Burhenne, Matthias: Biotestsystem mit Bodenalgen zur ökotoxikologischen Bewertung von Schwermetallen und Pflanzenschutzmitteln am Beispiel von Cadmium und Isoproturon

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Kapitel 4. Diskussion

4.1 Isolierung von Bodenalgen

Die in dieser Untersuchung durchgeführte Version der Agarplattenmethode wurde von Stellmacher (1993) entwickelt und zeichnete sich dadurch aus, daß die Erdsuspension durch einen Goldfilter (Kaffeedauerfilter) gegeben wurde. Hierdurch konnte erreicht werden, daß durch die schmale Passage durch die Schlitze (Schlitzgröße: 2 900 µm x100 µm) eine verstärkte Loslösung der Algen von den Erdpartikeln stattfand. Je höher der Bestandteil an grobkörnigen Partikeln oder organischem Material war, desto größer war die Gefahr, daß Algen in dem im Filter verbleibenden Material hängenblieben. Durch Nachspülen des im Filter verbleibenden Materials konnte ein Großteil der Algen noch ausgewaschen werden. Ein seitlich außen am Filter angelegter Aluminiumfolienstreifen erhöhte durch den engen Kontakt zur Filterwand die Durchflußgeschwindigkeit der Suspension mit den Algen. Die Bestimmung der Algendichte fand statt, indem die gefilterte Bodensuspension auf Agarplatten ausgestrichen und die Koloniezahl ermittelt oder die Bodensuspension in eine Zählkammer gegeben und mittels Mikroskop die Zelldichte bestimmt wurde.

Die Untersuchungen zeigten, daß trotz behutsamen Ausplattierens der Bodensuspension eine Zerstörung von größeren Bodenalgenzellen oder Zoosporenmutterzellen nicht ausgeschlossen werden konnte. Insbesondere die Freisetzung von Zoosporen kann aber zu einem ungewollten Einfluß auf die Anzahl von koloniebildenden Einheiten führen. Aus diesem Grund wurde im Laufe der Arbeit der bei der Agarplattenmethode standardmäßig genutzte Arbeitsschritt der Ausplattierung der Bodensuspension mittels Drigalskispatel aufgegeben. Statt dessen wurde die aufgebrachte Menge der Bodenlösung auf 1 000 µl erhöht. Sie wurde durch Schwenken auf der Petrischale verteilt und anschließend unter der Clean Bench ca. 20 min leicht getrocknet (Neuhaus et al. 1997), um einen optimalen Feuchtigkeitszustand des Agars für ein gutes Koloniewachstum zu erhalten. In vorliegender Arbeit fand nach ca. drei Wochen Kultivierung keine Veränderung der Koloniezahl mehr statt, so daß diese mit Hilfe einer Stereolupe festgestellt werden konnte. Zu diesem Zeitpunkt waren kleine Kolonien mit einer Stereolupe gut zu erkennen, aber es bildeten sich auch noch keine Tochterkolonien, die die Koloniezahl der aus den Böden stammenden Algen und Algenaggregate hätten unnatürlich erhöhen können.

Wie die Ergebnisse (s. Tab. 10, S. 41) zeigen, konnten mit dieser Methode verschiedene Arten von Bodenalgen isoliert werden. Die Standardabweichung für die ermittelten Gesamtalgendichten in jeweils vier Bodenparzellen (s. Tab. A4 und A6, S. 116 und 120) mit nahezu gleichen Bodenparameterwerten (s. Tab. A1, A2 und A3, S. 113 bis 115) war so gering, daß signifikante Unterschiede in der mittleren Algendichte in unbelasteten und belasteten (Blei und Cadmium) Böden ermittelt werden konnten.

In dieser Arbeit war es nicht möglich, alle Algen bei einer Koloniezahl von ca. 150 bis 1 500 pro Petrischale in weitere Gruppen oder Gattungen zu differenzieren. Nur Kieselalgen


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konnten aufgrund ihrer bräunlichen Koloniefärbung ohne aufwendige mikroskopische Untersuchung als Gruppe erkannt und extra gezählt werden. Die Koloniezahlen konnten auf der anderen Seite auch nicht verringert werden, da sich im Schwermetallversuch 1995 und 1996 (s. Tab. A4 und A6, S. 116 und 120) zeigte, daß die Anzahl der Cyanobakterien und Kieselalgen mit 0 bis 50 koloniebildenden Einheiten zu gering war und die Standardabweichung zu hoch, um Aussagen über ihre Abundanzen in Abhängigkeit von der Bodenbelastung machen zu können.

Die Vorteile der Agarplattentechnik sind, daß sowohl Aussagen über die Abundanzen von Algen in Böden gewonnen werden können, als auch Algenmaterial zur weiteren Isolierung und Gewinnung von Reinkulturen. Nur mit Hilfe von unialgalen Kulturen einzelner Arten ist es möglich, eine genaue Bestimmung der jeweiligen Art durchzuführen.

Der Nachteil liegt darin, daß eine Auswertung des Isolierungsversuches erst nach drei bis vier Wochen möglich ist. Des weiteren kann bei diesem Verfahren nie eine genaue Aussage über die real im Boden vorkommende Organismenanzahl getroffen werden (Mückenhausen 1974), denn es treten zwei Problembereiche auf:

In dieser Arbeit bewährte sich das BBM-Medium (Bischoff 1963) sowohl zur Isolierung von Algen aus Böden als auch zur Stammhaltung.

Das Problem der real im Boden vorkommenden Organismen gegenüber den isolierten Organismen gibt es bei allen Bodenmikroorganismengruppen. Aufgrund der Bodenstruktur ist es fast immer notwendig, Bodenlösungen und Verdünnungen herzustellen, die dann auf verschiedene Medien aufgebracht werden. Man zählt dann die gebildeten Bakterien-, Pilz- und Algenkolonien und rechnet entsprechend der Verdünnungen die Abundanzen für die jeweilige Organismengruppe aus. Für die Bodenbakterien gibt es Untersuchungen, in denen von den mittels Fluoreszenzmikroskopie gezählten Bakterien in Böden nur 0,1 bis 0,5 auf verschiedenen Kulturmedien isoliert werden konnten (Torsvik et al. 1990). Auch für die Bodenalgen ist die Bestimmung der Gesamtalgenabundanz über eine einfache auflichtfluoreszenzmikroskopische Technik möglich, mit welcher die Algen als rötlich leuchtende Zellen sichtbar gemacht und direkt in der Bodenlösung gezählt werden können (Oesterreicher 1988). Mit Hilfe dieses Verfahrens ist erkennbar, inwieweit die Koloniezahlen auf dem Agar die Algendichte im Boden wiedergeben. Für Bodenalgen stellte Oesterreicher (1988) mit Böden aus Skipisten oberhalb der Waldgrenze in einem Methodenvergleich der auflichtfluoreszenzmikroskopischen Technik und der Agarplattenmethode fest, daß ca. 90  der durch Direktzählung mit Auflichtfluoreszenz gezählten Algen mit Hilfe des BBM-Mediums isoliert werden konnten. Allerdings arbeitete Oesterreicher bei der Auswertung der kultivierten Agarplattenkulturen ebenfalls mit einem Auflichtfluoreszenzmikroskop, um auch


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sehr kleine Algenkolonien zu erfassen. In Arbeiten über die Erfassung der Abundanz von Bodenalgen (Neuhaus et al. 1997), wie auch in der vorliegenden, wurde die Auszählung mit einer Stereolupe ohne Auflichtfluoreszenz durchgeführt, und Musset (1994) zählte die Kolonien ohne Vergrößerungshilfsmittel. Aus diesen Gründen wäre es denkbar, daß ein geringerer Anteil an sehr kleinen Kolonien in diesen Arbeiten nicht mitgezählt wurde.

Zur Direktzählung mittels Auflichtfluoreszenzmikroskopie ist anzumerken, daß auch hier die gezählte Zellzahl nicht unbedingt mit der real im Boden vorkommenden Algenzahl gleichgesetzt werden kann. Gerade bei Dauerstadien (z. B. Hypnoblasten, Hypnosporen und Hypnozygoten) von Algen kann der Chlorophyllgehalt stark reduziert sein, so daß dieser auch mit Hilfe der Auflichtfluoreszenzmikroskopie nicht mehr erfaßt wird. Damit können auch die mit dieser Methode gewonnenen Daten nicht mit der real im Boden vorkommenden Algenpopulation gleichgesetzt werden. Des weiteren ist diese Methode auch nur für die Bestimmung von Zelldichten geeignet und nicht von Arten, denn eine Isolierung einzelner Algen vom Objektträger zur Gewinnung von Reinkulturen und deren Bestimmung ist kaum möglich.

Letztlich können die mit Hilfe der Agarplattenmethode ermittelten Algendichten nicht die real im Boden existierende Algendichte abbilden. Meistens wird diese höher sein. Wie Untersuchungen von Oesterreicher (1988) und Stellmacher (1993) zeigten, kann davon ausgegangen werden, daß mit Hilfe der Agarplattenmethode bei einer Mehrzahl der Böden mindestens 60 der vorkommenden Algen isoliert werden.

Die in der Mikrobiologie weit verbreitete Methode des Verdünnungsausstriches auf einer Agarplatte bewährte sich auch für Bodenalgen. Allerdings mußte sehr frühzeitig Algenmaterial aus winzigen Kolonien abgenommen und auf frische Agarplatten gesetzt werden, bevor diese von Pilzen oder Bakterienkolonien überwachsen wurden. In einigen Fällen mußte dieser Arbeitsschritt mehrmals durchgeführt werden, und es dauerte mehrere Monate, bis eine Klonkultur ohne Verunreinigung durch Bakterien und Pilze erreicht war. Erst dann konnte die mikroskopische Bestimmung der Kultur durchgeführt werden.

Das Hauptziel der Isolierungsversuche war es, unialgale Kulturen von verschiedenen Bodenalgenarten zu erhalten, für die Informationen darüber vorliegen, ob die Böden, in denen sie vorkamen, unbelastet waren oder ob sie z. B. Schwermetallbelastungen aufwiesen. Alternativ hätten Algen aus verschiedenen Stammsammlungen eingesetzt werden können. Allerdings waren in den verschiedenen Stammsammlungen nur kurze Angaben über die Isolierungsorte und keine Informationen über die Belastungssituationen angegeben. Aus diesem Grund wurden im Laufe dieser Arbeit aus einem belasteten Standort und fünf unbelasteten Standorten (Schwermetallversuchsfläche, Darßer Ort, Erdbeerbeet- und Gemüsebeetfläche BBA Berlin, Insel Vilm, Insel Hiddensee) Algen isoliert, die in Tab. 10 (s. S. 41) aufgeführt sind. Bei den aus unbelasteten Böden isolierten Bodenalgen konnte mit großer Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen werden, daß sie keine Resistenzen oder Toleranzen gegenüber Schwermetallen und anderen Schadstoffen entwickelten. Damit waren diese Algen als Organismen für die hier beschriebenen Biotests besonders geeignet.


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4.2 Algen in schwermetallhaltigen Böden

4.2.1 Bodenparameter

1995 wurden die Schwermetallgehalte nur für jeweils 2 Parzellen erfaßt (s. Tab. 2, S. 26) und 1996 alle vier Parzellen einer Belastungsstufe auf ihre Algenabundanzen hin untersucht. Es kann aber für die jeweils zwei nicht bodenanalytisch untersuchten Parzellen einer Belastungsstufe davon ausgegangen werden, daß sie ungefähr die gleichen Schwermetallgehalte aufweisen, da bei der Anlage der Versuchsfläche alle Parzellen einer Schwermetallbelastungsstufe mit den jeweils gleichen Konzentrationen eines Schwermetalls belastet wurden.

Die gemessenen Belastungen der Schwermetallversuchsparzellen mit Blei lagen mit ca. 930 mg/kg TS Boden und 3 600 mg/kg TS Boden um ein 9- bis 35faches und mit Cadmium bei 40 mg/kg TS Boden und 170 mg/kg TS Boden um ein 30- bis 110fachesüber den Grenzwerten der Klärschlammverordnung für Böden. Diese Grenzwerte der Klärschlammverordnung (1997) für die Aufbringung von Klärschlämmen besagen, daß ab einem Bleiwert von 100,0 mg/kg TS Boden und einem Cadmiumwert von 1,5 mg/kg TS Boden (bzw. 1,0 mg/kg TS Boden bei leichten Böden mit pH-Wert von 5-6) in den landwirtschaftlich oder gärtnerisch genutzten Böden Klärschlämme nicht mehr ausgebracht werden dürfen.

Seit dem 24. März 1998 ist das Bundes-Bodenschutzgesetz (1998) und seit dem 16. Juli 1999 auch die Bundes-Bodenschutz- und Altlastenverordnung (1999) in Kraft getreten, die im Anhang 2 Maßnahmen-, Prüf- und Vorsorgewerte enthält. Nach § 8 des Bundes-Bodenschutzgesetzes besagt der Vorsorgewert, daß bei dessen Überschreitung unter Berücksichtigung von geogenen oder großflächig siedlungsbedingten Schadstoffgehalten in der Regel davon auszugehen ist, daß die Besorgnis einer schädlichen Bodenveränderung besteht. Bei Überschreitung des Prüfwertes muß eine einzelfallbezogene Prüfung durchgeführt werden, um festzustellen, ob eine schädliche Bodenveränderung oder Altlast vorliegt. Wird der Maßnahmenwert überschritten, muß unter Berücksichtigung der jeweiligen Bodennutzung von einer schädlichen Bodenveränderung ausgegangen, und es müssen entsprechende Maßnahmen ergriffen werden.

Vergleicht man die Bleibelastungen von ca. 930 mg/kg TS Boden und 3 600 mg/kg TS Boden mit dem Prüfwert für Blei, der 5 mg/kg TS Boden beträgt, so sind die gemessenen Belastungen um den Faktor 180 bis 720 höher. Die Belastung mit Cadmium von 40 mg/kg TS Boden und 170 mg/kg TS Boden beträgt sogar ein 400- bis 1 700faches des Maßnahmenwertes für Cadmium, der bei 0,1 mg/kg TS Boden bzw. 0,04 mg/kg TS Boden bei Brotweizenanbau oder stark Cadmium anreichernden Gemüsearten liegt. Diese Werte gelten für den Schadstoffübergang Boden – Nutzpflanze für Ackerbauflächen und in Nutzgärten im Hinblick auf die Pflanzenqualität. Für den Schadstoffübergang Boden – Nutzpflanze auf Grünlandflächen im Hinblick auf die Pflanzenqualität gibt es einen Maßnahmenwert, der für Cadmium 20 mg/kg TS Boden und für Blei 1 200 mg/kg TS Boden beträgt. Die Vorsorgewerte für Cadmium sind für die Bodenart Ton 1,5 mg/kg TS Boden, für die Bodenart


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Lehm/Schluff 1,0 mg/kg TS Boden und für die Bodenart Sand 0,4 mg/kg TS Boden. In derselben Reihenfolge sind die Werte für Blei 100, 70 und 40 mg/kg TS Boden.

Die Kontrollböden der Schwermetallversuchsanlage wiesen in den oberen 5 cm ebenfalls einen erhöhten Cadmiumgehalt auf. Er lag mit ca. 6 mg/kg TS Boden um das ca. 4fache über dem Grenzwert, der für Böden, auf denen Klärschlämme aufgebracht werden dürfen, festgelegt ist, und über das 60fache über dem Maßnahmenwert der Bodenschutz- und Altlastenverordnung für den Schadstoffübergang Boden – Nutzpflanze auf Ackerbauflächen und in Nutzgärten.

Die Bleikonzentrationen für einen unbelasteten Boden liegen bei durchschnittlich 2,0 bis 300,0 mg/kg TS Boden und für Cadmium bei 0,06 bis 1,00 mg/kg TS Boden (Koch 1995). Eigene Untersuchungen (Burhenne 1994, Burhenne et al. 1997) zeigen, daß auf Rieselfeldböden im Süden vor Berlin Belastungen mit Blei von 100 bis 1 300 mg/kg TS Boden und mit Cadmium von 10 bis 30 mg/kg TS Boden vorkommen.

Mittels Calciumchloridextraktion erhält man einen Überblick, welche Konzentrationen an Schadstoffen und Nährstoffen für die Bodenorganismen verfügbar sein könnten (Köster & Merkel 1982, Hornburg & Brümmer 1989, Merkel 1996). Damit werden saure Bereiche im Boden im unmittelbaren Umfeld von Wurzeln (Marschner 1986, Gisi et al. 1990) oder Exoenzyme von Mikroorganismen nachgeahmt. Je nach Fähigkeiten der Organismen, Enzyme in ihre Umgebung abzugeben, und je nach den Hauptverbreitungsgebieten der Organismen im Boden (z. B. Rhizosphärenbereich) können sich die verfügbaren Konzentrationen der unterschiedlichen Stoffe auch in höheren oder niedrigeren Konzentrationenbefinden. Besonders auffällig ist bei der Calciumchloridextraktion in Tab. 9 (s. S. 35) die hohe Löslichkeit des Cadmiums von 20 mg/kg TS Boden. Blei zeigt in diesen Untersuchungen eine wesentlich geringere Löslichkeit trotz Gesamtgehalten bis zu 3 800 mg/kg TS Boden; sie liegt bei maximal 1,3 mg/kg TS Boden. Diese Ergebnisse bestätigen andere Untersuchungen (Alloway 1995, Heymann & Wiechmann 1996), die feststellen, daß die Verfügbarkeit und Mobilität von Cadmium in Böden im Vergleich zu anderen Schwermetallen (z. B. Blei und Kupfer) hoch ist. Mit abnehmendem pH-Wert nehmen die Mobilität und Verfügbarkeit von Cadmium in der Regel zu (Schulz & Mayer 1987, Hofer 1993).

4.2.2 Algenabundanzen

Ziel dieses Versuches war es, die Algenabundanzen in mit Blei und Cadmium belasteten Böden zu untersuchen und damit Erkenntnisse über das Wachstum der Algen in agrarwirtschaftlich genutzten schwermetallbelasteten und unbelasteten Böden unter Freilandbedingungen zu gewinnen.

Die statistische Auswertung (Dunett-Test, Signifikanzniveau 5 ) der Ergebnisse (s. S. 42) im Schwermetallversuch von 1995 zeigt, daß hoch mit Blei (Pb II = 3 609,5 mg/kg TS Boden) belastete Böden eine geringere Gesamtalgendichte aufweisen und hoch mit Cadmium (Cd II = 175 mg/kg TS Boden) belastete Böden eine höhere Gesamtalgendichte im Vergleich zur


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Kontrolle. 1996 wurde ebenfalls eine signifikant geringere Algendichte in den hoch mit Blei belasteten Böden (nur Pb II) im Vergleich zur Kontrolle festgestellt. Ein offensichtlicher Unterschied zwischen den mit Cadmium belasteten Böden und der niedrigen Bleikonzentration (Pb I = 928,0 mg/kg TS Boden) zur Kontrolle konnte aufgrund der hohen Variabilitäten bei den Parallelen nicht statistisch gesichert werden. Abb. 4 (s. S. 44) zeigt, daß aber die Gesamtalgendichten bei dem hoch mit Cadmium belasteten Boden (Cd II) bei zwei Parallelen deutlich und bei einer Parallelen knapp über den Werten der Kontrolle liegen.

Eine Interpretationsmöglichkeit der Ergebnisse ist, daß Cadmium eine wachstumsfördernde Wirkung auf Algen haben könnte. Lee et al. (1995) beobachteten bei der Meereskieselalge Thalassiosira weissflogii, daß durch eine Reduzierung des Zinkgehaltes in dem Kulturmedium und Zugabe von geringen Mengen an Cadmium eine Erhöhung des Wachstums erzeugt wurde. Aufgrund dieser Ergebnisse besteht die Möglichkeit, daß auch bei Bodenalgen geringe Mengen an Cadmium einen wachstumsfördernden Einfluß haben. Diese Vermutung wird bestätigt durch die Wachstumsförderungen der Algen im Gel-Biotest bei niedrigen Cadmiumkonzentrationen von 0,016 mg/l OECD-Medium bis 0,13 mg/l OECD-Medium (s. Abb. 7, S. 52). Dieses als Hormesis-Effekt beschriebene Phänomen wurde z. B. in den 70er Jahren von Wiedman und Appleby (1972) für Herbizide beschrieben. Sie stellten bei der Vorauflaufanwendung von elf Herbiziden in sublethalen Dosen eine signifikante Förderung des Wurzel- und Sproßwachstums von Hafer (Avena sativa) fest. Paterson und Wright (1987) beobachteten bei epiphytischen Algen ebenfalls eine Stimulierung des Wachstums durch das Herbizid Diquat in niedrigen Konzentrationsbereichen und vermuteten als eine Ursache den Hormesis-Effekt. Der Hormesis-Effekt wurde inzwischen bei einer Vielzahl von Untersuchungen für Herbizide, Schwermetalle und weitere toxische Substanzen in niedrigen Konzentrationsbereichen festgestellt.

Allerdings ist die Wachstumsförderung der Algen durch die hohen Cadmiumkonzentrationen (Gesamtgehalte: 43 bis 175 mg/kg TS Boden), die in den untersuchten Böden vorlagen, fraglich. Obwohl in Abb. 7 (s. S. 52) Anzeichen für einen Hormesis-Effekt bei manchen Algen erkennbar sind, kann dies nicht die erhöhten Algenabundanzen in den cadmiumbelasteten Böden erklären, da dieser Effekt bei sehr viel geringeren Konzentrationen auftrat. Die Untersuchungen in dieser Arbeit mit den entwickelten Biotests (s. S. 55) belegen außerdem, daß für die sechs Algenarten keine Stimulierung des Algenwachstums bei Cadmiumkonzentrationen von 8,0mg/l OECD-Mediumbodengemisch festgestellt werden konnte. Daraus läßt sich folgern, daß eine Wachstumsförderung durch einen Hormesis-Effekt, verursacht durch hohe Cadmiumkonzentrationen, sehr unwahrscheinlich ist.

Die erhöhten Algenabundanzen in den mit Cadmium belasteten Böden können auch nicht in Zusammenhang mit bestimmten Bodenparametern gebracht werden, die vielleicht nur bei den cadmiumbelasteten Böden besonders hoch oder niedrig lagen, da Wassergehalt, Leitfähigkeit, Gesamtstickstoffgehalt, mineralischer Stickstoffgehalt, organische Substanz, pH-Wert und Kohlenstoff/Stickstoff-Verhältnis in allen Böden ähnlich waren (s. Tab. A3, S. 115).

Ein weiterer Faktor für die erhöhte Algendichte könnte mit der Konkurrenz zwischen den einzelnen Mikroorganismengruppen des Bodens erklärt werden. Andere Mikroorganismen,


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wie Bakterien, Pilze und Protozoen, die sich auch von Algen ernähren, könnten durch das Cadmium gehemmt werden, wodurch das Algenwachstum indirekt gefördert würde. Dies erscheint nach den vorliegenden Daten am wahrscheinlichsten. Eine abschließende Antwort wäre nur durch umfangreichere, zusätzliche Untersuchungen der Abundanzen anderer Mikroorganismengruppen in Abhängigkeit von der Bodenbelastung zu erzielen.

Die verringerten Algenabundanzen in den mit Blei belasteten Versuchsparzellen gegenüber der Kontrolle werden wahrscheinlich direkt durch die hohen Bleikonzentrationen verursacht. Erhöhte Bleikonzentrationen können zu einer Hemmung der Photosynthese und des Zelllängenwachstums führen (Streit 1991). Koch (1995) stellt für Bleikonzentrationen ab 100 bis 1 000 mg/kg Boden fest, daß diese phytotoxische Wirkungen haben können und das Bodenmikroorganismenwachstum beeinflußt werden kann. In unbelasteten Böden liegen die Bleikonzentrationen bei 2 bis 60 mg/kg Boden, in anthropogen beeinflußten Böden, wie in Erzabbaugebieten des Harzvorlandes, bei bis zu 4 000 mg/kg Boden und in geringer Entfernung von verkehrsreichen Straßen bei bis zu 700 mg/kg Boden (Scheffer & Schachtschabel 1992). Burhenne (1994) stellte in Rieselfeldböden im Umland von Berlin Bleikonzentrationen von 100 bis 1 360 mg/kg TS Boden fest und Einax und Krieg (1995) wiesen in der Nähe eines Emittenten von bleihaltigem Glasstaub bis zu 600 mg/kg im Boden nach. Die Konzentrationen in den Versuchsparzellen, die mit Blei kontaminiert waren, lagen bei 900 bis 3 890 mg/kg TS Boden und waren damit in dem Bereich, der für Pflanzen und Mikroorganismen toxisch wirken kann.

Weiterhin wird durch die Ergebnisse dieser Arbeit deutlich, daß es Gesamtalgenabundanzen von bis zu 1 · 106 Zellen/g TS Boden in landwirtschaftlich genutzten Böden (Tiefe: 0 cm bis 5 cm) geben kann. Vergleicht man die Angaben verschiedener Autoren (Carson & Brown 1978, Wöhler et al. 1998 und Hahn & Neuhaus 1997), die im \#914;ereich von 5 · 103 bis
1,7 · 106 Zellen/g TS Boden liegen (Bodentiefen: 0 cm bis 2,5 cm und 0 bis 5 cm), so befinden sich die in dieser Arbeit ermittelten Werte im oberen Bereich. Dies zeigt, daß die Algendichte im Boden und damit auch die Biomasse häufig unterschätzt werden.

Die gegenüber der Algendichte in 0 cm bis 5 cm Bodentiefe fast doppelt so hohe Algendichte in den oberen 10 mm des Bodens (s. Abb. 3 a) und 3 b), S. 43) ist damit erklärbar, daß Algen überwiegend photoautotrophe Organismen sind. Daher ist davon auszugehen, daß Algen je nach Dichte und Lichtdurchlässigkeit des Bodens überwiegend die oberen Millimeter bis Zentimeter besiedeln und in tieferen Bodenschichten nur durch Regen verschwemmte Algen vorkommen. Allerdings sind Untersuchungen darüber bekannt, daß manche Algenarten auch ohne Licht wachsen, also zu einer heterotrophen Ernährung fähig sind (Reisigl 1964, Metting 1981).


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4.3 Algen in Böden vom Darßer Ort

4.3.1 Bodenparameter

Die Ergebnisse (s. Tab. 6, S. 28) zeigen, daß die beiden Böden für die untersuchten Stoffe als unbelastet einzustufen sind. Durch ihre von urbanen Einflüssen abgesonderte Lage ist es unwahrscheinlich, daß sich in diesen Böden andere belastende und schädigende Stoffe befinden. D 5 und D 6 sind nährstoffarme Böden (s. Tab. 7, S. 29) im Vergleich zu den Böden des Schwermetallversuches (s. Tab. A3, S. 115). Beide Böden bieten nur noch wenigen Organismengruppen eine Lebensgrundlage (s. Fototafel 2, Bild 2 und 3, S. 30). Trotz des einheitlich geringen bis mäßigen Bewuchses und der homogen aussehenden Bodenoberfläche treten im Boden D 6/8 Schwankungen der Bodenparameter im Vergleich zu den anderen Bodenproben des Standortes D 6 auf.

4.3.2 Algenabundanzen

Zum einen war es Ziel dieses Versuches festzustellen, ob die Heterogenität des Bodens Auswirkungen auf die Algendichte im Abstand von 20 cm hat und ob ein Zusammenhang zu bestimmten Bodenparametern besteht. Zum anderen sollten für die Biotests Bodenalgen isoliert werden, bei denen Toleranzen gegenüber Umweltchemikalien, die sich durch Bodenbelastungen oder Luftverunreinigungen ausgebildet haben, ausgeschlossen werden können. Des weiteren sollte dieser Versuch Informationen darüber geben, wie hoch die quantitative Algendichte in sandigen und nährstoffarmen Böden ist. Das Ansteigen und Abfallen der Algenabundanz von D 5/1 bis D 5/8 um das 10fache kann in keinen Zusammenhang mit den untersuchten Bodenparametern (Tab. 6 und 7, S. 28 bis 29) gebracht werden. Die maximalen eukaryontischen Algenabundanzen (Gesamtalgenzahl) liegen bei ca. 400 000 cfu/g TS Boden und sind im Vergleich zu den Werten des Schwermetallversuches 1995 und 1996 mit 800 000 bis 1 000 000 cfu/g TS Boden eher gering. Berücksichtigt man aber, daß einige der untersuchten Bodenparameter, wie der Gesamtstickstoff- und Gesamtphosphatgehalt, um die Hälfte bis um ein Vielfaches geringer sind als bei den Ackerböden der Schwermetallversuchsanlage und der pH-Wert bei D 5 bei 4,3 liegt, so sind die Algenabundanzen bei D 5 erstaunlich hoch. In agrarwirtschaftlichen Nutzflächen, bestehend aus einem anlehmigen Sandboden, stellten Hahn und Neuhaus (1997) Algendichten von 34 000 bis 160 000 cfu/g TS Boden in den oberen 5 Zentimetern fest, und auf jungen Böden, die sich in den letzten 30 Jahren auf Lavagestein (Hawaii) bildeten, kamen 5 500 bis 310 000 cfu/g TS Boden in den oberen 2,5 Zentimetern vor (Carson & Brown 1978). Die Gesamtalgendichte von 400 000 cfu/g TS Boden bei D 5 ist auch deshalb für diesen Boden als hoher Wert einzustufen, da dieser Boden keinen Schutz durch Bewuchs mit Gräsern etc. aufwies. Er war direkt Witterungseinflüssen und dementsprechend der Erosion ausgesetzt, so daß sich ein beständiger Biofilm in den oberen Millimetern des Bodens nicht aufbauen konnte. Derartige grünliche Biofilme waren besonders auf den Cadmiumparzellen der Schwermetallversuchsanlage zu beobachten (s. Fototafel 3, Bild 3, S. 45).


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Die hohen Algendichten im Probenahmestandort D 6 bei D 6/1 bis D 6/3 und D 6/8 können mit der leicht erhöhten organischen Substanz und dem erhöhten Wassergehalt in Verbindung gebracht werden (s. Abb. 5, S. 46; Tab. 6 und 7, S. 28 bis 29). Schelhorn (1936) stellt eine Abhängigkeit zwischen höheren Algendichten und der Fruchtbarkeit des Bodens fest. Ettl (1980) nennt den Zusammenhang zwischen Massenvorkommen von Bodenalgen („Bodenalgenblüten“) und den günstigen Bedingungen eines nährstoffreichen Substrates. Andererseits stellt Stina (1969) fest, daß hohe organische Substanzgehalte die stärkere Vermehrung von Bodenalgen eher hemmen, da damit ein zunehmender Konkurrenzkampf mit heterotrophen Bakterien und Pilzen entsteht. Eine zunehmende Mineralisierung der organischen Substanz sowie eingebrachte Düngemittel fördern aber das Bodenalgenwachstum.

Trotz des recht einheitlichen Bewuchses und überwiegend einheitlicher Bodenparameterwerte des Probenahmeortes D 6 (bis auf D 6/8) treten in den Algenabundanzen der unterschiedlichen Proben Schwankungen um das 10fache auf. Die maximalen Werte der Gesamtalgenzahl des Bodens D 6 liegen bei 800 000 bis 900 000 cfu/g TS Boden. Vergleicht man diesen Wert mit den Maximalwerten der Schwermetallversuche von 1995 und 1996, so zeigt sich, daß sie ebenfalls bei 800 000 bis 1 000 000 cfu/g TS Boden liegen. Dies ist bemerkenswert, da bei den mit Cadmium belasteten Böden ein deutlich grüner Biofilm auf der Erde erkennbar war (s. Fototafel 3, S. 45), der dagegen bei Standort D 6 nicht festzustellen war (s. Fototafel 2, Bild 3, S. 30). Da D 6 ein natürlicher leichter bzw. sandiger Boden ist, besteht die Möglichkeit, daß Licht mehrere Millimeter tief in den Boden eindringt, so daß sich die hohen Algenabundanzen nicht nur auf die oberen 1 bis 2 Millimeter des Bodens beschränken, sondern tiefer gehen und deshalb nicht als grünlicher Biofilm zu erkennen sind. Bei den Schwermetallversuchsböden handelt es sich um einen schluffigen Sand, der im Vergleich zu Boden D 6 eine lichtundurchlässigere Struktur aufweist.

In nährstoffarmen Böden, die zeitweise stärkeren Austrocknungsprozessen ausgesetzt sind, können Gesamtalgenabundanzen von bis zu 400 000 cfu/kg TS Boden vorkommen, wie die Untersuchungen am Darßer Ort zeigten. Die Schwankungen der Algenabundanzen in einheitlich wirkenden natürlichen Böden um das 10fache zeigen, wie wichtig mehrere (mindestens acht) Parallelbeprobungen in regelmäßigen Abständen von ca. 20 cm bis 100 cm – je nach Arealgröße – sind, damit eine Abschätzung der durchschnittlichen Algendichte für einen Boden bzw. ein Bodenareal erfolgen kann.

4.4 Der Gel-Biotest für die Bewertung von Cadmium und Isoproturon

Algen werden seit mehreren Jahrzehnten als Biotestorganismen genutzt. Untersuchungen mit aquatischen (Bartlett et al. 1974, Kunert & Böger 1979a, Kunert & Böger 1979b, Bringmann & Kühn 1980, Galassi & Vighi 1981 und Höhne 1991) und terrestrischen Algen (Bauer & Köcher 1979, Shizong et al. 1997) über ihre Eignung als Testorganismen in Biotests sind bekannt. Jedoch nutzen fast alle diese Untersuchungen nur eine Algenart als stellvertretenden Testorganismus für die Gruppe der autotrophen Mikroorganismen. Daß die Beschränkung auf


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eine Algenart als stellvertretender Testorganismus für die Gruppe der Algen unzureichend ist, wird durch die Untersuchungen von Loeppky und Tweedy (1969) in einem Biotest mit einem Flüssigmedium deutlich. Sie ermittelten für vier Algenarten die Sensibilität gegenüber drei Herbiziden und stellten für die Arten der Gattung Chlorella überwiegend eine geringere Sensibilität gegenüber den Herbiziden fest, während die Gattung Chlamydomonas sensibler reagierte. Dies ist von Wichtigkeit, da einige der oben genannten Biotests mit Arten aus der Gattung Chlorella vorgenommen wurden. Weitere Untersuchungen von Nusch (1977) und Bauer und Köcher (1979), Gerhardt und Putzger (1992), Merschhemke und Regh (1992) und Schäfer et al. (1994) bestätigen, daß unterschiedliche Arten von Algen verschiedene Sensibilitäten gegenüber Teststoffen aufweisen. Höhne (1991) weist daraufhin, daß eine Weiterentwicklung eines Biotestsystems mit dem gleichzeitigen Einsatz von Algen aus unterschiedlichen Ordnungen wünschenswert wäre.

Wie in der Einleitung dargestellt (s. Kap. 1.2.3, S. 15), wird der Algen-DIN-Test zunehmend auch für die Bewertung von Sedimenten und Bodeneluaten benutzt (Ahlf et al. 1992), obwohl er nur eine Süßwasseralgenart (Scenedesmus subspicatus oder Selenastrum capricornutum) als Testorganismus nutzt. Jedoch sollten für die Bewertung von Stoffen, die primär in Böden gelangen, oder für die Bewertung von Bodeneluaten Testorganismen ausgewählt werden, die in den entsprechenden Ökosystemen vorkommen.

Aus diesen Gründen wurden bei dem entwickelten Gel-Biotest fünf Bodenalgen als Testorganismen eingesetzt und zusätzlich Scenedesmus subspicatus. Alle Organismen wurden in separaten Kavitäten einer Mikrotiterplatte getestet, so daß der Gel-Biotest als ein Test mit sechs einzelnen Monospeziestests zu verstehen ist. Eine Vermischung der Algen zur Nachbildung eventueller Interaktionen der verschiedenen Arten im Boden war nicht notwendig, da bereits bei der Isolierung der verschiedenen Algenarten auf Agarplatten beobachtet wurde, daß Algenkolonien sich gegenseitig überwachsen oder ineinander verlaufen, ohne daß gegenseitige Hemmeffekte oder Beeinträchtigungen festgestellt werden konnten. Andererseits hätte eine Vermischung verschiedener Arten in einer Kavität bei der photometrischen Messung eine Differenzierung des Wachstums der verschiedenen Algenarten unmöglich gemacht und damit auch die Feststellung unterschiedlicher Empfindlichkeiten der einzelnen Arten gegenüber Teststoffen.

Es kann bei den Ergebnissen nur eingeschränkt davon ausgegangen werden, daß sich die Sensibilität von fünf sehr unterschiedlichen Bodenalgenarten gegenüber Teststoffen auf die Gesamtheit der mehr als 100 Algenarten, die in Böden vorkommen können, übertragen läßt. Aber die Beurteilung von möglichen Effekten ist mit fünf Bodenalgen und Scenedesmus subspicatus sehr viel besser durchzuführen als bei einem Biotest, der nur mit einer Wasseralgenart arbeitet.

4.4.1 Auswahl der Biotestorganismen

Um mit den ausgewählten Algen eine Vielzahl von Aspekten der unterschiedlichen Bodenalgenarten abzudecken, wurde bei der Auswahl der Biotestorganismen darauf geachtet,


66

daß es sich um häufig aus Böden isolierte Algen handelte und die Isolierungsorte schadstofffrei waren. Neben diesen beiden Auswahlkriterien wurde besonders auf unterschiedliche Gattungszugehörigkeit, verschiedene Zellgrößen sowie Wuchs- und Vermehrungsformen geachtet. Damit sollte ein möglichst weites Spektrum der Vielfalt von Bodenalgen abgedeckt werden. Durch Unterschiede in der Zellmorphologie und Vermehrungsart ist davon auszugehen, daß diese Algen sich in dem Aufbau ihres Cytoskelettes, z. B. durch Zoosporenbildung, sowie in ihrem Verhältnis von Zellmembranoberfläche zu Cytoplasma und in ihren Stoffwechselabläufen unterscheiden. Eine hohe Vermehrungsrate deutet auf einen hohen Stoffwechselumsatz hin. Damit weisen die ausgewählten Algenarten unterschiedliche Angriffsstellen für Teststoffe auf. Da es unmöglich ist, alle in Böden vorkommenden Algenarten als Biotestorganismen einzusetzen, ist mit der Auswahl der fünf Bodenalgenarten Xanthonema tribonematoides, Klebsormidium flaccidum, Stichococcus bacillaris, Xanthonema montanum und Chlamydomonas noctigama und der Süßwasseralge Scenedesmus subspicatus (s. Tab. 12, S. 53 und Fototafel 4, S. 48 bis 49) für die Entwicklung eines Bodenalgenbiotests ein ökotoxikologisch sinnvoller und letztlich auch praktikabler Ansatz gewählt worden. Durch die Integration der DIN-Alge Scenedesmus subspicatus, für die toxikologische Kenndaten für verschiedene Stoffe vorliegen (Pattard & Pernak 1992, Schäfer et al. 1994), ist ein Vergleich mit diesen Daten möglich.

Das Wachstum von Organismen ist ein weiterer wichtiger Faktor bei der Auswahl von Arten für Biotests. Betrachtet man das Wuchsverhalten der ausgewählten Algen (s. Abb. 6, S. 51), so zeigt sich, daß Scenedesmus subspicatus innerhalb von 96 h die höchsten OD-Werte erreicht. Die Erhöhung der OD-Werte bei den Bodenalgen beträgt gegenüber Scenedesmus nur maximal ein Drittel. Trotzdem liegt die Vermehrungsrate bei einer Bodenalgenart (Klebsormidium flaccidum)mit einer Vervierfachung der Zellzahl in 96 h über der von Scenedesmus subspicatus, die eine Zellvermehrung um ungefähr das Dreifache in derselben Zeiteinheit aufweist (s. Tab. A10 bis A15, S. 126 bis 128). Alle anderen Bodenalgen verdoppeln ungefähr ihre Zellzahl in den ersten 96 h. Die unterschiedliche Auswirkung der Zelldichte verschiedener Arten auf die Meßergebnisse mit einem Photometer hängen mit der unterschiedlichen Absorption des Lichtes durch die Art des Zellwachstums zusammen. Aufgrund der Wuchsform von Klebsormidium flaccidum durch Bildung langer beständiger Fäden treffen die punktförmigen Lichtstrahlen des Photometers auf weniger Zellen bei gleicher Zelldichte, als wenn die Zellen einzeln und unabhängig im Medium verteilt sind, wie bei Scenedesmus subspicatus. Aufgrund des fädigen Wachstums konnte die Eichgerade für Klebsormidium nicht mit dem Zellzählkammerverfahren ermittelt werden. Klebsormidium hat durch die spezielle Wuchsform auch die höchsten Werte in der Standardabweichung der vier Parallelen (s. Tab. A16, S. 129).

Insgesamt fällt die langsame Vermehrung von Bodenalgen gegenüber anderen Bodenmikroorganismengruppen auf. Im Vergleich dazu verdoppelt sich die Anzahl vieler Bakterienarten bereits innerhalb von 30 min bis zu wenigen Stunden (Schlegel 1985, Kleinig & Sitte 1992), und zahlreiche Actinomyceten- oder Pilzarten verdoppeln ihre Zellzahl bzw. Hyphenlänge innerhalb von einigen Stunden bis zu wenigen Tagen (Kleinig & Sitte 1992).


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Die Verdoppelung der Zellzahl im Gel-Biotest bei den meisten Bodenalgen entspricht der Vermehrungsgeschwindigkeit, die beim Wachstum der Algen auf Agarplatten ebenfalls beobachtet werden konnte. Im Boden-Biotest konnte für die drei getesteten Bodenalgen eine Vermehrung um das Dreifache und für Scenedesmus subspicatus um das Vierfache in 96 h festgestellt werden. In diesem Bereich kann die natürliche Vermehrungsgeschwindigkeit von Algen in Böden angeordnet werden. Allerdings liegen sowohl die Vermehrungsraten im Gel-Biotest als auch im Boden-Biotest unter der Vermehrungsrate, die im DIN-Algentest mit Scenedesmus subspicatus erzielt wird. Hier liegt eine Vermehrungsrate der Zellen um drei bis vier Generationen vor. Die geringeren Vermehrungsraten bei den neu entwickelten Biotests sind mit der langsameren Vermehrung der Bodenalgen und der anderen Kulturtechnik, die für Mikrotiterplatten nötig ist, zu erklären. Bei Mikrotiterplatten ist keine permanente Durchmischung des Mediums, wie dies mit Erlenmeyerkolben im DIN-Algentest üblich ist, durchführbar.

Trotz der langsameren Vermehrung der Algen ist der Gel-Biotest ein Test, der über eine bzw. bei Scenedesmus und Klebsormidium zwei Generationen andauert. Aus diesem Grund kann hier tendenziell von einem chronischen Biotestgesprochen werden, in dem die Toxizitätsauswirkungen über mehrere Generationen beobachtet werden können und nicht nur innerhalb der Generation, die in das Medium gegeben wurde. Letzteres ist bei Akut-Biotests der Fall, wie z. B. dem akuten Daphnientest (DIN 38 412, Teil 11), bei dem nach 24 h die Mortalität oder Schwimmunfähigkeit der ins Medium gebrachten Organismen als Testparameter herangezogen werden. Demgegenüber benötigt der chronische Daphnientest (Reproduktionstest) eine Versuchszeit von 14 oder 21 Tagen.

4.4.2 Mikrotiterplattenmethode

Die Nutzung der Mikrotiterplattentechnik und die photometrische Bestimmung des Algenwachstums waren möglich, da die ausgewählten Algen nicht zur Aggregation oder Kahmhautbildung neigten. Diese Zellanhäufungen hätten eine homogene Verteilung der Zellen in den 250 µl der Kavität verhindert und somit auch die Möglichkeit, reproduzierbare Meßdaten mit Hilfe des Photometers zu erzielen. Höhne (1991) entwickelte ebenfalls ein Biotestsystem auf Mikrotiterplattenebene unter Nutzung der beiden DIN-Testalgen Scenedesmus subspicatus und Selenastrum capricornutum und unter ähnlichen Versuchsbedingungen wie beim DIN-Algentest. Allerdings nutzte Höhne nicht das OECD-Medium als Kulturmedium. In diesem Testsystem sanken die Algen während der Kulturzeit auf den Boden, was zu einer ungleichen Nährstoffversorgung der sedimentierten Zellen führen kann. Um die Messung der Algendichte mittels Photometer zu ermöglichen, mußten die Algen für jede Messung mit einem Mikrotiterplattenschüttler resuspendiert werden. Dieses Verfahren war bei der Verwendung von Scenedesmus subspicatus oder Selenastrum capricornutum begrenzt einsetzbar. Allerdings wies Höhne (1991) darauf hin, daß bei stark toxischen Teststoffen, die eine Schleimabsonderung bei den zwei Algenarten auslösten und damit eine Zellaggregation bewirkten, eine Resuspendierung nur begrenzt möglich war. Ebenso ist bei anderen Algen


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arten, die fädig wachsen oder bei der Sedimentation zur Aggregation neigen, eine gleichmäßige Resuspendierung mittels Mikrotiterplattenschüttler nicht durchführbar.

Dieses Problem wurde in vorliegender Arbeit durch die Entwicklung eines gelartigen Mediums gelöst, welches das Absinken der Zellen auf den Kavitätenboden verhindert. Ebenfalls ist mit dieser Methode eine gleichmäßige Nährstoffversorgung der Algen gewährleistet, und das Resuspendieren der Zellen kurz vor der Messung nicht mehr notwendig. Die homogene Verteilung der Zellen in den Kavitäten eignet sich sehr gut für die Messung mit einem Photometer und ermöglicht daher auch den Einsatz von fädig wachsenden oder geringfügig zur Aggregation neigenden Testorganismen. Wie die Messungen zeigen, ist eine annähernd lineare Beziehung zwischen der Zunahme der Zellzahl und der Optischen Dichte bei allen als Testorganismen verwendeten Algenarten gegeben (s. Tab. A10 bis A15, S. 126 bis 128).

Die Optische Dichte wurde mit einem 800 nm Filter gemessen, obwohl dies nicht die Wellenlänge ist, bei der die höchsten Absorptionsbereiche von Algenzellen liegen. Der Vorteil des 800 nm Filters liegt darin, daß eventuelle Verfärbungen des Mediums, z. B. durch Reaktion der Zellen mit dem Teststoff, kaum die Messung beeinflussen, da bei 800 nm überwiegend Partikel bzw. Zellen gemessen werden.

Bei der Befüllung der Mikrotiterplatten mit den Teststoffkonzentrationen (s. Abb. 1, S. 37) ist das Problem des Randeffektes der Mikrotiterplatten zu berücksichtigen. Dieser Randeffekt bewirkt, daß die äußeren Kavitäten der Mikrotiterplatte auch bei Abdichtung mit einem Mikrotiterplattendeckel und Parafilm verstärkten verdunstungsfördernden Einflüssen ausgesetzt sind (Höhne 1991, Burhenne et al. 1999). Diesem Effekt wurde entgegengewirkt, indem die äußeren Kavitäten mit Wasser aufgefüllt und nur die inneren 60 Kavitäten für Versuchsansätze genutzt wurden.

Weiterhin mußte beim Einsatz der Mikrotiterplatten beachtet werden, aus welchem Material diese bestanden. Da Mikrotiterplatten aus Quarzglas aus finanziellen Gründen für den Einsatz im Biotestsystem nicht geeignet sind, wurden handelsübliche Polystyrolmikrotiterplatten verwendet. Allerdings kann es bei Polystyrol mit einer höheren Wahrscheinlichkeit als bei Glas zu sorbierenden Effekten und damit zu unerwünschten Konzentrationsänderungen des Teststoffes im Medium kommen. Um dies auszuschließen, müssen Informationen über die chemischen Eigenschaften des Teststoffes vorliegen und im Zweifelsfall ein Vorversuch durchgeführt werden, ob die nominale Teststoffkonzentration nach ein bis vier Tagen noch im Testmedium enthalten ist. Für Cadmiumchlorid konnte nach Erfahrungen am Institut für ökologische Chemie der Biologischen Bundesanstalt mit Kunststoffen und cadmiumbelasteten Böden eine Sorption des Cadmiums ausgeschlossen werden (mündl. Mitteilung Traulsen 1999). Um eventuelle sorbierende Eigenschaften des Polystyrols auf Isoproturon oder durch Beleuchtung ausgelöste Abbauprozesse des Isoproturons ausschließen zu können, wurden einige Kulturmedien nach 24 h und 96 h mit Hilfe einer HPLC-Anlage (UV-Detektor bei 242 nm) untersucht. Es konnte keine Reduzierung der Isoproturonkonzentration gegenüber der Ausgangskonzentration festgestellt werden. Um sorbierende Eigenschaften des Agars im gelartigen Medium auszuschließen, wurde das Medium filtriert und somit der


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überwiegende Anteil des Agars vom Medium getrennt. Die Untersuchung des nahezu agarfreien Mediums ergab ebenfalls keine deutliche Reduzierung des Isoproturongehaltes.

In dem entwickelten Gel-Biotest wurde das Kulturmedium aus dem DIN-Algen- und OECD-Algen-Test (OECD 201, DIN 28 692) eingesetzt. Es hat durch seinen geringen Anteil an Nährstoffen gute Voraussetzungen, um die Testsubstanz in ihrer gesamten Konzentration auf den Testorganismus wirken zu lassen, ohne daß die Testsubstanzen Reaktionen mit einem Teil der Chemikalien im Nährmedium eingehen.

4.4.3 Standardisierung des Gel-Biotests

Die Standardisierung einer Methode oder eines Testes ist die Grundlage, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Ein häufiges Problem bei der Bewertung von Daten, die mit Hilfe von Biotests gewonnen wurden, ist deren relativ große Variabilität im Vergleich zu Daten, die mit chemisch-analytischen Methoden ermittelt wurden. Dies liegt unter anderem an der biologischen Variabilität der Testorganismen (Guilhermon et al. 1996). Pestemer (1996) gab für Pflanzenbiotests bei genauer Versuchsdurchführung und sorgfältiger Auswahl der Testpflanzen eine Variation von 10 zwischen den einzelnen Wiederholungen an. Fent (1998) ging allgemein von einer Variabilität zwischen den einzelnen Wiederholungen eines Biotests um den Faktor 5 aus. Dieser Faktor konnte auf 10 ansteigen, wenn ein und derselbe Biotest in verschiedenen Laboren durchgeführt wurde (Fent 1998). Nyffeler et al. (1982) stellten bei unterschiedlich stark standardisierten Pflanzenbiotests eine Abweichung der Ergebnisse um den Faktor 5 bis 20 fest. Die Variation entstand besonders durch Unterschiede in der praktischen Versuchsdurchführung und den verschiedenen Pflanzenkulturbedingungen zwischen den Laboren. Streibig et al. (1995) ermittelten für Pflanzenbiotests, die in 12 verschiedenen Laboren durchgeführt wurden, durchschnittlich Abweichungen um den Faktor 10 und in Ausnahmen Abweichungen bis zu einem Faktor um 50. Der Variationskoeffizient zwischen den einzelnen Laboren betrug 10 bis 56 . Seiden et al. (1998) stellten für einen Pflanzengewebekulturbiotest, der mit zwei Herbiziden durchgeführt und viermal wiederholt wurde, einen Variationskoeffizienten für den ED50-Wert von 44 bis 48 fest. Tab. 15 (s. S. 73) und 16 (s. S. 74) zeigen für verschiedene Organismengruppen die EC50-Werte für Cadmium und Isoproturon, die mit verschiedenen Biotestorganismen ermittelt wurden. Besonders für den Biotest mit Daphnia magna wird deutlich, wie die Ergebnisse aus unterschiedlichen Untersuchungen variieren.

Zur Überprüfung, ob der vorliegende Gel-Biotest reproduzierbare Ergebnisse liefert, wurde der gesamte Versuch, der pro Konzentration jeweils vier Parallelen aufwies, für den Teststoff Cadmiumchlorid viermal wiederholt. Damit wurde geprüft, ob sich geringe Schwankungen bei der Kulturtemperatur, Lichtintensität, Pipettierungsungenauigkeiten sowie das Neuansetzen der Testorganismen wesentlich auf das Wachstum der Algen auswirkten. Dies war in einem tolerierbaren und für Biotests üblichen Rahmen der Fall. Der Variationskoeffizient der Mittelwerte für den viermal durchgeführten Versuch mit Cadmiumchlorid (s. Abb. 7, S. 52) betrug durchschnittlich 10 bis 30 , bei Klebsormidium aufgrund des fädigen Wachstums


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auch bis ca. 40 . Die Standardabweichung ist in Abb. 7 dargestellt. Der Variationskoeffizient der vier Parallelen innerhalb eines Versuches betrug in der Regel 5 bis 10 , bei Klebsormidium selten um 20 .

Nachdem die Ergebnisse der ausführlichen methodischen Untersuchungen des Gel-Biotests mit Cadmium deutlich machten, daß die Abweichungen zwischen den vier neu angesetzten Versuchen für Biotests relativ gering waren und damit die Qualität der Standardisierung überprüft wurde, wurde bei dem weiteren Einsatz des Gel-Biotests beim Teststoff Isoproturon nur noch ein Versuch mit vier Wiederholungen durchgeführt. Die Standardabweichung der vier Parallelen innerhalb eines Versuches betrug, ähnlich wie beim Test mit Cadmiumchlorid, innerhalb eines Versuches in der Regel 5 bis 10 des mittleren Meßwertes und bei Klebsormidium bis ca. 20 (s. Tab. A16, S. 129). Die Konfidenzintervalle der errechneten EC50-Werte der vorliegenden Untersuchung ähnelten den Intervallen von Untersuchungen, die mit dem Algen-DIN-Test durchgeführt wurden. Kirby & Sheahan (1994) ermittelten für Scenedesmus subspicatus einen EC50-Wert bei Isoproturon von 0,021 mg/l OECD-Medium mit einem Konfidenzintervall von 0,015 bis 0,027 mg/l OECD-Medium. In der vorliegenden Untersuchung betrug der vergleichbare Wert 0,42 mg/l OECD-Medium mit einem Intervall von 0,34 bis 0,54 mg/l OECD-Medium (s. Tab. 12, S. 53).

4.4.4 Toxikologische Kennwerte für Cadmium und Isoproturon im Gel-Biotest

Aus den EC10- und EC50-Werten (s. Tab. 12, S. 53) wird deutlich, daß die sechs Algenarten unterschiedlich auf Cadmium und Isoproturon reagieren. Für Cadmium gibt es eine Variation um den Faktor 80 beim EC10- und den Faktor 25 beim EC50-Wert, beim Isoproturon eine Variation um den Faktor 10. Womit können die unterschiedlichen Empfindlichkeiten der Algen gegenüber den beiden Teststoffen erklärt werden?

Eine Erklärungsmöglichkeit könnte die Größe der Zellen sein. Kleine Algenzellen könnten besonders empfindlich gegenüber Teststoffen sein, da ihre Zelloberfläche im Vergleich zum Zellvolumen groß und dadurch ein intensiverer Kontakt mit einem Teststoff gegeben ist als bei großzelligen Algen. Diese Hypothese läßt sich durch die Versuchsergebnisse sowohl für Cadmium als auch für Isoproturon nicht bestätigen, da gerade die kleinste Alge Stichococcus bacillaris eine der weniger empfindlichen Algen ist, insbesondere bezüglich Isoproturon. Dagegen gehört Xanthonema tribonematoides als sehr großzellige Alge hinsichtlich Isoproturon zu den empfindlicheren Algen.

Eine weitere Erklärung für die unterschiedlichen Sensibilitäten beim Cadmium könnte in der Höhe der Zellvermehrung liegen. Tab. 12 (s. S. 53) und Tab. A10 bis A15 (s. S. 126 bis 128) zeigen, daß die Algen am empfindlichsten sind, die das schnellere Wachstum aufweisen (Scenedesmus subspicatus und Klebsormidium flaccidum). Sie werden wahrscheinlich im gleichen Zeitintervall verhältnismäßig mehr Cadmiumionen aufnehmen als die langsamer wachsenden vier anderen Bodenalgenarten. Für Cadmium ist bekannt, daß es schon in geringen Konzentrationen toxisch wirken kann. Man vermutet, daß die toxische Wirkung durch die mehrwertigen Schwermetallionen hervorgerufen wird, die die Eigenschaft haben,


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Komplexverbindungen einzugehen und somit Enzymsysteme empfindlich zu stören (Streit 1991). Da eine höhere Vermehrungsrate meistens einen schnelleren Stoffwechsel zur Folge hat und damit auch eine höhere Syntheserate von Enzymen, ergänzen sich die Vermutungen über die toxische Wirkung der Schwermetallionen auf das Enzymsystem und über die höhere Sensibilität bei schneller wachsenden Algen. Krawczynska et al. (1989) stellten bei der Protistenart Tetrahymena pyriformis nach Kontamination des Mediums mit Cadmiumchlorid ebenfalls eine toxische, wachstumshemmende Wirkung fest, die durch elektronenmikroskopische Untersuchungen mit Abnormalitäten in der Ultrastruktur der Zellen erklärt werden konnte. Baunemann und Höfner (1991) konnten für Scenedesmus subspicatus nachweisen, daß von den Schwermetallen Cadmium, Kupfer, Nickel und Zink, Cadmium am stärksten von den Algen aufgenommen wurde und ebenfalls das Wachstum der Alge reduzierte. In der Untersuchung von Baunemann und Höfner (1991) konnte nur für die mit Cadmium kontaminierten Algen die Bildung eines cadmium-metallothionein-ähnlichen Proteins beobachtet werden. Metallothioneine sind schwermetallbindende cytoplasmatische Proteine und Peptide, deren Synthese durch Eintritt von Schwermetallen ins Zellinnere induziert wird (Richardson 1993). Diese Metallothioneine werden auch als Schwermetallstreßproteine bezeichnet, da sie in der Lage sind, Schwermetallionen zu binden (Morselt 1986) und diese dadurch als Stressoren für die Zelle ausschließen (Libbert 1987). Damit wäre erklärbar, warum einige Algen im Gel-Biotest und im Schwermetallversuch eine sehr hohe Toleranz gegenüber Cadmium aufweisen. Die Testalgen könnten eine unterschiedliche Induzierbarkeit der Metallothioneine und/oder unterschiedliche Strategien haben, die durch die Synthese der Metallothioneine verbrauchte Energie zu ersetzen. Dadurch sind möglicherweise einige Algen besonders effektiv in der Lage, die Cadmiumionen durch ihre Metallothioneine zu binden, bevor diese störend in das enzymatische System eingreifen können.

Die Erklärung, daß die Algen mit der höheren Reproduktionsfähigkeit am empfindlichsten gegenüber dem Teststoff sind, kann nicht für die ermittelten EC10- und EC50-Werte bei Isoproturon herangezogen werden, da bei diesem Stoff alle Algen außer Stichococcus bacillaris nah beieinanderliegende Werte haben, obwohl sich die Algenarten in ihrer Vermehrungsgeschwindigkeit unterscheiden.

Isoproturon ist ein Phenylharnstoff, der bei höheren Pflanzen über die Blätter und Wurzeln aufgenommen wird (Perkow & Ploss 1992, Domsch 1992)und innerhalb der Zellen das Photosynthesesystem II angreift, indem es sich an die Chloroplastenmembran bindet und den Elektronentransport hemmt (Hock et al. 1995). Simonis (1987) vermutet, daß eine Herbizidsorption in Mikroalgen zunächst durch eine Diffusion vom Medium in die Lipidphase der Zellen gemäß einem Verteilungsgleichgewicht erfolgt. Erst von der Lipidphase aus kommt es dann wahrscheinlich zu einer spezifischen Bindung an Proteine. Die selektive Wirkung von Photosynthesehemmern, die das Photosynthesesystem II angreifen, beruht auf unterschiedlichen Bindungsaffinitäten an die Thylakoidmembranen, die bei manchen Gräsern hoch ist, aber z. B. bei Weizen gering (Pfister et al. 1979, McIntosh et al. 1981). Es könnte sein, daß bei Stichococcus bacillaris ebenfallseine schwächere Bindung des Isoproturons an die Thylakoidmembran möglich ist als bei den anderen Algen und diese Algenart deshalb etwas unempfindlicher ist.


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Letztendlich ist zu vermuten, daß beim Cadmium die Wachstumsgeschwindigkeit und damit die unterschiedlich schnelle Aufnahme des Teststoffes der wahrscheinlichste Faktor für die unterschiedliche Sensibilität ist und beim Isoproturon die unterschiedliche Bindungsfähigkeit an die Chloroplastenmembran. Als weitere Erklärungsmöglichkeit könnten Unterschiede in Struktur und Stärke der Zellwand und Zellmembran genannt werden. Zur Überprüfung dieser Vermutung wären weitere Untersuchungen mit speziellen Arbeitstechniken erforderlich, wie z. B. elektronenmikroskopische Untersuchungsmethoden, die im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt werden konnten. Zukünftige Studien müssen zeigen, welche Faktoren letztlich dafür verantwortlich sind, daß manche Algenarten empfindlicher als andere gegenüber Cadmium und Isoproturon sind.

Der Gel-Biotest kann in bezug auf die Testsubstanz Cadmiumchlorid als eingeschränkt empfindlich eingestuft werden. Der im Rahmen der Trinkwasserverordnung vorgegebene Grenzwert für Cadmium liegt bei 0,005 mg/l. Der Cadmiumgehalt in unbelasteten Böden liegt im allgemeinen in Größenordnungen von 0,06 bis 1,00 mg/kgTS Boden (Koch 1991). Die empfindlichsten Algen Klebsormidium und Scenedesmus weisen zwar schon bei einer Cadmiumkonzentration von 0,3 bis 0,4 mg/l OECD-Medium eine 50ige Hemmung auf und der EC10-Wert für Klebsormidum liegt bei 0,003 mg/l, doch liegen die EC50-Werte für die anderen Algen bei 2 mg/l bis 8 mg/l OECD-Medium.

Vergleicht man diese Werte mit Ergebnissen aus anderen Biotests, so zeigt sich für Scenedesmus und Klebsormidium, daß sie empfindlicher gegenüber Cadmiumchlorid sind als die in Tab. 15 (s. S. 73) dargestellten Biotests mit Bakterien, Fischen und dem Seeigel Strangylocentrotus droebachiensis. Eine vergleichbare Empfindlichkeit besteht mit den Testorganismen Tetrahymena und Daphnia, wobei für Daphnia meistens ein EC50-Wert, der um den Faktor 10 empfindlicher ist, festgestellt wurde. Sowohl bei Tetrahymena als auch bei Daphnia wird die Variabilität der Ergebnisse von unterschiedlichen Untersuchungen deutlich. Die Untersuchung von Traunsburger et al. (1995) zeigt ebenfalls ein um den Faktor 5 empfindlicheren EC50-Wert für Nematoden. Der direkte Vergleich der EC50-Werte aus den Biotests mit Flüssignährmedien mit EC50-Werten aus Pflanzenbiotests ist nur eingeschränkt möglich, da letztere fast immer direkt in Böden oder bodenähnlichen Substraten stattfinden und dadurch eine andere Bioverfügbarkeit der Testsubstanz gegeben ist als in flüssigen Nährmedien. Beispielhaft für einen Pflanzenbiotest ist der EC50-Wert für die Herbstrübe Brassica rapa angegeben, der um den Faktor 250 höher liegt als für Scenedesmus und Klebsormidium. Ein weiterer Vergleich der Empfindlichkeit von Bodenalgen und Pflanzen in Bodenbiotests wird in Kap. 4.5.3 (s. S. 83) gegeben.

Für Isoproturon zeigt sich (s. Tab. 12, S. 53), daß eine 50ige Hemmung des Algenwachstums bei Isoproturonkonzentrationen von ca. 0,25 mg/l bis 1,0 mg/l OECD-Medium auftritt, mit der Ausnahme bei Stichococcus bacillaris mit einem EC50-Wert von 2,74 mg/l OECD-Medium. Tab. 15 (s. S. 73) ermöglicht den Vergleich der EC50-Werte der Algenarten Scenedesmus subspicatus, Xanthonema tribonematoides und Klebsormidium flaccidum mit Testorganismen anderer Biotests, die in Wasser oder wasserähnlichen Flüssigmedien durchgeführt werden.


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Tab.  15 : Vergleich der EC 50 -Werte für Cadmiumchlorid aus Biotests mit unterschiedlichen Testorganismen in Flüssignährmedien (Ausnahme: Pflanzenbiotest), Cadmiumchlorid als Cadmium in mg/l angegeben

Testorganismus

Zeit in Stunden

EC 50 -Werte in mg/l
2) LC
50 -Werte in mg/l

Literatur

Bakterien

Salmonella typhimurium 1535

8

   

10,4

Canton & Sloof (1982)

Vibrio fischeri 1)

1/4

   

20,0

Chou & Hee (1994)

Algen

Scenedesmus subspicatus

96

   

0,44

vorliegende Studie

 

48

   

0,22

Kühn & Pattard (1990)

 

72

   

0,14

Kühn & Pattard (1990)

 

72

   

0,032

Schäfer et al. (1994)

Klebsormidium flaccidum

96

   

0,33

vorliegende Studie

Selenastrum capricornutum

96

   

0,341

Chen et al. (1997)

Chlorella vulgaris

96

   

3,7

Canton & Sloof (1982)

Ciliaten

Tetrahymena pyriformis

48

   

0,78

Schäfer et al. (1994)

 

24

   

0,04

Huber et al. (1991)

Wasserflöhe

Daphnia magna

48

   

0,03

Canton & Sloof (1982)

 

48

   

0,082)

Hall et al. (1986)

 

48

   

0,0095

Guilhermino et al. (1996)

 

48

   

0,033-0,143)

Mark & Solbé (1998)

Nematoden

Caenorhabditis elegans

96

   

0,061

Traunsburger et al. (1995)

Fische

Poecilia reticulata (Guppy)

96

   

1,272)

Pickering & Henderson (1966)

 

96

   

11,1

Canton et al. (1982)

Salmo gairdneri (Regenbogenforellenart)

96

   

2,62)

Pascoe et al. (1986)

Seeigel

Strangylocentrotus droebachiensis, Embryo

120

   

1,8

Dinnel et al. (1989)

Pflanzen 4)

Brassica rapa (Herbstrübe)

240

   

111,54)

Günther & Pestemer 1990

1)

2)

3)

4)

Vibrio fischeri ist ein marines Bakterium, das in einem kommerziell vertriebenen MICROTOXBiotest erhältlich ist.

Angegeben ist der LC50-Wert in mg/l

EC50-Mittelwertbereich aus 13 Studien

Der Pflanzenbiotest wurde im Boden durchgeführt, die Stoffangabe war Cadmiumchlorid mg/kg TS Boden.

Die dargestellten Algenarten vorliegender und anderer Untersuchungen in Tab. 16 weisen eine ähnliche Sensibilität gegenüber Isoproturon mit einer überwiegenden Schwankungsbreite um den Faktor 10 auf. Stichococcus bacillaris stellt in der Gruppe der Algen die Art mit der etwas geringeren Sensibilität dar (s. Tab. 12, S. 53).


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Tab.  16 :  Vergleich der EC 50 -Werte für Isoproturon aus Biotests mit unterschiedlichen Organismen in Flüssignährmedien

Testorganismus

Zeit in Tagen

EC 50 -Werte in mg/l
1)
LOEC in mg/l)

Literatur

Algen

         

Scenedesmus subspicatus

4

   

0,42

vorliegende Studie

 

4

   

0,03

Wirkstoffdatenblatt BBA (1993)

 

4

   

0,021

Kirby & Sheahan (1994)

Xanthonema tribonematoides

4

   

0,35

vorliegende Studie

Klebsormidium flaccidum

4

   

0,84

vorliegende Studie

Wasserflöhe

Daphnia magna

2

   

447,01)2)

Wirkstoffdatenblatt BBA (1993)

 

21

   

40,01)3)

Wirkstoffdatenblatt BBA (1993)

 

21

   

0,321)4)

Wirkstoffdatenblatt BBA (1993)

 

2

   

507,0

Perkow & Ploss (1992)

Fische

         

Oncorhynchus mykiss (Regenbogenforellenart)

4

   

37,2

Wirkstoffdatenblatt BBA (1993)

 

4

   

37,0

Perkow & Ploss (1992)

Carassius auratus (Goldfisch)

4

   

100,0

Perkow & Ploss (1992)

Poecilia reticulata (Guppy)

4

   

90,0

Perkow & Ploss (1992)

Wasserpflanzen

Lemna minor

10

   

0,0335)

Kirby & Sheahan (1994)

1)

2)

3)

4)

5)

Angabe des LOECs

Testsubstanz während des Versuches ausgefallen, da keine Lösungsmittel eingesetzt wurden

Meßparameter war die Mortalität

Meßparameter war die Reproduktion

Meßparameter war das Frischgewicht

Etwas sensibler als die in Tab. 16 dargestellten Algenarten reagiert Lemna minor. Deutlich von diesen beiden Organismengruppen heben sich die EC50-Werte der verschiedenen Fischarten und Daphnia magna ab, die um den Faktor 100 bis 1 000 höher liegen. Für Daphnia magna wird durch den Vergleich der LOEC-Werte der unterschiedlichen Biotests deutlich (Tab. 16), welchen Einfluß es hat, wenn bei Biotests die Meßparameter, wie hier Mortalität oder Reproduktion, und die Versuchslänge verändert werden.


75

Für Vibrio fischeri oder vergleichbare Bakterientests mit einer Bakterienart sowie für Tetrahymena pyriformis und Caenorhabditis elegans konnten keine Daten aus der Literatur ermittelt werden.

Es zeigt sich, daß die verschiedenen Algenarten und Lemna minor als Biotestorganismen eine besonders hohe Sensibilität im Vergleich zu anderen Arten gegenüber Isoproturon besitzen. Dies ist mit der spezifischen Wirkung des Isoproturons auf das Photosynthesesystem zu erklären. Dieses Ergebnis bestätigt die Untersuchung von Knie (1992), der ebenfalls für Algen als Testorganismen eine besonders hohe Sensibilität gegenüber Stoffen, die eine Auswirkung auf das Photosynthesesystem haben, feststellte. Damit kann der Gel-Biotest für Isoproturon als empfindlicher Biotest eingestuft werden.

Der entwickelte Gel-Biotest ermöglicht die Bestimmung toxikologischer Kenndaten mit mehreren Algenarten als Biotestorganismen mit Hilfe der Mikrotiterplattentechnik gegenüber Teststoffen im flüssigen Medium. Er läßt eine differenzierte Aussage über die Reaktion verschiedener Algen aus zwei Lebensräumen (Wasser und Boden) auf Teststoffe zu.

4.4.5 Vorteile des Gel-Biotests gegenüber dem DIN-Algentest

Die Vorteile des entwickelten Gel-Biotests mit Mikrotiterplatten gegenüber dem DIN-Algentest liegen in der Miniaturisierung des Testsystems und der Vielfalt der Testorganismen. Im DIN-Algentest werden häufig 250 ml Kolben mit je 100 ml Medium pro Kolben genutzt, demgegenüber werden im Gel-Biotest nur 250 µl je Kavität benötigt. Berücksichtigt man, daß Teststoffkonzentrationen nicht in zu kleinen Medienmengen angesetzt und verdünnt werden können, so beträgt der Medienbedarf trotzdem nur ungefähr ein Hundertstel des Medienbedarfes des DIN-Algentests. Damit sind durch die Miniaturisierung eine wesentliche Reduzierung des häufig toxischen Medienabfalls und der Kosten gegeben.

Zusätzlich wird durch den Einsatz der Mehrkanalpipette und Messung der Optischen Dichte im Mikrotiterplattenphotometer eine wesentliche Zeitersparnis beim Ansetzen und Auswerten des Versuches erreicht. Aufgrund dieser Faktoren ist es erst möglich, sechs Algen innerhalb eines Biotests mit zehn Teststoffkonzentrationen einschließlich der Kontrollen zu untersuchen. Ebenso ist durch den entwickelten Biotest eine erhebliche Platzersparnis in Kulturräumen bzw. Kulturschränken gegeben. Würde der Gel-Biotest mit seinen 6 Testorganismen mit 250 ml Erlenmeyerkolben durchgeführt, so würden pro Versuch mit je vier Wiederholungen ca. 200 Erlenmeyerkolben benötigt werden.

Es stellt sich aber die Frage, ob die Miniaturisierung des Biotests nicht Auswirkungen auf dessen Sensibilität und die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse hat. Höhne (1991) verglich den Wachstumsverlauf und die EC50-Werte von Scenedesmus subspicatus und Selenastrum capricornutum im Mikrotiterplattentest und im DIN-Algentest mit Erlenmeyerkolben für die Teststoffe Kaliumdichromat und Kaliumchlorat und konnte keinen wesentlichen Unterschied in den Ergebnissen feststellen. Allerdings wich er von dem vorgeschriebenen DIN- und OECD-Medium ab, um höhere Vermehrungsraten der Algen innerhalb von 96 h zu erhalten.


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Da es in der vorliegenden Untersuchung ein Ziel war, die ermittelten Daten des Gel-Biotests, insbesondere für Scenedesmus subspicatus, mit Daten, die man mit dem DIN-Algentest erhielt, zu vergleichen, wurde im Gel-Biotest das OECD-Medium eingesetzt. Das führte aber zu einem langsameren Algenwachstum verglichen mit dem DIN-Algentest mit Erlenmeyerkolben, die während der Kulturphase geschüttelt werden. Da aber ein Vergleich der Ergebnisse zwischen Biotests mit unterschiedlichen Nährmedien nur unzureichend möglich ist, wurde das langsamere Wachstum im Gel-Biotest in Kauf genommenund kein Medium eingesetzt, daß das Wachstum erhöhen würde.

Schäfer et al. (1994) stellten in Untersuchungen mit dem DIN-Algentest mit Scenedesmus subspicatus, durchgeführt in Erlenmeyerkolben und der Testsubstanz Cadmiumchlorid, einen EC50-Wert nach 72 h mit einer Cadmiumkonzentration von 0,032 mg/l fest. Kühn und Pattard (1990) ermittelten mit dem DIN-Algentest nach 48 h einen EC50-Wert bei einer Cadmiumkonzentration von 0,22 mg/l und nach 72 h einen EC50-Wert von 0,14 mg/l. Dem gegenüber steht das Ergebnis des Gel-Biotests nach 96 h mit einem EC50-Wert von 0,44 mg/l für Scenedesmus subspicatus (s. Tab. 12, S. 53). Berücksichtigt man, daß es bei der Durchführung gleicher Biotestverfahren in unterschiedlichen Laboren zu Abweichungen um den Faktor 10 kommen kann (Fent 1998), liegen die Ergebnisse des Gel-Biotests und der genannten Untersuchungen relativ dicht beieinander. Allerdings ist dieser Vergleich der Einschränkung unterworfen, daß die Auswertung mit dem DIN-Algentest nach 72 h und mit dem Gel-Biotest nach 96 h stattfand. In anderen Biotestverfahren mit Flüssigmedien, die vor der Normierung des DIN-Algentestes entwickelt oder mit anderen Algenarten durchgeführt wurden, hat man für Cadmium gegenüber Scenedesmus quadricauda eine beginnende Schadwirkung bei einer Cadmiumchloridkonzentration (CdCl2 · 2 ½ H20) von 0,1 mg/l Medium festgestellt (Bringmann & Kühn 1959) und für Selenastrum capricornutum einen EC50-Wert nach 96 h mit einer Cadmiumkonzentration von 0,341 mg/l (Chen et al. 1997).

Für Isoproturon ist im Wirkstoffdatenblatt der BBA (1993) für den DIN-Algentest mit Scenedesmus subspicatus ein EC50-Wert mit einer Isoproturonkonzentration von 0,03 mg/l angegeben. Kirby und Sheahan (1994) ermittelten einen Wert von 0,021 mg/l mit Scenedesmus subspicatus im DIN-Algentest. Diese Werte liegen ungefähr um den Faktor 10 niedriger als der EC50-Wert im Gel-Biotest mit 0,42 mg/l. Es ist eine etwas geringere Sensibilität gegenüber dem DIN-Algentest vorhanden, die aber wie beim Cadmiumchlorid auch noch im Rahmen der feststellbaren Abweichungen (ca. Faktor 10) zwischen Laboren, die den gleichen Biotest durchführen, liegt.

Anhand des Vergleiches toxikologischer Kennwerte, die mit dem DIN-Algentest und Gel-Biotest mit Scenedesmus subspicatus und dem Teststoff Camiumchlorid und Isoproturon ermittelt wurden, wird deutlich, daß der Gel-Biotest eine ähnliche Sensibilität wie der DIN-Algentest besitzt.

Des weiteren zeigt sich, daß toxikologische Kennwerte von Teststoffen für eine Organismengruppe nur anhand bis zur Artebene festgelegter Testorganismen und genau standardisierter Testmethoden ermittelt werden sollten. Nur dann ist der Vergleich mit Untersuchungen anderer Forschergruppen möglich. Sobald sich eine Veränderung des Mediums, der


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Kulturbedingungen oder der Art ergibt, ist ein Vergleich der Ergebnisse eines Biotests nur noch eingeschränkt oder gar nicht mehr möglich und damit die Anwendung dieses Biotests im nationalen und internationalen Bereich nicht empfehlenswert.

4.5 Der Boden-Biotest für die Bewertung von Cadmium und Isoproturon

4.5.1 Methode

Wie in Kap. 1.2.3 (s. S. 14) dargestellt wurde, existieren verschiedene Untersuchungen über aquatische und terrestrische Algen als Biotestorganismen. Nur ein geringerer Teil dieser Untersuchungen beschäftigt sich mit der Eignung und Nutzung von Bodenalgen als Biotestorganismen, und nur sehr wenige Arbeiten haben den Versuch unternommen, Biotests mit Bodenalgen und einem Boden oder einer bodenähnlichen Matrix zu entwickeln. In diesen Arbeiten wurden verschiedene Wege erprobt, bodenähnliche Substrate in einen Biotest zu integrieren. Es wurden immer wieder die Schwierigkeiten der Messung des Algenwachstums im Boden oder der bodenähnlichen Matrix diskutiert.

Jansen et al. (1958) entwickelten einen Biotest, bei dem der Boden durch Perlite als Wachstumssubstrat nachgeahmt wurde. Da Perlite nicht mit einem natürlichen Boden verglichen werden kann, sollte dieser Test nicht als ein Bodenbiotest angesehen werden. Ebenso kann die Methode von Wright (1975) auch nicht als Bodenbiotest bezeichnet werden, da hier das Algenwachstum auf Agarpetrischalen ohne Beteiligung eines Bodens als Wachstumssubstrat stattfindet. Dann gab es Versuchsansätze über die Trennung von Algen und Boden über einen Cellulosebehälter, in dem sich der Boden befand (Aktins & Tchan 1967, Lefebvre-Drouet & Calvet 1983). In diesem Fall waren die Algen letztlich wieder in einem Flüssigmedium, und ein natürliches Wachstum der Algen im Boden war nicht möglich. In einer weiteren Untersuchung wurde das Algenwachstum mit Hilfe eines beimpften Filterpapiers, das auf den Boden aufgelegt wurde, beobachtet (Pillay & Tchan 1972). Auch bei dieser Methode ist ein natürlicher Kontakt zwischen Bodenalgen und Boden nicht gewährleistet. Ebenso ergab sich bei der Methode von Pipe und Cullimore (1980) die Schwierigkeit, daß die in den Boden eingeführten Objektträger nicht immer einen gleichmäßigen Kontakt zum Boden hatten und die mikroskopische Auswertung zeitaufwendig war und bei größeren Aggregaten von Zellhaufen ungenau.

Bei weiteren Arbeiten, in denen die Algen direkt im Boden wuchsen und Aussagen über die Algendichte pro g TS Boden getroffen werden sollten, wurden folgende Wege beschritten. Es wurde die Algendichte über den Chlorophyllgehalt des Bodens ermittelt (Ria & Mallick 1993, Hammel et al. 1998) oder die Agarplattenmethode gewählt, also die Aufbringung einer verdünnten Erdsuspension auf Agarplatten und Auszählung der Koloniedichte (Musset 1994, Sauthoff & Oesterreicher 1994, Neuhaus et al. 1997). Letztere Methode hat den Nachteil, daß eine Auswertung der Ergebnisse erst nach ca. drei Wochen möglich ist. Bei der Bestimmung des Chlorophyllgehaltes muß ein hohes Algenwachstum im Boden vorliegen, damit eine


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photometrische Messung überhaupt möglich ist. Dies war im Boden-Biotest der vorliegenden Arbeit nicht innerhalb von 96 h zu erreichen. Die drei getesteten Bodenalgen verdreifachten ihre Zellzahl, und Scenedesmus subspicatus vervierfachte sie innerhalb der 96 h. Hammel et al. (1998) werteten erst nach 14 Tagen Kulturdauer ihren Biotest per Chlorophyllbestimmung aus und erreichten dadurch höhere Vermehrungsraten. Drew und Anderson (1977) beschritten den Weg der Bestimmung der Algendichte mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskopes und einer Zellzählkammer, indem sie die Erde verdünnten und somit die Algendichte mikroskopisch bestimmbar wurde. Allerdings wurden nur die Gesamtalgendichten bestimmt. Eine sichere Bestimmung von verschiedenen Arten anhand einzelner Zellen in einer Erdsuspension ist grundsätzlich nicht durchführbar (Ettl & Gärtner 1995). In der vorliegenden Arbeit wurde, ähnlich wie bei Drews und Anderson (1977), das Wachstum der Algen im Boden bestimmt, indem durch Verdünnung des Biotestbodens und mikroskopische Auswertung mittels einer Neubauer-Zellzählkammer die Wachstumsrate ermittelt wurde (s. Fototafel 5, Bild 3, S. 79).

Der BBA-Boden, der im entwickelten Biotest eingesetzt wurde, ist besonders geeignet als Testboden, da es sich um einen schwach humosen schluffigen Sand mit einer organischen Substanz von 1,8 handelt. Damit ist der Testboden als ein sorptionsschwacher Boden einzustufen. Bei sorptionsschwachen Böden werden gegenüber sorptionsstarken Böden geringere Anteile an Bodenschadstoffen oder Pflanzenschutzmitteln an die organische Substanz oder Tonminerale gebunden (Gisi et al. 1990). Es kann ein größerer Anteil bioverfügbar bleiben, damit auch leichter ausgewaschen werden und dadurch in Oberflächengewässer und ins Grundwasser gelangen. Somit können mit diesem Biotestboden Sorptionsphänomene und die Bioverfügbarkeit von Stoffen nachgeahmt werden, die in zahlreichen Böden mit ungefähr ähnlichen Bodenparametern im Freiland ebenfalls stattfinden. Nach Mückenhausen (1974) beträgt der Anteil an Sand- und lehmigen Sandböden in den alten Bundesländern 20 . Der eingesetzte Testboden wurde bisher im Institut für ökologische Chemie der Biologischen Bundesanstalt für Land- und Forstwirtschaft in Berlin für unterschiedliche Pflanzentests eingesetzt (Pestemer & Günther 1993). Aus diesem Grund lagen zahlreiche Untersuchungsergebnisse über dessen eventuelle Belastung durch Xenobiotika vor. Aus diesen war ersichtlich, daß der Boden als unbelastet einzustufen war (mündl. Mitteilung Pestemer 1999), was eine grundlegende Voraussetzung für einen Biotestboden ist. Des weiteren war der Boden für die Abtrennung der Algen von den Bodenpartikeln optimal geeignet, da nur ein geringer Bodenanteil im Filter verblieb.

Dieser Boden wurde im Boden-Biotest zwar nicht sterilisiert, doch nach DIN 19 683 Teil 4 getrocknet. Bei diesem Verfahren bleiben organische Substanz (Hoffmann 1991) wie auch Tonminerale erhalten (mündl. Mitteilung Traulsen 1999; DIN 19 684 Teil 4). Andererseits ist der natürliche Algenbestand des Bodens nicht mehr vorhanden, und das Pilzwachstum in den Böden wird ebenfalls fast völlig reduziert. Bei der Auszählung der Algen war allerdings deutlich zu erkennen, daß verschiedene Bakterienarten die Erhitzung des Bodens überstanden. Man kann bei dem Versuchsboden nicht von einem natürlichen, aber doch von einem naturnahen Boden sprechen. Es wurden die sorbierenden Eigenschaften des Bodens durch das Trocknungsverfahren kaum verändert und die Mikroorganismengemeinschaft des Bodens


79

Fototafel 5 Bild 1: Mikrotiterplattenausschnitt des Boden-Biotests nach 96 h, von links nach rechts Zunahme der Isoproturonkonzentration.

Fototafel 5 Bild 2: Ausschnittsvergrößerung der Mikrotiterplatte.

Fototafel 5 Bild 3: Bodensuspension mit Chlamydomonas noctigama in der Neubauer-Zellzählkammer, wie sie nach dem Durchlauf durch den Goldfilter im Mikroskop zu sehen ist; Vergrößerung 400fach; zwei Zellen am oberen Bildrand.


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blieb teilweise erhalten. Ein weiterer Vorteil dieser Methode war, daß größere Bodenbewohner wie Insekten etc., die zu einer Zerstörung der gleichmäßigen Bodenoberfläche führen könnten, abgetötet wurden. Eine Zerstörung der glatten Bodenoberfläche in den Kavitäten hätte zu unterschiedlichen Wuchsbedingungen der Algen geführt (s. Fototafel 5, Bild 1 und 2, S. 79).

Um den Einsatz der Neubauer-Zellzählkammer zu ermöglichen und störende größere Partikel aus der Erdsuspension zu entfernen sowie gleichzeitig eine Abtrennung der Algen von größeren Bodenpartikeln zu erreichen, kam die Goldfiltermethode von Stellmacher (1993) zum Einsatz. Bei diesem Verfahren wurde die Erdsuspension mehrmals durch einen Kaffeedauerfilter gegeben, und beim Durchfließen der relativ engen Schlitze wurde der größte Teil der Algen von größeren Erdpartikeln gelöst. Vorherige Homogenisierungsschritte mittels Überkopfschütteln unterstützten die Abtrennung der Algen von gröberen Erdpartikeln. Je nach Boden konnten somit 70 bis 90 bzw. nach Stellmacher (1993) nahezu 100 der Algen von größeren Bodenpartikeln gelöst werden und in der verdünnten Erdsuspension mit Hilfe der Neubauer-Zellzählkammer ausgezählt werden. Da der ausgewählte Boden einen geringen organischen Substanzanteil aufwies,war der im Goldfilter verbleibende Bodenanteil gering, so daß eine gute Abtrennung und Ausspülung der Algen aus dem Boden gegeben war. Diese würde bei Böden mit einem höheren organischen Substanzgehalt etwas geringer sein.

Auf die Anwendung einer fluoreszenzmikroskopischen Auszählung der Algen im Filtrat wurde verzichtet, da die vier ausgewählten Algen sich deutlich von den feinen Bodenpartikeln der gefilterten Bodensuspension bei normaler Hellfeldbeleuchtung oder Nutzung der Phasenkontrasteinrichtung bei Vergrößerung um das 100- bis 400fache auszählen ließen (s. Fototafel 5, Bild 3, S. 79).

Allerdings konnten die Algen Stichococcus bacillaris und Klebsormidium flaccidum vom Gel-Biotest nicht im Boden-Biotest eingesetzt werden, da bei Stichococcus die geringe Zellgröße und stäbchenartige Form sich nur unzureichend von den Bodenpartikeln unterschied und das feste fädige Wachstum von Klebsormidium nicht zur Auswertung mit der Neubauer-Zellzählkammer geeignet war.

Die Bestimmung der Algendichte in der gefilterten Erdsuspension mittels Chlorophyllextraktion war nicht möglich, da dazu das Wachstum innerhalb von vier Tagen keine ausreichenden Algendichten ergab. Ebenso war eine an sich effektivere Auszählung der Algendichte mittels Culture-Counter-Gerät nicht möglich, da dieses Gerät nicht in der Lage ist, alle kleineren Bodenpartikel von den Algen zu differenzieren. Die relativ zeitaufwendige Auszählung der Zellen könnte durch ein Bildanalysesystem, daß an ein Mikroskop über Videokamera angeschlossen ist, beschleunigt werden. Da derartige Einrichtungen zur Zeit sehr teuer sind und nur in wenigen Laboren zu Verfügung stehen, wurde die Auswertung mit der klassischen Zählkammermethode vorgenommen.

Ein wesentlicher Unterschied des hier entwickelten Boden-Biotests war der Einsatz von vier Algenarten als Testorganismen gegenüber den Arbeiten von Aktins und Tchan (1967), Helling et al. (1971), Lefebvre-Drouet und Calvet (1983), Yanase et al. (1993) und Hammel


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et al. (1998), die nur eine Alge, häufig aus der Gattung Chlorella, als Biotestorganismus einsetzten.

Daß die Beschränkung auf eine Algenart als stellvertretender Testorganismus zur Ermittlung der ungefähren Empfindlichkeit gegenüber Teststoffen für die gesamte Gruppe der Bodenalgen unzureichend ist, wird durch die Untersuchungen von Cullimore und McCann (1977) deutlich. Sie ermittelten für 31 Algenarten, die in landwirtschaftlich genutzten Böden wuchsen, die Sensibilitität gegenüber vier Herbiziden und stellten insbesondere für die Gattungen Chlorella, Lyngbya, Nostoc und Hantzschia fest, daß diese die geringste Sensibilität gegenüber den Herbiziden aufwiesen. Dagegen hatten die Gattungen Chlamydomonas, Chlorococcum, Hormidium, Palmella und Ulothrix die höchsten Sensibilitäten. Dieses Ergebnis ist wesentlich, da einige der oben genannten Biotests, wie von Aktins und Tchan (1967),Helling et al. (1971), Lefebvre-Drouet und Calvet (1983) und Yanase et al. (1993), mit Arten aus der Gattung Chlorella als Testorganismen durchgeführt wurden. In Böden, die mit vier Herbiziden bearbeitet wurden, trat eine fast völlige Hemmung des Wachstums von Chlamydomonas-Arten auf. Stichococcus-Arten kamen nur noch zu 30 bis 40 vor, dagegen Chlorella-Arten noch zu 70 bis 80 (Cullimore & McCann 1977). Dies zeigt die geringe Sensibilität von Chlorella-Arten und macht deutlich, daß Aussagen, wie bei Aktins und Tchan (1967) über die geringere Sensibilität des Algenbiotests auf Atrazin im Vergleich z. B. zum Hafer-Wuchs-Test, der etwas empfindlicher auf Atrazin reagiert, nicht auf Biotests mit anderen Algenarten übertragen werden können. Aktins und Tchan (1967) arbeiteten nur mit Chlorella pyrenoidosa. Zusätzlich kamen Lefebvre-Drouet und Calvet (1983) gut eineinhalb Jahrzehnte später beim Vergleich zwischen einem Biotest mit Chlorella pyrenoidosa und dem Hafer-Wuchs-Test zu dem Schluß, daß beide Methoden für Atrazin zu Ergebnissen ähnlicher Größenordnung führen. Allerdings handelte es sich hier um einen anderen Biotestaufbau für die Alge als bei Aktins und Tchan (1967). Dies zeigt unter anderem den Einfluß eines unterschiedlichen Testdesigns auf die Sensibilität eines Testorganismus.

4.5.2 Standardisierung des Boden-Biotests

Wie Abb. 8 (s. S. 54) für die Reduktion des Algenwachstums durch Isoproturon zeigt, war beim Boden-Biotest innerhalb von vier Tagen die Messung der Wachstumssteigerungen verschiedener Algen in einem naturnahen Boden möglich. Somit konnten die verschiedenen toxikologischen Kennwerte gegenüber Teststoffen ermittelt werden. Durch die viermalige mikroskopische Bestimmung der Zelldichte (s. Tab. A18.1 bis A18.12, S. 138 bis 142) einer Erdsuspension und die dreimalige Versuchswiederholung konnten für Biotests relativ niedrige Variationskoeffizienten für alle Algen von 5 bis 15 und bei Xanthonema tribonematoides aufgrund der größeren Zellen von ca. 25 erzielt werden.

Aufgrund der zeitlich relativ aufwendigen Auswertung mit Hilfe des Mikroskopes und der Neubauer-Zellzählkammer konnten innerhalb eines Versuchsdurchgangs keine Parallelen angesetzt werden. Aus diesem Grund muß der Boden-Biotest mindestens drei- bzw. viermal


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wiederholt werden, damit die Bestimmung reproduzierbarer toxikologischer Kenndaten möglich ist.

4.5.3 Toxikologische Kennwerte für Cadmium und Isoproturon im Boden-Biotest

Bis zu einer Cadmiumkonzentration von 8,0 mg/kg OECD-Mediumbodengemisch konnte im Boden-Biotest keine hemmende Wirkung auf das Algenwachstum festgestellt werden. Dementsprechend hätte zur Bestimmung des EC10- und EC50-Wertes der Algen die Cadmiumchloridkonzentration gegenüber dem Gel-Biotest um ein Vielfaches erhöht werden müssen. Da es ein Ziel der Untersuchung war herauszufinden, ob Bodenalgen empfindlich auf Cadmium im Boden reagieren und eine Konzentration von 8,0 mg/kg OECD-Mediumbodengemisch weit über den Grenz- und Maßnahmenwerten (s. Kap. 4.2.1, S. 59) liegt bzw. nach Koch (1991) ab 1,0 mg/kg TS Boden ein Boden nicht mehr als unbelastet bezeichnet werden kann, wurde der Versuch nicht mit höheren Konzentrationen durchgeführt.

Zahlreiche Untersuchungen, von denen hier nur einige wenige genannt werden, beschäftigen sich mit Cadmiumkontaminationen im Boden und deren Einfluß auf verschiedenste Bodenorganismengruppen. Für Bakterien gibt es Untersuchungen, die den Einfluß von Cadmium auf die unterschiedlichen bakteriellen Stoffwechselaktivitäten anhand der Kohlendioxid-Produktion (Chang & Broadbent 1981), der Stickstoff-Mineralisation (Liang & Tiabatabai 1977), des Fe(III)-Reduktionstests (Welp & Brümmer 1988), der Arginin-Ammonifikation und Dehydrogenaseaktivität (Wilke 1991) und der mikrobiellen Biomasse (Frostegard et al. 1993) ermitteln. Untersuchungen über einzelne Bodenbakterienarten und deren Sensibilität gegenüber Cadmium gibt es kaum. Ebenfalls berechnen wenige Untersuchungen EC-Werte, sondern geben nur die prozentuale Hemmung gegenüber der Kontrolle an. Wilke (1991) stellt für 19 verschiedene Böden, die mit einer hohen Cadmiumkonzentration von 200 mg/kg TS Boden belastet wurden, die prozentuale Hemmung der Arginin-Ammonifikation und Dehydrogenaseaktivität nach 70 Tagen fest. In Tab. 17 (s. S. 83) sind die Ergebnisse von zwei Böden dargestellt, von denen einer mit einer organischen Substanz von 1,8 derjenigen des Testbodens im Bodenalgen-Biotest entsprach. Deutlich wird, daß erst sehr hohe Cadmiumgesamtgehalte zu einer Reduktion der bakteriellen Aktivitäten im Boden führen. Ebenso zeigen die Untersuchungen mit Eisenia fetida, Folsomia candida und drei höheren Pflanzenarten (Tab. 17), daß bei diesen verschiedenen Organismengruppen ebenfalls eine sehr geringe Sensibilität gegenüber Cadmium im Boden besteht. Pestemer et al. (1988) stellen für 15 Testpflanzen fest, daß erst bei einer Cadmiumchloridkonzentration von über 100 bis 1 000 mg/kg TS Boden der EC50-Wert erreicht oder überschritten ist.

Die Toleranz der Algen im Boden-Biotest, die auch durch die Ergebnisse des Schwermetallversuches bestätigt wird (s. Kap. 4.2.2, S. 60 bis 61), und die hohe Toleranz anderer Bodenorganismen in Böden gegenüber Cadmium läßt sich mit den Sorptionsprozessen in Böden erklären.


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Tab.  17 : EC 50 -Werte für Cadmiumchlorid mit unterschiedlichen Boden-Biotests, Cadmium in mg/kg TS Boden angegeben

Testorganismus

Testsubstrat

Organische Substanz in

Zeit in Tagen

EC 50 -Werte in mg/kg TS Boden

Literatur

Algen

               

Scenedesmus subspicatus

naturnaher

Boden

1,8

 

4

 

> 10

 

vorliegende Studie

Xanthonema tribonematoides

naturnaher

Boden

1,8

 

4

 

> 10

 

vorliegende Studie

Xanthonema montanum

naturnaher

Boden

1,8

 

4

 

> 10

 

vorliegende Studie

Chlamydomonas noctigama

naturnaher

Boden

1,8

 

4

 

> 10

 

vorliegende Studie

Bodenmikroorganismen 1)

             
           

bei

 

Arginin-Ammonifikation

natürlicher

Boden

1,8

 

70

 

200 mg Cd/kg

n. b.1)

Wilke 1991

           

bei

 

Arginin-Ammonifikation

natürlicher

Boden

3,6

 

70

 

200 mg Cd/kg

82 1)

Wilke 1991

           

bei

 

Dehydrogenaseaktivität

natürlicher

Boden

1,8

 

70

 

200 mg Cd/kg

13 1)

Wilke 1991

           

bei

 

Dehydrogenaseaktivität

natürlicher

Boden

3,6

 

70

 

200 mg Cd/kg

54 1)

Wilke 1991

Regenwurm

               

Eisenia fetida

Artificial

soil2)

20

 

21

 

215

 

Spurgeon & Hopkin 1995

Collembolen

               

(Springschwänze)

Folsomia candida 3)

Artificial

soil2)

20

 

28

 

590

 

Sandifer & Hopkin 1996

Pflanzen

               

Brassica rapa

(Herbstrübe)

natürlicher

Boden4)

1,5

 

14

 

> 100

 

Pestemer et al.

1988

Lepidium sativum

(Gartenkresse)

natürlicher

Boden4)

1,5

 

14

 

> 100

 

Pestemer et al.

1988

Trifolium pratense

(Rotklee)

natürlicher

Boden4)

1,5

 

14

 

> 100

 

Pestemer et al.

1988

1)

2)

3)

4)

Wilke (1991) untersuchte die Hemmung der Dehydrogenaseaktivität und Arginin-Ammonifikation in Böden, die mit einer Cadmiumkonzentration von 200 mg/kg TS Boden belastet wurden, und ermittelte die prozentuale Hemmung, n. b. (nicht bestimmbar).

„Artificial soil“ ist ein künstlich hergestellter Boden aus 70 Sand, 20 Kaoline und 10 organischer Substanz als Sphagnum Torf, Testparameter war die Wachstumsrate.

Testparameter war die Reproduktion.

Der Boden war ein lehmiger Sand, 1,5 Corg, 1 Ton, 26 Schluff, 72 Sand.

In den Bodenuntersuchungen des Schwermetallversuches wurde deutlich, daß bei Gesamtcadmiumgehalten von ungefähr 7 mg/kg TS Boden nur ungefähr 0,5 mg/kg TS Boden durch Calciumchlorid extrahierbar sind (s. Tab. A1 und A2, S. 113 bis 114). Auch bei diesen Konzentrationen handelt es sich nicht unbedingt um die für Algen bioverfügbaren Cadmiumkonzentrationen. Diese könnten noch geringer sein. Wilke (1991) ermittelte bei 19 Böden, die künstlich mit 200 mg/kg TS Boden Cadmiumchlorid belastet wurden, durch Untersuchung der Perfusionslösung, daß in allen Böden mehr als 99 % des Gesamtcadmiumgehaltes sorbiert und somit wahrscheinlich nicht mehr für die Organismen verfügbar waren.


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Dies erklärt, warum nicht nur für Algen, sondern für zahlreiche Testorganismen in Boden-Biotests hohe Cadmiumkonzentrationen von über 10 mg/kg TS Boden noch keinen oder nur einen geringen Einfluß auf die Wachstumsraten der Organismen hatten (s. Tab. 17, s. S. 83).

Beim Vergleich der EC50-Werte (s. Tab. 17) muß berücksichtigt werden, daß die Biotests in zahlreichen Versuchsparametern (z. B. Kulturbedingungen) voneinander abwichen und unterschiedliche Böden und bodenähnliche Substrate nutzten. Damit muß auch von einer unterschiedlichen Bioverfügbarkeit des Cadmiums in den Biotests ausgegangen werden. Welp und Brümmer (1988) stellten fest, daß bei einem höheren Gehalt an organischer Substanz des Bodens meistens die Toxizität von verschiedenen Xenobiotika, wie z. B. Cadmium oder Atrazin, im Boden gegenüber Organismen sinkt. Berger und Heitefuss (1991) konnten nachweisen, daß in Sandböden Herbizideffekte deutlicher ausgeprägt waren als in Lehmböden. Allgemein wird die Sorption von Xenobiotika überwiegend durch die Adsorption an die organische Substanz und an Tonminerale bestimmt, wobei den wichtigsten Einfluß die organische Substanz ausübt (Hock et al. 1995).

Für Isoproturon weisen die EC10- und EC50-Werte (Tab. 13, s. S. 55) aller Algen eine ähnliche Sensibilität auf. Wie die bereits diskutierten Ergebnisse des Gel-Biotests und die Ergebnisse des Boden-Biotests deutlich machen, haben Unterschiede in der Zellmorphologie, Vermehrungsart und besonders auch das unterschiedliche Verhältnis von Zelloberfläche zum Zellinneren keine erkennbare Auswirkung auf die Sensibilität der Algen. Die untersuchten Bodenalgen und Scenedesmus subspicatus weisen mit einem durchschnittlichen EC50-Wert von 0,5 mg/l OECD-Mediumbodengemisch eine hohe Sensibilität gegenüber Isoproturon auf. Rechnet man diesen Wert auf Trockensubstanz Boden um, so beträgt er 0,63 mg/kg TS Boden.

Reese-Stähler et al. (1999) stellten bei einer praxisüblichen Aufwandmenge für Isoproturon (1,5 kg/ha in Form von 3 l Fenikan, Isoproturon-Anteil 500 g/l und Diflufenican-Anteil 62,5 g/l) eine Stunde nach Applikation in den genommenen Bodenproben (Tiefe: 0 cm bis 5 cm) eine Isoproturonkonzentration von 1,6 mg/kg TS Boden fest. Dieser Wert lag nach 13 Tagen noch bei ca. 0,7 mg/kg TS Boden. Parallel dazu wurde mit dem Modul ANPROG aus dem Expertensystem PEMOSYS (Pestemer & Günther 1997) eine Simulation des Abbaus von Isoproturon durchgeführt, das aber im Vergleich zu den gemessenen Werten den Abbau unterschätzte. Diese Unterschätzung entstand dadurch, daß das Simulationsmodell ANPROG den Abbau in der 0 cm bis 10 cm Bodenschicht simuliert, in der genannten Studie aber nur die oberen 5 cm untersucht wurden. Ausgehend von den gemessenen Isoproturonkonzentrationen im Boden und dem in vorliegender Untersuchung ermittelten EC50-Wert für Algen von


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0,63 mg/kg TS Boden, ist es sehr wahrscheinlich, daß ein Großteil der Algen in den ersten Tagen in ihrem Wachstum gehemmt bzw. abgetötet wurden. Diese Vermutung ist der Einschränkung unterworfen, daß die organische Substanz des Bodens aus der Untersuchung von Reese-Stähler et al. (1999) mit durchschnittlich 3 und der Tongehalt mit 14 höher als im Boden des Boden-Biotests mit 1,8 organischer Substanz und 9,6 Ton lag. Der Schluffanteil war in beiden Böden 38 .

Neuhaus (1999) konnte in den von Reese-Stähler et al. (1999) analysierten sandigen Lehmböden eine deutliche Reduktion der Gesamtalgendichte von 20 bis 38 ermitteln. Für die Kieselalge Navicula spec. zeigte sich noch eine 88ige Reduktion gegenüber der Kontrolle 118 Tage nach Applikation. Xanthonema spec. wies 13 Tage nach Applikation eine 40ige Reduktion auf, die über mehrere Monate anhielt. Damit waren diese beiden Algenarten deutlich empfindlicher gegenüber dem Herbizid Fenikan als die Gesamtalgendichte. Aus diesen Untersuchungen schloß Neuhaus (1999), daß Bodenalgen als empfindliche Indikatoren für bestimmte Herbizide einzustufen sind. In vorherigen Freilanduntersuchungen hatte Neuhaus (1994) bei einer Applikation von 3 l Arelon je Hektar (1,5 kg Isoproturon je Hektar) festgestellt, daß die Gesamtbodenalgendichte in einem lehmigen Sand mit einer organischen Substanz von ca. 1,8 8 Wochen nach Applikation noch um ca. 75 gegenüber dem Kontrollboden reduziert war.

In Tab. 18 (s. S. 86) sind die EC50-Werte aus Boden-Biotests mit verschiedenen Bodenorganismen für Isoproturon aufgeführt. Wie beim Cadmiumchlorid können für die mikrobiologischen Untersuchungen und für die Biotests mit höheren Pflanzen keine EC50-Werte aus der Literatur angegeben werden, sondern nur die prozentuale Hemmung der Aktivitäten gegenüber der Kontrolle für ausgewählte Konzentrationen. Um die Ergebnisse des Boden-Biotests, in dem sich die Werte auf mg/kg OECD-Mediumbodengemisch beziehen, mit den Angaben der Aufwandmengen für Isoproturon auf einen Hektar vergleichen zu können, wurde die Aufwandmenge je Hektar unter der Annahme einer Lagerungsdichte (bzw. des Raumgewichtes) von ungefähr 1 g/cm3 auf mg/kg Boden (Tiefe: 10 cm) umgerechnet.

Die dargestellten Ergebnisse aus dem Wirkstoffdatenblatt BBA (1993) ergeben, daß die untersuchte Bodenmikroflora in ihrer Aktivität nicht negativ beeinflußt wird. Domsch (1992) kam bei einer vergleichenden Literaturstudie ebenfalls zu der Einschätzung, daß nachhaltige Effekte auf die Mikroflora bei praxisüblicher Dosierung nicht zu erwarten sind. Demgegenüber haben Malkomes (1980), Mudd et al. (1985) und Berger und Heitefuss (1991) bei Freilanduntersuchungen mit Isoproturon bei praxisüblicher Dosierung eine Veränderung der Dehydrogenaseaktivität beobachtet. Malkomes (1980) hat bei einer Isoproturonausbringung von 1,5 kg/ha bzw. ca. 1,5 mg/kg Boden (Tiefe: 10 cm) in Feldversuchen und Gefäßversuchen mit Wintergerste eine Reduktion der Dehydrogenaseaktivität festgestellt. Mudd et al. (1985) haben bei einer Anwendung von 2,5 kg/ha Isoproturon bzw. ca. 2,5 mg/kg Boden (Tiefe: 10 cm) eine Veränderung in der Rhizosphäre von Winterweizen ermittelt und Zu- und Abnahmen der Keimzahlen von Bakterien und Pilzen.


86

Tab.  18:  EC 50 -Werte oder prozentuale Hemmungen gegenüber der Kontrolle für Isoproturon mit unterschiedlichen Boden-Biotests; EC 50 - Werte in mg/kg OECD-Mediumbodengemisch

Testorganismus

Testsubstrat

Zeit in Tagen

EC 50 - Werte
bzw. s. 2)

Literatur

Algen

Scenedesmus subspicatus

schluffiger
Sand

4

   

0,35

vorliegende Studie

Xanthonema tribonematoides

schluffiger
Sand

4

   

0,21

vorliegende Studie

Xanthonema montanum

schluffiger
Sand

4

   

0,92

vorliegende Studie

Chlamydomonas noctigama

schluffiger
Sand

4

   

0,46

vorliegende Studie

Bodenmikroorganismen

Stickstoffmineralisierung

schluffiger
Sand1)

28

 

bei ca. 2,0
keine Hemmung2)

Wirkstoffdatenblatt

BBA (1993)

Stickstoffmineralisierung

toniger
Lehm1)

28

 

bei ca. 2,0
keine Hemmung2)

Wirkstoffdatenblatt

BBA (1993)

Dehydrogenaseaktivität

schluffiger
Sand1)

28

 

bei ca. 2,0
8 2)

Wirkstoffdatenblatt

BBA (1993)

Dehydrogenaseaktivität

toniger
Lehm1)

28

 

bei ca. 2,0
keine Hemmung2)

Wirkstoffdatenblatt

BBA (1993)

Pflanzen

Hordeum spec.
(Wintergerste)

sandiger
Lehm3)

34

 

bei ca. 1,5
keine Hemmung der oberird. Pflanzenmasse, 50

Malkomes (1980)

       

Hemmung der

 
       

Wurzelmasse2)

 

Apera spica-venti
(Windhalm)

Sand4)

4)

 

bei ca. 1,13
98 Reduktion

Maykuhs (1982)

       

der Pflanzen2)

 

Lolium spec.
(Weidelgras)

sandig toniger Lehm5)

5)

 

bei ca. 1,5
100 Reduktion

der Pflanzen2)

Gonzalez Ponce & Rodriguez (1983)

Avena sterilis
(Wildhafer)

sandig toniger Lehm5)

5)

 

bei ca. 1,5
90 Reduktion
der Pflanzen2)

Gonzalez Ponce & Rodriguez (1983)

Regenwurm

Eisenia fetida

artificial
soil6)

14

 

> 1000

Wirkstoffdatenblatt
BBA (1993)

1)

2)

3)

4)

5)

6)

Laborversuch; nach den Richtlinien für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln (Anderson et al. 1990) hat der Sandboden eine org. Sub. von 1 bis 2 und der Lehmboden von 2 bis 6 .

Hemmung in Prozent gegenüber der Kontrolle bei genannter Konzentration in mg/kg Boden.

Gefäßversuch; der Testboden hatte einen Anteil an org. Sub. von 5,6 .

Freilandversuch, Sandboden mit 2 bis 3 org. Sub., Versuchsdauer bis zur Ernte.

Freilandversuch, sandig toniger Lehmboden, keine Angabe der org. Sub., Versuchsdauer bis zur Ernte

Laborversuch; „artificial soil“ ist ein künstlich hergestellter Boden aus 70 Sand, 20 Kaoline und 10 organischer Substanz als Sphagnum Torf, Testparameter war die Wachstumsrate.

Sie schlossen aber aus den Ergebnissen, daß bei einer praxisüblichen Anwendung von ca. 1,5 kg/ha mit keiner schädlichen Wirkung auf Bodenmikroorganismen oder die Bodenfruchtbarkeit gerechnet werden muß. Berger und Heitefuss (1991) ermittelten in Feldversuchen eine Reduktion der Dehydrogenaseaktivität um 15 % bis 30 % bei einer Isoproturonkonzentration von ca. 1,5 kg/ha. Diese Hemmung konnten sie in Laborversuchen nicht mehr eindeutig nachweisen. Die Unterschiede zwischen Freiland- und Gefäßversuchen mit Pflanzen und Laboruntersuchungen ohne Pflanzen erklärten Berger und Heitefuss (1991) mit dem Einfluß des Isoproturons auf die gegenüber Photosynthesehemmern empfindlichen Algen und der fehlenden Rhizosphärenmikroflora in den Laborversuchen.


87

Während das Herbizid Isoproturon für die Anwendung in Kulturen mit Sommergerste, Sommerweizen und Wintergetreiden, ausgenommen Triticale, zugelassen ist (Wirkstoffdatenblatt BBA 1993) und dementsprechend bei praxisüblichen Aufwandmengen von 1,5 bis 2,0 kg/ha bzw. ca. 1,5 bis 2,0 mg/kg Boden (Tiefe: 10 cm) keine deutliche Schädigung hervorruft, reagieren die Algen deutlich sensibler als die genannten höheren Pflanzen. Zusätzlich ist zu berücksichtigen, daß der Boden-Biotest mit Algen nur vier Tage dauert und nicht 14 Tage bis zu mehreren Wochen, wie bei den anderen Biotests (s. Tab. 18, S. 86).

Allerdings konnte Malkomes (1980) bei Wintergerste in Gefäßversuchen eine ca. 50ige Reduktion der Wurzelmassen 34 Tage nach Behandlung mit 2 kg/ha Isoproturon bzw. ca. 2 mg/kg Boden (Tiefe 10 cm) feststellen. Die oberirdische Pflanzenmasse war aber nicht eindeutig geringer gegenüber der Kontrolle. Kees (1984) untersuchte die Kulturverträglichkeit verschiedener Herbizide in der Spätanwendung für Wintergerste unter unkrautfreien Bedingungen und stellte bei einer Isoproturonaufwandmenge von 2,0 kg/ha eine Kornertragsminderung von ca. 5  fest. Angaben über Bodenparameter wurden nicht gemacht. Maykuhs (1982) konnte bei Versuchen zur Unkrautbekämpfung in Triticale in einem Sandboden (organische Substanz von 2  bis 3 ) bei einer Arelonaufwandmenge von 1,5 kg/ha bzw. ca.1,5 mg/kg Boden (Tiefe 10 cm)eine 98ige Reduktion von Apera spica-venti (Windhalm) erreichen. Für Stellaria media (Vogelmiere), Viola arvensis (Feldstiefmütterchen) und Veronica hederifolia (Efeublättriger Ehrenpreis) wurde eine durchschnittlich 60ige Reduktion ermittelt. Maykuhs (1982) gab für Arelon eine Isoproturonkonzentration von 75  an. Gonzalez Ponce und Rodriguez Senas (1983) ermittelten in einem sandigen Lehmboden (Schluff 18,0 , Ton 13,9  und Sand 68,1 ) eine nahezu 100ige Reduktion von Lolium spec. (Weidelgräser) mit einer Isoproturonkonzentration von 1,5 kg/ha bzw. 1,5 mg/kg Boden (Tiefe 10 cm) und bei gleicher Aufwandmenge in einem sandig tonigen Lehmboden (Schluff 23,7 , Ton 22,4  und Sand 53,9 ) eine ebenfalls 100ige Reduktion von Lolium spec. und eine 90ige Reduktion von Avena sterilis (Wildhafer). Eine Angabe über die organische Substanz in den Böden wurde nicht gemacht.

Da Isoproturon für die Bekämpfung von zweikeimblättrigen Unkräutern, Ackerfuchsschwanz, Windhalm und einjähriger Rispe, eingesetzt wird, sind diese Pflanzen natürlich empfindlich gegenüber der praxisüblichen Aufwandmenge. Aufnahmen und Wirkort von Isoproturon wurden in Kap. 4.4.4 (s. S. 70 bis 72) diskutiert. Die voneinander abweichenden Empfindlichkeiten zwischen den verschiedenen höheren Pflanzen sahen Pfister et al. (1979) und


88

McIntosh et al. (1981) in den unterschiedlichen Bindungsaffinitäten an die Thylakoidmembranen, die bei manchen Gräsern hoch ist und z. B. bei Weizen gering. Ein weiterer Grund für die verschiedenen Empfindlichkeiten war der unterschiedlich schnelle Abbau des Herbizids in den Pflanzen. Es könnte sein, daß Algen ebenfallseine stärkere Bindung des Isoproturons an die Thylakoidmembran aufweisen oder das Isoproturon in den Algen langsamer abgebaut werden kann.

Der Regenwurm Eisenia fetida ist mit einem EC50-Wert von über 1000 mg/kg „artificial soil“ gegenüber Isoproturon nahezu unempfindlich. Ebenso wie bei Cadmium muß auch bei Isoproturon die Sorption durch den Boden berücksichtigt werden, die den wahrscheinlich bioverfügbaren Herbizidanteil für die Algen entscheidend reduziert. Isoproturon besitzt eine Wasserlöslichkeit von 65 g/l Wasser (Perkow & Ploss 1992) und einen Adsorptionskennwert Koc von ca. 100 (Nicholls 1994) und ist damit nach einer Klassifizierung von Kenaga (1980) zur Bodenmobilität von Herbiziden ein mobiles Pflanzenschutzmittel. Der Koc-Wert ist ein Adsorptionskoeffizient, der sich auf die organische Substanz bezieht. Er wird bestimmt, indem der Adsorptionskoeffizient (KD) mal 100 genommen und dann durch die organische Substanz in Prozent geteilt wird. Beim KD-Wert handelt es sich um den Adsorptionskoeffizienten, der das im Gleichgewichtszustand eingestellte Verhältnis zwischen der Konzentration des an den Boden adsorbierten Herbizids (Ca) und der Konzentration in der Bodenlösung (Ce) angibt. Der Dampfdruck von Isoproturon beträgt 3,3 mPa bei 20 °C, und die Halbwertzeit (DT50-Wert) im Boden liegt nach Angaben der Firma Rhone-Poulenc Agro bei 12 bis 32 Tagen (Perkow & Ploss 1992). Damit kann für den Boden-Biotest mit Algen davon ausgegangen werden, daß das Isoproturon sich in dem Versuchszeitraum von 96 h nur geringfügig reduziert. Die Halbwertzeit wird hier auch noch größer sein, da der Boden durch die Erhitzung beim Trocknen auf 105 °C nur noch eine eingeschränkte mikrobiologische Aktivität hat. Mandal (1986) konnte für sterilisierte Böden einen Anstieg der Halbwertzeit von Isoproturon auf 75 Tage gegenüber nicht sterilisierten Böden mit ca. 30 Tagen feststellen. Eine Reduzierung des Isoproturongehaltes durch Verflüchtigung kann fastvölligausgeschlossen werden. Maas et al. (1988) stellten in einem Laborversuch eine 3ige Verflüchtigung von Isoproturon nach 12 h von einem schwachsorptiven lehmigen Sandboden fest.

Es liegen zahlreiche Publikationen, z. B. von Gaillarden (1997) und Pantani et al. (1997) zu tonigen Lehmböden, Perrin-Ganier et al. (1996) zu einem tonigen Schluffboden, Reese-Stähler et al. (1999) zu einem sandigen Lehmboden, Berger und Heitefuss (1990) und Cox und Walker (1999) zu verschiedenen Böden, vor, die sich mit der Adsorption von Isoproturon im Boden beschäftigen. In den Untersuchungen von Reese-Stähler et al. (1999) zeigte sich, daß die wasserextrahierbaren und damit nach Stalder und Pestemer (1980) potentiell pflanzenverfügbaren Isoproturonanteile in den ersten 13 Tagen nach Applikation 40  bis 50  betrugen. Dieser Anteil reduzierte sich aber nach 40 Tagen auf ungefähr 20 . Berger und Heitefuss (1990) ermittelten für Isoproturon bei einem tonigen Schluffboden mit 1,8  organischer Substanz, 18,8  Ton und 73,4  Schluff direkt nach Ausbringung von 1,5 kg/ha einen wasserextrahierbaren Anteil von ca. 50 , der nach 21 Tagen nur noch bei ca. 30  lag. Zu ähnlichen Ergebnissen des wasserextrahierbaren Anteils von 58,1  direkt nach Isoproturonausbringung von 1,8 kg/ha und 9,25  nach 45 Tagen kamen Perrin-Ganier et al.


89

(1996) für einen Boden mit Gehalten von 2,6  organischer Substanz, 26,1  Ton und 49,7  Schluff. Da die Sorption von Pflanzenschutzmitteln überwiegend durch den Gehalt der organischen Substanz und teilweise durch den Tongehalt im Boden bestimmt wird (Hock et al. 1995 undMeyer-Windel et al. 1997) und diese bei Berger et al. (1990), Perrin-Ganier et al. (1996) und Reese-Stähler et al. (1999) zwischen 1,8  bis 3  organischer Substanz und 14  bis 26,1  Ton lagen, gegenüber 1,8  organischer Substanz und 9,6  Ton im Boden-Biotest, kann für diesen Boden von einem etwas höheren im Wasser gelösten Anteil von ca. 65  direkt nach Isoproturonzugabe ausgegangen werden. Er wird sich in den ersten 4 Tagen nur um wenige Prozent verringert haben. Dieser Anteil und eventuell auch der an den Boden sorbierte Anteil (s. Kap. 4.6, S. 89 bis 91) könnte die in Tab. 13 (s. S. 55) aufgeführte Reduktion des Algenwachstums bewirken.

Es wird ähnlich wie beim Gel-Biotest (s. Tab. 16, S. 74) deutlich, daß Algen als photosynthesebetreibende Organismen zu den empfindlichsten Testorganismen gegenüber Photosynthesehemmern gehören. Pipe (1992) wies ebenfalls auf die hohe Empfindlichkeit von Algen auf Herbizide hin, insbesondere für die, die in das Photosynthesesystem eingreifen. Besonders interessant ist die höhere Empfindlichkeit einiger Algen gegenüber Herbiziden im Vergleich zu einigen Pflanzen. Dies läßt den relativ einfachen und in wenigen Tagen durchführbaren Boden-Biotest mit Algen, der ein Test mit eukaryontischen Pflanzenzellen ist, als einen geeigneten Vortest in der Beurteilung insbesondere von Pflanzenschutzmitteln in Erwägung ziehen. Er könnte vor den intensiveren Untersuchungen mit Pflanzenbiotests durchgeführt werden und diese ergänzen. Letztlich werden aber Algentests Pflanzentests nicht ersetzen können, da Pflanzentests weitere Informationen über die Aufnahme des Pflanzenschutzmittels über die Wurzeln aus tieferen Bodenschichten und Verteilung des Mittels in der Pflanze liefern. In Deutschland werden Algenbiotests schon zur Beurteilung von Pflanzenschutzmitteln eingesetzt und einige Herbizide sind auch als algentoxisch (Kennzeichen NW 262) eingestuft worden, wie z. B. neben Isoproturon auch Amitrol, Linuron und Paraquat. Eine ausführliche Auflistung geben Hock et al. (1995). Allerdings bezieht sich die ermittelte Algentoxizität immer nur auf den DIN-Algentest mit der Süßwasseralgenart Scenedesmus subspicatus oder Selenastraum capricornutum in einem Flüssigmedium und eben nicht auf Bodenalgen in einem Boden.

4.6 Vergleich der Ergebnisse vom Gel-Biotest und Boden-Biotest

Der Vergleich der EC50-Werte (s. Tab. 14, S. 55), die im Gel-Biotest und Boden-Biotest gewonnen wurden, zeigt, daß Cadmium im wasserähnlichen Flüssigmedium für Algen ab Konzentrationen von 0,3 mg/l bis 6,0 mg/l deutlich toxisch ist, aber im naturnahen Boden des Boden-Biotests bei Konzentrationen von 8,0 mg/kg TS Boden keine toxische Wirkung auf Algen zu erkennen ist. Deutlich wird der große Unterschied zwischen Gel-Biotest und Boden-Biotest. Im Schwermetallversuch im Freiland konnte sogar bei einem Cadmiumgesamtgehalt von 180 mg/kg TS Boden keine Reduzierung, sondern sogar ein verstärktes Algenwachstum der Gesamtalgenpopulation festgestellt werden. Laborexperimente und Feldversuche belegen


90

die eher geringe Sensibilität von Algen gegenüber Cadmium, bis auf die zwei Ausnahmen im Gel-Biotest Scenedesmus und Klebsormidium.

Es läßt sich eindeutig belegen, daß beim Cadmium im Boden-Biotest die toxische Wirkung auf Algen drastisch gegenüber dem Gel-Biotest abnimmt. Ein großer Anteil des Cadmiums im Boden wird sorbiert und der bioverfügbare Gehalt im Boden stark verringert.

Erstaunlich ist im Vergleich mit den Ergebnissen des Schwermetallversuches, daß sogar in Böden mit einem calciumchloridlöslichen Cadmiumgehalt von bis zu ungefähr 20 mg/kg TS Boden keine Hemmung des Algenwachstums auftritt, obwohl im Gel-Biotest spätestens ab ca. 6 mg/l (s. Tab. 12, S. 53) eine deutliche Hemmung des Wachstums der sechs Testalgen meßbar ist. Es ist davon auszugehen, daß der calciumchloridlösliche Anteil höher ist als die für die Algen bioverfügbaren Schwermetallgehalte.

Aus diesen mit dem hier entwickelten Biotestsystem gewonnenen Ergebnissen kann jedoch nicht geschlossen werden, daß Cadmium ein unbedenkliches Schwermetall ist und kaum in Pflanzen aufgenommen wird. Untersuchungen z. B. von Salt (1988) zeigen, daß Cadmium in höheren Pflanzen, besonders in den Speicher- und Sproßorganen, angereichert wird und damit cadmiumbelastete Böden letztlich eine Gefahr für zahlreiche Organismengruppen bis zum Menschen darstellen. Hier zeigt sich die Wichtigkeit, die Bewertung eines Stoffes nicht nur mit einem Biotest vorzunehmen, sondern mit verschiedenen Testsystemen, analytischen Untersuchungsmethoden und Freilandversuchen. Die Fülle dieser Untersuchungen führte in Europa dazu, daß man anorganische Herbizide, wie z. B. Arsenverbindungen, oder Quecksilberverbindungen als Fungizide und andere schwermetallhaltige Pflanzenschutzmittel kaum mehr benutzt und für einen Großteil dieser Mittel ein Anwendungsverbot erlassen wurde (Hock et al. 1995).

Der Vergleich der Ergebnisse für Isoproturon zwischen Gel-Biotest und Boden-Biotest zeigt, daß die Ergebnisse des Gel-Biotests, unter Berücksichtigung der Konfidenzintervalle, sich kaum von denen des Boden-Biotests unterscheiden. Das läßt sich teilweise damit erklären, daß Isoproturon ein sorptionsschwacher Wirkstoff ist, der gut in Wasser löslich und im Boden relativ mobil ist. Durch den Vergleich (s. Kap. 4.5.3, S. 88 bis 89) mit Böden aus Untersuchungen von Hock et al. (1995),Meyer-Windel et al. (1997), Berger et al. (1990), Perrin-Ganier et al. (1996) und Reese-Stähler et al. (1999), die ähnliche Bodenparameter wie der Boden des Boden-Biotests aufwiesen, kann die Vermutung abgeleitet werden, daß ein Isoproturon-Anteil von 65 mit Wasser extrahierbar und damit für die Organismen im Boden-Biotest verfügbar ist. Somit werden die Algen über die Bodenlösung im Boden-Biotest einem Großteil des Isoproturongesamtgehaltes ausgesetzt sein. Allerdings müßte der Isoproturonanteil, der für die Organismen verfügbar ist, um 35 geringer sein als im Gel-Biotest. Dieser Anteil müßte im Boden adsorbiert und nicht bioverfügbar sein.

Trotz dieses wahrscheinlich adsorbierten Isoproturonanteils sind die toxikologischen Kennwerte für Isoproturon des Gel-Biotests nahezu identisch mit denen des Boden-Biotests (s. Tab. 12 bis 14, S. 53 bis 55). Untersuchungen, die Bakterien als Testorganismen einsetzten, führten zu ähnlichen Ergebnissen. So konnten Rönnpagel et al. (1995) nachweisen, daß in Biotests mit Böden und synthetischen Sedimenten, die z. B. mit Kupfer belastet


91

wurden, die Sensibilität von Bacillus cereus sogar größer war als in aquatischen Biotests. Untersuchungen mit Arthrobacter globiformis (Rönnpagel et al. 1998) führten zu ähnlichen Ergebnissen. Ebenso stellte Ahlf (1995) für Sedimente fest, daß neben den mit Wasser extrahierbaren Schadstoffkonzentrationen auch sorbierte Schadstoffe einen Einfluß auf Organismen haben können. Es gibt verschiedene Ansätze, diese Phänomene zu erklären.

Ahlf (1995) stellt für die Kontaminationsmöglichkeiten von Organismen in belasteten Sedimenten fest, daß diese besonders auf das Porenwasser, aber auch auf die Aufnahme von organischem Detritus zurückgeführt werden können. Insbesondere bei der Sedimentingestion und Verdauung des Detritus unter veränderten pH-Bedingungen können partikulärgebundene Schadstoffe wieder bioverfügbar und für den Organismus toxisch werden.Allerdings ist es schwierig, diese Erkenntnisse, die in aquatischen Tests mit Sedimenten und/oder mit anderen Organismengruppen gewonnen wurden, einfach auf Böden und Bodenalgen zu übertragen. Für die untersuchten Algen kann eine Aufnahme von Detritus oder Bakterien, wie sie z. B. bei Oligochaeten oder Protozoen vorkommt, ausgeschlossen werden.

Trotzdem besteht die Möglichkeit, daß Bodenalgen als Organismen, die einen engen Kontakt zu Bodenpartikeln haben, durch sorbierte Pflanzenschutzmittelanteile in ihrem Wachstum beeinflußt werden können, indem z. B. die für viele Algen üblichen Schleimhüllen die Verfügbarkeit von sorbierten Schadstoffen ermöglichen.

In verschiedenen Publikationen, wie z. B. von Günther und Pestemer (1990), Hock (1995) und Fent (1998), wird darauf hingewiesen, daß fast ausschließlich die bioverfügbaren Schadstoffe einen Einfluß auf das Wachstum von Organismen haben. Der Einfluß von sorbierten Schadstoffen wird ausgeschlossen oder als gering eingeschätzt. Allerdings wird immer wieder diskutiert, was unter dem Begriff „Bioverfügbarkeit“ grundsätzlich zu verstehen ist (Alef 1994, Rönnpagel et al. 1995 und Fent 1998) und welche Methoden oder Extraktionsmittel notwendig sind, um die bioverfügbaren Anteile eines Stoffes annäherungsweise festzustellen (Debus & Hund 1995).

Somit kann kein abschließendes Urteil gefällt werden, ob die Algen auch durch den sorbierten oder nur durch den bioverfügbaren Isoproturon-Anteil in ihrem Wachstum gehemmt werden.

Schließt man eine Beeinflussung der Algen durch den sorbierten Isoproturonanteil innerhalb der 96 h aus, so besteht eine weitere Erklärungsmöglichkeit für das vorliegende Ergebnis darin, daß die Bodenalgen beim Ansetzen des Versuches mit der gesamten Isoproturonkonzentration in Berührung kommen, bevor ein Teil des Isoproturons im Boden zeitabhängig unterschiedlich stark sorbiert wird und nur teilweise bioverfügbar ist.

Insgesamt zeigt diese Diskussion, daß es noch einen hohen Forschungsbedarf erstens im Bereich der Frage der Bioverfügbarkeit gibt und zweitens in dem Gebiet der Boden-Biotests, insbesondere mit Algen und deren Sensibilität im Vergleich zu aquatischen Biotests. Letzterer Punkt wird in vorliegender Arbeit in Tab. 19 (s. S. 92) behandelt.

Um die Empfindlichkeiten aller Testbodenalgen gegenüber der Wasseralge Scenedesmus vergleichen zu können, wurde der BodenalgenmittelwertEC50 entwickelt. Er besteht aus dem Mittelwert der fünf im Gel-Biotest oder im Boden-Biotest ermittelten EC50-Werte der


92

Bodenalgen mit Angabe der Minimal- und Maximalwerte. Mit diesem Wert wird nicht nur deutlich, ob die getesteten Bodenalgen im Mittel sensibler oder unsensibler als Scenedesmus gegenüber einem Teststoff sind, sondern es ist auch die Reaktionsbreite der Bodenalgen erkennbar.

Vergleicht man die EC50-Werte, die für Cadmium im Gel-Biotest mit Scenedesmus subspicatus gewonnen wurden, mit dem BodenalgenmittelwertEC50, so zeigt sich, daß letzterer Wert mit 4,23 mg/l um das 10fache höher liegt als der EC50-Wert von Scenedesmus, die damit in der Regel empfindlicher gegenüber Cadmium ist als Bodenalgen (s. Tab. 19). Dies könnte damit erklärt werden, daß Algen im Boden höheren Konzentrationen an unterschiedlichsten Stoffen und Spurenelementen ausgesetzt sind und der natürliche Schwermetallgehalt in unbelasteten Böden größer ist als der im Wasser. Für den Boden-Biotest ist aus den in Kap. 4.5.3 (s. S. 82) genannten Gründen keine Berechnung des BodenalgenmittelwertesEC50 möglich.

Tab.  19:  Die BodenalgenmittelwerteEC 50 und die EC 50 -Werte von Scenedesmus subspicatus des Gel-Biotests und des Boden-Biotests für Cadmium und Isoproturon in mg/l OECD-Medium beim Gel-Biotest und in mg/kg OECD-Mediumbodengemisch beim Boden-Biotest.

Bio-test

EC 50 -Wert für Scenedesmus subspicatus bei Cadmium

Bodenalgen-mittelwertEC 50 bei Cadmium

EC 50 -Wert für Scenedesmus subspicatus bei Isoproturon

Bodenalgen-mittelwertEC 50 bei Isoproturon

Gel-

 

Minimum 0,33

 

Minimum 0,25

Biotest

0,44

4,23

0,42

0,75

   

Maximum 8,06

 

Maximum 2,74

Boden-

     

Minimum 0,21

Biotest

> 8,0

> 8,0

0,35

0,53

       

Maximum 0,92

Für Isoproturon läßt sich weder im Gel-Biotest noch im Boden-Biotest ein Unterschied zwischen den EC50-Werten für Scenedesmus und dem BodenalgenmittelwertEC50 feststellen. Die Tatsache, das Scenedesmus subspicatus sich in seinen EC50-Werten nicht wesentlich von den BodenalgenmittelwertenEC50 für den Gel-Biotest und Boden-Biotest unterscheidet, könnte damit erklärt werden, daß Isoproturon ein Xenobotika ist und weder im Boden noch im Wasser vorkommt. Dementsprechend konnten sich keine Toleranzen bei den Bodenalgen gegenüber diesem Teststoff ausbilden.

4.7 Vergleich des Biotestsystems mit Bodenalgen gegenüber anderen Biotests

Die Vorteile des in vorliegender Arbeit entwickelten Testsystems gegenüber einer Vielzahl anderer Biotests und Testsysteme sind in Tab. 20 aufgeführt. Dabei kann nicht auf einzelne


93

Tests, z. B. Pflanzentests mit speziellen Arten, genauer eingegangen werden, so daß die Aussagen nur einen überblicksmäßigen Charakter haben.

Tab.  20:  Vorteile des entwickelten Biotestsystems mit Bodenalgen, bestehend aus Gel- und Boden-Biotest, gegenüber anderen Biotests

Biotests bzw. Biotestgruppen

Vorteile des Testsystems gegenüber einzelnen Biotests bzw. Biotestgruppen

Vorteile gegenüber allen genannten Biotests

Pflanzenbiotests in Böden

  • Nutzung von eukaryontischen Organismen mit kurzen Vermehrungszeiten – Versuchsdauer 96 h
  • Nutzung von pflanzlichen Zellen in einem miniaturisierten Test
  • geringer Material- und Platzbedarf
  • geringe toxische Abfallmengen

  • Vergleichsmöglichkeit der Auswirkung verschiedener Kontaminationspfade auf Algen in flüssigen und bodennahen Substraten durch ähnliches Testdesign zwischen Gel- und Boden-Biotest

Biotests mit Mikroorganismen, die Enzymaktivitäten nutzen

  • Aussagemöglichkeiten über die toxikologischen Kennwerte einzelner Arten – trotzdem Berücksichtigung mehrerer Arten

Biotests mit Mikroorganismen einer Art

  • Einsatz von mehreren cytologisch sehr verschiedenen Algenarten, statt nur einer Art
  • Einsatz von Algenarten aus den Lebensräumen Wasser und Boden

DIN 28 692 Biotest -Wachstumshemmtest mit der aquatischen Alge Scenedesmus subspicatus

  • Einsatz von sechs verschiedenen Algenarten als Testorganismen gegenüber einer Art im DIN-Test
  • Einsatz von Bodenalgenarten, die im DIN-Test bisher unberücksichtigt blieben
  • Vergleichsmöglichkeit zwischen der Sensibilität einer aquatischen Alge (Scenedesmus subspicatus) mit mehreren Bodenalgenarten
  • Miniaturisierung – geringer Material- und Platzbedarf, sowie nur kleine Mengen toxischen Abfalls
  • effektiveres Meßverfahren durch Verwendung eines Mikrotiterplattenphotometers beim Gel-Biotest
  • Durch Verwendung des gleichen Versuchsmediums und der gleichen aquatischen Testlage im Gel-Biotest besteht die Möglichkeit der Vergleichbarkeit und Überprüfbarkeit der Ergebnisse mit Literaturdaten (s. Kap. 4.4.5, S. 75).


94

Insgesamt eignet sich das in dieser Arbeit entwickelte Biotestsystem aus Gel-Biotest und Boden-Biotest dazu, differenzierte Aussagen über das ökotoxikologische Potential von Stoffen für Bodenalgen und für die Süßwasseralge Scenedesmus subspicatus zu erhalten.

Der Einsatz eines Flüssigmediums und eines naturnahen Bodens in dem Biotestsystem ermöglicht die Nachahmung der Kontaminationspfade, über die sich ein Teststoff im Wasser und Boden verbreitet. Somit kann die ökotoxikologische Wirkung von Teststoffen auf Algen im Wasser und Boden gleichermaßen festgestellt werden. Gleichzeitig stellt das entwickelte Testsystem die Bedeutung der noch kaum erforschten Organismengruppe der Bodenalgen mit ihren vielfältigen ökologischen Funktionen, ihrer hohen Artenanzahl und Individuendichte im Boden für die ökotoxikologische Forschung heraus.


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