Die verwendeten Ferkel (n= 17) waren in den letzten 24 Stunden vor Versuchsbeginn geboren worden. Die Herkunft war einheitlich:

Agrar-GmbH Bergsdorf, Schweineaufzuchtbetrieb, Liebenberger Weg 12 c,

16775 Bergsdorf, BT Liebenberg

Der Versuch wurde vom Tierschutzbeauftragten des Berliner Senats genehmigt.

Die Versuchstiere wurden am Morgen des jeweiligen Versuchstages in die Tier-OP-Einrichtung auf dem Campus Virchow-Klinikum geliefert. Bis zum Versuchsbeginn wurden die Versuchstiere mittels Infrarotlampe vor Kälte geschützt.

Nach dem Wiegen (Sartorius, Germany) erfolgte die Prämedikation mit 8 mg/kg Körpergewicht Stresnil (Azaperon) und 10 mg/kg KG Ketanest (Ketamin) intramuskulär.

Während der Präparation wurde der Wärmeerhalt über eine herkömmliche Wärmematte und im Verlauf des Versuches durch einen Inkubator sichergestellt.

An den sedierten Versuchstieren wurden sowohl ein Nabelvenen- als auch ein Nabelarterienkatheter der Größe 2,5 Ch (Sherwood Medical, Tullamore, Ireland) gelegt, die Tiefe der Katheter betrug 5 bzw. 7,5 cm. Die korrekte Lage wurde durch die freie Aspirierbarkeit von Blut gesichert. Die Einführung der Katheter gestaltete sich problemlos, die Inspektion des abdominellen Situs nach Tötung ergab keinen Anhalt für Fehllagen der Katheter.

Zur Aufrechterhaltung der Analgosedierung wurden in einer Glucose–Elektrolytlösung mit einer Rate von 6 ml/kg/h über den venösen Nabelkatheter dauerhaft 10 mg/kg/h Pentobarbital und 5 µg/kg/h Fentanyl infundiert. Der arterielle Nabelkatheter wurde mit einem Druckwandler zur Blutdruckmessung verbunden und sein Lumen mit heparinisierter NaCl-Lösung mit 1 ml/h kontinuierlich gespült.

Im nächsten Schritt wurden die Tiere oral intubiert. Eingeführt wurden Tuben der Größe 3,0 Ch (Vygon, France), an denen ein Side-Port vorhanden war. Die Beatmung erfolgte mittels druckgesteuertem Respirator (BP 2001, Bear Medical System, USA).

Anschließend wurde das Tier in Rückenlage auf der Liegefläche eines Inkubators (Isolette, Air Shields, Irland) gelagert. Alle weiteren Arbeiten erfolgten über die geöffnete Arbeitsklappe des beheizten Inkubators. Vorbereitend wurde die Kopfhaut für die NIRS-Messung rasiert und gereinigt. Zum Monitoring der Vitalparameter (Servo SMV 178, Hellige, Germany) wurden auf rasierten Flächen an beiden Schultern sowie am Lendenbereich linksseitig drei EKG-Elektroden angebracht, der Thermosensor wurde substernal angeklebt. Am rechten Vorderlauf (1) sowie am linken Hinterlauf (2) wurden Sonden für die O₂-Sättigung befestigt (1-Oximeter, Radiometer Kopenhagen, Dänemark; 2-Hewlett Packard, Modell 66 S). Während der initialen Messungen vor dem Start der PLV zeigten beide Geräte identische Sauerstoffsättigungen an. Im Verlauf der PLV dienten sie der Kontrolle möglicher therapiebedingter prä– und postductaler Sättigungsunterschiede.

Auf den Schädel wurden die Optoden für die Near-infrared Spectroscopy (NIRO 300, Hamamatsu Photonics, Japan) parietal links und rechts im Abstand von 4 cm positioniert. Hierfür wurde mit handelsüblicher Plasteline eine Haube geformt, die dem Schädeldach fest und dicht anlag. Die Haube nahm die Optoden im vorgegebenen Abstand auf und sicherte den korrekten Sitz im Verlauf des Versuchs. Mit einer beidseitigen Baumwollstoff-Ummantelung war die Plasteline-Haube vor Verklebungen mit dem Versuchstier und unabsichtlichen Verformungen geschützt. Desweiteren wurde so die Umlichtabschirmung der Optoden vervollständigt, so daß die Optoden einerseits von der Haube abgedeckt und auch denkbare Reflexion des infraroten Lichts durch die Plasteline mittels Stoffüberzug verhindert wurden.

Die zeitliche Abfolge aller Meßzeitpunkte (MZP) war in den Experimentprotokollen festgelegt. Während eines MZP wurden die Vitalparameter zunächst handschriftlich erfaßt, danach erfolgte die Blutentnahme für die arterielle BGA.

Zu den MZP erhobene Parameter finden sich in Tabelle 2.

Messmethode

Parameter

EKG

Pulsrate (in min^-1)

arterieller Druckwandler

art. Mitteldruck – MAD (in mmHg)

Pulsoxymetrie

art. Sauerstoffsättigung (in %)

Thermosensor

Körpertemperatur (in C°)

Pneumotachograph (Ventrak)

Tidalvolumen (in ml/kg), PIP, PEEP

Blutgasanalyse (BGA)

PaO₂, PaCO₂ (in mmHg), pH

Tabelle 2:

Zur Durchführung der BGA wurden über den arteriellen Katheter nach Spülung jeweils ca. 0,2 ml Blut entnommen. Die Analyse wurde unmittelbar darauf durchgeführt (ABL 505, Radiometer Kopenhagen, Dänemark).

Zur Messung des Tidalvolumens, PIP und PEEP wurde der Flowsensor des Ventrak (CO₂SMO, Novametrix, USA) zwischen das T-Stück des Beatmungsgerätes und den endotrachealen Tubus plaziert.

Die mittels NIRS gewonnenen Daten für das cerebrale oxygenierte und deoxygenierte Hb wurden kontinuierlich mit einer Aufzeichnungsrate von 1 Sekunde erfaßt. Über das Setzen von Markern unmittelbar zu Beginn eines MZP wurde eine zeitliche Zuordnung für die spätere Auswertung gewährleistet. Ausgehend vom gesetzten Marker wurde aus den Daten der vorangegangenen 15 Sekunden ein Mittelwert gebildet und in die Auswertung einbezogen. Zur Erleichterung der Interpretation der Meßdaten wurden Manipulationen im Verlauf des Experiments mit Markern versehen.

Die Near-infrared Spectroscopy (NIRS) ist eine Methode zur Messung der Konzentrationsänderung von oxygeniertem und deoxygeniertem cerebralem Hb.

Die NIRS verwendet Licht der Wellenlänge 650 – 1000 nm. Infrarotes Licht wird im Gegensatz zu sichtbarem Licht von biologischem Gewebe weniger absorbiert und kann so in tiefere Schichten eindringen. In diesem Bereich haben das oxygenierte und deoxygenierte cerebrale Hb unterschiedliche Absorptionsspektren, so daß der Anteil beider Komponenten bestimmt werden kann.

Man bezeichnet Substanzen mit eigenen charakteristischen Absorptionsspektren als Chromophoren. In biologischen Geweben tragen zur Absorption sowohl Substanzen mit konstantem Absorptionsspektrum (z.B. Wasser, Lipide) als auch Substanzen, deren Absorptionsspektrum mit Änderung der Oxygenierung wechselt (z.B. Hb, Myoglobin), bei.

Beim Durchtritt von Licht einer bestimmten Wellenlänge durch ein nichtstreuendes Medium mit absorbierender Substanz kommt es in Abhängigkeit seines spezifischen Extinktionskoeffizienten zur Verminderung der Intensität des Lichts. Die Extinktion (A) ist proportional zur Konzentration (c), dem spezifischen Extinktionskoeffizienten (α) und der Schichtdicke (d) der Substanz.

A = α * c * d

In biologischen Geweben resultiert die Extinktion zu 80 % aus Streuung und zu 20 % aus Absorption. Daraus ergibt sich die notwendige Erweiterung des Lambert-Beer-Gesetzes.

A = α * c* d * B + G

Mit dem Term B, dem Differential Pathlength Factor (DPF), wird die tatsächliche optische Distanz ausgedrückt, da der Weg der gestreuten Photonen länger als der einfache geometrische Abstand der Optoden ist. Dieser Faktor wurde für verschiedene Spezies bestimmt (85).

Der Term G steht für die nicht bestimmbaren Streuungsverluste und ist daher unbekannt. Da die Gleichung nicht aufgelöst werden kann, ist es nicht möglich, die absolute Konzentration der Substanz zu berechnen. Jedoch unter der Annahme, daß G, d und B konstant bleiben, ergibt sich für die Änderung der Extinktion A eine Proportionalität zur Änderung der Konzentration. Mit der NIRS lassen sich somit ausgehend von einer willkürlichen Nullinie Veränderungen der Konzentration von oxygeniertem Hb und deoxygeniertem Hb verfolgen.

Der in der vorliegenden Studie verwendete NIRS-Monitor NIRO 300 (Hamamatsu Photonics K.K., Japan) nutzt als Lichtquelle vier Puls-Laserdioden (Wellenlänge 775, 810, 850 und 905 nm). Bei diesem Gerät besteht die Möglichkeit der Spatially Resolved Spectroscopy (SARS), mit der zusätzlich zur NIRS weitere Parameter berechnet werden können. Auf die SARS wurde jedoch in Rücksprache mit der Herstellerfirma verzichtet, da für die Verwendung des dafür erforderlichen, mit mehreren Sensoren bestückten Detektors an Schädeln, die kleiner als die von Frühgeborenen sind, keine methodische Sicherheit besteht. Im Weiteren wird auf diese Technik daher nicht eingegangen. Unter Mithilfe der Firma Hamamatsu wurde der Detektor durch einen zweiten optischen Fiber ersetzt. Das verwendete Meßprinzip beruhte so allein auf dem Lambert-Beer-Gesetz als Grundlage der NIRS. Zur Berechnung der Meßwerte wurde in Anlehnung an die Arbeit von Van d. Zee et al. (85) ein Differential Pathlength Factor (DPF) für cerebrales Gewebe Neugeborener verwendet.

Um die intrapulmonale PFC-Menge genau steuern zu können, wurde das Volumen in ein Zielgewicht umgerechnet. Das zu erreichende Zielgewicht ergab sich für a) Gr. I. und II und b) Gr. III wie folgt:

1. Zielgewicht = 30 ml * Körpergewicht (in kg) * 1,77 g / ml

2. Zielgewicht = 10 ml * Körpergewicht (in kg) * 1,77 g / ml

Die Einfüllgeschwindigkeit ergab sich durch die Randomisierung der Versuchstiere. Der Aufbau des PFC-Volumens erfolgte in Gruppe II und III mit einer Geschwindigkeit von

1,5 ml/min Körpergewicht.

Bei Erreichen des berechneten Gewichts und damit des angestrebten PFC-Volumens wurde eine kontinuierliche PFC-Applikation mit einer Substitutionsgeschwindigkeit von

0,2 ml/min Körpergewicht

durchgeführt. In Abhängigkeit vom Gewichtsverlauf wurde eine Veränderung der Substitutionsgeschwindigkeit notwendig.

Nach Start der PFC-Einfüllung über den Side-Port des Trachealtubus wurde der Gewichtszuwachs am Waagen-Display direkt abgelesen. Die Entwicklung des Gewichts wurde bis zum Abschluß des Versuchs in Minuten-Abständen schriftlich festgehalten. Eine stetige rechnerische Korrektur des Gewichts von den additiven Dauerinfusionen (Spül- und Elektrolytlösung) ermöglichte die genaue Quantifizierung des intrapulmonalen PFC-Volumens.

Für den initialen Teil des Experiments, zum Einfluß von Einfüllgeschwindigkeit und PFC-Volumen, wurden die Einstellungen für die Beatmung (PIP, PEEP, Frequenz, FiO₂ 1,0) unter PLV beibehalten. Es sollte der alleinige Einfluß der PFC–Applikation während einer Dauer von 20 Minuten auf den Verlauf der cerebralen Hämodynamik erfaßt werden.

Die PFC-Applikation erfolgte in den Gruppen in unterschiedlicher Weise. Bei schneller Einfüllgeschwindigkeit (Gr. I) wurde eine Spritze (Braun, Germany) an den Side-Port angesetzt und das PFC-Volumen als Bolus innerhalb von 45 Sekunden verabreicht. Bei langsamer Einfüllgeschwindigkeit (1,5 ml/min) und zur Substitution (0,2 ml/min) wurde das PFC mittels Infusiomat (Firma Braun, Germany) appliziert. Die Steuerung der PLV bzw. die Kontrolle des PFC-Volumens erfolgte durch Gewichtsmessung wie unter II.4. beschrieben.

Die letzte Messung unter CMV (FiO₂ 1,0) diente als Ausgangs-MZP. Die weiteren MZP lagen nach der ersten, dritten, fünften, zehnten Minute und nach 20 Minuten zum Abschluß dieses Versuchsteils.

Für den zweiten Teil des Experiments zum Einfluß der Änderung der FiO₂ wurde die PLV weitergeführt. Aus den Gruppen II und III wurden dafür insgesamt zehn Versuchstiere ausgewählt. Dazu erfolgte eine Fallzahlabschätzung, nach der fünf Versuchstiere pro Gruppe zur Detektion einer Abnahme der cerebralen Oxygenierung von 4 µmol/l mit α= 5% und β= 20% nötig waren. Die restlichen Versuchtiere wurden wie unter II.5.3. beschrieben getötet.

Im zweiten Teil des Experiments wurden die Einstellungen für die Beatmung unter PLV geändert. Es wurde gegebenenfalls der PIP wiederum in Schritten von 1 cm H₂O erhöht, um den PaCO₂ zu normalisieren, d.h. in einem Bereich mit maximal 3 mmHg Abweichung zu den Werten unter CMV zu führen.

Nach der Normalisierung des PaCO₂ erfolgte unter PLV mit einer FiO₂ von 1,0 eine Messung als Ausgang. Im Weiteren wurde die FiO₂ auf 0,5 reduziert, nach einer Stabilierungsphase von 15 Minuten wurde ein MZP durchgeführt. Eine weitere Reduktion der FiO₂ auf 0,21 unter PLV erfolgte wegen der Gefahr einer Hypoxie nicht. Im Anschluß erfolgte die Tötung der verbliebenen zehn Versuchstiere.

Die Tötung der analgosedierten Tiere erfolgte mittels Injektion von 5 ml einer 10%igen KCL–Lösung.