II. Material und Methoden

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Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Beantwortung von zwei grundlegenden Fragen des Einsatzes der PLV an gesunden, neugeborenen Ferkeln:

  1. Wie wird die cerebrale Hämodynamik und Oxygenierung während partieller Flüssigkeitsbeatmung durch die Einfüllgeschwindigkeit und das PFC-Volumen beeinflußt?
  2. Ist in gesunden Lungen die Beeinflussung des systemischen PaO2 durch die Sauerstofflöslichkeit des PFC mit Rückwirkungen auf die cerebrale Oxygenierung verbunden?

Zur Beantwortung dieser Fragestellungen wurde die cerebrale Konzentration an oxygeniertem und deoxygeniertem Hämoglobin (Hb) mittels Near Infrared Spectroscopy unter den Bedingungen der konventionellen Druckbeatmung (CMV) und bei PFC-Füllung der Lungen zur partiellen Flüssigkeitsbeatmung (PLV) bestimmt. Außerdem wurden hämodynamische Parameter, die Blutgase und das Tidalvolumen erfaßt

II.1. Allgemeine Vorbereitung und Darstellung der Messzeitpunkte

II.1.1. Versuchstiere

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Die verwendeten Ferkel (n= 17) waren in den letzten 24 Stunden vor Versuchsbeginn geboren worden. Die Herkunft war einheitlich:

Agrar-GmbH Bergsdorf, Schweineaufzuchtbetrieb, Liebenberger Weg 12 c,

16775 Bergsdorf, BT Liebenberg

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Der Versuch wurde vom Tierschutzbeauftragten des Berliner Senats genehmigt.

II.1.2. Prämedikation

Die Versuchstiere wurden am Morgen des jeweiligen Versuchstages in die Tier-OP-Einrichtung auf dem Campus Virchow-Klinikum geliefert. Bis zum Versuchsbeginn wurden die Versuchstiere mittels Infrarotlampe vor Kälte geschützt.

Nach dem Wiegen (Sartorius, Germany) erfolgte die Prämedikation mit 8 mg/kg Körpergewicht Stresnil (Azaperon) und 10 mg/kg KG Ketanest (Ketamin) intramuskulär.

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Während der Präparation wurde der Wärmeerhalt über eine herkömmliche Wärmematte und im Verlauf des Versuches durch einen Inkubator sichergestellt.

II.1.3. Präparation

An den sedierten Versuchstieren wurden sowohl ein Nabelvenen- als auch ein Nabelarterienkatheter der Größe 2,5 Ch (Sherwood Medical, Tullamore, Ireland) gelegt, die Tiefe der Katheter betrug 5 bzw. 7,5 cm. Die korrekte Lage wurde durch die freie Aspirierbarkeit von Blut gesichert. Die Einführung der Katheter gestaltete sich problemlos, die Inspektion des abdominellen Situs nach Tötung ergab keinen Anhalt für Fehllagen der Katheter.

Zur Aufrechterhaltung der Analgosedierung wurden in einer Glucose–Elektrolytlösung mit einer Rate von 6 ml/kg/h über den venösen Nabelkatheter dauerhaft 10 mg/kg/h Pentobarbital und 5 µg/kg/h Fentanyl infundiert. Der arterielle Nabelkatheter wurde mit einem Druckwandler zur Blutdruckmessung verbunden und sein Lumen mit heparinisierter NaCl-Lösung mit 1 ml/h kontinuierlich gespült.

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Im nächsten Schritt wurden die Tiere oral intubiert. Eingeführt wurden Tuben der Größe 3,0 Ch (Vygon, France), an denen ein Side-Port vorhanden war. Die Beatmung erfolgte mittels druckgesteuertem Respirator (BP 2001, Bear Medical System, USA).

Anschließend wurde das Tier in Rückenlage auf der Liegefläche eines Inkubators (Isolette, Air Shields, Irland) gelagert. Alle weiteren Arbeiten erfolgten über die geöffnete Arbeitsklappe des beheizten Inkubators. Vorbereitend wurde die Kopfhaut für die NIRS-Messung rasiert und gereinigt. Zum Monitoring der Vitalparameter (Servo SMV 178, Hellige, Germany) wurden auf rasierten Flächen an beiden Schultern sowie am Lendenbereich linksseitig drei EKG-Elektroden angebracht, der Thermosensor wurde substernal angeklebt. Am rechten Vorderlauf (1) sowie am linken Hinterlauf (2) wurden Sonden für die O2-Sättigung befestigt (1-Oximeter, Radiometer Kopenhagen, Dänemark; 2-Hewlett Packard, Modell 66 S). Während der initialen Messungen vor dem Start der PLV zeigten beide Geräte identische Sauerstoffsättigungen an. Im Verlauf der PLV dienten sie der Kontrolle möglicher therapiebedingter prä– und postductaler Sättigungsunterschiede.

Auf den Schädel wurden die Optoden für die Near-infrared Spectroscopy (NIRO 300, Hamamatsu Photonics, Japan) parietal links und rechts im Abstand von 4 cm positioniert. Hierfür wurde mit handelsüblicher Plasteline eine Haube geformt, die dem Schädeldach fest und dicht anlag. Die Haube nahm die Optoden im vorgegebenen Abstand auf und sicherte den korrekten Sitz im Verlauf des Versuchs. Mit einer beidseitigen Baumwollstoff-Ummantelung war die Plasteline-Haube vor Verklebungen mit dem Versuchstier und unabsichtlichen Verformungen geschützt. Desweiteren wurde so die Umlichtabschirmung der Optoden vervollständigt, so daß die Optoden einerseits von der Haube abgedeckt und auch denkbare Reflexion des infraroten Lichts durch die Plasteline mittels Stoffüberzug verhindert wurden.

II.1.4. Allgemeine Beschreibung der Meßzeitpunkte

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Die zeitliche Abfolge aller Meßzeitpunkte (MZP) war in den Experimentprotokollen festgelegt. Während eines MZP wurden die Vitalparameter zunächst handschriftlich erfaßt, danach erfolgte die Blutentnahme für die arterielle BGA.

Zu den MZP erhobene Parameter finden sich in Tabelle 2.

Tabelle 2:

Messmethode

Parameter

EKG

Pulsrate (in min-1)

arterieller Druckwandler

art. Mitteldruck – MAD (in mmHg)

Pulsoxymetrie

art. Sauerstoffsättigung (in %)

Thermosensor

Körpertemperatur (in C°)

Pneumotachograph (Ventrak)

Tidalvolumen (in ml/kg), PIP, PEEP

Blutgasanalyse (BGA)

PaO2, PaCO2 (in mmHg), pH

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Zur Durchführung der BGA wurden über den arteriellen Katheter nach Spülung jeweils ca. 0,2 ml Blut entnommen. Die Analyse wurde unmittelbar darauf durchgeführt (ABL 505, Radiometer Kopenhagen, Dänemark).

Zur Messung des Tidalvolumens, PIP und PEEP wurde der Flowsensor des Ventrak (CO2SMO, Novametrix, USA) zwischen das T-Stück des Beatmungsgerätes und den endotrachealen Tubus plaziert.

Die mittels NIRS gewonnenen Daten für das cerebrale oxygenierte und deoxygenierte Hb wurden kontinuierlich mit einer Aufzeichnungsrate von 1 Sekunde erfaßt. Über das Setzen von Markern unmittelbar zu Beginn eines MZP wurde eine zeitliche Zuordnung für die spätere Auswertung gewährleistet. Ausgehend vom gesetzten Marker wurde aus den Daten der vorangegangenen 15 Sekunden ein Mittelwert gebildet und in die Auswertung einbezogen. Zur Erleichterung der Interpretation der Meßdaten wurden Manipulationen im Verlauf des Experiments mit Markern versehen.

II.2. Beschreibung der speziellen Meßmethodik – Near-infrared Spectroscopy

II.2.1. Grundlagen

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Die Near-infrared Spectroscopy (NIRS) ist eine Methode zur Messung der Konzentrationsänderung von oxygeniertem und deoxygeniertem cerebralem Hb.

Die NIRS verwendet Licht der Wellenlänge 650 – 1000 nm. Infrarotes Licht wird im Gegensatz zu sichtbarem Licht von biologischem Gewebe weniger absorbiert und kann so in tiefere Schichten eindringen. In diesem Bereich haben das oxygenierte und deoxygenierte cerebrale Hb unterschiedliche Absorptionsspektren, so daß der Anteil beider Komponenten bestimmt werden kann.

Man bezeichnet Substanzen mit eigenen charakteristischen Absorptionsspektren als Chromophoren. In biologischen Geweben tragen zur Absorption sowohl Substanzen mit konstantem Absorptionsspektrum (z.B. Wasser, Lipide) als auch Substanzen, deren Absorptionsspektrum mit Änderung der Oxygenierung wechselt (z.B. Hb, Myoglobin), bei.

II.2.2. Lambert-Beer-Gesetz

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Beim Durchtritt von Licht einer bestimmten Wellenlänge durch ein nichtstreuendes Medium mit absorbierender Substanz kommt es in Abhängigkeit seines spezifischen Extinktionskoeffizienten zur Verminderung der Intensität des Lichts. Die Extinktion (A) ist proportional zur Konzentration (c), dem spezifischen Extinktionskoeffizienten (α) und der Schichtdicke (d) der Substanz.

A = α * c * d

In biologischen Geweben resultiert die Extinktion zu 80 % aus Streuung und zu 20 % aus Absorption. Daraus ergibt sich die notwendige Erweiterung des Lambert-Beer-Gesetzes.

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A = α * c* d * B + G

Mit dem Term B, dem Differential Pathlength Factor (DPF), wird die tatsächliche optische Distanz ausgedrückt, da der Weg der gestreuten Photonen länger als der einfache geometrische Abstand der Optoden ist. Dieser Faktor wurde für verschiedene Spezies bestimmt (85).

Der Term G steht für die nicht bestimmbaren Streuungsverluste und ist daher unbekannt. Da die Gleichung nicht aufgelöst werden kann, ist es nicht möglich, die absolute Konzentration der Substanz zu berechnen. Jedoch unter der Annahme, daß G, d und B konstant bleiben, ergibt sich für die Änderung der Extinktion A eine Proportionalität zur Änderung der Konzentration. Mit der NIRS lassen sich somit ausgehend von einer willkürlichen Nullinie Veränderungen der Konzentration von oxygeniertem Hb und deoxygeniertem Hb verfolgen.

II.2.3. Konfiguration des NIRO 300

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Der in der vorliegenden Studie verwendete NIRS-Monitor NIRO 300 (Hamamatsu Photonics K.K., Japan) nutzt als Lichtquelle vier Puls-Laserdioden (Wellenlänge 775, 810, 850 und 905 nm). Bei diesem Gerät besteht die Möglichkeit der Spatially Resolved Spectroscopy (SARS), mit der zusätzlich zur NIRS weitere Parameter berechnet werden können. Auf die SARS wurde jedoch in Rücksprache mit der Herstellerfirma verzichtet, da für die Verwendung des dafür erforderlichen, mit mehreren Sensoren bestückten Detektors an Schädeln, die kleiner als die von Frühgeborenen sind, keine methodische Sicherheit besteht. Im Weiteren wird auf diese Technik daher nicht eingegangen. Unter Mithilfe der Firma Hamamatsu wurde der Detektor durch einen zweiten optischen Fiber ersetzt. Das verwendete Meßprinzip beruhte so allein auf dem Lambert-Beer-Gesetz als Grundlage der NIRS. Zur Berechnung der Meßwerte wurde in Anlehnung an die Arbeit von Van d. Zee et al. (85) ein Differential Pathlength Factor (DPF) für cerebrales Gewebe Neugeborener verwendet.

II.3. Allgemeine Durchführung der konventionellen Druckbeatmung

Initial war eine Beatmungsfrequenz von 40/min, ein PEEP (Positive Endexpiratory Pressure) von 3 cm H2O und ein PIP (Positive Inspiratory Pressure) von 8-10 cm H2O eingestellt. Zunächst war eine FiO2 von 0,21 als Ausgang gewählt.

Die Effektivität der ersten Beatmungseinstellung wurde durch eine BGA kontrolliert. Um den PaCO2 im physiologischen Bereich (35 – 45 mmHg) zu halten, konnte der PIP in Schritten von 1 cm H2O variiert werden. Wenn der PaCO2 sich durch zwei BGA innerhalb von 15 Minuten im physiologischen Bereich bestätigte, begann das Experiment.

II.4. Allgemeine Durchführung der PLV

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Die Versuchsanordnung wurde auf einem Tablett aufgebaut und im Inkubator auf eine Waage (Sartorius, Germany) gestellt. Die Phase der PLV begann mit der Nullsetzung der Waage.

Die Einfüllung des jeweiligen PFC-Volumens und auch die Substitution erfolgten über den Side-Port des Trachealtubus, das bedeutet ohne Dekonnektion vom Beatmungsgerät. Verwendet wurde nicht präoxygeniertes PF 5080 (3M, Neuss, Germany), welches eine Dichte von 1,77 g/ml und eine Sauerstofflöslichkeit von 40 ml O2 pro 100 ml besitzt (s.a. Tab. 1). Zur ständigen Kontrolle und Steuerung eines konstanten PFC-Volumens wurde die Versuchsanordnung permanent gewogen.

II.4.1. Berechnung des Zielgewichtes

Um die intrapulmonale PFC-Menge genau steuern zu können, wurde das Volumen in ein Zielgewicht umgerechnet. Das zu erreichende Zielgewicht ergab sich für a) Gr. I. und II und b) Gr. III wie folgt:

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  1. Zielgewicht = 30 ml * Körpergewicht (in kg) * 1,77 g / ml
  2. Zielgewicht = 10 ml * Körpergewicht (in kg) * 1,77 g / ml

Die Einfüllgeschwindigkeit ergab sich durch die Randomisierung der Versuchstiere. Der Aufbau des PFC-Volumens erfolgte in Gruppe II und III mit einer Geschwindigkeit von

1,5 ml/min Körpergewicht.

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Bei Erreichen des berechneten Gewichts und damit des angestrebten PFC-Volumens wurde eine kontinuierliche PFC-Applikation mit einer Substitutionsgeschwindigkeit von

0,2 ml/min Körpergewicht

durchgeführt. In Abhängigkeit vom Gewichtsverlauf wurde eine Veränderung der Substitutionsgeschwindigkeit notwendig.

II.4.2. Steuerung der PFC-Einfüllung

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Nach Start der PFC-Einfüllung über den Side-Port des Trachealtubus wurde der Gewichtszuwachs am Waagen-Display direkt abgelesen. Die Entwicklung des Gewichts wurde bis zum Abschluß des Versuchs in Minuten-Abständen schriftlich festgehalten. Eine stetige rechnerische Korrektur des Gewichts von den additiven Dauerinfusionen (Spül- und Elektrolytlösung) ermöglichte die genaue Quantifizierung des intrapulmonalen PFC-Volumens.

II.5. Spezielles Experimentprotokoll

Das spezielle Experimentprotokoll wurde so gestaltet, um die oben genannten zwei Fragestellungen zu untersuchen. Dabei sollte zum einen beantwortet werden, wie die cerebrale Hämodynamik und Oxygenierung bei der PLV durch die Einfüllgeschwindigkeit und das PFC-Volumen beeinflußt wird. Alle Tiere durchliefen, randomisiert in drei Gruppen (s.u.), diesen initialen Versuchsteil über 20 Minuten.

Anschließend wurde ein Teil der Versuchstiere aus zwei Gruppen zur Durchführung des zweiten Versuchsteils ausgewählt. Die PLV wurde fortgesetzt, und durch Änderung der FiO2 sollte beantwortet werden, wieweit in gesunden Lungen die Beeinflussung des systemischen PaO2 durch die Sauerstofflöslichkeit des PFC mit Rückwirkungen auf die cerebrale Oxygenierung verbunden ist.

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In dieser Reihenfolge – zunächst dem Vergleich der schnellen vs. langsamen Einfüllung, dann dem Vergleich von langsamer Einfüllung eines niedrigen (10 ml/kg) vs. hohen (30 ml/kg) PFC-Volumen und folgend dem Einfluß der Änderung der FiO2 unter PLV - sind die Meßwerte im Ergebnisteil in drei Abschnitten dargestellt.

Zu Versuchsbeginn, noch vor der Prämedikation, erfolgte die Randomisierung durch Auswahl eines geschlossenen Umschlags, der die Gruppennummer (I, II oder III) enthielt.

  1. Gruppe I schnelle Bolusapplikation von 30 ml PFC/kg: n= 6
  2. Gruppe II langsame Dauerinfusion von 30ml PFC/kg: n= 6
  3. Gruppe III langsame Dauerinfusion von 10 ml PFC/kg: n= 5 (*)
    (*) Von den ursprünglich 6 Tieren dieser Gruppe wurde eines wegen bestehender äußerer Extremitätenverletzung nicht in die Studie miteinbezogen.

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Die Versuchstiere wurden wie bereits beschrieben präpariert, und unter CMV wurde durch PIP-Regulierung der PaCO2 im physiologischen Bereichstabilisiert.

Die Beatmungsparameter (PIP, PEEP, Frequenz) blieben während der folgenden Phase unter CMV mit ansteigender FiO2 zunächst unverändert. Um den Einfluß verschiedener FiO2 auf die Meßparameter zu untersuchen, wurde die FiO2 schrittweise von 0,21 auf 0,5 und 1,0 erhöht. Während dieser Phase unter CMV erfolgte die Messung der Parameter jeweils nach einer Stabilisierung von 15 Minuten. Diese Meßwerte dienten dem Vergleich mit Änderungen der FiO2 unter PLV (zweite Fragestellung) und sind im Ergebnisteil dort mit ausgewertet.

II.5.1. Beeinflussung der cerebralen Hämodynamik durch Einfüllgeschwindigkeit und PFC-Volumen

Für den initialen Teil des Experiments, zum Einfluß von Einfüllgeschwindigkeit und PFC-Volumen, wurden die Einstellungen für die Beatmung (PIP, PEEP, Frequenz, FiO2 1,0) unter PLV beibehalten. Es sollte der alleinige Einfluß der PFC–Applikation während einer Dauer von 20 Minuten auf den Verlauf der cerebralen Hämodynamik erfaßt werden.

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Die PFC-Applikation erfolgte in den Gruppen in unterschiedlicher Weise. Bei schneller Einfüllgeschwindigkeit (Gr. I) wurde eine Spritze (Braun, Germany) an den Side-Port angesetzt und das PFC-Volumen als Bolus innerhalb von 45 Sekunden verabreicht. Bei langsamer Einfüllgeschwindigkeit (1,5 ml/min) und zur Substitution (0,2 ml/min) wurde das PFC mittels Infusiomat (Firma Braun, Germany) appliziert. Die Steuerung der PLV bzw. die Kontrolle des PFC-Volumens erfolgte durch Gewichtsmessung wie unter II.4. beschrieben.

Die letzte Messung unter CMV (FiO2 1,0) diente als Ausgangs-MZP. Die weiteren MZP lagen nach der ersten, dritten, fünften, zehnten Minute und nach 20 Minuten zum Abschluß dieses Versuchsteils.

II.5.2. Einfluß der Änderung der FiO2 unter PLV auf die systemische und cerebrale Oxygenierung

Für den zweiten Teil des Experiments zum Einfluß der Änderung der FiO2 wurde die PLV weitergeführt. Aus den Gruppen II und III wurden dafür insgesamt zehn Versuchstiere ausgewählt. Dazu erfolgte eine Fallzahlabschätzung, nach der fünf Versuchstiere pro Gruppe zur Detektion einer Abnahme der cerebralen Oxygenierung von 4 µmol/l mit α= 5% und β= 20% nötig waren. Die restlichen Versuchtiere wurden wie unter II.5.3. beschrieben getötet.

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Im zweiten Teil des Experiments wurden die Einstellungen für die Beatmung unter PLV geändert. Es wurde gegebenenfalls der PIP wiederum in Schritten von 1 cm H2O erhöht, um den PaCO2 zu normalisieren, d.h. in einem Bereich mit maximal 3 mmHg Abweichung zu den Werten unter CMV zu führen.

Nach der Normalisierung des PaCO2 erfolgte unter PLV mit einer FiO2 von 1,0 eine Messung als Ausgang. Im Weiteren wurde die FiO2 auf 0,5 reduziert, nach einer Stabilierungsphase von 15 Minuten wurde ein MZP durchgeführt. Eine weitere Reduktion der FiO2 auf 0,21 unter PLV erfolgte wegen der Gefahr einer Hypoxie nicht. Im Anschluß erfolgte die Tötung der verbliebenen zehn Versuchstiere.

II.5.3. Versuchsende

Die Tötung der analgosedierten Tiere erfolgte mittels Injektion von 5 ml einer 10%igen KCL–Lösung.

II.6. Statistische Auswertung

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Bis auf die NIRS-Parameter sind alle weiteren Parameter als absolute Meßwerte ausgewertet worden. Die NIRS-Parameter stellen relative Meßwerte dar, die auf den Ausgangswert normiert sind.

Zur Auswertung der Daten zum Einfluß von Einfüllgeschwindigkeit und PFC-Volumen auf die Meßgrößen im Verlauf der ersten 20 Minuten unter PLV wurden für die einzelnen zu den jeweiligen Meßzeitpunkten erhobenen Parameter die Mittelwerte und Standardabweichungen berechnet. In jeder Gruppe wurden die Parameter zwischen den einzelnen Meßzeitpunkten (MZP nach der 1., 3., 5., 10. und 20. Minute) und dem Beginn der Messung (Zeitpunkt 0 vor Beginn der PLV) verglichen. Desweiteren wurde der Verlauf der Parameter über die ersten 20 Minuten zwischen den drei Versuchsgruppen analysiert (Gr. I 30 ml schnell vs. Gr. II 30 ml langsam, Gr. II vs. Gr. III 10 ml langsam). Hierbei wurden die zu den jeweiligen identischen Meßzeitpunkten (s.o.) erhobenen Parameter zweier Gruppen verglichen. Die Unterschiede der Parameter wurde jeweils mittels ANOVA und Bonferroni-Korrektur analysiert, ein p < 0,05 galt als statistisch signifikant.

Auch für den zweiten Teil des Experiments zum Einfluß der Änderung der FiO2 unter CMV und PLV auf die Meßgrößen wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen der Parameter berechnet, verglichen und die statistische Signifikanz der Unterschiede mittels ANOVA und Bonferroni-Korrektur analysiert. Dabei erfolgte in den einzelnen Versuchsgruppen der Vergleich der Parameter bei einer CMV mit FiO2 0,21 (Ausgang) mit den Parametern unter CMV und PLV bei verschiedener FiO2 (0,5/1,0). Weiterhin wurden in jeder Gruppe die Parameter unter CMV und PLV mit identischer FiO2 direkt verglichen. Der Vergleich zwischen den Versuchsgruppen (10 bzw. 30 ml Füllungsvolumen) erfolgte bei gleicher Beatmungsform und FiO2.

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Zur statistischen Auswertung wurde als Software Statgraphics 5.0 (Manugistics, Rockville, USA) verwendet.


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25.10.2005