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4.  ERGEBNISSE

4.1. Allgemeines

Es werden mehr und mehr Mitglieder der low-density lipoprotein (LDL) Rezeptor Gen Familie beschrieben und noch schneller wächst die Anzahl der beschriebenen Liganden für einzelne Familienmitglieder. Zunächst wurde davon ausgegangen, dass die sowohl von Säugern, als auch von anderen Gattungen gebildeten Zelloberflächenrezeptoren lediglich die Aufnahme von Lipoproteinen in die Zellen vermitteln. Inzwischen ist bekannt, dass die Rezeptoren mannigfache Rollen in zellulären Prozessen spielen. Dieses ist möglich, indem sie unterschiedliche Liganden in verschiedenen Gewebearten erkennen, und in die Zellen aufnehmen oder durch sie eine Signalkaskade im Zellinneren veranlassen.

Megalin, dem bisher größten Mitglied der LDL Rezeptor Familie sind in letzter Zeit einige Aufgaben zugeschrieben worden, die man allgemein als Aufnahme lipophiler Substanzen im Komplex mit ihren Transportproteinen umschreiben kann. Es handelt sich um das Steroid Vitamin D, gebunden an Vitamin D Bindeprotein (DBP) und um das Retinoid Vitamin A, gebunden an Retinol Bindeprotein, die von Megalin in der Niere in die Zellen des proximalen Tubulus aufgenommen werden (Nykjaer et al. 1999, Christensen et al., 1999a und b).

Das angestrebte Ziel meiner Arbeit war eine weitere Aufklärung, welche Rolle Megalin in der Aufnahme von gebundenen, lipophilen Substanzen wie z. B. Steroiden im Komplex mit Carrierproteinen spielt. Dazu wurden zwei experimentelle Strategien verfolgt.

Begonnen wurde mit der Suche nach weiteren möglichen Liganden. In dieser Arbeit wurden drei Proteine (24p3, Apo D und CCSP) ausgesucht, die jeweils die Funktion eines Transportmoleküls für lipophile Stoffe in einer hydrophilen Umgebung wie Blut oder anderen Körperflüssigkeiten übernehmen.

In diesem Teil meiner Arbeit habe ich versucht, die Hypothese zu untermauern, dass hydrophile Stoffe nicht ausschließlich durch freie Diffusion in die Zelle gelangen, wie von Mendel 1989 vermutet (Mendel, 1989), sondern dass sie mitsamt ihrem Transportmolekül durch Endozytose aufgenommen werden. Die aufgeworfene Hypothese geht davon aus, dass das Transportmolekül selbst der


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Teil des Komplexes ist, der vom Endozytoserezeptor erkannt und gebunden wird. Die Identifizierung von Transportmolekülen für lipophile Substanzen, die von Megalin in Gewebe aufgenommen werden, wäre ein weiterer Beweis für die Korrektheit dieser Hypothese.

Durch die Etablierung eines eukaryotischen Expressionssystems im Labor (Hilpert et al., 2001) wurde die Voraussetzung geschaffen, die Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Rezeptoren und potentiellen Liganden zu untersuchen.

Gereinigtes Protein in ausreichender Menge zur Verfügung zu haben, stellte bisher oft ein Problem dar. Die Aufreinigung aus Gewebeextrakten ergibt häufig geringe Ausbeuten an funktionellem Protein. Derweilen birgt diese Methode die Gefahr in sich, dass die oft nicht unerheblichen Mengen an Verunreinigungen die Versuchsergebnisse verfälschen könnten.

Rekombinant hergestellte Proteine, die man aus prokaryotischen Expressionssytemen gewinnt, haben diese Nachteile deutlich reduziert, bergen jedoch andere. In Bakterien hergestellte Eiweiße haben die korrekte Primärstruktur, aber aus Mangel an zelleigenen Hilfsmolekülen, sogenannten Chaperones, weisen die Sekundärstrukturen oftmals Fehler auf. Auch die richtige Zusammenlagerung von mehreren funktionellen Untereinheiten des Proteins, sowie dessen korrekte Modifizierung ist nicht immer gewährleistet. Diese Gegebenheiten führen oftmals dazu, dass trotz richtiger Sequenz und Größe des gereinigten Proteins seine physiologische Aktivität nur sehr begrenzt ist. Aus diesen Gründen entschied ich mich, in zwei Fällen (Apo D und 24p3) die Herstellung selbst in einem eukaryotischen Expressionssystem vorzunehmen. Das dritte von mir untersuchte Protein (CCSP) stammte aus den herkömmlichen Quellen der bakteriellen Produktion und aus einer Körperflüssigkeitsaufreinigung. Das rekombinant hergestellte Protein wurde mir freundlicherweise von Johan Lund aus Lund, Norwegen zur Verfügung gestellt.

Die zweite hier verfolgte experimentelle Strategie zur Aufklärung der Rolle Megalins in der Aufnahme lipophiler Substanzen, ist die Analyse von Megalin exprimierenden Geweben. Der Nachweis möglicher Defekte, die sich mit dem Fehlen lipophiler Substanzen, wie z. B. Steroidhormonen erklären ließe, würden der Expression von Megalin in reproduktiven Organen eine Funktion zuordnen.


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In diesem Kontext wurde der Uterus als Megalin exprimierendes Gewebe zur weiteren Analyse gewählt, da Hinweise vorliegen, dass dem Rezeptor eine Rolle bei grundlegenden Entwicklungen des Organs zukommen könnte. So ist bei zirka 60 % der weiblichen, Megalin defizienten Mäuse eine Anomalie der Geschlechtsöffnung zu beobachten, die als Vaginalverschluss beschrieben wird.

4.2. 24p3

24p3 war der erste Kandidat, der als möglicher Ligand für Megalin untersucht wurde. Affimetrix Analysen in denen man die Menge an produzierter mRNA aus Nieren von Megalin defizienten Tieren und Kontrolltieren miteinander verglichen hatte, lieferte die Idee, dass 24p3 möglicherweise mit Megalin interagieren könnte. Es wurde in den Nieren der Knockout Mäuse eine signifikant höhere Menge an 24p3-RNA gemessen. In den drei durchgeführten Parallelansätzen wurden eine 9.2fache, 6.3fache und 2.8fache Menge an 24p3-RNA Menge in der Knockout Maus vorgefunden (Hilpert et al., 2002).

4.2.1. Aufreinigung von 24p3

Zur Prüfung, ob es tatsächlich eine direkte Interaktion zwischen dem Endozytoserezeptor Megalin und dem Transportmolekül 24p3 gibt, mussten zunächst ausreichende Mengen an gereinigtem Protein hergestellt werden. Unter Verwendung des eukaryotischen Expresionssystems der 293-EBNA Zellen konnte ich ein Fusionsprotein herstellen, dass zusätzlich zur eigentlichen Aminosäuresequenz am carboxyterminalen Ende ein Myc-Epitop, eine Faktor Xa-Restriktionsstelle und 6 Histidinreste besaß. Durch Affinitätschromatographie reinigte ich 24p3 aus den Zellüberständen von 293-EBNA Zellen, die das Protein produzierten und in das Medium ausschieden, auf. Mit Hilfe der genannten Histidinreste konnte ich das rekombinante Protein an eine Ni-NTA SuperflowSäule binden und die Säule mit einem Imidazol-haltigem Puffer eluieren, wobei insgesamt 40 Fraktionen gesammelt wurden. Abb. 4.1. A zeigt das typische Elutionsprofil einer 24p3-Aufreinigung. Dabei wurde die Extinktion bei 280 nm mitgeschrieben (blaue Linie). Die senkrechten Einteilungen geben die gesammelten Fraktionen an.

Abb. 4.1. 24p3 Aufreinigung A Konditioniertes Medium von 24p3 produzierenden 293-EBNA Zellen wurde auf eine Ni-NTA Superflow Säule gegeben. Das Waschen und Eluieren der Säule wurde photometrisch überwacht (y-Achse). Gesammelt wurden inklusive der Waschfraktionen 40 Fraktionen. Die Elution erfolgte mit 400 mM Imidazol.
B Es ist die Western-Blot Analyse ausgesuchter Fraktionen abgebildet. Hierzu wurde ein Antikörper genutzt, der den Myc-Bereich des Fusionsproteins detektiert. KM = konditioniertes Medium, NB = Medium nach Bindung auf die Säule, W = Waschfraktion

Im vorderen Bereich des Elutionsprofils sind die Waschfraktionen aufgezeichnet. Es wurden so erhebliche Mengen an im Zellmedium enthaltenem Serum, Farbstoffen und zellulären Abbauprodukten abgetrennt, die sich trotz vorheriger Dialyse im Zellüberstand befanden. Der sich anschließende lange, flache Kurvenverlauf zeigt, dass sich keine weiteren Verunreinigungen mehr von der Säule abwaschen ließen. Startend mit Fraktion 5 wurden die erste 500 µl der eigentlichen Elution gesammelt. Nach Fraktion 38 wurde die Kollektion abgebrochen. Abb. 4.1. B zeigt die Western-Blot Analyse ausgewählter [Seite 56↓] Fraktionen. Sie wurden in einer 10 % SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Diese wurde dann mit einem Antikörper, der gegen das Myc-Epitop gerichtet war, inkubiert. Deutlich ist, dass die Fraktionen 15 und 16 die Hauptmenge an Protein enthalten, doch auch in Fraktion 14 sind wesentliche Mengen 24p3 vorhanden. Verglichen mit dem konditionierten Medium (KM in der ersten Spur) ist 24p3 stark angereichert worden. Auch in Medium, das bereits über die Säule gegeben wurde (NB, zweite Spur) ist noch 24p3 nachweisbar, es zeigt, dass die Säule abgesättigt war. Durch die hier beschriebene Methode konnte aus einem Liter konditioniertem Medium 3,6 mg rekombinantes 24p3 gewonnen werden. Da das Myc-Epitop und die Histidinreste nicht mehr benötigt wurden, war der nächste Schritt in der Aufreinigung von 24p3 die enzymatische Abspaltung dieses Anhanges vom Protein. Hierzu wurde die im Fusionsprotein vorhandene Faktor Xa-Proteasestelle genutzt. 24p3 wurde 1:50 (w/w) mit Faktor Xa gemischt und 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach der ktor Xa-Inkubation wurde das Enzym/Proteingemisch zwei Stunden auf Eis mit 1 ml des Ni-NTA Superflow Säulenmaterials geschüttelt, um so die abgespaltenen Histidin-Myc-Anhänge aus dem Gemisch zu binden. Entfernt wurden das Säulenmaterial dann mittels Zentrifugation. Jeweils 3,5 µg ungeschnittenes (Abb. 4.2. Spur 1) und geschnittenes 24p3 (Spur 2) wurden in einer 4-12 % SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat gefärbt.

Abb. 4.2. Faktor Xa Restriktionsbedingungen Aufgereinigtes 24p3 wurde mit Faktor Xa behandelt: Spur 1 unbehandelt, in Spur 2 mit Faktor Xa behandelt. Die Proteine wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt. Der Erfolg der Proteolyse wurde durch eine Färbung mit Silbernitrat dokumentiert.


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Nach Abspaltung des Anhanges hat des rekombinant hergestellte 24p3 die beschriebene Größe von 26 kDa, hingegen ist 24p3 mit His-Myc-Anhang 30 kDa groß. Das so hergestellte 24p3 wurde zwecks Antikörperherstellung in ein Kaninchen injiziert.

4.2.2. Immunisierung

Die drei durch Immunisierung (Firma Eurogentec in Herstal, Belgien) gewonnenen Seren wurden durch Western-Blot Analyse überprüft. Es wurden jeweils 1 µg Protein 24p3 mit His-Myc-Anhang (Abb. 4.3. Spur 1-3) aufgetragen, sowie als Kontrollen Apo D mit His-Myc-Anhang (Spur 4) und Apo E R II mit(Spur 5) und ohne His-Myc-Anhang (Spur 6) und in einer 10 % SDS-PAGE aufgetrennt, dann auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Membran wurde in Streifen geschnitten und diese wurden mit den Seren aus drei Blutabnahmen inkubiert.

Abb. 4.3. Analyse der drei Blutabnahmen eines Antiserums gegen 24p3

A Jeweils 1 µg Protein (Spur 1, 2 und 3 24p3 mit His-Myc-Anhang, Spur 4 Apo D mit His-Myc-Anhang, Spur 5 Apo E R 2 mit His-Myc-Anhang, Spur 6 Apo E R II ohne His-Myc-Anhang) wurde in einer SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die in Streifen geschnittene Membran wurde mit den Antiseren der drei Blutabnahmen der Immunisierung inkubiert. B zeigt als Kontrolle für eine gleichmäßige Beladung die Membran vor der Färbung mit den Antikörpern. Die Proteine sind mit einer Ponceau-Färbung sichtbar gemacht.


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Unter der Western-Blot Analyse ist zur Kontrolle der gleichmäßigen Beladung der Spuren die Ponceau-Färbung der Nitrozellulosemembran abgebildet (B). Sie zeigt das aufgetrennte Gesamtprotein. Die Überprüfung der Qualität des polyklonalen Antikörpers, der gegen 24p3 gezogen wurde, macht deutlich, dass die drei Blutabnahmen die gleiche Bindungsaktivität besitzen, da 24p3 in den Spuren 1 bis 3 gleich stark gefärbt ist. Jedoch wird von dem Antiserum auch Apo D mit His-Myc-Anhang in Spur 4 erkannt, wobei der Apo D-Anteil des Konstruktes angezeigt wird. Apo D hat drei hochkonservierte Strukturdomänen mit 24p3 gemein. Es kann nicht der His-Myc-Anhang sein, der durch das Antiserum erkannt wird, da das in Spur 5 geladene Apo E R II mit His-Myc-Konstrukt kein Signal gibt.

4.2.3. BIAcore Analyse der 24p3 - Bindung an Megalin

Durch BIAcore Analysen wurde untersucht, ob Megalin an 24p3 bindet und so für die zelluläre Aufnahme von 24p3 verantwortlich sein könnte. Für diesen Versuch wurde 24p3 und als Positiv-Kontrolle Rezeptor assoziiertes Protein (RAP) jeweils in einer Konzentration von 1 µM verwendet. RAP ist ein intrazelluläres Chaperone, das an alle Endozytoserezeptoren der LDL Rezeptor Familie bindet. Es wurde der relativen Anstieg von BIAcore Response Units im Vergleich zu einer Kontrollflüssigkeit gemessen und im folgenden Diagramm aufgetragen.

Abb. 4.4. BIAcore Analyse der 24p3-Bindung an Megalin

Immobilisiertes Megalin auf einem BIA Sensor Chip (25 fmol/mm²) wurde mit gereinigtem 24p3 in einer Konzentration von 1 µM inkubiert. Nach 600 Sekunden wurde begonnen, 24p3 mit Puffer wieder auszuwaschen. Als Kontrolle wurde in einem zweiten Experiment gereinigtes RAP (ebenfalls 1 µM) über den Megalin-Chip geleitet.


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Es konnte eine Bindung von RAP an Megalin, jedoch keine von 24p3 an dem Rezeptor beobachtet werden.

Die obere Kurve von Abb. 4.4. zeigt die Bindung von RAP an Megalin. Knapp 1200 Response Units konnten gemessen werden.

Nach 600 Sekunden erfolgte ein Abfall der Kurve, da zu dem Zeitpunkt RAP aus dem Fließstrom weggelassen wurde. Nur noch Puffer floss über den mit Megalin beschichteten Sensorchip und wusch RAP so wieder aus.

Je spezifischer und stärker die Bindung ist, desto länger benötigt der Puffer, das gebundene Protein vom Sensorchip zu waschen.

Die untere Kurve von Abb. 4.4. zeigt, dass rekombinantes, gereinigtes 24p3 nicht an Megalin bindet, da kein Anstieg der Response Units zu erkennen ist.

Damit wurde die Untersuchung einer möglichen Interaktion zwischen Megalin und 24p3 mit dem Ergebnis eingestellt, dass es wahrscheinlich keine direkte Bindung zwischen den beiden Proteinen gibt.

Die Tatsache, dass vermehrt RNA von 24p3 in den Nieren Megalin defizienter Tiere produziert wird, ist daher wahrscheinlich nicht direkt durch das Fehlen des Rezeptors bedingt. Es ist allerdings nicht auszuschließen, dass es tatsächlich einen indirekten Bezug zwischen 24p3 und Megalin gibt.

Dies sollte jedoch nicht Gegenstand der hier vorgestellten Arbeit sein. Alternativ wäre es möglich, dass das rekombinant in EBNA Zellen produzierte Protein nicht Rezeptor-bindungskompetent und somit biologisch nicht aktiv ist.


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4.3.  Apo D

Das zweite Lipocalin, das als ein möglicher Ligand für Megalin in Frage kam, war Apo D. Apo D wird, außer dass es im Plasma hauptsächlich im Verbund mit high density lipoprotein (HDL-) Partikeln vorkommt (Ayrault-Jarrier et al., 1963), unter anderem auch im Brustdrüsengewebe exprimiert (Cofer et al., 1996).

Die Eigenschaft von Apo D, als Transportmolekül für Progesteron zu dienen (Pearlman et al., 1973), wird in diesem Zusammenhang diskutiert (Rassart et al., 2000).

Auch Megalin wird von Epithelzellen der Brustdrüsenkanäle exprimiert (Lundgren et al., 1997). Eine Funktionsbestimmung in diesem Gewebe ist bis heute nicht erfolgt. Da Megalin bereits als ein Rezeptor beschrieben wurde, der für die zelluläre Aufnahme eines Lipocalins (RBP) verantwortlich ist (Nykjaer et al. 2002), ist es nicht auszuschließen, dass auch im Fall von Apo D die Endozytose durch Megalin vermittelt wird.

4.3.1. Aufreinigung von Apo D

Zunächst galt auch im Fall von Apo D, dass keine ausreichende Mengen an reinem Protein zu Verfügung standen, um eine mögliche Interaktion mit Megalin untersuchen zu können.

Daher habe ich, wie in Abb. 4.3. bereits angedeutet, auch rekombinantes Apo D in dem eukaryotische Expresionssystem der 293-EBNA Zellen produziert. Hierzu wurde als Vorlage für humanes Apo D (RZPD, Berlin, Deutschland) benutzt und die cDNA durch PCR amplifiziert.

Nach Umklonierung in den Expressionsvektor pCEP-Pu-SP-his-myc-fX wurden 293-EBNA Zellen mit dem Konstrukt mittels Elektroporation transformiert. Das Medium der Zellen wurde abgesaugt und konnte durch Affinitätschromatographie aufgereinigt werden, da das Fusionsprotein zusätzlich zur Aminosäuresequenz von Apo D am carboxyterminalen Ende sechs Histidinreste enthielt. Die Histidinreste banden des rekombinanten Proteins an eine Ni-NTA SuperflowSäule und insgesamt 40 Fraktionen wurden mit einem Imidazol-haltigem Puffer von der Säule eluiert.


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In Abb. 4.5. ist das Elutionsprofil einer Apo D-Aufreinigung gezeigt.

Abb. 4.5. Apo D Aufreinigung

A Konditioniertes Medium von Apo D produzierenden 293-EBNA Zellen wurde auf eine Ni-NTA Superflow Säule gegeben. Das Waschen und Eluieren der Säule wurde photometrisch überwacht (y-Achse). Gesammelt wurden inklusive der Waschfraktionen 40 Fraktionen. Eluiert wurde mit 400 mM Imidazol.

B Ausgesuchte Fraktionen wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie gefärbt. NB = Medium nach Bindung auf die Säule, W = Waschfraktion

Nach dem Auswaschen des im Medium enthaltenen Serums und der zellulären Stoffwechselprodukte (W = Waschfraktion) zeigte ein flacher Kurvenverlauf im Elutionsprofil, dass sich keine weiteren Verunreinigungen mehr von der Säule abwaschen ließen. Startend mit Fraktion 5 wurden jeweils 500 µl der Elution


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sammelt (Fraktion 5-38). Die sich rechts befindende y-Achse zeigt die jeweils gemessenen optische Dichte bei 280 nm und gibt dabei indirekt die relative Proteinmenge an. Ausgewählte Fraktionen (Abb. 4.5. B) wurden in einer 4-12 % SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie gefärbt. Gemäß dieser groben Übersicht ist in den Fraktionen 13-15 die Hauptmenge an Protein zu finden, doch auch in Fraktion 15 sind nicht unerhebliche Mengen an Apo D vorhanden. Aus einem Liter konditioniertem Medium konnte ich mittels dieser Methode 3,8 mg rekombinantes Apo D gewinnen. Da für eine Immunisierung eines Kaninchens und zur generellen Weiterverwendung des Proteins der Myc-Epitop- und Histidin-Anhang störend wäre, wurde dieser durch eine enzymatische Abspaltung mit Faktor Xa entfernt. Hierzu wurde Apo D mit Faktor Xa gemischt und 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Das Faktor Xa / Apo D-Gemisch wurde zwei Stunden auf Eis mit 1 ml des Ni-NTA Superflow Säulenmaterials geschüttelt, um so die abgespaltenen Histidin-Myc-Anhänge zu binden. Mit einer Zentrifugation wurden Säulenmaterial und gebundene His-Myc-Anhänge entfernt. Jeweils 4 µg ungeschnittenes (Abb. 4.6. Spur 1) und geschnittenes Apo D (Spur 2) wurden in einer 4-12 % SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie gefärbt.

Abb. 4.6. Faktor Xa Restriktionsbedingungen
Aufgereinigtes Apo D wurde mit Faktor Xa behandelt: Spur 1 unbehandelt, in Spur 2 im Verhältnis 1:50 für 24 Stunden bei 37°C und dann in einer SDS-Page aufgetrennt. Das Gel wurde mit Coomassie gefärbt.

 

Das in Spur 2 der Abb. 4.6. dargestellte Apo D hat ohne den für die Aufreinigung nötigen Anhang die in der Literatur beschriebene Größe von 30 kDa (Goessling et al., 2000). Apo D mit His-Myc-Anhang hingegen ist gut 36 kDa groß. Das so hergestellte Apo D wurde zur Antikörperherstellung in ein Kaninchen injiziert.


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4.3.2.  Immunisierung

Die Immunisierung des Kaninchens wurde wieder von der Firma Eurogentec vorgenommen. Die aus den drei erhaltenen Blutabnahmen gewonnenen Seren wurden durch Western-Blot Analyse überprüft. Es wurden jeweils 4 µg Protein Apo D mit His-Myc-Anhang (Abb. 4.7. Spur 1-3) aufgetragen, sowie als Kontrollen 24p3 mit His-Myc-Anhang (Spur 4) und Apo E R 2 mit His-Myc-Anhang (Spur 5) und in einer 10 % SDS-PAGE aufgetrennt, danach auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Membran wurde in Streifen geschnitten und diese wurden mit den drei Blutabnahmen inkubiert.

Abb. 4.7. Gewinnung eines polyklonalen Antikörpers gegen Apo D
A Je 4 µg Protein (Spur 1, 2 und 3 Apo D mit His-Myc-Anhang, Spur 4 24p3 mit His-Myc-Anhang, Spur 5 Apo E R 2 mit His-Myc-Anhang) wurden in einer SDS-Page aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die in Streifen geschnittene Membran wurde mit den Antiseren der drei Blutabnahmen der Immunisierung inkubiert.
B Die Proteine auf der Nitrozellulosemembran sind vor der Antikörperfärbung mit einer Ponceau-Färbung sichtbar gemacht worden. Dieses diente zur Kontrolle einer gleichmäßigen Beladung.

 

Im Teil B der Abb. 4.7. ist die Ponceau-Färbung der Nitrozellulosemembran gezeigt. Sie zeigt das aufgetrennte Gesamtprotein, bevor die Membran mit den Antiseren gefärbt wurde. Es ist zu vermerken, dass diese Art von Färbung wenig sensibel ist und nur grob als Beladungskontrolle dienen kann. In den ersten drei Spuren der Membran wurden jeweils Apo D mit His-Myc-Anhang geladen und


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man erkennt, dass mit Fortdauer der Immunisierung die Stärke des Signals steigt. Unerfreulicherweise wird nicht nur Apo D im Molekulargwichtsbereich von 36 kDa detektiert, sondern zusätzlich sind zahlreiche Banden im Bereich von 80 bis weit über 150 kDa erkennbar. Ob es sich um Rückstände des Serums handelt, das nicht durch die Aufreinigung entfernt werden konnte, oder um Aggregate von Apo D lässt sich durch diesen Versuch nicht sagen. Erstaunlicherweise gibt die Ponceau-Färbung der Nitrozellulosemembran keinen Hinweis darauf, dass im Western-Blot solche starken Signale in dem Molekulargwichtsbereich zu erwarten wären. Auch das Antiserum gegen Apo D zeigt Kreuzreaktionen mit 24p3 mit His-Myc-Anhang in Spur 4, also dem zweiten auf dem Blot vertretenen Lipocalin. Wie in Absatz 4.2.2. angeführt, haben Apo D und 24p3 drei hochkonservierte Strukturdomänen gemein. Wie das Antiserum gegen 24p3 detektiert auch das gegen Apo D beide Vertreter der Lipocalin-Familie. Es muss also festgestellt werden, dass die Qualität des Antikörpers mangelhaft ist. Es ist in diesem Falle jedoch nicht ganz ausgeschlossen, dass auch der His-Myc-Anhang etwas zu dem erhaltenen Signal beiträgt, also durch das Antiserum erkannt wird, da Apo E R 2 mit His-Myc-Anhang (Abb. 4.7. Spur 5) ebenfalls ein schwaches Signal gibt. Dem Anschein nach ließ sich in diesem Versuchsansatz der His-Myc-Anhang des Proteins nicht komplett von allen Molekülen abspalten und/oder nicht gänzlich aus ihm entfernen, nachdem er abgespalten wurde. Da es sich bei dem Antiserum gegen Apo D um ein polyklonalen Antikörper handelt und ein Myc-Epitop offensichtlich sehr immunogene Eigenschaften besitzt, werden von dem hier dargestellten Antiserum außer den Lipocalinen gemeinsamen Strukturen zusätzlich das Myc-Epitop erkannt.

4.3.3. BIAcore Analyse der Apo D - Bindung an vier LDL R Familienmitglieder

Um zu testen, ob Megalin für die zelluläre Aufnahme von Apo D verantwortlich sein könnte, wurde durch BIAcore Analysen untersucht, ob Apo D an Megalin bindet. Zusätzlich wurden auch weitere Rezeptoren der LDL R Gen Familie, nämlich Apo E R 2, LRP und VLDL R auf ihr Bindungsverhalten Apo D gegenüber untersucht.


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Für diese Versuche wurde jeweils 1 µM gereinigtes Apo D verwendet. Es wurde der relativen Anstieg von BIAcore Response Units im Vergleich zu einer Kontrollflüssigkeit ohne Apo D gemessen und im folgenden Diagramm aufgetragen.

Abb. 4.8. BIAcore Analyse der Apo D-Bindung an LRP, VLDL R,Apo ER II und Megalin Immobilisiertes LRP (25 fmol/mm²), VLDL R (32 fmol/mm²), Megalin (25 fmol/mm2) und Apo E R II (8 fmol/mm²) auf einem BIA Sensor Chip wurden mit gereinigtem rekombinanten Apo D in einer Konzentration von 1 µM inkubiert. Nach 60 Sekunden wurde begonnen, Apo D mit Puffer wieder ausgewaschen.

Es konnte eine Bindung von Apo D sowohl an Megalin und als auch an den VLDL R beobachtet werden (die beiden oberen Kurven in Abb. 4.8.).

Die oberste Kurve zeigt die Bindung von Apo D an VLDL R. Knapp 20 Response Units konnten gemessen werden. Sehr ähnlich sieht die Kurve und damit das Bindungsverhalten von Apo D an Megalin aus (zweiter Kurvenverlauf von oben). Der Abfall der Kurve erfolgte nach 60 Sekunden, da zu dem Zeitpunkt aus dem Fließstrom das Apo D weggelassen wurde und nur noch Puffer über den mit dem angegebenen Rezeptor beschichteten Sensorchip floss und so Apo D wieder auswusch.

Die unteren beiden Kurven zeigen, dass Apo D nur sehr schwach an LRP, jedoch gar nicht an Apo E R II bindet, da im Fall von LRP nur ein minimaler Anstieg der Kurve zu erkennen ist, und im Fall von Apo E R 2 gar keiner.

Es bleibt festzustellen, dass das von mir rekombinant hergestellte Apo D relativ gut an Megalin und VLDL R bindet, an LRP nur mit sehr geringer Affinität und an Apo E R II überhaupt nicht.


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4.3.4.  Apo D - Aufnahme und Degradation durch BN 16 Zellen

Bisher konnte die Bindung von Apo D an Megalin und an VLDL R gezeigt werden, beides Vertreter der LDL Rezeptor Gen Familie.

In den folgenden Experimenten wurde ausschließlich die mögliche Interaktion zwischen Apo D und Megalin untersucht. Auf eine abschließende Antwort, ob VLDLR für eine zelluläre Aufnahme von Apo D verantwortlich ist, musste leider aufgrund eines fehlenden Zellmodells (Zellen mit VLDL R-Expression) an dieser Stelle verzichtet werden.

Sowohl Megalin als auch Apo D sind in Brustdrüsengewebe zu finden. Megalin kleidet die Epithelien aus und Apo D wird in Sekreten und in Flüssigkeiten von Brustzysten gefunden. Die Frage ist nun, ob es auch zu einer Interaktion zwischen den beiden Proteinen in vivo kommt.

Um diese Situation in vitro zu simulieren, verwendete ich als Zellmodell Karzinomazellen des Dottersacks von Brown Norway Ratten (BN 16), da diese BN 16 Zellen Megalin exprimieren (Le Panse et al., 1997a).

Mit Hilfe der Liganden Blot Analyse wurde getestet, ob der Membranextrakt von BN 16 Zellen in der Lage ist, rekombinantes 125J-Apo D zu binden. Als Kontrollzellen wurden HeLa-Zellen verwendet, eine Tumorzelllinie, die kein Megalin exprimiert.

Vorab wurde rekombinantes Apo D mit 125Jod radioaktiv markiert. Es besaß eine spezifische Aktivität von 14243 cpm/ng.

Als Kontrolle wurde auch RAP radioaktiv markiert. Wie unter 4.2.3. beschrieben, ist RAP ein Protein, das mit hoher Affinität zu Megalin bindet. Es besaß eine spezifische Aktivität von 25276 cpm/ng. Es wurden 5 (Abb. 4.9. Spur 1) und 10 µg (Spur 2) der BN 16 Zellmembranen und 10 µg der HeLa-Zellmembranen (Spur 3) in einer nicht reduzierenden 4-12 % SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert.


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Die Membran wurde in zwei Teile geschnitten und der Teil mit Spur 1 mit rekombinantem 125J-RAP, der Teil mit Spur 2 und 3 mit rekombinantem 125J-Apo D inkubiert. Gebundene Proteine wurden durch einen Phosphoimager (Fujix Bas 2000) sichtbar gemacht.

Abb. 4.9. Liganden-Blot Analyse von BN 16 Membranen 5 µg aufgereinigte Membranen von BN 16 Zellen in Spur 1 und 10 µg in Spur 2, sowie 10 µg aufgereinigte Membranen von HeLa-Zellen in Spur 3 wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt. Durch Liganden-Blot Analyse konnte dargestellt werden, dass BN 16 Zellen sowohl rekombinantes 125J-RAP als auch rekombinantes 125J-Apo Dauf ihrer Zelloberfläche binden können. HeLa-Zellen, die kein Megalin besitzen, tun dieses nicht. Die Positionen der Markerproteine mit den Größen 250, 98 und 64 kDa sind angezeigt.

Wie in Abb. 4.9. zu sehen, konnten BN 16 Zellen rekombinantes 125J-Apo D binden. Der bindende Rezeptor ist mit höchster Wahrscheinlichkeit Megalin, da RAP im selben Molekulargewichtsbereich gebunden wird. Ob es zu einer zeitabhängigen Aufnahme und einem darauf folgenden lysosmalen Abbau des Proteins kommt, sollte durch Aufnahme- und Degradationsstudien aufgeklärt werden.

BN 16 Zellen in 1 ml gutaminfreiem DMEM mit 0,1 % (w/v) BSA erhielten 100 ng des rekombinanten 125J-Apo D pro ml Medium. Zusätzlich enthielt das Medium entweder 100 µg/ml Glutathion S-Transferase-RAP Fusionsprotein (GST-RAP), 50 µg/ml Glutathion S-Transferase (GST) oder 200 µM Chloroquin,


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einen Inhibitor des lysosomalen Abbaus. Nach einer Inkubation bei 37°C wurde im Abstand von einer und von vier Stunde die Menge an radioaktiven Abbauprodukten, welche in das Medium ausgeschieden wurde, gemessen (Abb. 4.10.).

Abb. 4.10. Degradation von rekombinantem Apo D durch BN 16 Zellen BN16 Zellen in 1 ml glutamin- und serumfreiem DMEM mit 0,1 % BSA (w/v) erhielten 100 ng rekombinantes 125J-Apo D. Es wurde zu den Zellen entweder 50 µg GST/ml, 100 µg GST-RAP/ml oder 200 µM Chloroquin gegeben. Nach einer Inkubation über die angegebenen Zeitintervalle bei 37°C wurde die Menge an radiomarkierten Abbauprodukten im Medium gemessen. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte und die Standartabweichungen von insgesamt drei Versuchen.

Nach einer Stunde wurden 13,4 ng und nach vier Stunden 49,5 ng 125J-Apo D pro mg BN 16 Zellen in die Zellen aufgenommen und degradiert. Diese Werte wurden ohne Zugabe von Inhibitoren gemessen.

Die Zugabe von GST diente der Verifizierung, dass der blockierende Teil des GST-RAP Fusionsproteins das RAP war. Die Zugabe von GST-RAP zum Assay reduziert deutlich die Aufnahme und den Abbau von Apo D.

Nach einer Stunde verringerte RAP die Apo D Aufnahme auf 16,6 %, nach vier Stunden wurden im Vergleich zu der ungehinderten Aufnahme 34 % degradiertes 125J-Apo D im Zellüberstand vorgefunden.


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Auch mit Zugabe von Chloroquin, einem Inhibitor lysosomaler Degradation, konnte die Degradation von 125J-Apo D durch BN 16 Zellen vermindert werden. Betonen möchte ich, dass Chloroquin nicht die Endozytose, also die Aufnahme des Proteins in die Zellen unterbindet, jedoch den Abbau desselbigen. Nach einer Stunde konnten 26,4 % und nach vier Stunden 22,3 % des Normalwertes gemessen werden.

Es kann zusammenfassend gesagt werden, dass Apo D von BN 16 Zellen aufgenommen und degradiert wird, und dass sowohl RAP, als auch Chloroquin die Aufnahme und Degradation von Apo D deutlich reduzieren.

Es ist sehr wahrscheinlich, dass diese Aufnahme und Degradation von Megalin vermittelt wird, da Megalin das einzige Apo D bindende Protein in BN 16 Zellen ist, das durch RAP inhibiert wird.

4.3.5. Apo D - Progesteron

Grundsätzlich lässt sich feststellen, dass die zelluläre Aufnahme von Apo D und der darauf folgende Abbau des Proteins durch Megalin vermittelt wird. Die Frage, warum Megalin Apo D in die Zellen aufnimmt ist jedoch nicht beantwortet. Im Fall eines hormonabhängigen Gewebes wie der Brust ist es von Interesse, wie die Steroide in die Zellen gelangen. Daher sollte im folgenden Versuch untersucht werden, ob Apo D in seiner Eigenschaft als Progesteron-Transportmolekül aufgenommen wird.

Zunächst einmal wurde H³-Progesteron mit dem von mir rekombinant hergestellten Apo D komplexiert. Der entstandene Komplex besaß einespezifische Aktivität von 11,8 cpm/ng Apo D. BN 16 Zellen in 0,32 ml gutaminfreiem DMEM mit 0,2 % (w/v) BSA erhielten 55,6 µg des rekombinantenApo D/H³-Progesteron-Komplexes pro ml Medium. Zusätzlich enthielt das Medium entweder 100 µg/ml Glutathion S-Transferase-RAP Fusionsprotein (GST-RAP) oder 50 µg/ml Glutathion S-Transferase (GST). Nach einer Inkubation bei 37°C wurde nach einer, zwei und vier Stunden die Menge an radioaktivem Progesteron, welches in die Zellen aufgenommen wurde, gemessen.


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Abb. 4.11. Akkumulation von rekombinantem Apo D im Komlex mit
H³-Progesteron durch BN 16 Zellen

BN16 Zellen in 0,32 ml glutamin- und serumfreiem DMEM mit 0,2 % BSA (w/v) erhielten 55,6 µg rekombinantesApo D/H3 - Progesteron. Es wurde zu den Zellen entweder 100 µg GST-RAP / ml oder 50 µg GST/ml. Nach einer Inkubation über die angegebenen Zeitintervalle bei 37°C wurde die Menge an radiomarkiertem Progesteron in den Zellen gemessen.

Ohne die Zugabe von RAP als Inhibitor konnte in der Tat eine zeitabhängige Akkumulation von Progesteron in den BN 16 Zellen gemessen werden (Abb.4.11.). Durchschnittlich 343 ng des Komplexes wurden binnen vier Stunden in die Zellen aufgenommen. Wie bereits in Absatz 4.3.4. beschriebenen, diente die Zugabe von GST der Kontrolle, dass der GST-Anteil im GST-RAP Fusionsproteins nicht der blockierende Teil war. Jedoch reduziert die Zugabe von GST-RAP zum Assay nicht die Aufnahme und Akkumulation von Progesteron. Es kann zusammenfassend gesagt werden, dass sich Progesteron in BN 16 Zellen zeitabhängig ansammelt. Jedoch kann nicht von einer rezeptorvermittelten Aufnahme gesprochen werden, wenigstens nicht, was Megalin betrifft. Wäre Megalin an der Endozytose von Progesteron im Komplex mit Apo D beteiligt, ließe sich die Aufnahme durch eine Zugabe von RAP hemmen. Dieses konnte nur für Apo D ohne Progesteron gezeigt werden.


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4.4.  CCSP BIAcore Analysen

Dieser Teil der Arbeit diente der Untersuchung, ob Megalin der Rezeptor ist, welcher das Trägerprotein CCSP bzw. CCSP im Komplex mit einem Liganden durch Endozytose in Gewebe aufnimmt.

Dafür wurde das Hauptaugenmerk auf den proximalen Tubulus der Niere gerichtet, da von diesem Gewebe bekannt ist, dass es für Wiederaufnahme von CCSP und CCSP/PCB aus dem glomerulären Filtrat verantwortlich ist (Stripp et al., 1996).

Von Megalin sind bereits mehrere Funktionen in der Niere bekannt. Megalin ist für die Rückgewinnung von bestimmten Vitaminen im Komplex mit ihren Trägerproteinen aus dem glomerulären Filtrat verantwortlich. Zu diesen Komplexen gehören 25-OH Vitamin D3/Vitamin D-bindendes Protein, Vitamin A/Retinol-bindendes Protein und Vitamin B12/Transcobalamin (Nykjaer et al., 1999, Christensen et al., 1999, Moestrup et al., 1998).

Neben Megalin ist allerdings auch ein zweiter Endozytoserezeptor im Epithelium des proximalen Tubulus der Niere beschrieben worden (zusammengefasst von Christensen et al., 1998). Dieser zweite Rezeptor heißt Cubilin, es ist ein peripheres Membranprotein. Von Cubilin ist bekannt, dass es in der Resorption von Albumin involviert ist (Birn et al., 2000a). Ich habe also im Folgenden beide Endozytoserezeptoren parallel untersucht.

4.4.1. CCSP - Bindung an Cubilin und Megalin

Um zu testen, ob einer der beiden Rezeptoren ebenso für die tubuläre Aufnahme von CCSP verantwortlich sein könnte, wurde durch BIAcore Analysen untersucht, ob CCSP an Cubilin oder Megalin bindet.

Für diese Versuche wurde jeweils gereinigtes CCSP aus einer Spülung der Lungen mit steriler Kochsalzlösung (Lavage) der Ratte in einer Konzentration von 1 µM verwendet. Es wurde der relativen Anstieg von BIAcore Response Units im Vergleich zu einer Kontrollflüssigkeit gemessen und im folgenden Diagramm aufgetragen (Abb. 4.12.).


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Abb. 4.12. BIAcore Analyse der CCSP - Bindung an Cubilin und Megalin

Immobilisiertes Megalin (25 fmol / mm2)und Cubilin (40 fmol / mm2)auf einem BIA Sensor Chip wurden mit gereinigtem CCSP aus einer Lungen-Lavage der Ratte in einer Konzentration von 1 µM inkubiert. Nach 600 Sekunden wurde begonnen, CCSP mit Puffer wieder auszuwaschen.

Es konnte eine Bindung von CCSP an Cubilin, jedoch keine an Megalin beobachtet werden.

Die obere Kurve zeigt die Bindung von CCSP an Cubilin. Knapp 60 Response Units konnten gemessen werden.

Der Abfall der Kurve erfolgte nach 600 Sekunden, da zu dem Zeitpunkt aus dem Fließstrom das CCSP weggelassen wurde und nur noch Puffer über den mit Cubilin beschichteten Sensorchip floss und so CCSP wieder auswusch.

Die untere Kurve zeigt, dass CCSP nicht an Megalin bindet, da kein Anstieg zu erkennen ist.

4.4.2. Bindungsaffinität von CCSP an Cubilin

Da CCSP offenbar an Cubilin bindet, sollte die Bindungsstärke zwischen CCSP und Cubilin quantifiziert werden. Für die Berechnung des Kd-Wertes wurden verschiedene Konzentrationen von CCSP aus der Lungen-Lavage einer Ratte über immobilisiertes Cubilin geleitet.


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Abb. 4.13. Kalkulation der Bindungsaffinität von CCSP an Cubilin

Immobilisiertes Cubilin (40 fmol/mm2)auf einem BIA Sensor Chip wurden mit gereinigtem CCSP aus einer Lungen-Lavage der Ratte in einer Konzentration von 1 µM, 500 nM, 200 nM, 100 nM und 50 nM inkubiert. Nach 600 Sekunden wurde begonnen, CCSP mit Puffer wieder auszuwaschen. Aus den kinetischen Parametern wurde ein Kd-Wert von 56 nM errechnet.

Erwartungsgemäß zeigte sich mit steigender CCSP-Konzentration in dem Fließstrom ein Anstieg der Response Units (Abb.4.13.).

Aus den kinetischen Parametern konnte mit Hilfe der BIAevaluation 3.0-Software ein Kd-Wert von 56 nM für die Bindung von CCSP aus der Lavage einer Ratte an Cubilin errechnet werden. Ersetzte man dieses natürliche Protein durch rekombinantes Ratten-CCSP wurde eine geringfügig kleinere Affinität von 400 nM gemessen. Diese Daten sind hier nicht gezeigt.

4.4.3. CCSP Bindung an Cubilin in Abhängigkeit von Kalzium und Magnesium

Um die Bindung von CCSP an Cubilin noch detaillierter beschreiben zu können, wurde EDTA, ein Chelatbildner für Kalziumionen in den Bindungspuffer und somit in den Versuchsablauf zugegeben.

Es wurden jeweils 0,5 µM rekombinantes Ratten-CCSP in Anwesenheit (Abb. 4.14., unteren Kurve) oder Abwesenheit von 20 mM EDTA (Abb. 4.13., oberer Kurvenverlauf) über den Cubilin beschichteten Sensorchip geleitet.


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Abb. 4.14. CCSP-Bindung an Cubilin ist durch EDTA Zugabe inhibierbar

Die Bindung zu immobilisiertem Cubilin (40 fmol/mm2)auf einem BIA Sensor Chip wurde mit 0,5 µM rekombinanten CCSP der Ratte in Anwesenheit (untere Kurve) und in Abwesenheit (obere Kurve) von 20 mM EDTA getestet.

Ohne Zugabe von EDTA wurde ein normaler Kurvenverlauf und damit eine ungehinderte Bindung von CCSP an Cubilin beobachtet (obere Kurve). Die deutlich flachere, untere Kurve bei Zugabe des Kalziumionen bindenden Chelatbildners EDTA zeigt, dass die Bindung von CCSP an Cubilin abhängig von der Anwesenheit von Kalziumionen ist. Ohne Kalziumionen ist nur eine geringe Bindung messbar.

4.4.4. Inhibierung der CCSP Bindung zu Cubilin durch RAP

Des Weiteren wurde getestet, welche Konsequenzen die Zugabe von RAP zu dem Bindungsversuch hat. RAP ist ein zelluläres Chaperone, das nicht nur, wie bereits erwähnt, an alle Mitglieder der LDL R Gen Familie, sondern auch Cubilin bindet. Gibt man rekombinantes RAP in vitro zu Cubilin, kann man die Bindung von Liganden an den Rezeptor verhindern (Kristiansen et al., 1999). Ob dieses auch für CCSP gilt, sollte im folgenden Versuch in Erfahrung gebracht werden. Hierzu wurde Cubilin mit 10 µM RAP vorinkubiert und die resultierenden Response Units wurden gemessen. Nach 700 Sekunden wurde in den Fließstrom zusätzlich 10 µM RAP oder 0,5 µM rekombinantes Ratten-CCSP injiziert.


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Abb. 4.15. CCSP-Bindung an Cubilin ist durch RAP blockierbar

Cubilin auf dem BIA Sensor Chip (40 fmol/mm2) wurde mit 10 µM RAP vorinkubiert. Über diesen Komplex wurde dann eine Lösung mit 0,5 µM rekombinantem CCSP oder 10 µM RAP geleitet. Weder RAP noch CCSP verursachten einen weiteren Anstieg der Response Units (oberer Kurvenverlauf). Der untere Kurvenverlauf beschreibt das Bindungsverhalten von CCSP ohne Vorinkubation mit RAP.

Die obere Kurve in Abb. 4.15. zeigt die Bindung von CCSP an Cubilin bei einer Vorinkubation des Rezeptors mit RAP. Erwartungsgemäß wird eine erhebliche Bindung (400 Response Units) angezeigt, da RAP bekanntlich sehr stark an Cubilin bindet. Eine weitere Bindung von RAP oder auch von CCSP ist nicht mehr möglich. Zu den durch die Pfeile angezeigten Zeitpunkten wurde jeweils eins der Proteine zugegeben, doch ein weiteres Ansteigen der Kurve wurde nicht beobachtet. Die untere Kurve der Abb. 4.15. zeigt noch einmal die Situation ohne Vorinkubation mit RAP. Hierbei ist der veränderten Maßstab der Y-Achse im Vergleich zu den bisherigen Abbildungen zu beachten. Ohne Vorinkubation mit RAP bindet CCSP zu Cubilin, welches mit circa 50 Response Units sichtbar wurde. Dieses Experiment macht deutlich, dass CCSP und RAP an die gleichen Epitope von Cubilin binden, da RAP eine Bindung von CCSP an Cubilin vollständig unterbinden kann.


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4.5.  CCSP in vitro

Bisher konnte die spezifische und Kalziumionen-abhängige Bindung von CCSP zu Cubilin, einem peripheren Membranprotein, welches unter anderem im

proximalen Tubulus der Niere exprimiert wird, gezeigt werden. Da tubuläre Epithelzellen CCSP in vivo aufnehmen (Brandt et al., 1985), wurde in den folgenden Experimenten untersucht, ob die Bindung von CCSP an Cubilin zur Endozytose des Proteins führt. Auch in diesem Versuch sollten Karzinomazellen des Dottersacks von Brown Norway Ratten (BN 16) als Zellmodell dienen, da beschrieben wurde, dass diese neben Megalin auch hinreichende Mengen an Cubilin exprimieren (Le Panse et al., 1997a).

4.5.1. BN 16 Zellen als Zellmodell

Zunächst wurde mit Hilfe der Western-Blot Analys überprüft, ob die verwendeten BN 16 Zellen tatsächlich genügende Mengen Cubilin und Megalin produzieren (Abb.4.16.). Es wurden 10 (Spur 1) oder 1 µg (Spur 2) der Zellmembranen in einer nicht reduzierenden 4-12 % SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Membran mit Spur 1 wurde mit einem Kaninchen Anit-Cubilin IgG und die mit Spur 2 mit einem Schaf Anti-Megalin IgG inkubiert. Gebundene Antikörper wurden mittels Chemolumineszenz sichtbar gemacht.

Abb. 4.16. Western Blot Analyse von BN 16 Membranen 10 µg aufgereinigte Membranen von BN 16 Zellen in Spur 1 und 1 µg in Spur 2 wurden in einer SDS - PAGE aufgetrennt. Durch Western-Blot Analyse konnte dargestellt werden, dass BN 16 Zellen Cubilin und Megalin auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Die Positionen der Markerproteine mit den Größen 250 kDa und 98 kDa sind angezeigt.

 

Die Tatsache, dass BN 16 Zellen Cubilin und Megalin exprimieren, konnte durch Western Blot Analyse bestätigt werden. Zusätzlich konnte festgestellt werden, dass keiner der eingesetzten Antikörper kreuzreagiert, d.h., der Anti-Cubilin Antikörper erkennt nicht Megalin oder umgekehrt. Auf dieses Ergebnis werde ich [Seite 77↓]später noch einmal zurückkommen. Da BN 16 Zellen die Rezeptorausstattung von Zellen des proximalen Tubulus der Niere besitzen, wurden sie im Folgenden

genutzt, um zu untersuchen, ob die Bindung von CCSP an Cubilin zur Endozytose des Proteins führt.

4.5.2. CCSP - Aufnahme und Degradation durch BN 16 Zellen

Durch Aufnahme- und Degradationsstudien sollte aufgeklärt werden, ob es zu einer zeitabhängigen Aufnahme und einem darauffolgenden lysosmalen Abbau des Proteins kommt. Hierzu wurde zunächst rekombinantes CCSP mit 125Jod radioaktiv markiert. Es besaß eine spezifische Aktivität von 1754 cpm/ng. BN 16 Zellen in 0,5 ml gutaminfreiem DMEM mit 0,2 % (w/v) BSA erhielten 230 ng des rekombinanten 125J - CCSP pro ml Medium. Zusätzlich enthielt das Medium entweder 100 µg / ml Glutathion S-Transferase-RAP Fusionsprotein (GST-RAP), 50 µg / ml Glutathion S-Transferase (GST) oder 200 µM Chloroquin. Nach einer Inkubation bei 37°C wurde in Abständen von einer Stunde die Menge an radioaktiven Abbauprodukten, welche in das Medium ausgeschieden wurde, gemessen (Abb.4.17.).

Abb. 4.17. Degradation von rekombinantem CCSP durch BN 16 Zellen

BN 16 Zellen in 0,5 ml glutamin- und serumfreiem DMEM mit 0,2 % BSA (w/v) erhielten 230 ng rekombinantes 125J-CCSP / ml. Es wurde zu den Zellen entweder 50 µg GST / ml, 100 µg GST-RAP / ml oder 200 µM Chloroquin gegeben. Nach einer Inkubation über die angegebenen Zeitintervalle bei 37°C wurde die Menge an radiomarkierten Abbauprodukten im Medium gemessen. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte und die Standartabweichungen von insgesamt drei Versuchen.


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Ohne die Zugabe von Inhibitoren wurden binnen einer Stunde durchschnittlich 13,5 ng, nach zwei Stunden 95ng, nach drei Stunden 135 ng und nach vier Stunden 186,5 ng 125J-CCSP pro mg BN 16 Zellen, in die Zellen aufgenommen und degradiert.

Die Zugabe von GST diente der Verifizierung, dass der blockierende Teil des GST-RAP Fusionsproteins das RAP war. Die Zugabe von GST-RAP zum Assay verhindert deutlich die Aufnahme und den Abbau von CCSP.

Nach einer Stunde vermochte RAP eine Aufnahme komplett zu blockieren, nach vier Stunden wurden im Vergleich zu der ungehinderten Aufnahme immerhin 31 % degradiertes 125J-CCSP im Zellüberstand vorgefunden.

Mit Zugabe von Chloroquin, einem Inhibitor lysosomaler Degradation, konnte dieser Effekt noch verstärkt werden. Nach vier Stunden konnten lediglich 8,6 % des Normalwertes gemessen werden.

Es kann zusammenfassend gesagt werden, dass sowohl durch RAP, als auch durch Chloroquin die Degradation von CCSP in erheblichen Maße reduziert wurde.

4.5.3. Inhibierung der CCSP Aufnahme durch Antikörpern

Zur Bestätigung, dass der zelluläre Katabolismus von CCSP wirklich abhängig von der Anwesenheit Cubilins ist, wurden Antikörper gegen Cubilin den Aufnahme- und Degradationsstudien zugegeben, um so spezifisch diesen Rezeptor und nicht Endozytose im allgemeinen zu unterbinden.

Für diesen Versuch erhielten BN 16 Zellen wiederum glutaminfreies DMEM mit 0,2 % (w/v) BSA, diesmal in einem Volumen von 0,25 ml.

In den verschiedenen Versuchen wurden 270-450 ng/ml 125J-CCSP mit einer spezifische Aktivität von 1754 cpm/ng zugegeben.

Zusätzlich wurden 200 µg IgGs/ml dem Zellmedium zugegeben. Außer dem Antikörper gegen Cubilin wurden als Kontrollen nicht-immune IgGs und ein Antiserum gegen Megalin verwendet.

Nach einer Inkubation von zwei Stunden bei 37°C wurde die Menge der radioaktiven Abbauprodukte im Zellüberstand bestimmt.


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Abb. 4.18. Inhibierung des Abbaus von rekombinantem CCSP durch Zugabe von Anti-Megalin und Anti-Cubilin IgGs

BN 16 Zellen in 0,25 ml glutamin- und serumfreiem DMEM mit 0,2 % BSA (w/v) erhielten 270-450 ng rekombinantes 125J-CCSP/ml. Es wurde zu den Zellen zusätzlich die angegebenen gereinigten IgGs gegeben. Nach einer Inkubation von 2 Stunden bei 37°C wurde die Menge an radiomarkierten Abbauprodukten im Medium gemessen. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte und die Standartabweichungen von insgesamt drei Versuchen

Der Kontrollwert (100%), mit dem alle Abbauraten hier verglichen wurden, wurde ohne Zugabe jeglicher Antikörper ermittelt. Er liegt je nach Zelldichte zwischen 70 und 450 ng CCSP pro mg Zellprotein. Dieser Wert ist hier nicht gesondert aufgeführt. Wie erwartet führte die Zugabe von Anti-Cubilin IgG zum Zellmedium (Abb. 4. 18. Spur 1) zu einer drastischen Verringerung der Degradation von CCSP. Ein unspezifisches Kaninchen IgG behindert in keiner Weise den zellulären Abbau von CCSP (Spur 2). Jedoch wurde die CCSP Degradation überraschender Weise durch die Beifügung eines Anti-Megalin IgGs (Spur 3) fast ebenso stark inhibiert, wie durch die Zugabe von Anti-Cubilin. Spur 4 zeigt dass ein nicht-immunes Schaf IgG keine Auswirkungen auf die Internalisierung und Degradation von CCSP hatte. Eine kombinierte Gabe von


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Anti-Cubilin und Anti-Megalin führte zu einem kompletten Ausbleiben des CCSP Abbaus (Abb. 4. 18. Spur 5). In Spur 6 ist der Effekt von kombinierter Beifügung beider Kontroll-Antikörper gezeigt. Wie bereits in Absatz 4.6.1. erwähnt, erkennen die Anti-Megalin IgGs Cubilin nicht. Daher ist die beobachtete Inhibierung des CCSP Abbaus bei Zugabe von Anti-Megalin Antikörpern nicht durch eine direkte Bindung der Anti-Megalin IgGs erklärbar. Vielmehr ist die Degradation von CCSP durch BN 16 Zellen abhängig von Megalin, einem Rezeptor, der nicht CCSP bindet (Abb. 4.12.). Dieser Befund ist insofern höchst interessant, da er frühere Hypothesen über die Wirkungsweise von Cubilin unterstützt. Cubilin ist ein Protein ohne transmembrane oder zytoplasmatische Domänen, welches nur lose mit der Plasmamembran assoziiert ist. Da Cubilin aber in vitro zu Megalin binden kann, wurde vermutet, dass Cubilin im Zusammenspiel mit Megalin als Endozytoserezeptor wirken könnte (Moestrup et al., 1998, Hammad et al., 2000). Möglich wäre es, dass Cubilin durch die Bindung von inhibierenden Antikörpern an Megalin selbst nicht mehr an Megalin binden kann. Dadurch wäre die Aufnahme von Liganden durch Cubilin bei BN16 Zellen behindert.

4.6. CCSP in vivo

Um zu bestätigen, dass ein Aufnahmemechanismus durch solch ein „Rezeptoren-Doppel“ auch in vivo existiert, wurde der CCSP-Metabolismus der Niere in Patienten mit einem Defekt im für Cubilin codierenden Gen oder in einem Mausmodell mit einer Megalin Defizienz untersucht. Wäre die Theorie korrekt, dass CCSP nur durch das Zusammenspiel von Megalin und Cubilin in die Zellen des proximalen Tubulus aufgenommen werden kann, sollten Nieren, denen einer der beiden Rezeptoren fehlt, CCSP im Urin ausscheiden.

4.6.1. CCSP im Urin von Patienten mit einer Cubilin Defizienz

Zunächst wurde der Urin hinsichtlich einer CCSP-Exkretion bei Patienten mit dem Imerslund-Grasbeck Syndrom untersucht. Dieses Syndrom resultiert aus einem ererbten Defekt im Gen codierend für Cubilin (Aminoff et al., 1999). Als Kontrollen wurden Patienten mit einem Fanconi-Syndrom der Niere analysiert.


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Sie leiden an einem generellen Defekt in der tubulären Rückaufnahme von Proteinen und scheiden daher zahlreiche Plasmabestandteile aus, die im Normalfall im proximalen Tubulus der Niere reabsorbiert werden. Es wurden jeweils 5 µl Urin von zwei gesunden Menschen (Abb. 4.19. Spur 1 und 3), zwei Patienten mit Imerslund-Grasbeck Syndrom (Spur 2 und 4) und einem Fanconi-Patienten (Spur 5) aufgetragen und in einer 4-20 % nicht-reduzierenden SDS-PAGE aufgetrennt, dann auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Membran wurde im oberen Teil mit einem Antiserum, das gegen humanes CCSP gerichtet war und im unteren Teil mit einem Antikörper gegen humanes β-2 Mikroglubulin (β-2M) inkubiert. Gebundene Antikörper wurden mittels Chemolumineszenz sichtbar gemacht.

Abb. 4.19. Exkretion von CCSP im Urin von Imerslund - Grasbeck Syndrom Patienten 5 µl Urin von zwei Patienten mit Imerslund - Grasbeck Syndrom (Imers.), einem mit einem Fanconi - Syndrom (Fanconi) und zwei gesunde Kontrollen (Kontro) wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt und durch Western-Blot Analyse konnte die Ausscheidung von CCSP und β-2 Mikroglubulin dokumentiert werden

 

Deutlich sichtbar ist, dass Patienten mit einem Imerslund-Grasbeck Syndrom erhebliche Mengen CCSP mit ihrem Urin ausscheiden (Abb. 4.19. Spur 2 und 4). Bei gesunden Menschen ist dieses nicht zu beobachten (Spur 1 und 3). Allerdings wurden gleiche Mengen CCSP auch im Urin von Fanconi-Patienten nachgewiesen (Spur 5). Da Patienten mit einem Imerslund-Grasbeck Syndrom im Gegensatz zu Fanconi-Patienten nicht an einem generellen und unspezifischen Defekt in der tubulären Rückaufnahme von Proteinen leiden, konnte in ihrem Urin kein β-2 Mikroglubulin nachgewiesen werden. Es wird als ein Markerprotein für eine tubuläre Fehlfunktion angesehen (Pergande et al., 1994) und ist deutlich sichtbar


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in Spur 5, dem Urin des Fanconi-Patienten. Insgesamt wurden vier Patienten mit Imerslund-Grasbeck Syndrom, drei mit einem Fanconi-Syndrom und sechs Kontrollen analysiert. Alle Proben stimmten mit den hier in Abb. 4.19. gezeigten Ergebnissen überein. Diese Analysen ergaben, dass Patienten mit einer generellen Cubilin Defizienz CCSP in ihrem Urin ausscheiden und, dass die Exkretion von CCSP nicht auf einen unspezifischen Defekt in der tubulären Reabsorbtion zurückzuführen ist.

4.6.2. CCSP im Urin Megalin defizienter Mäuse

Da bisher noch keine Patienten mit einer Megalin Defizienz beschrieben worden sind, wurden für die weiteren Untersuchungen Megalin Knockout Mäuse herangezogen. Hierzu wurden je 15 µl Urin von zwei Kontrolltieren und drei Megalin defizienten Mäusen in einer 4-20 % nicht-reduzierenden SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Diese wurde dann mit einem Antiserum, das gegen CCSP aus der Ratte gerichtet war inkubiert. Gebundene Antikörper wurden durch Chemolumineszenz sichtbar gemacht.

Abb. 4.20. Ausscheidung von CCSP im Urin von Megalin defizienten Mäusen. Je 15 µl Urin von dreiMegalin defizienten Mäusen (-/-) und zwei Kontrollen (+/+) wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt. Durch Western-Blot Analyse konnte die Ausscheidung von CCSP im Urin der Knockout Mäuse dokumentiert werden. Die Positionen der Markerproteine sind angezeigt

 

Tatsächlich ist CCSP im Urin von Megalin defizienten Mäusen, jedoch nicht im Urin von Kontrolltieren nachweisbar(Abb.4.20.). Mit diesem Ergebnis wird die Hypothese, dass beide Rezeptoren für die tubuläre Aufnahme von CCSP


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verantwortlich sind, unterstützt. Tiere, die nur Cubilin, aber kein Megalin besitzen, scheiden CCSP in ihrem Urin genauso aus, wie Patienten, die zwar Megalin in der Niere exprimieren, aber kein Cubilin.

4.6.3. CCSP Lokalisation in der Niere

Die fehlende Aufnahme von CCSP in der Niere Megalin defizienter Mäuse wurde weiterhin durch eine immunohistochemische Analyse von murinen Nierenschnitten bestätigt. Hierzu wurden Parafinschnitte von Nieren Megalin defizienter Mäuse und von Kontrolltieren mit einem Antiserum gegen CCSP aus der Ratte gefärbt.

Abb. 4.21. Immunhistochemische Analyse von CCSP in der murinen Niere

Nachweis von CCSP in Parafinschnitten der Niere von Megalin defizienten Mäusen (-/-) und Kontrolltieren (+/+). Durch die Pfeile wird auf apikalen Endosomen und Lysosomen hingewiesen. Die Vergrößerung beträgt rechts 1: 1050 und links 1: 700.

In Abb. 4.21. ist links der Schnitt einer Kontrollniere zu sehen, rechts der einer Megalin Knockout Maus.

Die Pfeile markieren das in Endosomen und Lysosomen lokalisierte CCSP in Zellen des proximalen Tubulus der Kontrollniere und weisen auf eine Aufnahme des Proteins aus dem glomerulären Filtrats hin. In der Megalin defizienten Maus ist kein intrazelluläres CCSP im proximalen Tubulus der Niere nachweisbar.


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4.6.4.  Cubilin in der Niere

Um die Folgen einer Megalin Defizienz auf die Expression des funktionalen Cubilin Rezeptors zu untersuchen, wurde die immunohistochemischen Analysen von murinen Nierenschnitten auf den Nachweis von Cubilin ausgedehnt. Hierzu wurden Parafinschnitte von Nieren von Megalin defizienten Mäusen und Kontrolltieren mit einem Antiserum gegen Cubilin inkubiert. Diese Antikörper wurden durch Fluoreszenz sichtbar gemacht.

Abb. 4.22. Immunhistochemische Analyse von Cubilin in der murinen Niere

Nachweis von Cubilin in Parafinschnitten der Niere von Megalin defizienten Mäusen (-/-) und Kontrolltieren (+/+). Bei Wildtyp Mäusen ist im Gegensatz zu den Knockout Tieren Cubilin in hoher Dichte um das Lumen des proximalen Tubulus exprimiert. Vergrößerung beträgt 1: 1400.

In Abb. 4.22. ist bereits bei relativ geringer Vergrößerung zu sehen, dass in der Niere der Megalin defizienten Maus weit weniger Cubilin ausgebildet wird.

Während im linken Bild, dem Nierenschnitt der Wildtyp Maus der Bürstensaum des proximalen Tubulus der Niere stark gefärbt ist, sind in der Knockout Maus nur geringfügige Anfärbungen zu erkennen.

Eine genauere Lokalisation von Cubilin in der Niere ist durch Elektronenmikroskopie möglich. Dieses Experiment wurde im Labor von Erik Christensen, Department für Zellbiologie der Universität Aarhus mit seiner freundlichen Unterstützung durchgeführt. Es wurden ultradünne Gefrierschnitte der Nieren von Megalin defizienten Mäusen (Abb. 4.23. oberes Bild) und Wildtyp Kontrollnieren (unteres Bild) mit einem Antiserum gegen Cubilin inkubiert, dem eine Inkubation mit ein goldgekoppeltem Sekundärantikörper und eine elektronenmikroskopischen Aufnahme folgte.

Abb. 4.23. Elektronenmikroskopische Untersuchung auf Cubilin in der Niere der Maus elektronenmikroskopische Aufnahmen von Schnitten durch die proximalen Tubuli der Nieren von Wildtyp Mäusen (oben, +/+) und Megalin defizienten Tieren (unten, -/-). Die Pfeile im oberen Abschnitt markieren die dichten, apikalen Tubuli. Im unteren Bild markieren die Pfeile Transportvesikel. BS = Bürstensaum, E = Endosomen; Vergrößerung 1: 70000

In der elektronenmikroskopischen Analyse wurde Cubilin in Endosomen und Membranvesikeln gefunden, die eine recycelnde Aufgabe ausüben, sogenannte dichte, apikale Tubuli. Sie dienen der Rückführung von internalisierten Rezeptoren an die Zelloberfläche. Diese Beobachtung deckt sich mit der [Seite 86↓]beschriebenen Funktion Cubilins als Endozytoserezeptor. In der Megalin defizienten Maus hingegen wurde Cubilin nicht in dichten, apikalen Tubuli oder Endosomen gefunden. Die angezeigten Membranvesikel sind von geringerer Dichte, es dürfte sich bei ihnen um Vesikel handeln, die neu synthetisiertes Cubilin vom Trans-Golgi Netzwerk an die Oberfläche transportieren. Es bleibt festzuhalten, dass die Gesamtmenge an Cubilin in der Niere Megalin defizienter Mäuse deutlich reduziert ist. Unterstützt wird dieses Ergebnis durch eine Western-Blot Analyse, in der Membranextrakte von Nieren Megalin defizienter Mäuse direkt mit denen von Kontrolltieren verglichen wurde. Jeweils 10 µg Nierenmembranen pro Spur wurden in einer 4-16 % SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Der obere Teil dieser Membran wurde mit einem Antikörper gegen Cubilin, der untere Teil in seiner Funktion als Ladekontrolle mit einem Antikörper gegen RAP inkubiert.

Abb. 4.24. Western-Blot Analyse der murinen Nierenmembran auf Cubilin Nierenmembranenproteine (10 µg Protein) von Megalin Knockout Mäusen (Spur 1, 3 und 5) und von Kontrollen (2 und 4) wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt. Durch Western-Analyse wurde Menge an membranassoziiertem Cubilin dargestellt (obere Bande). Als Kontrolle für eine gleichmäßige Beladung wurde RAP angefärbt. Die Positionen der Markerproteine sind angezeigt.

 

In Abb. 4.24. Spur 1, 3 und 5 in sind die Nierenmembranen von Megalin defizienten Tieren aufgetragen. Die Menge an Cubilin ist im Vergleich zu denen der Kontrolltiere in Spur 2 und 4 reduziert. Diese Resultate bedeuten, dass in Megalin defizienten Nieren die Ausstattung mit Cubilin reduziert ist.

4.6.5. CCSP in der Lunge

Die bisherigen Versuche haben demonstriert, dass CCSP im proximalen Tubulus der Niere vermittelt durch das Rezeptoren-Doppel Cubilin und Megalin aufgenommen wird.


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Als nächstes wurde untersucht, ob dieser Mechanismus auch in der Lunge für den CCSP Katabolismus verantwortlich ist. Da kein Lungenmaterial von Patienten mit einem Imerslund-Grasbeck Syndrom zur Verfügung stand, wurde das Hauptaugenmerk auf die Lungen von Megalin defizienten Mäusen gelegt.

4.6.5.1 Gesamtproteinbild bei Megalin defizienten Tieren und Kontrollen

Zu diesem Zweck wurde die bronchio-alveolare Lavage von Megalin Knockout Mäusen mit der von Wildtypen verglichen.

Hierzu wurden je 5 µg Protein aus der Lungen-Lavage von Wildtyp Mäusen (Abb. 4.25. Spur 2, 3 und 5), sowie von Knockout Mäusen (Spur 1 und 4) in einer 4-15 %, reduzierenden oder nicht-reduzierenden SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat gefärbt.

Abb. 4.25. Analyse der bronchio-alveolaren Lavage von Megalin Knockout Mäusen und Wildtypen Lavage-Flüssigkeit der Lunge (5 µg Protein) von Megalin Knockout Mäusen (Spur 1 und 4) und von Kontrollen (2, 3, 5, 6) wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat gefärbt. Die Positionen der Markerproteine sind angezeigt

 

Es konnte weder im reduzierten noch im nicht-reduzierten Zustand ein offensichtlicher Unterschied im Gesamtproteinmuster entdeckt werden.

4.6.5.2 CCSP-Quantifizierung in der Lavage von Megalin Knockout und Kontrolltieren

Um doch noch eventuelle Unterschiede in der Menge an CCSP in den Lungen-Lavages nachzuweisen, wurde der nicht-reduzierende Teil einer identischen SDS-PAGE wie unter 4.7.5.1. beschrieben auf eine Nitrozellulosemembran transferiert und mit einem Antiserum gegen CCSP aus der Ratte inkubiert (Abb.4.26.).

Abb. 4.26. Western-Blot Analyse der bronchio-alveolaren Lavage von Megalin Knockout Mäusen und Wildtypen Lavage-Flüssigkeit der Lunge (5µg Protein) von Megalin Knockout Mäusen (Spur 1) und von Kontrollen (2 und 3) wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und durch Western-Blot Analyse wurde die Anwesenheit von CCSP in allen Proben dokumentiert. Die Positionen der Markerproteine sind angezeigt.

 

In Spur eins ist die Lavage eines Megalin defizienten Tieres aufgetragen. Sie ist in Hinblick auf die Menge CCSP, die sich in der Lunge befindet, nicht von denen der Kontrolltiere zu unterscheiden.

Dieses Ergebnis bedeutet, dass in Megalin defizienten Lungen sich keine größeren Mengen CCSP ansammeln. Es schließt jedoch nicht aus, dass ein alternativer Rezeptor für den Katabolismus von CCSP in der Lunge existiert.

Mit diesen Resultaten konnte erstmalig gezeigt werden, dass ein Co- Rezeptorsystem für die Resorption eines Proteins im proximalen Tubulus der Niere notwendig ist.

Ein Rezeptor in diesem „Doppel“ ist Megalin, ein Vertreter der LDL R Gen Familie. Der andere Mitspieler ist Cubilin, ebenfalls ein extrem großer, multifunktioneller Rezeptor, dem allerdings eine Transmembrandomäne und ein zytoplasmatischer Anhang fehlt.

CCSP bindet zuerst an Cubilin und der Komplex aus Rezeptor und Transportprotein assoziiert mit dem Endozytoserezeptor Megalin und wird in die Zellen aufgenommen.

Fehlt Megalin oder Cubilin in der Niere, wird CCSP mit dem Urin ausgeschieden und ist für den Körper verloren. Die Niere ist das Gewebe, in dem CCSP normalerweise aus dem Primärharn rückresorbiert wird. Zu einer Anreicherung


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des Proteins und einer darauf folgenden Zerstörung des Gewebes, kommt es, wenn CCSP im Komplex mit PCBs vorliegt.

PCBs sind enzymatisch von uns nicht abbaubar sind. Folglich kommt es zu einer Einlagerung und Anreicherung.

Utero- oder Blastokinin, Bezeichnungen für CCSP, die für das homologe Protein bei Hasenartigen üblich sind, weisen auf einen Wirkungsort von CCSP hin. Blastokinin wurde als der Bestandteil der uterinen luminalen Flüssigkeit beschrieben, der in vitro die Blastulation induziert und die Reifung der Blastozysten des Kaninchens fördert.

Es ist also davon auszugehen, dass CCSP entweder durch sich selbst eine Signalkaskade anregt oder durch seine Aufnahme in Zellen im Uterus Substanzen zur Verfügung stellt, die unerlässlich für reproduktive Vorgänge sind. In beiden Fällen ist ein CCSP bindender Rezeptor notwendig. Von Megalin wissen wir nun, dass es die CCSP Aufnahme in die Niere vermittelt. Ich möchte im Folgenden darstellen, ob Megalin auch für eine CCSP Aufnahme im Uterus in Frage kommt und/oder welche Funktion Megalin im Uterus ausüben könnte.

4.7. Expression von Megalin im Uterus

Interessanterweise bilden zirka 60 % der weiblichen Megalin Knockout Mäuse eine Anomalie der Geschlechtsöffnung aus (Abb.4.27.), die als vaginale Obstruktion oder Vaginalverschluß beschrieben wird.

Abb. 4.27. Vaginalverschluss bei Megalin defizienten Mäusen. Die Geschlechtsöffnung eines Megalin Knockout Weibchens (links) und vergleichend die normale Entwicklung bei einem Kontrolltier (rechts). Die Vagina des Megalin defizienten Tieres bleibt durch eine Haut verschlossen, die sich üblicherweise mit Erreichen der Geschlechtsreife zurückbildet.

 


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Mäuseweibchen werden normalerweise mit einer geschlossenen Vagina geboren, die sich im Laufe ihrer Geschlechtsreife öffnet.

Dieses ist ein von 17β-Östradiol abhängiger Vorgang (Allen et al., 1984). Im Durchschnitt öffnet sich die Vagina in der dritten bis vierten Woche nach der Geburt (Safranski et al., 1993).

Es ist bisher nicht beschrieben worden, dass Progesteron in diesen Vorgang eingreift. CCSP als Transportmolekül für Progesteron sollte deshalb bei dem Verlust des die Vagina verschließenden Häutchens keine Rolle spielen.

Eine Expression von Megalin im Uterus hingegen ist dokumentiert worden (Saito et al., 1994, Zheng et al., 1994).

Der Rezeptor, exprimiert von Epithelzellen und dem Lumen zugewandt, kleidet das Innere des Uterus aus. Welche Funktion Megalin im Inneren des Uterus zukommt, ist bisher nicht bekannt.

Es ist jedoch denkbar, dass Megalin hier, ähnlich wie im proximalen Tubulus der Niere, für z. B. die Endozytose von Steroiden verantwortlich ist. Progesteron und Östradiol sind nur die wichtigsten Hormone, die für einen geregelten Zyklus notwendig sind.

Um Megalins Rolle in der Geschlechtsreifung und später während des Zyklus näher zu untersuchen, wurde zunächst eine detailierte Analyse der Expression des Rezeptors im Uterus, beginnend mit der postembryonalen Entwicklung bis zum Erwachsenenalter, unternommen. Diese Untersuchung sollte eine erste Auskunft liefern, ob die Rezeptorexpression abhängig vom Hormonstatus der Tiere ist.

4.7.1. Megalin Expressionsmuster während der postnatalen Entwicklung

Durch eine immunohistochemische Analyse des murinen Uterus soll dargestellt werden, zu welchem Zeitpunkt Megalin exprimiert wird.

Arbeiten von Annette Hammes und Robert Spoelgen aus dem Labor von Thomas Willnow haben gezeigt, dass Megalin während der gesamten Embryonalentwicklung nicht im Uterus des Embryos nachgewiesen werden kann (persönliche Kommunikation).

Daher beschränkt sich meine Arbeit auf eine Untersuchung der postembryonalen Entwicklung der Tiere.


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Hierzu wurden Parafinschnitte der Uteri in verschiedenen Entwicklungsstadien mit einem Antiserum gegen Megalin, das aus der Ziege gewonnen wurde, gefärbt. Zur besseren Orientierung wurden die Gewebe mit Mayers Hämalaun Färbelösung gegengefärbt.

Abb. 4.28. Immunhistochemische Analyse von Megalin im murinen Uterus von Neugeborenen Megalin kann im Uterus von Mäusen am Tag nach ihrer Geburt nicht nachgewiesen werden. Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun Färbelösung. Die Vergrößerung beträgt 1:100.

Die in Abb. 4.28. gezeigten Parafinschnitte präsentieren die Situation einen Tag nach der Geburt. Neugeborene Mäuse exprimieren kein Megalin in ihrem Uterus.

Die nächste Abbildungen zeigen Uteri von ein und zwei Wochen alten Tieren.


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Abb. 4.29. Immunhistochemische Analyse von Megalin im murinen Uterus im Alter von ein und zwei Wochen

Der Nachweis von Megalin im Uterus von Mäusen ist eine Woche nach ihrer Geburt möglich (A). Die Abbildung B ist eine Kontrollfärbung ohne Antiserum gegen Megalin. Megalin ist auch nach zwei Wochen (C-F) sehr gut nachweisbar. Die Pfeile in der Vergrößerung zeigen die typischen Verteilungen der Expression: das Epithel und die Drüsen. Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun Färbelösung. Die Vergrößerung beträgt bei A-E 1:100 bzw. bei F 1:200.

Schon eine Woche nach der Geburt wird vom Uterusepithel Megalin exprimiert (Abb. 4.29. A). In diesem Alter sind bei den Tieren noch keine Brustwarzen sichtbar, die Ohren sind erst seit 3-4 Tagen geöffnet. Abb. 4.29 B zeigt eine Kontrollfärbung, bei der das Antiserum gegen Megalin weggelassen wurde.

Noch eine Woche später, also 14 Tage nach der Geburt findet man Megalin auch in vaginalem Drüsengewebe (Abb. 4.29. D - F).


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Wir können also feststellen, das Megalin im Uterus bereits lange vor dem Erreichen der Geschlechtsreife ausgebildet wird. Im Alter von zwei Wochen haben die Jungtiere gerade ihre Augen geöffnet.

In Abb. 4.30. sind die Uteri adulter, geschlechtsreifer Weibchen im Alter von vier (A) und fünf (B) Wochen gezeigt. Zu diesem Zeitpunkt ist das Häutchen, dass die Vagina verschloss, bereits zurückgebildet.

Abb. 4.30. Immunhistochemische Analyse von Megalin im adulten, murinen Uterus

Auch im adulten Zustand bleibt die Megalin Expression erhalten. In A ist ein Parafinschnitt einer Uterus einer vier Wochen alten Maus gezeigt, B nach fünf Wochen. Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun Färbelösung. Die Vergrößerung beträgt 1:100.

Megalin wird vom Epithel und in den Drüsen ausgebildet. Es sind allerdings beim Vergleich der beiden Uteri in Abb. 4.30. Schwankungen in der Stärke der Expression zu erkennen. Der Uterus des älteren Weibchens exprimert weniger Megalin. Das kann zwei Gründe haben. Erstens ist es möglich, dass nach vier Wochen die Megalin Expression abnimmt. Zweitens ist es denkbar, dass in Abhängigkeit des Zyklus und damit der involvierten Hormone, auch die Menge an im Uterus exprimiertem Rezeptor schwankt.

4.7.2. Megalin Expression in Abhängigkeit des Zyklus

Deshalb habe ich versucht, bei 21 Tagen alten, gerade noch geschlechtunreifen Tieren, den Zyklus durch Hormongaben zu simulieren. Zu diesem Zeitpunkt ist die Vagina noch geschlossen, die Weibchen würden aber binnen weniger Tage bis einer Woche von alleine anfangen, den Zyklus zu durchlaufen.


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Selbstverständlich setzt der Auf- und Abbau der Uterusschleimhaut, die Reifung und dann der Eisprung ein Zusammenspiel von vielen Hormonen und anderen Faktoren voraus. Das gesamte Blutbild verändert sich, die Körpertemperatur und Puls ebenfalls.

Doch es lässt sich durch 17β-Östradiol- und Progesterongaben dieses simulieren bzw. einleiten (Huang et al., 1999). So konnte ich zum einen sicherstellen, dass die von mir verglichenen Tiere sich in der gleichen Phase des Zyklus befanden und zum anderen analysieren, ob sich in Hinblick auf die Expression von Megalin die Phasen von einander unterschieden.

Zum Zweck der künstlichen hormonellen Synchronisation wurden die Mäuse in drei Gruppen eingeteilt. Der ersten Gruppe, bei der die Proliferationsphase des Zyklus eingestellt werden sollte, in der sich die Uterusschleimhaut aufbaut, wurde über vier Tage 1 µg/Tag 17β-Östradiol in Öl sub cutan (s. c.) injiziert. Die zweite Gruppe erhielt 1 µg 17β-Östradiol plus 1 mg Progesteron in Öl pro Tag. Diese Behandlung induziert die Sekretionsphase, in der die Uterusschleimhaut bereit für die Einnistung eines befruchteten Eies ist. Eine Kontrollgruppe erhielt lediglich Speiseöl gespritzt. Wie bereits erwähnt wurden für diese Versuche drei Wochen alte Weibchen genommen, da die Tiere zu diesem Zeitpunkt noch geschlechtsunreif waren. Die Geschlechtsöffnungen der Kontrollgruppe waren auch nach Abschluss der vier Tage noch nicht geöffnet.

Um zu kontrollieren, ob die Tiere auf die Hormone reagierten, wurden die Gewichte der Uteri gemessen. Bei Mäusen, die 17β-Östradiol/Progesteron erhielten, verändert sich bei Mäusen das Gewicht der Gebärmutter nur wenig im Vergleich zu unbehandelten Tieren. Spritzt man den Tieren jedoch 17β-Östradiol, nimmt das Nassgewicht um bis das vierfache zu. Dieses ist nicht durch eine dickere Schleimhaut zu erklären, sondern die Uteri schwellen aufgrund einer massiven Anreicherung von ULF in den beiden Hörnern und dem Corpus Uterus an.

In Abbildung 4.31. sind die Uteri der Kontrolltiere zu sehen, denen Öl gespritzt wurde. Diese Tiere sind als geschlechtsunreif zu betrachten.


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Abb. 4.31. Immunhistochemische Analyse von Megalin im murinen Uterus im Alter von drei Wochen

Megalin ist deutlich exprimiert in Drüsen und vom Epithel. Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun Färbelösung. Die Vergrößerung beträgt A - C 1:100 bzw.
D 1:200.

Die geschlechtsunreifen Tiere im Alter von drei Wochen zeigen ohne künstlich Hormonstimulation eine sehr kräftige Megalin Expression, die sich nicht wesentlich von zwei Wochen alten Tieren (Abb. 4.29. C-F) unterscheidet. Der Rezeptor wird von Drüsen und vom Epithel gebildet.

In der simulierten Proliferationsphase hingegen, also bei 17β-Östradiol Injektionen, wird im Uterus weit weniger Megalin gebildet.

Doch es ist nicht nur die Menge an Rezeptor, die sich verändert hat, sondern vor allem seine Verteilung.


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Abb. 4.32. Immunhistochemische Analyse von der Megalin Expression am Tag 5,5 p.c. im Bereich der implantierten Embryonen

Murine Uteri nach viertägiger 17β-Östradiol Behandlung der Tiere. Es ist nur wenig Megalin im Epithel und in den Drüsen (Pfeile in Vergrößerung D) nachweisbar. Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun Färbelösung. Die Vergrößerung beträgt für A-C 1:100 bzw. für D 1:200.

Das dem Lumen zugewandte Epithel zeigt hier nur in einem von drei Tieren eine relevante Expression von Megalin auf der Zelloberfäche (Abb. 4.32. C). In der Vergrößerung (D) zeigt sich, dass der Rezeptor auch nicht mehr stark in den Drüsen nachweisbar ist. Vielmehr sind die einzigen Anfärbungen in Vesikeln im Stroma zu finden.

Bei kombinierter 17β-Östradiol- und Progesterongabe (Abb. 4.33.) dagegen, also Einleitung einer sekretorischen Phase, in der die Uterusschleimhaut auf die Einnistung eines befruchteten Eies vorbereitet ist, ähnelt zwar die Verteilung von Megalin im Uterus der geschlechtsunreifer Tiere, jedoch wird weit weniger Rezeptor exprimiert.


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Abb. 4.33. Immunhistochemische Analyse von Megalin im murinen Uterus während der Sekretionsphase

Murine Uteri nach viertägiger 17β-Östradiol-/Progesteronbehandlung der Tiere. Megalin ist im Epithel und in den Drüsen nachweisbar. Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun Färbelösung. Die Vergrößerung beträgt A-C 1:100 bzw. D 1:200.

Megalin ist im Epithel und in den Drüsen von Mäusen nach einer Behandlung mit 17β-Östradiol-/Progesteron nachweisbar. Im Vergleich zum juvenilen Uterus ist die Expression von Megalin allerdings deutlich reduziert.

Betrachtet man die beiden Gruppen, in denen der Hormonstatus synchronisiert wurde und ihre Kontrollgruppe vergleichend, ist der subjektive Eindruck, dass im geschlechtsunreifen Zustand am meisten Megalin im Uterus exprimiert wird. Unabhängig von der Verteilung des Rezeptors ist in der Proliferationsphase am wenigsten Rezeptor nachweisbar.

Dazwischen liegt die sekretorische Phase. Hier bewirkt die gleichzeitige Präsenz von Progesteron - und Östradiol, dass Megalin höher als bei alleiniger 17β-Östradiolgabe exprimiert wird, doch deutlich weniger als bei juvenile Mäusen.

Da sich jedoch histologische Analysen nur bedingt zur Quantifizierung eignen, wurde die Menge an Megalin mRNA bestimmt.


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Hormonell synchronisierten Mäusen und Kontrolltieren wurden von nach vier Tagen Hormoninjektionen die Uteri entnommen und mRNA aus den Geweben gewonnen.

Von der mRNA wurde durch reverse Transkription cDNA hergestellt. Anschließend konnte mit der Methode der TaqMan®-PCR die tatsächlich produzierte Megalin-mRNA quantifiziert werden. Zusätzlich zu den beiden Primern wird dieser PCR eine Sequenz-spezifische Sonde zugegeben. Diese Sonde ist mit einem Fluoreszein-Derivat markiert, das allerdings aufgrund der räumlichen Nähe zu einem ebenfalls die Sonde markierenden Quencher-Farbstoff nicht zur Fluoreszenz angeregt werden kann. Die hybridisierte Sonde wird durch die Exonuklease Aktivität der Polymerase hydrolysiert, so dass die beiden Farbstoffe ihre Nähe zueinander verlieren.

Abb. 4.34. TaqMan®-PCR zur Quantifizierung von Megalin im Uterus

Als Ergebnisse der TaqMan®-PCR werden Unterschiede des normalisierten Signals zum kleinsten, gemessenen Wert angegeben (dieses Tier ist hier nicht aufgeführt). Für die noch juvenilen Kontrolltiere wurde ein durchschnittliches Δ RN von 71,65 gemessen, für die17β - Östradiol behandelten Tiere ein Δ RN von 3,4 und für die Progesteron/Östradiol behandelten Tiere ein Δ RN von 51,23, allerdings mit einer hohen Standartabweichung aufgrund des mittleren Progesteron/Östradiol behandelten Tieres.


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Die TaqMan®-PCR (Abb.4.34.) gibt die Bestätigung für den optischen Eindruck, den die immunhistologische Untersuchung der Uteri lieferte.

Die Tiere in der Proliferationsphase, bei denen kaum noch Megalin im Epithel und in den Drüsen sichtbar war (Abb. 4.32.), bilden mit einem durchschnittlichen Δ RN von 3,4 nur ein Zwanzigstel an Megalin mRNA im Vergleich zu juvenilen Tieren. Für diese Tiere wurde ein durchschnittlichen Δ RN von 71,65 berechnet, dieser Wert entspricht dem Eindruck der histologischen Analysen (Abb. 4.31.), in der eine sehr starke Färbung des mukosen Epithels und der Drüsen zu sehen ist. Die Werte für die Tiere in der sekretorischen Phase geben im Durchschnitt einen Δ RN von 51,23. Der durchschnittliche Wert entspricht in der Tat dem Eindruck der Antikörperfärbungen (Abb. 4.33.). Doch eines der Tiere zeigt mit einem Δ RN von 130 ein höheres Signal als alle anderen Tiere.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass generell die Menge an exprimiertem Megalin im Uterus mit Erreichen der Geschlechtsreife abnimmt. Während des Zyklus ist die Menge an gebildetem Rezeptor Schwankungen unterworfen. Diese Schwankungen sind bedeutend kleiner als die beim Wechsel vom juvenilen zum adulten Tier.

Als nächstes sollte untersucht werden, wie die Megalin Expression bei trächtigen Weibchen aussieht, deren Embryonen im Begriff sind, zu implantieren.

Megalin wird vom sich entwickelnden Embryo produziert. Diese Expression findet bereits vor und auch nach der Implantation statt (Buc-Caron et al., 1987, Gueth-Hallonet et al., 1994). Von der Blastocyste wird Megalin im Trophoektoderm gebildet, nach der Einnistung im Dottersack, im amniotischen Ektoderm und im Neuroektoderm.

Da die Megalin Expression in der Gebärmutter während des Menstruationszyklus offensichtlich stark reguliert wird, sollte im Folgenden überprüft werden, ob die Implantation eines Embryos ebenfalls Einfluss auf die Expression von Megalin hat.Zu diesem Zweck wurden Parafinschnitte von Uteri samt gerade implantierter Embryonen (Tag 5,5 p.c.) mit Anti-Megalin IgG gefärbt.


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Abb. 4.35. Immunhistochemische Analyse vom Uterus samt Embryonen einer trächtigen Maus am Tag 5,5 p.c. auf Megalin

Tag 5,5 p.c. wurden Uteri von trächtigen Mäusen samt gerade implantierten Embryonen entnommen. Aus Bild C wurden zwei Ausschnitte vergrößert, die die Expression im uterinen Epithel (D) zeigen, sowie die vom Embryo und die ihn umgebende mukose Epithel (E). Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun Färbelösung. Vergrößerung für A + B 1:20, C + F 1:50, D + E 1:100.

Wie bereits bei nicht schwangeren Tieren ist Megalin auch am Tag der Implantation im uterinen Epithel exprimiert (4.35. D). Zusätzlich konnte eine starke Megalin Expression im mukosen Epithel um den implantierten Embryo festgestellt werden. Tatsächlich ist die Implantation durch eine feine Abstimmung von Progesteron und 17β-Östradiol bestimmt. Kurz vor der tatsächlichen [Seite 101↓]Einnistung der Embryonen, schon am Tag 4,5 p.c. kommt es im Uterus zu einer vermehrten Ausschüttung von 17β-Östradiol, hervorgerufen durch eine Sekretion

des luteinisierenden Hormons. Ohne diesen Östrogenschub sind die Embryonen nur noch weitere 24 Stunden überlebensfähig (Rugh, 1993). Megalin wird zu diesem Zeitpunkt am Ort der Implantation gebildet. Ein Fehlen Megalins verhindert jedoch nicht zwangsläufig die Einnistung des Embryos, denn überlebende Megalin Knockout Weibchen, deren Vagina sich öffnet, sind in der Lage, Junge auszutragen. Am Tag 1 nach der Geburt (Abb. 4.36. C) ist Megalin im Epithel und in Drüsen nachweisbar, die Expression im mukosen Epithel ist mit der von Mäusen vergleichbar, die nie gebärend waren (A und B).

Abb. 4.36. Immunhistochemische Analyse von Megalin im murinen Uterus adulter Weibchen ohne Geburt und direkt nach einer Geburt
C Nach einer Geburt ist die Megalin im Epithel und in Drüsen nachweisbar.
A und B Vergleich der Expression im mukosen Epithel mit Mäusen, die nie gebärend waren. Bei diesen ist faktisch kein Megalin in Drüsen nachweisbar. Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun Färbelösung. Vergrößerung 1:100.

Es ist bekannt, dass Megalin in der adulten Maus von Epithelzellen des Uterus exprimiert wird. Die bisherigen Versuche haben demonstriert, dass dieses bereits früh in der postembryonalen Entwicklung, lange vor Erreichen der Geschlechtsreife geschied. Ferner steht die Megalin Expression unter [Seite 102↓]hormonellem Einfluss. In juvenilen Tieren ist viel Megalin im Uterusepithel nachweisbar, mit Erreichen der Geschlechtsreife jedoch wird deutlich weniger Megalin exprimiert. Auch innerhalb des Zyklus ist die Megalin Expression Schwankungen unterworfen. In der Proliferationsphase, in der sich unter hohen Östradiolkonzentrationen die Uterusschleimhaut aufbaut, wird wenig Megalin detektiert. In der sekretorischen Phase, in der zusätzlich zum 17β-Östradiol- auch

das Progesteronniveau hoch ist, wird wieder mehr Megalin gebildet. In dieser Phase des Zyklus ist die Gebärmutterschleimhaut empfänglich für die Implantation der Embryonen. Zum Zeitpunkt, an dem sich die Embryonen in die Uterusschleimhaut einnisten, wird Megalin auch verstärkt im dem zugewandte Epithel produziert. Die physiologische Funktion dieser stark regulierten Expression von Megalin im Uterus während der Geschlechtsreifung, des weiblichen Zyklus und der embryonalen Implantation ist nicht bekannt. Es ist anzunehmen, dass Megalin in seiner Funktion als Endozytoserezeptor aus dem Lumen des Uterus, in der sich die uterine, luminale Flüssigkeit (ULF) befindet, Proteine aufnimmt. Dies könnte von Bedeutung für den Stoffwechsel des uterinen Gewebes oder der Signalweiterleitung dienen. Zur Analyse der Funktion von Megalin im Uterus ist der erste Schritt, herauszufinden, welchen Liganden Megalin aus der ULF in die Zellen des Epithels aufnimmt. Daher wird im Folgenden untersucht werden, welche Proteine aus der ULF an Megalin binden.

4.8. Liganden für Megalin in der uterinen, luminalen Flüssigkeit (ULF)

In den verschiedenen Stadien des Zyklus werden unterschiedliche Proteine in der ULF hoch- und herunterreguliert. CCSP findet z.B. seine höchste Expression in der Zeit nach der Ovulation, in der aus dem Follikel durch den Eisprung der Corpus luteum entsteht (Muller-Schottle et al., 1999). Diese Phase ist im Uterus die Sekretionsphase, in der die Gebärmutterschleimhaut empfänglich für die Implantation der Embryonen ist. Dies bedeutet, dass die CCSP - Produktion durch Progesteron und 17β-Östradiol angeregt wird. Die Konzentration von Laktoferrin in der ULF ist durch 17β-Östradiol induzierbar (Pentecost et al., 1987, Jefferson et al., 2000). Ebenfalls 17β - Östradiol stimuliert die 24p3 Expression im Uterus, das Protein wird in die ULF sekretiert (Chu et al., 1996, 2000).


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4.8.1.  Proteinmuster von ULF im Zyklus

Als ersten Schritt zur Identifikation eines möglichen Interaktionspartners für Megalin wurden von hormonell synchronisierten Mäusen und Kontrolltieren die Proteinkonzentrationen der ULF verglichen. Wie in Absatz 4.7.2. beschrieben, wurden geschlechtsunreifen Weibchen über vier Tage 17β-Östradiol oder 17β-

Östradiol in Kombination mit Progesteron injiziert, um die Proliferations- oder sekretorische Phase des Zyklus einzustellen. Eine Kontrollgruppe bekam s. c. Öl gespritzt. Die entnommenen Uteri wurden mit einer isotonen Natriumchloridlösung gespült, um die ULF aus dem Lumen der Gebärmutter zu gewinnen. Jeweils 10 µg Gesamtprotein der gesammelten ULF wurden in einer 4-12 % SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat gefärbt.

Abb. 4.37. ULF von hormonell synchronisierten Wildtyp Mäusen. Zur künstlichen Einstellung der sekretorischen Phase oder Proliferationsphase des Zyklus wurde Mäusen 1 µg 17β-Östradiol oder 1µg 17β-Östradiol und 1 mg Progesteron pro Tag s.c. injiziert. Eine Kontrollgruppe erhielt lediglich Öl. Die gewonnene ULF (10 µg Protein) wurden in einer 4-12 % SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat gefärbt. Der Pfeil ◄ deutet die Position von in der ULF hochregulierten Proteinen im Gel an.

 

Die mit Silbernitrat gefärbte SDS-PAGE (Abb.4.37.) zeigt, dass in der Proliferationsphase mindestens fünf Proteine deutlich induziert, bzw. in ihrer Expression hochreguliert sind. Auf diese Proteine wird durch die links positionierten P feile im Gel hingedeutet. Es handelt sich um Proteine oder Aggregate die in der SDS – PAGE bei etwa 250 kDa, ungefähr 200 kDa, zirka 120 kDa, sowie gut 70 kDa und knapp unter 30 kDa migrieren. Im Gegensatz zum deutlich abweichenden Proteinexpressionsmuster der ULF bei 17β-Östradiol Injektionen kann zwischen denen von Kontrollen und Progesteron/17β-Östradiol behandelten Tieren kein offensichtlicher Unterschied festgestellt werden. Dieses schließt nicht grundsätzlich aus, dass es während der sekretorischen Phase zu [Seite 104↓]einer Veränderung der Proteinkomposition in der ULF kommt. Jedoch wären es nur relativ geringe Proteinmengen, die sich verändern würden.

4.8.2. Proteinmuster von ULF im Zyklus von Megalin defizienten Mäusen

Um zu testen, ob Megalin für die Aufnahme von Proteinen aus der ULF verantwortlich sein könnte, wurde durch BIAcore Analysen untersucht, ob

Bestandteile der ULF zu Megalin binden. Wenn Megalin ein Rezeptor für einen oder mehrere Bestandteile aus der ULF ist, sollte auch ein Fehlen von Megalin im Uterus Auswirkungen auf die Zusammensetzung der Proteine in dieser Flüssigkeit haben. In der Regel kann man beim Fehlen eines Endozytoserezeptors mit einer Akkumulation von Liganden rechnen, da diese nicht mehr in das Gewebe aufgenommen werden können. In der folgenden Abbildung 4.38. sind in Teil A vergleichend die ULF von hormonell synchronisierten Wildtyp und Megalin Knockout Mäusen abgebildet. Die ULF (10 µg Gesamtprotein) wurden in einer 4-10 % SDS-PAGE aufgetrennt und das Gel wurde mit Coomassie gefärbt.

Teil B der Abbildung zeigt die BIAcore Analysen der ULF von hormonell synchronisierten Wildtyp Mäusen.


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Abb. 4.38. Die ULF von hormonell synchronisierten Wildtyp und Megalin defizienten Mäusen

A Die ULF (10 µg Gesamtprotein) von Wildtyp und Megalin defizienten Mäusen wurden in einer 4-10 % SDS-PAGE aufgetrennt. Das Gel wurde mit Coomassie gefärbt. Die ULF in Spur 1, 2 und 3 entstammt Wildtyp Mäusen, die entweder nur mit Öl (Spur 1), mit Östradiol (Spur 2) oder mit Progesteron und Östradiol (Spur 3) behandelt wurden. Spur 4 und 5 repräsentieren die ULF von Megalin defizienten Mäusen, in Spur 4 nach 17β-Östradiol- und in Spur 5 nach Progesteron/17β-Östradiol Injektionen. Die Sternedeuten auf die Proteine hin, die deutlich vom Expressionsmuster der Kontrollen abweichen. B Immobilisiertes Megalin (25 fmol/mm2) auf einem BIA Sensor Chip wurde mit ULF von hormonell synchronisierten Wildtyp Mäusen inkubiert. Nach 600 Sekunden wurde begonnen, die Bestandteile wieder auszuwaschen.

Bei Betrachtung der Coomassie gefärbten Proteinmuster in den beiden Phasen des Zyklus fällt keine offensichtlicher Unterschied zwischen den Wildtyp und den Megalin defizienten Mäusen auf. Weder in der Proliferations-, noch in der sekretorischen Phase kommt es zur Akkumulation oder Reduktion eines Proteins bei den Knockout Tieren. Das Bindungsverhalten der ULF von Wildtyp Mäusen (Abb. 4.38. B) und das von Megalin Knockout Mäusen (nicht abgebildet) ist identisch. In der oberen Kurve zeigt die ULF von 17β-Östradiol behandelten Tieren (sowohl Wildtyp, als auch Megalin Knockout Maus) eine Bindung an Megalin von knapp 600 Response Units. Es konnte jedoch im Vergleich kaum eine Bindung der Progesteron/17β-Östradiol induzierten ULF oder der [Seite 106↓]Kontrolltier ULF beobachtet werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass in der Proliferationsphase es einen Bestandteil in der ULF gibt, der an Megalin in der BIAcore Analyse bindet. Dieses Protein ist bei Wildtyp und Megalin defizienten Tieren gleichermaßen vorhanden. Es wurde weder eine nennenswerte Ansammlung, noch ein Fehlen eines Bestandteils der ULF beobachtet.

4.8.3. Aufreinigung und Identifizierung des Megalin bindenden Proteins

Zur Identifizierung des an Megalin bindenden Bestandteils der ULF in der Proliferationsphase wurde von 17β-Östradiol behandelten Tieren die ULF gesammelt. Diese wurde durch Gel-Filtration über eine Superose Säule aufgereinigt und die erhaltenen Fraktionen wurden auf ihr Bindungsverhalten zu Megalin durch BIAcore Analyse überprüft. Zusätzlich wurden je 15 µl der Fraktionen in einer 4-16 % SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat gefärbt.

Abb. 4.39. ULF - Fraktionen nach der Superose Säule

A Nach Auftrennung der ULF von 17β-Östradiol behandelten Tieren über eine Superose 12 HR 10/30 Säule wurden 15 µl der Fraktionen 15, 18, 24, 27, 30, 43/44 (vereinigt) und 48-50 (vereinigt) in einer 4-16 % SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat gefärbt. B Immobilisiertes Megalin auf einem BIA Sensor Chip wurde mit den Fraktionen aus dem Säulenlauf inkubiert. Nach 600 Sekunden wurde begonnen, mit Puffer zu waschen. Aus den kinetischen Parametern wurde ein Kd-Wert von 98,9 nM für Fraktion 18 errechnet.


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Wie in Abb. 4.39. zu sehen ist, zeigen die verschiedenen Fraktionen sowohl verschiedene Proteinmuster (A), als auch stark von einander abweichende Bindungsverhalten zu Megalin (B). Da Bestandteile in Faktion 18 Bestandteile besonders stark zu Megalin binden, wurde diese für eine weitere Aufreinigung ausgewählt. Abbildung 4.39. Azeigt, dass die Fraktion 18 noch aus einem Gemisch von zahlreichen Proteinen bestand. Fraktion 18 wurde deshalb durch einen Lauf über eine Mono-Q Säule weiter aufgereinigt. Die gesammelten Fraktionen dieser Chromatographie wurden wieder auf ihr Bindungsverhalten zu Megalin durch eine BIAcore Analyse überprüft (Daten hier nicht gezeigt). Gleichzeitig wurden wiederum je 15 µl der Fraktionen in einer 4-16 % SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat gefärbt, um sie auf ihre Reinheit zu überprüfen (Abb.4.40.).

Abb. 4.40. Bindungsverhalten der Fraktionen nach Mono-Q Säule

Nach Auftrennung der ULF von 17β-Östradiol behandelten Tieren über eine Mono-Q Säule, wurden 15 µl der Fraktionen 13, 15, 17, 19, 21, 23, 28. 36 und 41 in einer 4-16 % SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat gefärbt. Die Fraktionen wurden ferner auf ihre Bindung zu Megalin in einer BIAcore Analyse überprüft (Daten nicht gezeigt). Das Bindungsverhalten ist unter der Abbildung der SDS-PAGE durch – für geringe Bindung bis ++ für starke Bindung zu Megalin angeführt.


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In Fraktion 36 der ULF Aufreinigung über eine Mono-Q Säule fand sich ein 70-80 kDa großes Protein, dass stark zu Megalin bindet. In Fraktion 15 befanden sich ebenfalls Bestandteile, die eine Bindung zu Megalin zeigten, jedoch setzte sich Fraktion 15 aus einem Proteingemisch zusammen, so dass für eine Identifizierung des Megalin bindenden Bestandteils eine weitere Aufreinigung nötig gewesen wäre. Somit war das Protein in Fraktion 36 der erste Kandidat, der durch eine MALDI-MS sequenziert wurde. Die Sequenzierung ergab, dass das an Megalin bindende Protein aus der ULF von Mäusen in der Proliferationsphase das Eisen-bindende Glykoprotein Laktoferrin ist. Dieses Ergebnis stimmt mit dem in der SDS-PAGE beobachteten Molekulargewicht des sequenzierten Proteins überein, da für Laktoferrin ein Gewicht von knapp 80 kDa angegeben wird (Aisen et al., 1980).

4.9. Laktoferrin

Laktoferrin gehört zur Transferrin Familie und wird von vielen Epithelien, meist in Drüsen, exprimiert und sekretiert (Yu et al., 1993, Pentecost et al., 1987, Masson et al., 1966b). Das Laktoferrin das Hauptprotein in ULF ist, welches durch 17β-Östradiol induziert wird, ist bekannt (Pentecost et al., 1987, Jefferson et al., 2000). Neben dem Eisentransport (Lyer et al., 1993) werden Laktoferrin unter anderem bakteriostatische, zellwachstumsfördernde, zelldifferentierende

oder immunregulatorische Eigenschaften zugesprochen (Bullen et al., 1978, Nichols et al., 1987, Zimecki et al., 1995, Crouch et al., 1992).

4.9.1. Expression im Zyklus

Da Laktoferrin ein Ligand für Megalin in der murinen ULF ist, sollte als nächstes untersucht werden, ob ein Fehlen des Rezeptors im Uterus zur einer Akkumulation oder Herunterregulierung von Laktoferrin in der ULF führt. In dem mit Coomassie gefärbten Gel konnte zwischen den ULF von Wildtyp und Megalin Knockout Mäusen kein Unterschied ausgemacht werden, doch ist die Methode für diese Zwecke zu grob. Daher wurde erneut Wildtyp und Megalin Knockout ULF von hormonell synchronisierten Tieren in einer SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Membran wurde mit einem Antikörper gegen Laktoferrin inkubiert.

Abb. 4.41. Western-Blot Analyse der ULF von Megalin Knockout Mäusen und Wildtypen ULF von hormonell synchronisierten Tieren (10µg Protein) von Megalin Knockout Mäusen (-/-) und von Kontrolltieren (+/+) wurden in einer 10 % SDS-PAGE aufgetrennt. Durch Western-Blot Analyse wurde Laktoferrin in den Proben dokumentiert.

 

Die Western-Blot Analyse der Wildtyp-ULF aus der Proliferationsphase (Abb.4.41.) zeigt erwartungsgemäß mehr Laktoferrin als die ULF, die während der sekretorischen Phase gewonnen wurde. Vergleicht man jedoch die Menge an Laktoferrin die sich in der ULF von Wildtyp Mäusen befindet mit der von Megalin defizienten Tieren, so ist kein Unterschied auszumachen. Es kommt in der Tat nicht zu einer Anreicherung von Laktoferrin aufgrund des fehlenden Rezeptors im Uterus. Es kann lediglich festgestellt werden, dass Laktoferrin zu

Megalin bindet, es aber keine quantitativen Auswirkungen durch ein Fehlen des Rezeptors in hormonell synchronisierten Tieren gibt.

Welche Funktion Megalin im Stoffwechsel von Laktoferrin oder im Uterus ausüben könnte ist aber weiterhin unklar.

4.9.2. Funktion von Laktoferrin im Uterus

Laktoferrin wurde beschrieben als trans-aktivierendes Protein, das nach seiner Aufnahme in den Nukleus mittels Stress aktivierter Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK) und AP-1 DNA - Bindungsstellen im Gen von Matrix-Metalloproteinase 1 (MMP1) die Transkription des Gens einleitet (Oh et al., 2001). Das murine Homolog zum humanem MMP1 nennt sich MCOL A (murine Collagenase-like A), die cDNAs der beiden Proteine sind zu 74 % identisch. MCOL A fungiert als interstitielle Kollagenase und spielt beim Ab- und Umbau [Seite 110↓]von Geweben eine wichtige Rolle (Balbin, et al., 2001). Die Hauptexpression von MCOL A findet während der Embryogenese statt. MCOL A wird sowohl vom Embryo selbst, als auch von der Plazenta gebildet.

Um zu untersuchen, ob die Aktivierung des Gens für MMP1 durch Laktoferrin auch in der Maus funktioniert, wurde die MCOL A - mRNA Expression der Gebärmutter in der Proliferations- und in der sekretorischen Phase untersucht. Wäre die Theorie korrekt, dass MCOL A durch ein Signal von Laktoferrin hochreguliert wird, sollten während der Proliferationsphase größere Mengen MCOL A im Uterus zu finden sein. Wäre ferner die Theorie korrekt, dass Laktoferrin durch Megalin in die Zellen des Uterusepithels gelangt, sollten Uteri, denen der Rezeptor fehlt, weniger MCOL A - mRNA bilden. Für diesen Zweck wurden Wildtypmäuse hormonell synchronisiert und nach vier Tagen Hormoninjektionen die Uteri entnommen. Die mRNA wurde aus den Geweben gewonnen. Von der mRNA wurde cDNA hergestellt und mit der Methode der TaqMan®-PCR wurde die MCOL A - mRNA quantifiziert. Mit in den Versuch wurde eine mit Östradiol behandelte Megalin Knockout Maus aufgenommen. Während der sekretorischen Phase sollten aufgrund der hohen Konzentrationen an Laktoferrin in der ULF am leichtesten Auswirkungen auf die MCOL A mRNA Menge auszumachen sein.


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Abb. 4.42. TaqMan®-PCR zur Quantifizierung von MCOL A im Uterus, dem murinen Homolog zu MMP1

Als Ergebnisse der TaqMan®-PCR werden Unterschiede des normalisierten Signals zum kleinsten, gemessenen Wert angegeben. Für die noch juvenilen Kontrolltiere wurde ein durchschnittliches Δ RN von 14,7 gemessen, allerdings mit einer hohen Standartabweichung, für die17β-Östradiol behandelten Tiere ein Δ RN von 1,1, wobei für das Megalin defiziente Tier 1,3 gemessen wurde und für die Progesteron/Östradiol behandelten Tiere ein Δ RN von 11,0.

Sowohl juvenile Tiere, als auch Mäuse, die sich in der sekretorischen Phase des Zyklus befinden, haben im Vergleich zu Tieren in der Proliferationsphase höhere Mengen an MCOL A - mRNA im Uterusgewebe (Abb.4.42.). Diese Östradiol behandelten Tiere bilden unabhängig einer Megalin Expression im Uterusepithel kaum mRNA für MCOL A. Es bleibt zusammenzufassen, dass das murine Homolog für humanes MMP1 MCOL A nicht durch hohe Dosen Laktoferrin in der Expression hochreguliert wird. Im Gegensatz zu humanem MMP1 verhält es sich vielmehr andersherum. Bei hohen Mengen Laktoferrin im Uterus wird die mRNA für MCOL A in der Maus offenbar herunterreguliert. Ob die Transkription durch Laktoferrin inhibiert wird, kann nicht gesagt werden.

Es bleibt Spekulation, ob Laktoferrin bei der Maus über Megalin in die Epithelzellen aufgenommen wird. In die Signalkaskade, die MCOL A reguliert, ist Megalin aber wahrscheinlich nicht eingebunden.


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07.03.2004