae		Stichoccocus bacillaris
	Darß 6/1/11	„		Chlorophyceae		Coccomyxa spec.
	Darß 6/1/12	„ „		Xanthophyceae		Xanthonema solidum

Diese wurden bestimmt und in eine Stammsammlung aufgenommen. Die Zuordnung der Algen zu den Klassen (Tab. 10, S. 41) wurde nach Ettl & Gärtner (1995) durchgeführt. Nicht alle Algen konnten bis zur unialgalen Kultur, die bakterienfrei ist, aufgearbeitet werden. Manche Algen – insbesondere Kieselalgen – gingen nach dem zweiten oder dritten Überimpfen auf neue BBM-Agarplatten ein. Insgesamt wurden aus den verschiedenen Isolierungsversuchen 98 Algen isoliert. Davon wurden 35 zu Reinkulturen aufgearbeitet, und 18 Bodenalgen konnten bis zur Art bestimmt werden. Bei fünf Algen war die Bestimmung der Art unsicher. Von den isolierten Algen wurden fünf als Biotestorganismen ausgewählt (s. Tab. 11, S. 47).

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3.1.1 Algenabundanzen in den schwermetallhaltigen Böden

In Abb. 3 a) und b) (s. S. 43) sind die Ergebnisse des Schwermetallversuches von 1995 mit den Algenabundanzen für die Bodentiefe von 0 cm bis 1 cm und 0 cm bis 5 cm in Abhängigkeit von der Schwermetallbelastung der Parzellen aufgeführt. Es sind die Mittelwerte aus je zwei analysierten Parzellen (s. Tab. 4, S. 27) pro Konzentrationsstufe angegeben. Diese betrugen für die erste Cadmiumkonzentrationsstufe (Cd I) 43,1 mg/kg TS Boden, für die zweite (Cd II) 175,0 mg/kg TS Boden, für die erste Bleikonzentrationsstufe (Pb I) 928,0 mg/kg TS Boden und für die zweite (Pb II) 3 609,5 mg/kg TS Boden.

In den mit Cadmium belasteten Böden war die Gesamtalgenpopulation am höchsten und in den mit Blei belasteten Böden am niedrigsten (s. Fototafel 3, Bild 1 bis 3, S. 45). Die statistischen Untersuchungen zum Schwermetallversuch von 1995 ergaben folgende Resultate:

Diejenige für 1995 mittels Varianzanalyse (Signifikanzniveau 5 ) zeigte, daß die koloniebildenden Einheiten der Gesamtalgenpopulation (Abb. 3 a und 3 b) sich in den unterschiedlichen schwermetallhaltigen Böden signifikant voneinander unterschieden. Mittels Dunett-Test (Signifikanzniveau 5 ) wurde berechnet, daß die Böden Cd I zur Kontrolle, Cd II zur Kontrolle und Pb II zur Kontrolle eine signifikant niedrigere Algendichte aufwiesen. Diese Aussagen trafen sowohl für die Tiefe von 0 cm bis 1 cm sowie auch für 0 cm bis 5 cm zu.Im Schwermetallversuch 1996 (Bodentiefe: 0 cm bis 5 cm) wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. In Abb. 4 (s. S. 44) ist eine deutliche Hemmung der Gesamtalgenzahl in den mit Blei belasteten Böden zu erkennen. Allerdings war die höhere Gesamtalgenzahl bei den mit Cadmium belasteten Böden nicht so ausgeprägt, wie dies 1995 der Fall war. Die statistische Auswertung mittels Dunett-Test (Signifikanzniveau 5 ) zeigte, daß für Pb II wieder eine signifikant geringere Algendichte gegenüber der Kontrolle vorlag. Für Pb I, Cd I und Cd II konnte auf dem Niveau von 5 kein signifikanter Unterschied zur Kontrolle ermittelt werden. Die statistische Auswertung für die Abundanzen der Cyanobakterien und Kieselalgen wurde weder für 1995 noch 1996 durchgeführt. Die Zahl der koloniebildenden Einheiten war zu gering und die Standardabweichung zu hoch (s. Tab. A5 und A6, S. 118 bis 120).

Der Vergleich im Schwermetallversuch von 1995 in Abb. 3 a) und b) machte die quantitative Algenverteilung in den oberen 5 cm des Bodens deutlich. Es ist die Abnahme der Algenabundanzen für alle Gruppen in den Bodenproben aus 0 cm bis 5 cm (a) gegenüber 0 cm bis 1 cm (b) zu erkennen.

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Abb. 3 a) Algenabundanzen des Schwermetallversuches von 1995 mit vier Kontrollparzellen und je zwei Parzellen pro Konzentrationsstufe und Schwermetall (gemessene Cadmium- und Bleigesamtgehalte), Bodentiefen a) 0 cm bis 1 cm und b) 0 cm bis 5 cm, Gesamtalgenzahl (alle eukaryontischen Algen). Die Kieselalgen sind in der Gesamtalgenzahl enthalten und zusätzlich separat dargestellt. K l und K r (Kontrollparzellen im linken bzw. rechten Bereich des Versuchsfeldes).

Abb. 3 b) Algenabundanzen des Schwermetallversuches von 1995 mit vier Kontrollparzellen und je zwei Parzellen pro Konzentrationsstufe und Schwermetall (gemessene Cadmium- und Bleigesamtgehalte), Bodentiefen a) 0 cm bis 1 cm und b) 0 cm bis 5 cm, Gesamtalgenzahl (alle eukaryontischen Algen). Die Kieselalgen sind in der Gesamtalgenzahl enthalten und zusätzlich separat dargestellt. K l und K r (Kontrollparzellen im linken bzw. rechten Bereich des Versuchsfeldes).

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Abb. 4: Algenabundanzen des Schwermetallversuches von 1996 mit vier Kontrollparzellen und je vier Parzellen pro Konzentrationsstufe und
Schwermetall (Cadmium und Blei); beprobte Bodentiefe: 0 cm bis 5 cm, Gesamtalgenzahl (alle eukaryontischen Algen)

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Fototafel 3 Bild 1: Versuchsparzellen, die hoch mit Blei belastet waren.

Fototafel 3 Bild 2: Einstiche des Bodenstechers in einer hoch mit Blei belasteten Parzelle. Es war kein grünlicher Biofilm auf dem Boden zu erkennen.

Fototafel 3 Bild 3: Einstiche des Bodenstechers in einer hoch mit Cadmium belasteten Parzelle. Es war ein grünlicher Biofilm erkennbar.

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3.1.2 Algenabundanzen in Böden vom Darßer Ort

Beim Probenahmestandort D 5 konnten keine Kieselalgen und nur in einem Fall eine geringe Zahl an Cyanobakterien isoliert werden (s. Abb. 5 und Tab. A9, S. 123). Beim Probenahmestandort D 6 wurde eine geringe Anzahl an Kieselalgen in zwei Proben festgestellt und eine höhere Anzahl an Cyanobakterien. Die Abundanzen der Gesamtalgen wiesen in beiden Böden Schwankungen um das ca. 10fache auf.

Es wurden mehrere Algen isoliert und Reinkulturen angelegt. Drei der fünf Bodenalgen (s. Tab. 11, S. 47), die für die Biotests genutzt wurden, stammten von den unbelasteten Böden des Darßer Ortes.

Abb. 5: Algenabundanzen von zwei Probenahmeorten (D 5 und D 6) vom Darßer Ort. Es wurden je 8 Einzelproben im Abstand von 20 cm genommen. Beprobte Bodentiefe: 0 cm bis 5 cm, Gesamtalgenzahl (alle eukaryontischen Algen). Kieselalgen zusätzlich separat dargestellt.

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3.2 Biotestsystem

3.2.1 Auswahl der Biotestorganismen für die Biotests

Aus der durch die Isolierungsversuche entstandenen Stammsammlung wurden Algen ausgewählt (s. Tab. 11), die aus unbelasteten Böden vom Darßer Ort und der BBA stammten.

Tab.  11: Algen, die als Biotestorganismen im Gel-Biotest und Boden-Biotest eingesetzt wurden. Graue Schrift: Biotestalgen (s. Fototafel 4, S. 48 bis 49) des Boden-Biotests und des Gel-Biotests; schwarze Schrift: Biotestalgen, die nur im Gel-Biotest eingesetzt wurden.

Algenart/Isolierungs-code und -ort	Abteilung/Klasse	Zellmorphologie	Vermehrung	Vorkommen
Xanthonema tribonematoides (Pascher) Silva 1979 K3 (Erdbeerbeet, BBA)	Chrysophyta Xanthophyceae	Großzellige (Breite 12-15 µm, Länge 18-30 µm), kurzfädige Alge	Zoosporen, Dauerstadien in Form von Zysten oder Hypnoblasten	auf feuchten Böden
Klebsormidium flaccidum (Kützing) Silvia, Mattox & Blackwell 1972 Darß 6/1/2 (Darßer Ort)	Chlorophyta Charophyceae	Zelle mittlerer Größe (Breite 5-8 µm, Länge 15-24 µm), bildet beständige Fäden	Fortpflanzung durch Zoosporen (wenige), Aplanosporen, Hypnoblasten und Fadenzerfall	Böden, weit verbreitet
Stichococcus bacillaris Nägeli 1849 Darß 4,3 (Darßer Ort)	Chlorophyta Charophyceae	sehr kleine Alge (Breite 2-2,5 µm, Länge 3,5-6,6, selten 12 µm), bildet ver-schleimende Kurzfäden	vegetative Teilung und Fragmentierung der Zellfäden	weit verbreitete, sehr häufige Alge in Böden, auf Gestein, Rinden etc.
Xanthonema montanum (Vischer) Silva 1979 Darß 6/1/8 (Darßer Ort)	Chrysophyta Xanthophyceae	Zelle mittlerer Größe (Breite 5 µm, Länge 7-10 µm), bildet kurze leicht zerfallende Fäden	Zoosporen oder Aplanosporen (unbewegliche Sporen)	Böden, weit verbreitet
Chlamydomonas noctigama Korschikoff in Pascher 1927 MEA 7 (Erdbeerbeet)	Chlorophyta Chlamydophyceae	größere Zelle (Breite 5-20 µm, Länge 8-22 µm), einzellig	intensive Zoosporenbildung, Hypnoblasten	Böden
Scenedesmus subspicatus Chodat 1926 ScSu (SAG 86 81)	Chlorophyta Chlorophyceae	Zelle mittlerer Größe (Breite 3-5 µm, Länge 5-8 µm), bildet 2-4zellige Zönobien	Autosporenbildung	Süßwasseralge des DIN 28692, bisher nicht aus Böden isoliert, weit verbreitete Süßwasseralge

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Fototafel 4 Bild 1: Xanthonema tribonematoides, Vergrößerung 630fach, Differential-Interferenzkontrast

Fototafel 4 Bild 2: Klebsormidium flaccidum, Vergrößerung 630fach, Differential-Interferenzkontrast

Fototafel 4 Bild 3: Stichococcus bacillaris, Vergrößerung 1 000fach, Phasenkontrast

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Fototafel 4 Bild 4: Xanthonema montanum, Vergrößerung 630fach, Differential-Interferenzkontrast

Fototafel 4 Bild 5: Chlamydomonas noctigama,Vergrößerung 630fach, Differential-Interferenzkontrast

Fototafel 4 Bild 6: Scenedesmus subspicatus, Vergrößerung 1 000fach, Phasenkontrast

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• möglichst unterschiedliche Gattungs- und Klassenzugehörigkeit
• Unterschiede in Zellgröße, Wachstumsgeschwindigkeit, Vermehrungsart
• Möglichkeit der Kultivierung der Algenart ohne bakterielle Kontaminationen
• photometrisch meßbares Wachstum innerhalb weniger Tage.

Die grau geschriebenen Algen wurden sowohl im Gel-Biotest als auch im Boden-Biotest eingesetzt. Die schwarz geschriebenen Algen wurden nur im Gel-Biotest benutzt. Diese beiden Arten waren aufgrund ihrer Zellgröße nicht für die Zellzahlzählung in einer Boden-Suspension mit dem Mikroskop geeignet. Im Falle der Gattung Xanthonema wurden zwei Arten in die Biotestsysteme integriert, da sich diese Arten besonders in ihrer Zellgröße unterschieden. Xanthonema tribonematoides gehörte zu einer der wenigen großzelligen Bodenalgenarten.

Die Alge Scenedesmus subspicatus wird im OECD 201 Biotest eingesetzt. Sie wurde in beide Biotestsysteme integriert, um ihre Wachstumsreaktion mit den Reaktionen der Bodenalgen in dem entwickelten Biotestsystem auf verschiedene Testsubstanzen vergleichen zu können.

3.2.2 Wuchsverhalten der ausgewählten Biotestorganismen

Abb. 6 zeigt die Wachstumskurven der fünf Bodenalgen und von Scenedesmus subspicatus innerhalb von 96 h. Die Daten und die dazugehörigen Standardabweichungen sind in Tab. A16 (s. S. 129) aufgeführt. Der Variationskoeffizient der Wiederholungen innerhalb eines Versuches betrug bei fast allen Algen maximal 5 bis 10 . Die Optische Dichte wurde mit einem 800 nm Filter gemessen.

Um das Mikrotiterplattenphotometer zur Bestimmung des Zellwachstums einsetzen zu können, mußte für alle Algen geprüft werden, ob eine annähernd lineare Beziehung zwischen den gemessenen OD-Werten und der Zelldichte in der Zellsuspension innerhalb der ersten 96 h bestand. Dies war bei allen Algen der Fall (s. Tab. A10 bis A15, S. 126 bis 128). Es kam bei den ausgewählten Algen innerhalb der 96 h zu keiner stärkeren Aggregation der Zellen oder Bildung einer Kahmhaut, die die photometrische Messung verhindert hätten.

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Abb. 6: Wachstumskurven der verwendeten Biotestalgen innerhalb der ersten 96 h

3.2.3 Gel-Biotest

Standardisierung des Gel-Biotests

Der Biotest wurde soweit standardisiert, daß bei vier zeitlich getrennt durchgeführten Wiederholungsversuchen, die ebenfalls auf jeweils vier Parallelen pro Konzentration basierten, der Variationskoeffizient der vier Wiederholungsversuche bei allen Algen um 20  und in wenigen Ausnahmen bei 30 lag. Dagegen war der Variationskoeffizient der vier Parallelen innerhalb eines Versuches geringer und lag durchschnittlich bei 5  bis 10  (s. Tab. A17.1 bis A17.25, S. 130 bis 137).

Beispielhaft sind in Abb. 7 das prozentuale Wachstum der Testalgen bei verschiedenen Cadmiumkonzentrationen und die Standardabweichung von vier zeitlich versetzten Wiederholungsversuchen dargestellt. Bei einigen Algen ist ein Hormesis-Effekt erkennbar.

Mit Hormesis-Effekt (s. Kap. 4.2.2, S. 61) bezeichnet man das Phänomen, daß Organismen bei geringen Konzentrationen eines toxischen Stoffes eine Wachstumsstimulation aufweisen (Paterson & Wright 1987).

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Abb. 7: Algenwachstum der Testalgenin Prozent gegenüber der Kontrolle (Kontrolle = 100 %, nicht dargestellt) im Gel-Biotest nach 96 h mit Standardabweichung bei unterschiedlichen Cadmiumkonzentrationen.

	0,0156	0,0313	0,0625	0,1250	0,25	0,50	1,00	2,00	4,00
Cadmium in mg/l OECD-Medium

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Im Gel-Biotest reagierten die Algenarten in ihrem Wachstum unterschiedlich auf Cadmium und Isoproturon (Tab. 12).

Tab.  12: EC ₁₀ -, EC ₅₀ -Werte (96 h) und 95 -Konfidenzintervalle (KI) des Gel-Biotests für Cadmium aus vier Wiederholungsversuchen und Isoproturon aus einem Versuch mit vier Wiederholungen in mg/l OECD-Medium, nominal

Gattung, Art	Cadmium EC 10 und KI		Cadmium EC 50 und KI		Isoproturon EC 10 und KI		Isoproturon EC 50 und KI
Scenedesmus subspicatus	0,03	0,02 0,05	0,44	0,36 0,53	0,07	0,05 0,08	0,42	0,34 0,54
Xanthonema tribonematoides	0,25	0,15 0,36	4,30	3,00 7,25	0,03	0,02 0,05	0,35	0,27 0,47
Stichococcus bacillaris	0,23	0,14 0,33	2,49	1,94 3,45	0,27	0,18 0,36	2,74	2,01 4,24
Klebsormidium flaccidum	0,003	0,001 0,006	0,33	0,24 0,46	0,02	0,01 0,03	0,84	0,57 1,47
Xanthonema montanum	0,13	0,11 0,26	8,06	4,69 17,97	0,10	0,08 0,12	0,49	0,42 0,59
Chlamydomonas noctigama	0,15	0,08 0,23	5,97	3,67 12,41	0,06	0,04 0,07	0,25	0,21 0,29

Beim Cadmium war Klebsormidium flaccidum am empfindlichsten und am unempfindlichsten Xanthonema tribonematoides bzw. beim EC₅₀ Xanthonema montanum. Der Unterschied zwischen den Algen betrug beim EC₁₀-Wert ca. Faktor 80 und beim EC₅₀-Wert ca. Faktor 25.

Beim Isoproturon lagen alle Algen in ihrer Empfindlichkeit, sowohl beim EC₁₀- als auch beim EC₅₀-Wert, relativ dicht beieinander. Die einzige Ausnahme stellte Stichococcus bacillaris dar, die um das 4-6fache unempfindlicher gegenüber Isoproturon war.

Gemessene pH-Wert-Abweichungen der verschiedenen OECD-Medienkonzentrationen mit Cadmiumchlorid und Isoproturon lagen weder zu Beginn noch am Ende des Biotests über 1,5.

3.2.4 Boden-Biotest

Standardisierung des Boden-Biotests

Der Boden-Biotest wurde soweit standardisiert, daß bei drei zeitlich getrennt durchgeführten Wiederholungsversuchen der Variationskoeffizient der mittleren Meßwerte bei allen Algen bis auf wenige Ausnahmen 5 bis 15 betrug. Aufgrund der Großzelligkeit von Xanthonema tribonematoides und der damit geringeren Zellzahl gegenüber den kleinzelligen Algen im Boden-Biotest waren die Abweichungen bei dieser Alge am größten (s. Abb. 8, S. 54). Bei Xanthonema montanum ist der Hormesis-Effekt erkennbar.

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Abb. 8: Algenwachstum in Prozentgegenüber der Kontrolle (Kontrolle = 100 , nicht dargestellt) im Boden-Biotest mit Standardabweichungnach 96 h bei unterschiedlichen Isoproturonkonzentrationen.

Ergebnisse für Cadmium und Isoproturon

Für Cadmium konnte bis zu einer Konzentration von 8,0 mg/kg OECD-Mediumbodengemisch bei keiner Alge eine Hemmung des Wachstums festgestellt werden. Deshalb konnte kein EC₁₀- oder EC₅₀-Wert berechnet werden. Aus diesem Grund sind in Tab. 13 (s. S. 55) nur die EC₁₀- und EC₅₀-Werte für Isoproturon dargestellt.

Für Isoproturon lagen für alle Algen, außer für Xanthonema tribonematoides, die EC₁₀-Werte um 0,04 mg/kg OECD-Mediumbodengemisch und die EC₅₀-Werte zwischen 0,35 und 0,92 mg/kg OECD-Mediumbodengemisch. Xanthonema tribonematoides hatte den niedrigsten EC₁₀- und EC₅₀-Wert.

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Tab. 13: EC10- und EC50-Werte (96 h) und 95 -Konfidenzintervalle (KI) des Boden-Biotests für Isoproturon in mg/kg OECD-Mediumbodengemisch, nominal.

Gattung, Art	Isoproturon EC 10 und KI		Isoproturon EC 50 und KI
Scenedesmus subspicatus	0,055	0,038 0,074	0,35	0,28 0,43
Xanthonema tribonematoides	0,005	0,002 0,011	0,21	0,14 0,29
Xanthonema montanum	0,034	0,013 0,066	0,92	0,65 1,32
Chlamydomonas noctigama	0,016	0,006 0,032	0,46	0,32 0,66

Gemessene pH-Wert-Abweichungen der OECD-Medienbodengemische mit unterschiedlichen Cadmiumchlorid- und Isoproturonkonzentrationen lagen weder zu Beginn noch am Ende der Biotests über 1,5.

Vergleich zwischen Gel- und Boden-Biotest

In Tab. 14 sind die Ergebnisse der EC₅₀-Werte der beiden Biotests des Biotestsystems dargestellt. Für Cadmium konnte im Boden-Biotest kein EC₅₀-Wert ermittelt werden, da bei einer Cadmiumkonzentration von 8,0 mg/kg OECD-Mediumbodengemisch keine Hemmung festgestellt werden konnte.

Tab.  14 : EC50-Werte des Gel- und Boden-Biotests für Cadmium und Isoproturon in mg/l OECD-Medium beim Gel-Biotest und in mg/kg OECD-Mediumbodengemisch beim Boden-Biotest; n. g. (nicht getestet).

Gattung, Art	Gel-Biotest Cadmium		Gel-Biotest Isoproturon		Boden-Biotest Isoproturon
Scenedesmus subspicatus		0,44		0,42		0,35
Xanthonema tribonematoides		4,30		0,35		0,21
Stichococcus bacillaris		2,49		2,74		n. g.
Klebsormidium flaccidum		0,33		0,84		n. g.
Xanthonema montanum		8,06		0,49		0,92
Chlamydomonas noctigama		5,97		0,25		0,46

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