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3.  MATERIAL UND METHODEN

3.1. Antikörper

Die Antikörper gegen a.) Ratten-CCSP, b.) Kaninchen-Megalin und c.) Ratten-Cubilin sind beschrieben worden von a.) Lund et al. (1988a), b.) Moestrup et al. (1993) und c.) Sahali et al. (1993). Antikörper gegen β2 - Mikroglobulin und gegen Laktoferrin wurden von DAKO (Hamburg, Deutschland) erworben. Antikörper gegen das Myc-Epitop wurden von Sigma bezogen. Die Gewinnung polyklonaler Antikörper gegen humanes Apo D und murines 24p3 wurde von Eurogentec (Herstal, Belgien) vorgenommen. Es wurden jeweils einem Kaninchen dreimalig im Abstand von 14 Tagen 150 µg des entsprechenden Proteins injiziert. Die Blutentnahmen fanden an den Tagen 38, 66 und 80 der Immunisierung statt. Die Antiseren wurden bis zur Verwendung bei -80°C aufbewahrt.

Als sekundäre Antikörper wurden verwendet: ein Alexa 546 konjugiertes Anti-Kaninchen IgG (Molecular Probes, Leiden, Niederlande), ein Peroxidase konjugiertes Anti-Kaninchen IgG (DAKO, Hamburg, Deutschland), ein Gold konjugiertes Anti-Kaninchen IgG (British BioCell International, Cardiff, Großbritannien) und ein Peroxidase konjugiertes Anti-Schaf IgG (DAKO, Hamburg, Deutschland).

Als tertiärer Antikörper wurde ein Peroxidase konjugiertes Anti-Peroxidase IgG aus der Ziege (DAKO, Hamburg, Deutschland) genutzt.

3.2. Verwendete Tiere und Organismen

3.2.1. Mäusehaltung

Die Tiere wurden unter kontrollierten Bedingungen in einem Tag-/Nachtrhythmus von 12 Stunden gemäß dem Tierschutzgesetz gehalten und hatten freien Zugang zu Standardfutter und Wasser. Die Megalin defizienten Mäuse gp330 -/- und die dazugehörigen Kontrolltiere besaßen einen gemischten genetischen Hintergrund von 129SvEmcTer und CD1 Mäusen. Sie wurden in Willnow et al. (1996) beschrieben. Die verwendeten Wildtypmäuse besaßen einen gemischten genetischen Hintergrund von 129SvEmcTer und Balb C Mäusen.


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3.2.2.  Bakterien

Zur Herstellung Kalzium-kompetenter Bakterien wuchsen E.coli DH5α über Nacht bei 37oC auf einer LB-Agarplatte (1 % Bacto-Trypton, 1 % NaCl, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Bacto-Agar) ohne Antibiotika. Eine Einzelkolonie wurde in 50 ml LB-Medium (1 % Bacto-Trypton, 1 % NaCl, 0,5 % Hefeextrakt) expandiert. Es wurde die OD650 der Flüssigkultur bestimmt und auf eine optische Dichtevon 0,05 mit LB - Medium verdünnt. Dann wurde weitere zwei bis drei Stunden bei 37oC inkubiert, bis die Kultur eine OD650 von 0,5-0,6 erreicht hatte. Das Wachstum der Bakterienkultur wurde auf Eis gestoppt und die Bakterien für 10 Minuten bei 4oC und 4000g abzentrifugiert. Der Zellniederschlag wurde in kalter 50mM CaCl2 resuspendiert und 55 Minuten auf Eis inkubiert. Es folgte eine erneute Zentrifugatrion für 10 Minuten bei 4oC und 4000g. Das Bakterienpellet wurde resuspendiert in kalter Glyzerin-CaCl2 Lösung (20 % Glyzerin, 50 mM CaCl2) und über Nacht bei 0oC inkubiert. Die Zellsuspension wurden aliquotiert und bei -80oC gelagert.

3.3. SDS-PAGE und Western Blot Analysen

SDS-Polyacrylamid Gel Elektrophoresen (SDS-PAGE) wurden nach dem Protokoll von Laemmli (Laemmli, 1970) durchgeführt.

Färbungen der Proteine mit Silbernitrat oder Coomassie Brilliant Blau G (Sigma) wurden nach Standartprotokollen vorgenommen. Als Proteinstandart wurde der vorgefärbte Blue sea 4-250 kDa Marker von Novex benutzt.

3.3.1. Coomassiefärbung

Für die Coomassie Färbung wurde 0,1 % Coomassie Brilliant Blue G, 1 % Essigsäure; 40 % Methanol als Färbelösung verwendet. Als Entfärber diente 5 % Methanol, 12,5 % Essigsäure.

3.3.2. Silberfärbung

Für eine Silberfärbung wurden die Gele in 50 % Methanol, 12 % Essigsäure, 60 mM Formaldehyd fixiert, gefolgt von dreimaligem Waschen in 35 % Ethanol. Nach einer kurzen Inkubation in 800 nM Na2S2O3 und anschließendem kurzen


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Waschen in ddH2O wurde mit 3 mM AgNO3, 900 nM Formaldehyd gefärbt, zweimal mit ddH2O gewaschen und mit 13,8 mM NaCO3, 600 nM Formaldehyd, 160 nM Na2S2O3 entwickelt.

3.3.3. Western Blot Analysen

Für die Immunodetektion wurden die Gele auf Nitrocellulosemembranen der Marke Hybond C+ von Amersham transferiert (Towbin et al., 1979).

Die Membranen wurden blockiert in PBS, pH 7,4 mit 0,05 % Tween-20 (Sigma), die 5 % Magermilchpulver und 5 % fötales Kälberserum enthielt. Der Primärantikörper wurde in PBS, pH 7,4, 0,05 % Tween-20, 5 % Magermilchpulver für 45 Minuten auf der Membran belassen. Es folgten drei Waschgänge mit zweimal PBS, pH 7,4, 0,05 % Tween-20, 0,1 % SDS, 1 % NP-40 und einmal PBS, pH 7,4, 0,05 % Tween-20. Als Sekundärantikörper wurde ein Peroxidase-gekoppeltes IgG in PBS, pH 7,4, 0,05 % Tween-20, 5 % Magermilchpulver benutzt, das gegen den Primärantikörper gerichtet war. Nach nochmaligem Waschen wurde der Western Blot mit ECL (Amersham) entwickelt (Harlow and Lane, 1988).

3.4. Immunhistologie

3.4.1. Gefrierschnitte

Für die Gefrierschnitte wurden Megalin defiziente Mäuse und Kontrolltiere durch transkardiale Perfusion fixiert. Hierzu wird in das Herz 4 % Paraformaldehyd (Merck) in 0,1 M Natrium-Cacodylat Puffer eingeleitet. Die gesammelten Gewebe wurden zurechtgeschnitten und für eine weitere Stunde in 1 % Paraformaldehyd fixiert. Dann folgte eine Infiltration mit 2,3 M Saccharose (Sigma) und 2 % Paraformaldehyd für 30 Minuten. Schließlich wurde das Gewebe in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Semidünne 0,8 µm Gefrierschnitte der Gewebe, angefertigt mit einem Kryostaten der Marke Jung CM 3000 (Leica, Wetzlar, Deutschland), wurden entweder mit Kaninchen Anti-Ratten-CCSP Antikörpern (1:10000 Verdünnung) oder Kaninchen Anti-Ratten-Cubilin Antikörpern (1:2000Verdünnung) für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dem folgte entweder ein Alexa 546 konjugiertes Anti-Kaninchen IgG, welches


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unter dem Fluorescenz-Mikroskop sichtbar wurde oder ein Peroxidase konjugiertes Anti-Kaninchen IgG. Die Peroxidase wurde durch Diaminobenzidin (Fluka) sichtbar gemacht und die Schnitte wurden mit Mayers Hämalaunlösung (Merck) zwei Minuten gegengefärbt.

Für die Elektronenmikroskopie wurden ultradünne 70-90 nm Gefrierschnitte über Nacht bei 4°C mit dem Anti-Cubilin Antikörper inkubiert (1: 5000). Dem folgte ein 10 nm Gold konjugiertes Anti-Kaninchen IgG.

3.4.2. Parafinschnitte

Für die Parafinschnitte wurde hormonell synchronisierten Mäusen der Uterus entnommen und mit 4 % Paraformaldehyd in PBS pH 7,4 (GIBCO) für 24 Stunden fixiert. Die Gewebe wurden einen Tag gewässert. Dann wurden die Uteri in einer Alkoholreihe entwässert (zwei Stunden in 70% Ethanol (Roth), zwei Stunden in 90% Ethanol, über Nacht in 96 % Ethanol, drei mal zwei Stunden in 100% Ethanol und zwei mal 20 Minuten in Xylol (Roth)). Die Gewebe wurden mit Parafin (Roth) infiltriert und in Parafinblöcke gegossen. Geschnitten wurden die Gewebe mit einem Mikrotom RM 2155 (Leica, Wetzlar, Deutschland).4 µm Schnitte der Gewebe wurden entparafiniert und rehydriert. Mit einem Ziegen Anti-Kaninchen-Megalin Antikörper wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Darauf folgten Inkubationen mit zuerst einem Peroxidase konjugierten Anti-Schaf IgG und anschließend mit einem Peroxidase konjugierten Anti-Peroxidase IgG aus der Ziege. Die Peroxidase wurde durch Diaminobenzidin sichtbar gemacht und die Schnitte wurden mit Mayers Hämalaunlösung 30 Sekunden gegengefärbt.

3.4.3. Mikroskopie

Für die mikroskopischen Untersuchungen wurde ein FluoView TFL51und für die photographischen Aufnahmen eine DP50-Digitalkamera (beides Olympus Europe, Hamburg, Deutschland) benutzt.

3.5. Urinproben

Mittelstrahl-Urinproben von Patienten mit einem Myeloma-assozziierten Fanconi Syndrom wurden freundlicherweise von P.Aucouturier (Necker Hopital, Paris,


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France) zur Verfügung gestellt. Urinproben von Patienten mit einem Imerslund-Grasbeck Syndrom wurden von O. de Baulmy (Hopital Robert Debré, Paris, France) bezogen. Kontrollurine wurden freundlicherweise von Kollegen im Labor bereitgestellt. Zum Sammeln von Urin wurden Megalin defiziente Mäuse und Kontrolltiere für 16 Stunden in metabolischen Käfigen gehalten. In ihrem Trinkwasser befand sich 16 % Saccharose. Die Urinproben (durchschnittlich 5 ml/16 Stunden) wurden auf Eis gesammelt. Die Volumina pro Stunde und die Creatininwerte waren identisch zwischen Megalin defizienten Mäusen und Kontrolltieren (durchschnittlich 0,5 mmol Creatinin/l). Die Proben wurden bis zur weiteren Verwendung bei -80°C aufbewahrt.

3.6. Lungen - Lavage

Für eine Spülung der Lungen (Lungen-Lavage) wurden Megalin defiziente Mäuse und Kontrolltiere gemäß Tierschutzgesetz durch zervikale Dislokation getötet und in die Trachea wurde ein kurzer Schnitt gesetzt. Mit jeweils 1 ml steriler Kochsalzlösung (150 mM NaCl) wurden die Lungen gespült. Dazu wurde die Kochsalzlösung vorsichtig mit einer Spritze ohne Kanüle in die Lunge geleitet und nach kurzem Warten wieder herausgezogen. Diese Lungen-Lavage wurde zum Entfernen der alveolaren Makrophagen und sonstiger zellulärer Bestandteile 10 Minuten bei 4°C und 10000g zentrifugiert. Die Proben wurden durch Zentrifugation für 3 Stunden bei 4°C und 1500g durch eine Centricon Ultra-YM-Membran (Millipore) aufkonzentriert. Die Proteinkonzentration wurde mit Hilfe des Bradford-Reagenz der Firma Bio-Rad bestimmt und die Proben wurden bis zur weiteren Untersuchung bei -80°C gelagert.

3.7. Synchronisierung des Zyklus

Zur hormonellen Synchronisation der Megalin defizienten Mäuse und Kontrolltiere wurden ihnen über 4 Tage täglich Hormone s.c. injiziert. Hierzu wurden geschlechtsunreife, 21 Tage alte Jungtiere verwendet. Die erste Gruppe erhielt 1 µg 17β-Östradiol (Sigma)/Tag in 100 µl handelsüblichem Speiseöl, eine zweite Gruppe erhielt 1 mg Progesteron (Sigma) und 1 µg 17β-Östradiol in 100 µl Speiseöl/Tag, den Kontrolltieren wurde lediglich 100 µl Öl gespritzt.


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3.8.  Uterine luminale Flüssigkeit (ULF)

3.8.1. Gewinnung

Zum Erhalt der uterinen luminalen Flüssigkeit (ULF) wurden die im Zyklus synchronisierten Tiere durch zervikale Dislokation getötet, die Uteri entnommen und mit 100 µl 150 mM NaCl Lösung gespült. Dazu wurde durch eine sehr feine Kanüle (23g, B&D) die Kochsalzlösung in die Uteri gespritzt und zur Entnahme der Flüssigkeit wurde am nach unten hängenden Ende ein Loch in das Gewebe geschnitten. Gröbere Bestandteile in der ULF wurden durch eine Zentrifugation mit 10000g für 5 Minuten bei Raumtemperatur entfernt. Danach wurde 10 mM EDTA-Lösung zugegeben, so dass daraus eine Endkonzentration von 1 mM resultierte. Die Proteinkonzentration wurde photometrisch bestimmt und die Proben wurden bis zur weiteren Untersuchung bei -80°C gelagert.

3.8.2. Aufreinigung des Megalin - bindenden Bestandteils in der ULF

Uterine luminale Flüssigkeit von mit 17β - Östradiol behandelten Wildtypmäusen wurde durch Gel-Filtration (Superose 12 HR 10 / 30 von Amersham) aufgereinigt. Dazu wurde ULF auf die Säule geladen und mit 20 mM Tris, pH 8,0 eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden einerseits mit 4-16 % SDS-PAGE und Silberfärbung analysiert und gleichzeitig wurde durch BIAcore Analyse überprüft, welche der Fraktionen das an Megalin bindene Protein enthielten. Diese und die beiden flankierenden Fraktionen wurden über eine Mono-Q Säule (Amersham) weiter aufgereinigt. Zur Elution diente ein Salzgradient von 0-1 M NaCl in 20 mM Tris, pH 8,0. Wieder wurden die Fraktionen einerseits mittels BIAcore Analyse überprüft, andererseits auf einem 4-16 % Gel aufgetrennt. Das Gel wurde mit Silbernitrat gefärbt. Die einzige Proteinbande der Fraktion, die eine Bindung an Megalin zeigte, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und nach einer Trypsinierung von der Firma Profundis-biotech (Aarhus) mit Hilfe von MALDI-MS analysiert.


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3.9.  Klonierung der Konstrukte ApoD und 24p3

3.9.1. Primer

Humane ApoD cDNA wurde durch PCR amplifiziert. Hierzu wurde der Klone IMAGp998D042074Q2 (RZPD, Berlin, Deutschland) als Vorlage benutzt.

Als Primer für die PCR dienten die Oligonukleotide

5´- gcc cgc tag cac aag cat ttc atc ttg gga agt gcc-´3 und

5´-caa tga ctg cgg ccg ctt acg aga gct tgg ggc agt tca c-´3.


Murine 24p3 cDNA wurde durch PCR amplifiziert. Hierzu diente der Klone IMAGp998K238789 (RZPD, Berlin, Deutschland) als Vorlage.

Als Primer für die PCR dienten die Oligonukleotide

5´-gct agc cca gga ctc aac tca gaa ctt gat ccc t-´3 und

5´- gcg gcc gct cag ttg tca atg cat t-´3.


Jedes dieser Primerpaare war so konstruiert, dass eine Nhe I Restriktionsstelle vor und eine Not I Restriktionsstelle nach dem Insert eingefügt wird. Ferner wurden Stopcodons an geeigneter Stelle eingefügt.

3.9.2. Amplifikation durch PCR

Die gewünschten DNA-Bereiche wurden mit einer Soriano-PCR (Soriano et al. 1991) amplifiziert. Ein 25 µl PCR-Ansatz enhielt außer 1 µl Matrizen-DNA in verschiedenen Konzentrationen 2,5 µl 10x Gitschier-Puffer (166 mM Ammoniumsulfat, 670 mM Tris-HCl, pH 8,8, 67 mM MgCl2, 50 mM β-Mercaptoethanol, 67µM EDTA), 2,5 µl DMSO, 1,25 µl einer dNTP-Mischung (jeweils 2,5 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 1,25 µl BSA (1,6 mg/ml), 0,2 µl jeweils des 5’- und 3’Primers (0,1 µg / µl), 0,125 µl Taq DNA-Polymerase (5 U/µl). Es wurden folgende Temperaturen und Zeiten eingestellt: einmal 93oC für 3 Minuten, einmal 55oC für 5 Minuten, einmal 65oC für 5 Minuten, vierzigmal 93oC für 30 Sekunden, dann 55oC für eine Minute, dann 65oC für 3 Minuten. Es folgt eine abschließender Zyklus mit je einmal 93oC für 3 Minuten, 55oC für 3 Minuten, 65oC für 10 Minuten und schließlich 4oC bis zur Entnahme der PCR.


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3.9.3.  Ligation in den pGEM - T® Easy I - Vektor

Direkt aus dem Reaktionsgefäß für die PCR wurden 3 µl des amplifizierten DNA-Fragments mit 5 µl 2x Rapid Ligation Puffer® für T4 Ligase, 1 µl (= 50 ng) linearisiertem pGEM - T ® Easy I – Vektor (Abb.3.1.) und 1 µl T4-Ligase (3 U/µl) gemischt und bei 16oC über Nacht inkubiert.

3.9.4. Transformation in Kalzium - kompetente E.coli Bakterien

Nach erfolgreicher Ligation des Fragments in den Vektor wurde das Konstrukt in Ca++-kompetente DH5α Zellen transformiert. 100 μl Ca++-kompetente DH5α wurden mit 100 ng Vektor-DNA gemischt und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Es folgten Inkubationen von zwei Minuten bei 37oC und einer Minute auf Eis. Nach Zugabe von 200 μl LB-Medium wurden der Ansatz für 30 Minuten bei 37oC

inkubiert. Die transformierten Zellen wuchsen über Nacht bei 37° C auf einer Selektionsagarplatte mit Ampicillin (200μg/ml).

Abb. 3.1. Karte für den pGEM - T® Easy I - Vektor

3.9.5. DNA-Isolierung

Zur Umklonierung in den Zielvektor wurden Einzelkolonien von der Agarplatte in Ampicillin-haltigem (50 µg/ml) LB-Medium (1 % Bacto-Trypton, 1 % NaCl, 0,5 % Hefeextrakt) überimpft und über Nacht bei 37°C vermehrt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und in 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM Glukose, 2,5 mM EDTA, 5 % RNase A resuspendiert. Die gleiche Menge 0,2 N NaOH, 1 % SDS lysierte die Zellen. Nochmals dieselbe Menge 3 M Kaliumacetat, 11,5 % Essigsäure enteiweißte das Gemisch, und bei 14000g und 4oC wurden die Zelltrümmer für 10 Minuten abzentrifugiert. Es folgte eine Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol [Seite 42↓](25/24/1) Extraktion, der die obere, wässrige Phase abgenommen und mit dem 2,5-fachen Volumen absoluten Ethanols ausgefällt wurde. Die DNA wurde mit 14000g bei 4oC für 10 Minuten zentrifugiert und mit 70% Ethanol von Salzen befreit. Die präzipitierte DNA wurde in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8) gelöst.

3.9.6. Umklonierung in den Zielvektor pCEP-Pu-SP-his-myc-fX

Aus dem so erhaltenen Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen Nhe I und Not I (Amersham), sowie einem one-for-all Puffer (Amersham) über Nacht bei 37°C das Insert geschnitten. Der Ansatz lief über ein 0,8 %iges Agarosegel (Gibco) und die durch Ethidiumbromid (Merck) unter UV-Licht sichtbare Bande wurde ausgeschnitten. Mit Hilfe des QIAquick®-Kits der Firma Qiagen wurde die DNA aus dem Gel gemäß Protokoll der Firma extrahiert und konnte anschließend in den Zielvektor pCEP-Pu-SP-his-myc-fX (Abb.3.2.) ligiert werden.

Abb. 3.2. Karte für den pCEP-Pu-Vektor

Die eingezeichneten Pfeile geben die Restriktionsstellen an

Hierzu wurden 4U T4 DNA Ligase (4 U/µl) von Roche, 2 µl Ligasepuffer (10 x-Konzentrat: 500 mM Tris-HCl, 70 mM MgCl2, 10 mM DTT), 1 mM rATP, sowie Insert- und Vektor-DNA in Verhältnis von 10:1 und einem Gesamtvolumen von 20 μl für 3 Stunden bei 37oC inkubiert. Nach erfolgreicher Ligation wurde die


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DNA wie oben beschrieben in E.coli Zellen transformiert und danach expandiert. Nach erneuter DNA-Extraktion aus Bakterien wurde zuerst die Sequenz verifiziert. Die Firma Invitek (Berlin, Deutschland) sequenzierte alle Konstrukte. Danach konnte dieser Expressionsvektor pCEP-Pu-SP-his-myc-fX mit den Konstrukten in das eukaryotische Expressionssystem der 293-EBNA Zellen von Invitrogen transformiert werden. 293-EBNA Zellen haben den Replikationsfaktor EBNA-1 des Ebstein Barr Virus stabil im Genom integriert und produzieren ihn kontinuierlich. Charakteristisch für den Expressionsvektor pCEP-Pu-SP-his-myc-fX wiederum ist es, dass die Genexpression vom Promoter des Cytomegalovirus angetrieben wird (Kohfeldt et al., 1997). Dieser Expressionsvektor hat den Startpunkt (origen) des Ebstein Barr Virus. In Anwesenheit des Replikationsfaktors EBNA-1 wird das Plasmid ständig repliziert. Die durch die Konstrukte exprimierten Proteine enthielten am aminoterminalen Ende einen Anhang von sechs Histidinresten, ein Myc-Epitop und eine Faktor Xa-Restriktionsstelle. Die Histidinreste dienten zur Aufreinigung des Proteins durch Nickel-Affinitätschromatographie. Die Myc-Epitope konnten durch kommerziell erhältliche Antikörper erkannt werden und ließen den Nachweis der Fusionsproteine in der Western-Blot Analyse zu. Die Faktor Xa-Restriktionsstelle ermöglichte eine Abtrennung des gesamten Anhanges.

3.10. Zellkultur

3.10.1. Generelle Zellkulturbedingungen

Für diese Arbeit wurden Karzinomazellen des Dottersackes aus der braunen, norwegischen Ratte (BN16) und humane embryonale Nierenzellen (293-EBNA Zellen) von Invitrogen verwendet. BN16 Zellen wurden in Standartmedium, d.h. in DMEM (Biochrom), dem 10 % fötales Kälberserum (FCS) von Biochrom, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 µg/ml) von Gibco zugesetzt waren, kultiviert. Für die Aufnahme- und Degradationsversuche wurden BN16 Zellen kurz vor Versuchsbeginn auf DMEM ohne Glutamin (Gibco) umgestellt, welches 0,2 % BSA (Sigma) und Penicillin/Streptomycin in den oben genannten Konzentrationen enthielt. Die 293-EBNA Zellen wuchsen in Standartmedium,


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mit 250 µg/ml G-148 Sulfat (Gibco). Die Zellkulturinkubatoren (Heraeus) stellten eine Atmosphäre mit 5 % CO2 und eine Temperatur von 37oC sicher.

3.10.2. Expression von ApoD und 24p3 in 293-EBNA Zellen

293-EBNA Zellen wurden mit den unterschiedlichen Konstrukten mittels Elektroporation transformiert. Hierzu wurden den Zellen in der Zellkulturschale das Medium abgesaugt. Dann wurden die Zellen mit PBS pH 7,6 gewaschen. Nach einer kurzen Inkubation mit Trypsin (0,05 %) /EDTA (0,02 %)-Lösung (Gibco) bei 37°C wurden die abgelösten Zellen in Medium aufgenommen und durch eine kurze Zentrifugation bei 500 g und Raumtemperatur vom Überstand abgetrennt. Es folgten zwei Waschschritte der Zellen, der erste mit Medium, der zweite mit PBS, pH 7,6. Danach wurden die Zellen zweimal mit 25 mM NaCl in Standartmedium vorbehandelt, um nach Zugabe der DNA mit 230 mV und 500 μFD im Gene Pulser der Firma Bio-Rad elektroporiert zu werden. Die transformierten 293-EBNA Zellen wurden in DMEM kultiviert, das mit 10 % FCS, 250 µg/ml G-418 Sulfat und 1 µg/ml Puromycin (Sigma) versetzt war. Zur Produktion von konditioniertem Medium wurde auf das Puromycin verzichtet und die Menge an FCS reduziert. Zur erfolgreichen Expression von Apo D war 2,5 % , für 24p3 5 % FCS im Erntemedium notwendig. Das konditionierte Medium wurde alle zwei bis drei Tage gesammelt und durch frisches Medium ersetzt.

3.10.2. Herstellung eines Membranextraktes aus Dottersackzellen (BN16)

Es wurden BN16 Zellen in einer Zellkulturschale das Medium abgesaugt. Dann wurden die Zellen mit PBS pH 7,6 gewaschen und abgekratzt. Durch eine kurze Zentrifugation bei 500g und 4°C wurden die Zellen vom Puffer abgetrennt. Nach Feststellung des Gewichts wurde Lösung A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM Magnesiumchlorid, 0,25 mM Saccharose, 250 µM PMSF) in einem Volumen von 150 µl pro 100 mg Protein zu den Zellen gegeben. Mit Hilfe eines Potters (Glas Cal, Terre Haute, USA) wurden die Zellen homogenisiert. Die gröberen Zelltrümmer wurden für zehn Minuten mit 1000g bei 4°C abzentrifugiert. Es folgte eine weitere Zentrifugation für zehn Minuten mit 10000g bei 4°C zur Entfernung der Zellkerne. Der Überstand wurde 45 Minuten mit 100000g bei 4°C


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zentrifugiert. Das erhaltene Pellet wurde in 5µl Lösung B (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM MgCl2, 80 mM NaCl, 1mM PMSF) pro 100 mg Ausgangsgewicht resupendiert. Zur Homogenisierung wurde die Membranfraktion durch fortgesetzt kleiner werdende Injektionsnadeln (18g, 22g, 25g) gedrückt. Die Proteinkonzentration wurde photometrisch bestimmt und die Proben wurden bis zur weiteren Untersuchung bei -80°C gelagert.

3.11. Aufreinigung und Darstellung der Proteine

3.11.1. RAP

Rekombinante Glutathion S-Transferase (GST) oder einem Fusionsprotein aus Glutathion S-Transferase und Rezeptor-assoziiertem Protein aus der Ratte (GST-RAP) wurden in DH5α Bakterien produziert, wie bereits beschrieben (Herz et al., 1991). Dazu wurden E.coli Bakterien des Stammes DH5α, die das GST oder GST-RAP Expressionskonstrukt enthielten bei 37°C bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,4-0,5 hochgezogen. Eine Zugabe von Isopropylthio-β-D-Galaktosid (Endkonzentration 0,01 % (w/v)) induzierte die Expression. Die Kulturen wuchsen 4-6 Stunden bei 30°C. Mit einer Zentrifugation bei 4°C und 5000 g wurden die Zellen geerntet. Der Zellniederschlag wurde in 1/100 des anfänglichen Volumens in 15 % (w/v) Saccharose, 50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0 resuspendiert. Es wurde Lysozym (1 mg/ml) zugefügt und weitere 30 Minuten auf Eis inkubiert. Danach wurde eine wässrige Lösung von 2 % Triton X-100 und 0,5 mM Phenylsulfonylfluorid in einem Volumen von 1/50 des Ausgangsvolumens mit der Bakteriensuspension vermischt. Die Reagenzgefäße wurden geschüttelt und die Lysate wurden durch fortgesetzt kleiner werdende Injektionsnadeln (18g, 22g, 25g) gedrückt. Dithiothreitol (DTT) in einer Endkonzentration von 1 mM und Glutathionagarose wurden zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei 4°C rotierend inkubiert. Dann wurde die Agarose mit 500 g abzentrifugiert und dreimal mit Puffer A gewaschen (20 mM HEPES, pH 7,6, 100 mM KCl, 0,2 mM EDTA, 20 % Glycerol, 1 mM DTT, 0,5 mM Phenylsulfonylfluorid). Die Agarose wurde in dem gleichen Puffer resuspendiert und mit der Agarosesuspension wurde eine Säule von 1 cm Durchmesser gepackt. Nach nochmaligem Waschen mit Puffer A wurde GST-RAP oder GST mit Puffer


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A, der zusätzlich 25 mM Glutathion enthielt (mit NaOH auf pH 7,5 eingestellt) von der Säule eluiert. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt, die das Protein enthielten vereinigt und gegen 0,2 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8,0 dialysiert.

3.11.2. CCSP

CCSP aus einer Lungenwaschung bei der Ratte und rekombinantes Ratten-CCSP wurden wie bereits beschrieben (Lund et al., 1988b; Hard et al., 1995) gereinigt. Beide Ratten-Proteine wurdenfreundlicherweise von J. Lund (Lund, Schweden) zur Verfügung gestellt.

3.11.3. ApoD und 24p3

Diese gesammelten ApoD- und 24p3-haltigen Zellüberstände wurden über Nacht gegen Grundpuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,0) dialysiert und dann über eine Ni-NTA Superflow Säule gegeben (Qiagen). Die Säule wurde mit Grundpuffer, der 20 mM Imidazol enthielt, gespült. Die Elution des Proteins erfolgte mit 400 mM Imidazol in Grundpuffer. Eine Konzentrationsbestimmung wurde vorgenommen und die Reinheit des Eluats wurde mittels SDS - PAGE und anschließender Färbung durch Silbernitrat oder Coomassie Brilliant Blue G überprüft. Zur Abspaltung des aminoterminalen Anhanges wurden jeweils 50 µg Apo D oder 24p3 für 18 Stunden bei 37°C mit 1 µg Faktor Xa verdaut (Sigma)

3.12.  125 Jod – Markierung der Proteine

Die Proteine CCSP, GST-RAP und Apo D wurden mit 125Jod (Amersham) radioaktiv markiert mit der IODOGEN-Methode (Fraker und Speck, 1978).

Dazu wurden 30-40 µg Protein mit 2 µl 125Jod ( entspricht 220 µCi oder 7,4 MBq) für 5 Minuten (CCSP und Apo D) oder 15 Minuten (RAP) in ein Reaktionsgefäß mit Iodogen (200 µg) gegeben. Eine Abtrennung von ungekoppeltem Jod erfolgte mit einer Sephadex G-25 Säule (PD-10 desalting columns von Amersham), die zuvor mit 0,25 % BSA in PBS, pH 7,6 equilibriert wurde. Dazu wurde das Reaktionsgemisch in die Säule einlaufen gelassen und mit glutamin- und serumfreiem DMEM mit 0,2 % BSA und Penicillin/Streptomycin in den oben genannten Konzentrationen eluiert. So wurde das radioaktive Protein von freiem


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125Jod getrennt. Es wurden 0,5 ml Fraktionen gesammelt und die Radioaktivität im γ-Counter 1470 Wizard (Wallac) gemessen. Die Radioaktivität/ng Protein wurde errechnet und die Probe bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.

3.13. in vitro Aufnahme - und Degradationsstudien

3.13.1. Degradationsassay

Die zelluläre Aufnahme und Degradation radioaktiv markierter Proteine wurden an BN16 Zellen untersucht. Diese Zellen wurden für diese Versuche vom Standartmedium auf glutamin- und serumfreies DMEM mit 0,2 % BSA und Penicillin/Streptomycin in den oben genannten Konzentrationen umgestellt. 30 Minuten vor Zugabe der radioaktiv markierten Proteine wurden zu den Zellen die Antikörper (200 µg/ml), GST (50 µg/ml), GST-RAP(100 µg/ml) oder Chloroquin (200 µm) gegeben. Die 125Jod - markierten Liganden wurden zum Kulturmedium gegeben und in den angegebenen Zeitintervallen wurde die zelluläre Degradation nach Standartprotokollen gemessen (Goldstein et al., 1983). Hierzu wurde der Zellüberstand 1:3 mit 15 % Trichloressigsäure (TCA) von Merck gemischt, fünf Minuten bei 10000g zentrifugiert und der Überstand im γ-Counter gemessen. Die Degradation wurde ausgedrückt in Nanogramm des nicht durch TCA fällbaren Proteins im Zellkulturmedium, pro mg Gesamtzellprotein.

3.13.2.  Steroid - Bindung

Zur Bindung von ³H-markiertem Progesteron (Amersham) wurden 750 pmol des Steroids mit 600 pmol Apo D in einem Glasgefäß für 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wurde der Komplex von ungekoppeltem Steroid und Apo D getrennt, indem man das Reaktionsgemisch über eine Sephadex G-25 Säule aufreinigte. Es wurden 0,5 ml Fraktionen gesammelt und die Ausbeute an Komplex wurde im Scintillationszähler LS 3801 (Beckmann, Berlin, Deutschland) bestimmt.


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3.14.  BIAcore Analysen

Eine Quantifizierung der Bindung der verschiedenen Liganden an die unterschiedlichen Rezeptoren wurde durch BIAcore Analysen (Biosensor, Schweden) vorgenommen, bereits beschrieben von Nykjaer et al., 1999.

Zur Herstellung eines Rezeptorchips wurde ein kontinuierlicher Strom von 5 µl HBS Puffer (10 mM HEPES, 3,4 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,005 % Surfactant P20, pH 7,4) pro Minute über die Sensoroberfläche eingestellt. Die carboxylierte Dextran-Matrix der Sensorchip-Durchflusszelle wurde aktiviert durch eine Zugabe von 60 µl einer Lösung von 200 mM N-Ethyl-N`-(3-Dimethylaminopropyl) Carbidiimid und 50 mM N-Hydroxysuccimid. Danach wurden 180 µl 10 mM Natriumazetat, pH 4,5 mit 10 µg/ml Kaninchen-Megalin oder Kaninchen-Cubilin, rekombinantes Apo E R 2, LRP oder VLDL R in die Messzelle injiziert. Die verbleibenden Bindungsstellen wurden durch eine darauf folgende Injektion von 35 µl 1 M Ethanolamin, pH 8,5 blockiert. Die Bindung des immobilisierten Rezeptors an den Chip wurde in BIAcore response units (RU) ausgedrückt und war gleichbedeutend mit 25 fmol Megalin/mm2, 40 fmol Cubilin/mm2, 32 fmol/mm² VLDLR, 25 fmol/mm² LRP und 8 fmol/mm² Apo E R 2. Zur Bestimmung der Bindungsstärke wurden die Liganden in 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1,5 mM CaCl2, 1 mM EGTA, pH 7,4 zu dem CM5 BIA Sensorchip gegeben, auf dem Megalin oder Cubilin immobilisiert war. Im Falle einer spezifischen Bindung erfolgte ein optisches Signal. Der relative Anstieg an response units (RU) gegenüber Kontrollen wurde bestimmt. Zwecks genauer Bestimmung der Bindungsaffinität zu Cubilin wurden verschiedene Konzentrationen der Liganden der BIAcore Analyse unterzogen. Die kinetischen Parameter wurden mit der BIAevaluation 3.0-Software ausgewertet.

3.15. Quantifizierung von RNA - Expression durch TaqMan® PCR

3.15.1. RNA - Präparation

Megalin defiziente Mäuse und Kontrolltiere, sowie Wildtypmäuse wurden über vier Tage hormonell synchronisiert. Dann wurden den Mäusen die Uteri entnommen und sofort in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Noch tiefgefroren [Seite 49↓]wurden die Organe zu Trizol (Roth) gegeben (für 50-125 mg Uterus 1,0 ml Trizol, für 125-200 mg Uterus 1,5 ml Trizol ). Die Uteri wurden in einem Polytron PT 20-Homogenisator (Ika Labortechnik) homogenisiert und 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dieses Homogenisat wurde mit 0,2 ml Chloroform (Sigma)/ml Trizol gemischt und 3 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zelltrümmer wurden mit einer Zentrifugation für 30 Minuten bei 12150 g und 4°C abgetrennt, der klare Überstand wurde mit 0,5 ml Isopropanol (Sigma) pro ml gemischt und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die RNA wurde bei 13200g und 4°C für 15 Minuten abzentrifugiert und der Niederschlag wurde in 70% Ethanol/DEPC-ddH2O resuspendiert (zur Herstellung von DEPC-ddH2O wird ddH2O mit 0,01 % DEPC (Diethyl-pyrocarbonat von Roth) über Nacht inkubiert und anschließend autoklaviert). Die RNA wurde ein weiteres Mal für acht Minuten bei 4°C und 5160 g abzentrifugiert und nach Entfernung des Überstandes an der Luft für 15 Minuten getrocknet. Die gewonnene RNA wurde in 100 µl DEPC-ddH2O aufgenommen und 10 Minuten bei 55°C unter Schütteln gelöst. Nach photometrischer Bestimmung der RNA-Konzentration wurden die Proben bis zur weiteren Bearbeitung bei -80°C gelagert.

3.15.2. Synthese von cDNA

Um aus einer RNA-Matrize einzelsträngige cDNA zu erhalten, musste eine reverse Transkription durchgeführt werden. Da die Gesamt-RNA umgeschrieben werden sollte, wurde als Primer ein aus vielen kurzen Oligonukleotiden bestehender Random-Primer gewählt, so dass mehrfache, unspezifische Bindungen über die gesamte RNA erfolgten. Es wurde der Superscript II Kit von Gibco benutzt. 2 µg RNA wurden mit 1,8 µl Random-Primer und ddH2O (22,2 µl - Volumen der RNA) gemischt, 10 Minuten bei 65°C inkubiert und danach auf Eis gestellt. Anschließend wurden 8 µl (5x) firststrand buffer, 4 µl DTT (100 mM) und 2 µl einer dNTP-Mischung (jeweils 10 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP) zugegeben und zwei Minuten bei 42°C inkubiert. Nach der Zugabe von 2 µl Superscript wurde die Mischung 10 Minuten bei Raumtemperatur, eine Stunde bei 42°C und 10 Minuten bei 70°C inkubiert.


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3.15.3.  Primer und TaqMan®Probes

Die genutzten Primer und TaqMan®Probes waren die folgenden:

Für Megalin:

Megalin forward: 5´-tgc acg gag gaa gtt gct att- ´3

Megalin reverse: 5´-tcc act gta gcc gct aga aca c- ´3

Megalin Sonde: 5´-Fam tga tga gaa tga cct ccc caa atg ca-´3 Tamra


Für Murine Collagenase-like A (MCOL A)

MCOL forward: 5´-tga aga agc cca ggt gtg g- ´3

MCOL reverse: 5´-ggt cca acg agg att gtt gtg- ´3

MCOL Sonde: 5´- Fam cct gat gtg gcc cca tat gcc att ac- ´3 Tamra

3.15.4. TaqMan® PCR

Bei der quantitativen RT-PCR (TaqMan® PCR) erfolgt die Quantifizierung während der Amplifikation. Dieses ist möglich durch den Einsatz sequenzspezifischer Primer und einer fluorogenen Sonde. Sie besteht aus einem Oligonukleotid, dessen 5´-Ende mit einem Fluoreszein-Derivat markiert ist, während das 3´-Ende als Quencher-Farbstoff ein Rhodamin-Derivat trägt und außerdem mit einem Phosphatrest blockiert ist (Lee et al. 1993). Der verwendete Reporter-Farbstoff 6-Carboxy-Fluoreszein wird bei einer Wellenlänge von 488 nm zur Fluoreszenz angeregt, was allerdings durch seine Nähe zum Quencher-Farbstoff durch einen Fluoreszenz-Energietransfer unterdrückt wird. Dieses ist die Situation bei einer intakten Sonde. Bei der Amplifikation wird die hybridisierte Sonde durch die 5´-3´-Exonuklease Aktivität der Taq-Polymerase hydrolysiert. Dadurch wird die räumliche Nähe der Reporter- und Quencher-Farbstoffe aufgehoben und es kommt zu einem Fluoreszenzsignal. Der Anstieg der Fluoreszenz ist der Amplifikation direkt proportional und kann zur Quantifizierung genutzt werden. Die gemessene Expressionen von Megalin und Murine Collagenase-like A (MCOL A) wurden auf die Expression des Glykolyseenzyms Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) normalisiert, welches in jeder Zelle in gleichen Mengen synthetisiert wird. Es wurden Standartreihen mit jeweils vier Verdünnungen (1:1, 1:2, 1:4, 1:8) für


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Megalin, MCOL und GAPDH erstellt. Die quantitative RT-PCR wurde mit dem TaqMan®-EZ Kit von Perkim Elmer gemäß Protokoll durchgeführt. Dazu werden 1µl DNA mit 9µl ddH2O, je 0,75µl reverse und forward Primer, 1 µl Sonde, 12,5µl PCR Master Mix gemischt. Es wurden folgende Temperaturen und Zeiten eingestellt: zwei Minuten 50 °C, zehn Minuten 95°C, 15 Sekunden 95°C, eine Minute 60°C. Dieser Zyklus wurde 45 x wiederholt. Zur Analyse wurde der Gene Amp 5700 Sequence Detector von Abi genutzt. Die Rohdaten aus dem TaqMan – Report wurden zuerst gemittelt, da in Tripletts gemessen wurde. Dann wurde der Mittelwert auf den Mittelwert der GAPDH-Expression normalisiert. Schließlich wurde die kleinste gemessene Expression als Standart gesetzt und der Unterschied an normalisiertem Reportersignal errechnet (Δ RN).


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07.03.2004