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5.  DISKUSSION

Viele wichtige Funktionen im Körper sind von lipophilen Hormonen abhängig. Beispielsweise die optische Wahrnehmung, die sexuelle Reifung und Reproduktion oder der Aufbau von Knochen stehen in Abhängigkeit von Steroiden und Retinoiden. Bisher wurde die Aufnahme dieser lipophilen Moleküle in ihre Zielgewebe durch die „freie Hormonhypothese“ (Abb.5.1. A) erklärt. Die Hypothese geht davon aus, dass lipophile Hormone durch passive, freie Diffusion in ihre Zielzellen gelangen. Die im Serum gebundenen Transportproteine regulieren lediglich die Menge und Verfügbarkeit an freien Hormonen.

Abb. 5.1. Freie Hormonhypothese und Endozytose von Steroid / Carrier Komplexen

A Die freie Hormonhypothese geht davon aus, dass Hormone beim Erreichen ihres Zielgewebes sich vom Transportprotein trennen. Die lipophilen Steroide diffundieren durch die Lipiddoppelschicht der Plasmamembran und stehen anschließend dem Zellmetabolismus zur Verfügung.

B Das neue Modell postuliert, dass ein Endozytoserezeptor wie Megalin das Transportmolekül im Komplex aus Transportmolekül und Ligand erkennt. Der Komplex samt Rezeptor wird internalisiert. Dann dissoziiert der Rezeptor vom Komplex, er wird zur Zelloberfläche zurücktransportiert. Nach der Degradation des Transportmoleküls ist das Hormon für den Stoffwechsel verfügbar.


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Neuere Untersuchungen zeigten, dass lipophile Hormone auch durch den Endozytoserezeptor Megalin aufgenommen werden können. Arbeiten mit Vitamin D, Vitamin B12 und Vitamin A zeigen, dass diese Vitamine in die Zellen des proximalen Tubulus der Niere keinesfalls durch freie Diffusion gelangen, sondern dass es sich vielmehr um einen spezifische Aufnahmemechanismen handelt (Moestrup et al., 1996, Nykjaer et al., 1999, Christensen et al., 1999). Nach diesem vorgeschlagenen Modell (Abb.5.1.B) geschied die Aufnahme lipophiler Hormone durch Endozytose, analog zur Aufnahme von Lipoproteinen. Zielgewebe exprimieren Endozytoserezeptoren wie z.B. Megalin. Wie bei der Aufnahme von Lipoproteinen ist es der Proteinanteil im Komplex aus Hormon und Transportprotein, der an den Rezeptor bindet, dieses führt zur Internalisierung und der Proteinanteil wird in der Zelle degradiert. Die lipophilen Hormone können metabolisiert werden.

Mit der vorliegenden Arbeit wurde versucht, dieses neue Modell der Hormonaufnahme weitergehend zu untersuchen und es sind tatsächlich Schritte gelungen, die als weitere Verifizierung des Modell gelten. Im experimentellen Teil wurden zwei Strategien verfolgt. Es werden zunächst die Ergebnisse diskutiert, die im Ergebnisteil den Abschluss bildeten, der Analyse des Megalin exprimierenden Uterus. Anschließend werden mit Apo D und CCSP zwei weitere Carrierproteine für lipophile Hormone vorgestellt, die durch Megalin vermittelte Endozytose von Zellen aufgenommen werden.

5.1. Megalin im Uterus

Die Bedeutung der durch Megalin vermittelten Aufnahme lipophiler Hormone spiegelt sich vielfälltig im Phänotyp der Megalin Knockout Maus wieder. So entwickeln Megalin Knockout Mäuse aufgrund ihres ständigen Verlusts von Vitamin D über den Urin eine erhebliche Knochenerweichung (Osteomalazie) (Nykjaer et al., 1999). Wildtyp Mäuse gewinnen Vitamin D im Komplex mit seinem Carrierprotein DPB im proximalen Tubulus der Niere aus dem Primärharn zurück.

Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die sexuelle Reifung bei Megalin Knockout Weibchen gestört ist. Bei 60 % der Tiere kommt es zu keiner Öffnung der Vagina,


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einem Östradiol abhängigem Vorgang. Bei Wildtyp Mäusen ist eine Megalin Expression ab der ersten Woche nachweisbar (Abb.4.29. A, B), die Vagina öffnet sich bei ihnen mit dem Erreichen der Geschlechtsreife in der dritten bis vierten Woche nach der Geburt. Arbeiten von Annette Hammes und Robert Spoelgen aus dem Labor von Thomas Willnow haben gezeigt, dass nicht nur bei weiblichen Megalin Knockout Mäusen die Geschlechtsentwicklung gestört ist. Bei den Männchen senken sich die Hoden nicht aus der Leibeshöhle in das Scrotum herab (persönliche Kommunikation). Dieser Vorgang ist abhängig von Testosteron. Als weiteres Indiz für die Bedeutung von Megalin für den Metabolismus von lipophilen Hormonen/Steroiden ist die regulierte Expression von Megalin in dem steroid-abhängigen Uterus. Während der frühen Entwicklung des Uterus ist Megalin ab der ersten Woche stark exprimiert. Diese Expression nimmt mit zunehmenden Alter ab, bleibt jedoch über die Geschlechtsreife hinaus erhalten. Bei geschlechtsreifen Weibchen ist sowohl Menge, als auch Verteilung von Megalin im Uterus vom Zyklus und damit vom Hormonstatus der Tiere abhängig. Eine Maus durchläuft mit 8 ± 3 Tage im Vergleich zum Menschen (28 ± 3 Tage) den Zyklus sehr viel schneller. Doch auch wenn der Zeitrahmen gerafft ist, sind es die gleichen Hormone, die steuernd wirken. In Abb. 5.2. ist exemplarisch der Ablauf mit den wichtigsten Hormonen zusammengefasst. Es kommt zur periodischen Reifung von Follikeln im Ovar und zu einer Veränderungen der Uterusschleimhaut (Endometrium). Bei hohen FSH (Follikel stimulierendes Hormon)-Konzentrationen im Plasma reifen Primärfollikel im Ovar. In der Mitte des Zyklus beginnt eine Ausschüttung von LH (luteinisierendes Hormon) durch die Hypophyse. Die reifenden Follikel wiederum bilden Östradiol. Bei einem bestimmten Konzentrationsverhältnis zwischen FSH und LH kommt es zur Ovulation, der Follikel wird zum Corpus luteum. Durch Östradiol wird das Endometrium zum Wachstum angeregt (Proliferationsphase). Die Hypophyse sekretiert verstärkt LH. LH regt wiederum die Bildung von Gestagenen an, unter ihnen Progesteron. Durch Progesteron geht der Uterus in die Sekretionsphase über und ist bereit für die Einnistung eines befruchteten Eies (Nidation). Kommt es zu keiner Nidation, bildet sich der Gelbkörper zurück und die Produktion von


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Progesteron wird gedrosselt. Daraufhin kann die Uterusschleimhaut nicht aufrechterhalten werden und wird abgestoßen.

Abb. 5.2. Menstruationszyklus der Frau

A Die Plasmakonzentrationen von den Gonadotrophinen FSH und LH sind dargestellt. Beide Hormone werden von der Hypophyse ausgeschüttet.

B Die Konzentrationen an weiblichen Sexualhormonen, wobei sich die Angaben für Östradiol auf ng/100ml und für Progesteron um µg/100ml beziehen.

C Im Ovar kommt es aufgrund der Ausschüttung von FSH durch die Hypophyse zur Reifung eines Primärfollikels. Durch die zusätzliche Ausschüttung von LH wird die Reifung des Follikels stimuliert, der selbst wiederum beginnt, Östradiol zu produzieren und exkretieren. In der Mitte des Zyklus kommt es zur Ovulation und der Follikel wandelt sie anschließend zum Gelbkörper (Corpus luteum) um.

D Östradiol bewirkt einerseits den Aufbau des Endometriums und hemmt andererseits die Ausschüttung von weiterem FSH. Die Produktion von LH wird angeregt. LH fördern die Bildung von Gestagenen, unter anderem Progesteron, das die Uterusschleimhaut zur Umstellung von der Proliferations- zur Sekretionsphase bewegt und sie für die Einnistung eines befruchteten Eies vorbereitet. Kommt es zu keiner Nidation, bildet sich der Gelbkörper zurück. Die Konzentration an Progesteron nimmt ab und die Uterusschleimhaut wird abgestoßen. Abbildung kombiniert nach verschiedenen Autoren.


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Trotz der hohen Komplexität des Menstruationszyklus lassen sich die Proliferations- und Sekretionsphase im Tierversuch bei Mäusen durch wiederholte Hormoninjektionen simulieren.

Im juvenielen Uterus weisen sowohl die Drüsen, als auch das luminale Epithel eine starke Expression von Megalin auf. Im Vergleich dazu ist die Expression von Megalin während der durch 17β-Östradiol induzierten Proliferationsphase im Wesentlichen auf Vesikel im Stroma beschränkt. In der sekretorischen Phase aber bewirkt die gleichzeitige Präsenz von Progesteron- und Östradiol einen Wiederanstieg der Megalin Expression. Wie bei juvenile Mäusen, jedoch deutlich schwächer, wird Megalin während der Sekretionsphase in Drüsen und vom luminlaen Epithel exprimiert. Diese histologischen Befunde decken sich mit der Quantifizierung von Megalin mRNA durch TaqMan®-PCR. Die Menge an Megalin Transkripten im Uterus war in juvenilen Mäusen am höchsten, gefolgt von mit Progesteron und Östradiol stimulierten Tieren. Bei Mäusen, die sich in der Proliferationsphase befanden, konnten nur geringe Mengen an Megalin mRNA im Uterus detektiert werden.

Die Zusammensetzung der ULF spiegelt die vom Zyklus abhängige Expression von Proteinen wieder. Deutliche Unterschiede im Proteinmuster der ULF während der Sekretions- und der Proliferationsphase sind in den Abb. 4.37 und 4.38 A zu erkennen. Eines der in der Proliferationsphase hochregulierten Proteine wurde als potentieller Ligand für Megalin im Uterus identifiziert.

Es handelt sich um das Glykoprotein Laktoferrin. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Arbeiten überein, welche von einer durch Östradiol induzierbaren Expression von Laktoferrin (Pentecost et al., 1987, Jefferson et al., 2000), sowie von einer Bindung des Proteins an Megalin (Willnow et al., 1992) berichten. Laktoferrin besitzt die Eigenschaft, Eisen zu binden und greift in eine Reihe vorwiegend immunologischer Prozesse ein (Aisen et al., 1980).

Es ist demonstriert worden, dass Laktoferrin von Zellen aus dem Serum aufgenommen und in den Nukleus transportiert werden kann (Garre et al., 1992).

Im Zellkern bindet Laktoferrin zur DNA und fungiert als Transkriptionsfaktor (Penco et al, 2001).


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Die postulierte Arbeitshypothese war, dass eine zelluläre Aufnahme von Laktoferrin aus dem Serum oder anderen Körperflüssigkeiten wie der ULF durch Megalin erfolgt. Interessanterweise ist eines der Zielgene, welches durch Laktoferrin hochreguliert wird, das Gen für die Collagenase MMP1 (Oh et al., 2001). Als ein die extrazelluläre Matrix degradierendes Enzym ist MMP1 an einer ganzen Reihe physiologischer Prozesse beteiligt, die einen Umbau von Bindegewebe voraussetzen (Birkedal-Hansen, 1995). Dazu gehören neben Wundheilung, Implantation und Embryonalentwicklung (Qin et al., 1997), auch Auf- und Abbau des Endometriums während des Menstruationszyklus (Rawdanowicz et al., 1994).

Die vorliegenden Arbeit zeigt, dass die Megalin Expression während des Zyklus hoch- und herabreguliert wird (Abb. 4.31- 4.34). Da Laktoferrin Bestandteil der ULF ist, könnte eine geregelte MMP1 Expression im Uterus von Megalin abhängig sein. Als wahrscheinlichster Kandidat für ein murines MMP1 Homolog gilt bisher MCOL A (Balbin et al., 2001). Es handelt sich dabei um eine ebenfalls im Uterus exprimierte Collagenase, deren cDNA zu 74% mit der cDNA der humanen MMP1 übereinstimmt. In weiblichen Mäusen gleicht die Auf- Abregulation von MCOL A dem Expressionsmuster von Megalin (Abb. 4.34 und Abb. 4.42). Die Anzahl an Transkripten ist bei juvenilen Tieren am größten. Bei geschlechtsreifen Weibchen wird sowohl Megalin, als auch MCOL A in nennenswerten Mengen nur während der sekretorischen Phase transkribiert. Während der Proliferationsphase, also zum Zeitpunkt der größten Expression von Laktoferrin in der ULF, wird kaum MCOL A mRNA im Uterus gefunden. Auch konnte während dieser Phase des Zyklus kein Unterschied in der Transkription der Collagenase zwischen Megalin Knockout Mäusen und Kontrolltieren bestimmt werden.

Damit stellt sich die Frage, warum hohe Konzentrationen von Laktoferrin nicht zu einer vermehrten Transkription von MCOL A führen. Bisher existieren keine Arbeiten, die von einer trans-aktivierenden Aktivität Laktoferrins auf MCOL A berichten. Es besteht folglich die Möglichkeit, dass im Gegensatz zu humanem MMP1, murines MCOL A nicht durch Laktoferrin aktiviert wird. Eine andere Erklärungsmöglichkeit liefert das Expressionsmuster Megalins während der


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Proliferationsphase. Das Vorkommen des Rezeptors ist reduziert auf die Vesikel (Abb. 4.32.), eine luminale Expression im Endometrium hingegen ist nicht mehr nachweisbar. Laktoferrin kann folglich in der Proliferationsphase nicht mehr durch Megalin aus der ULF aufgenommen werden. Unter der Voraussetzung, dass ausschließlich Megalin für die zelluläre Aufnahme Laktoferrins verantwortlich ist, könnte MCOL A nicht mehr aktiviert werden. In diesem Fall sollte sich während der Sekretionsphase in Megalin defizienten Mäusen nur eine geringe Transkrition von MCOL A im Gegensatz zu Wildtyp Tieren nachweisen lassen. Da Megalin Knockout Weibchen äußerst selten überleben, konnten diese Experimente bisher noch nicht durchgeführt werden.

Megalins Aufgabe im Uterus könnte auch die Endozytose anderer Proteine sein. So wird neben Laktoferrin auch Apolipoprotein J/Clusterin, ein weiterer Ligand von Megalin, in uterinen Sekreten vorgefunden (Kounnas et al., 1995, Brown et al., 1995). Apolipoprotein J/Clusterin ist ein 75-80 kDa großes Heterodimer, welches in vielen Organen produziert wird und dann meist sekretiert wird. In einer ganzen Reihe von Körperflüssigkeiten ist Apolipoprotein J/Clusterin vorzufinden, wie z.B. der Muttermilch und der ULF (Jones et al., 2002, Kounnas et al., 1995). In Mäusen ist die Expression von Apolipoprotein J/Clusterin wie die Megalins abhängig vom Hormonstatus der Tiere. Injektionen von nur Östradiol oder nur Progesteron führen nicht zu vermehrter Produktion von Apolipoprotein J/Clusterin mRNA. Eine Vorbehandlung mit Östradiol, gefolgt von Progesteron-Injektionen bewirken hingegen einen massiven einem Anstieg an Protein ( Brown et al., 1995). Dieser Hormonstatus ist typisch für die Situation, die wir in der späten sekretorischen Phase vorfinden. Abb.5.2. zeigt, dass nach dieser Phase meist die Menses folgt, also eine komplette Neuorganisierung des Uterusepithels. In der Tat ist Apolipoprotein J/Clusterin für Umstrukturierungsprozesse des Gewebes wichtig. Das Protein gilt als extrazellulärer „Zellschutz“, der die bei der Lyse von Zellen anfallenden Gewebsreste bindet und beseitigt (Brown et al., 1995). Megalin wird ebenfalls vermehrt in der Sekretionssphase exprimiert (Abb. 4.34.), vielleicht mit der Aufgabe, Apolipoprotein J/Clusterin zu binden und internalisieren. Interessanterweise bilden Karzinomazellen des Endometriums


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sowohl in vitro, als auch in vivo vermehrt Apolipoprotein J/Clusterin nach Östradiol-Stimulation (Wunsche et al., 1998).

Obwohl diese physiologischen Daten das Modell der Rezeptor vermittelten, zellulären Aufnahme von lipophilen Hormonen im Komplex mit spezifischen Transportmolekülen nicht direkt unterstützen, sind sie doch ein wichtiger Beleg für die Bedeutung von Megalin für die Entwicklung und Funktion steroid-abhängiger Gewebe, hier dem Uterus. Direkte Unterstützung für die Richtigkeit des Modells ist die Identifizierung zweier Transportproteine für Steroide (Apo D und CCSP), die durch Megalin vermittelter Endozytose von Zellen aufgenommen werden.

5.2. Apo D

Apo D ist multifunktionelles Transportprotein für zahlreiche Liganden, welches zur Proteinfamilie der Lipocaline gehört (Rassart et al., 2000, Åkerstrom et al., 2000). Die Lipocaline RBP, α1-M (α1-Mikroglobulin) und OBP (Odorant-bindendes Protein) sind bereits als Liganden für Megalin identifiziert worden (Christensen et al., 1999, Leheste et al., 1999). Apo D ist überwiegend mit high density lipoprotein (HDL)-Partikeln im Plasma assoziiert (McConathy and Alaupovic, 1973).

In der vorliegenden Arbeit ist gezeigt worden, dass Apo D zu Megalin bindet (Abb. 4.8.) und in Megalin exprimierende Zellen aufgenommen und degradiert wird (Abb. 4.9 und 4.10). Diese Daten verifizieren neuere Berichte, die HDL-Partikel als Liganden für Megalin beschreiben (Hammad et al., 2000, Kozyraki et al., 2001). Es ist also durchaus möglich, dass diese Interaktion zwischen HDL-Partikeln und Megalin von Apo D vermittelt wird. Apo D bindet unter anderem Bilirubin, Arachidonsäure (Peitsch et al., 1989, Morais-Cabral et al., 1995) und Progesteron (Pearlmann et al., 1973, Dilley et al., 1990).

Die Aufklärung der Aufnahmemechanismen von Steroiden ist von besonderer medizinischer Bedeutung. Steroidhormone spielen eine herausragende Rolle in der Wachstumsregulation hormonsensitiver Tumore, die immerhin für ein Drittel aller menschlichen Krebserkrankungen verantwortlich sind (Labrie et al., 1986, Davidson et al., 1989, Boring et al., 1991). Besonders in der Entstehung und


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Progression von Brust- und Prostatakrebs wird eine Rolle für Apo D diskutiert (Sanchez et al., 1992a und b, Aspinall et al., 1995). In überraschend vielen Tumoren apokriner Herkunft werden auffallend hohe Konzentrationen an Apo D gemessen.

In der Zystenflüssigkeit großer Zysten der Brust von Frauen, die unter Mastopathia cystica fibrosa leiden, kann Apo D über 50% der Gesamtproteinmenge ausmachen (Balbin et al., 1990). Es kann zu einer 1000fach höheren Konzentration von Apo D im Vergleich zum Plasma kommen. Auch wenn aus diesen Zysten selbst keine Tumore hervorgehen, besteht für die betroffenen Frauen ein zwei- bis vierfach erhöhtes Risiko, an Brustkrebs zu erkranken (Balbin et al., 1990, Sanchez et al, 1992a). Weiterhin gilt für Brustkrebserkrankungen, dass die Apo D Expression höher in differenzierten Karzinomen ist, als in undifferenzierten, aggressiven Tumoren (Sanchez et al., 1992 a und b). Die Konzentration von Apo D wird daher als Marker für die Tumorprogression angesehen (Diez-Itza et al., 1994). Eine hohe Apo D Expression in Brustkarzinomen verringert bei betroffenen Frauen die Chancen eines Rückfalls und steigert ihre Überlebenschancen. Bei Prostatakrebs hingegen ist die Apo D Expression in gutartigen Tumoren nur leicht, in malignen Karzinomen stark im Vergleich zum Normalwert erhöht.

Die Megalin vermittelte Aufnahme und Degradation von rekombinant hergestelltem Apo D konnte im Zellkulturversuch dokumentiert werden (Abb. 4.10). Mit dieser Arbeit konnte jedoch keine durch Apo D vermittelte Steroidaufnahme in Megalin exprimierende Zellen gezeigt werden.

In der Tat scheint die Kopplung von Progesteron an sein Transportprotein Apo D schwierig zu sein und es werden selbst unter Verwendung nativen Apo D aus Zystenflüssigkeit nur geringe Ausbeuten an Komplex erzielt (Dilley et al., 1990). Das Unvermögen von Megalin expimierender Zellen, Apo D im Komplex mit Progesteron aufzunehmen (Abb. 4.11.), mag also daran liegen, dass die Komplexbildung höchst mangelhaft war, auch wenn sie anfangs aufgrund hoher Ausbeuten im Vergleich zu veröffentlichter Literatur erfolgreich aussah (Dilley et al., 1990). Die plausibelste Erklärung ist, dass Progesteron außen am Lipocalin die Bindungsstellen zu Megalin besetzte, statt die Ligandenbindungsdomäne des


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Proteins zu belegen. Eine weitere Bindung des vermeintlichen „Komplexes“ zum Rezeptor und eine anschließende Aufnahme in die Zellen konnte nicht mehr stattfinden. Die drei unabhängigen Studien, mittels BIAcore Analyse (Abb. 4.8.), in der Liganden Blot Analyse (Abb. 4.9.) und die wiederholten Apo D-Aufnahme und Degradation Versuche durch BN 16 Zellen (Abb. 4.10.) geben eine klare Auskunft, dass Apo D an Megalin bindet.

Es konnte außer der Bindung von Apo D an Megalin auch eine in der Affinität vergleichbare Bindung an VLDL R festgestellt werden (Abb. 4.8.). Sowohl Megalin, als auch VLDL R werden im Brustgewebe exprimiert (Lundgren et al., 1997, Simonsen et al., 1994). Doch es ist der VLDL R, der in Brustkrebsgewebe gefunden wird, hier spezifisch in den Epithelzellen (Martensen et al., 1997, Webb et al., 1999 und 2001). Leider konnte aufgrund des Fehlens einer VLDL R exprimierenden Zelllinie dieser erfolgversprechende Weg nicht weiter durch in vitro Studien verfolgt werden.

Festzuhalten bleibt, dass Megalin Apo D, das Transportprotein für Progesteron und eine Reihe anderer Steroidhormone, in vitro bindet und aufnimmt.

5.3. CCSP

In der vorliegenden Arbeit habe ich die für die Aufnahme von CCSP im proximalen Tubulus der Niere verantwortlichen Rezeptoren identifiziert. Die Existenz solcher Rezeptoren wurde postuliert aufgrund der Aufnahme von CCSP und CCSP im Komplex mit PCBs in die Niere (Brandt et al., 1985, Stripp et al., 1996). Für diese CCSP Aufnahme sind zwei zelluläre Rezeptoren erforderlich: Cubilin, ein peripheres Membranprotein, welches direkt an CCSP bindet und Megalin, ein Endozytoserezeptor, der für die Endozytose vom Komplex aus CCSP und Cubilin notwendig ist.

Cubilin wurde ursprünglich identifiziert und kloniert als Intrinsic Faktor-Rezeptor, ein Protein, welches im Endbereich des Dünndarms für die Aufnahme von IF/Vitamin B12 verantwortlich ist (Seetharam et al., 1997, Birn et al., 1997, Sahali et al., 1988, Moestrup et al., 1998). In Übereinstimmung mit dieser entscheidenden Aufgabe in der Vitamin B12 Aufnahme im Darm entwickeln Patienten mit einem Defekt im Gen für Cubilin (Imerslund-Gräsbeck Syndrom)


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einen Vitamin B12 Mangel und einer damit einhergehenden Anämie (Aminoff et al., 1999).

Außer im Endbereich des Dünndarms wird Cubilin in einer Reihe anderer Geweben exprimiert, darunter im proximalen Tubulus der Niere und im Dottersack ( Moestrup et al., 1998, Hammad et al., 2000). Diese Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass das Protein in die Aufnahme von zusätzlichen Liganden in nicht gastro-intestinale Zellen involviert sein könnte. Im proximalen Tubulus wurde Cubilin als der Rezeptor identifiziert, der für die Resorption von filtriertem Albumin aus dem Primärharn verantwortlich ist (Birn et al., 2000). Ebenfalls ist seine Rolle in der Aufnahme von HDL-Partikeln beschrieben (Kozyraki et al., 1999, Hammad et al., 1999).

Mit seiner Funktion als Endozytoserezeptor mutet die Struktur von Cubilin ungewöhnlich an. Dem Protein fehlen sowohl eine Transmembran-, als auch eine zytoplasmatische Domäne. Es ist nur locker mit der Plasmamembran verbunden. Diese Verbindung wird durch eine amphipatische Helix hergestellt, die sich am aminoterminalen Ende des Proteins befindet (Kristiansen et al., 1999). Da Cubilin mit Megalin oft coexprimiert wird und diesen Rezeptor in vitro bindet, wurde ein Modell vorgeschlagen, in dem Cubilin an Megalin bindet, um gemeinsame Endozytose und ein Recycling an die Zelloberfläche zu durchlaufen (Moestrup et al., 1998).

Es wurden einige Liganden vorgeschlagen, welche diesen Corezeptor Mechanismus nutzen, inklusive IF (Moestrup et al., 1998), Albumin (Birn et al., 2000) und HDL (Hammad et al., 2000). Doch bisher sind keine Resultate publiziert worden, die zeigen, dass dieses „Rezeptoren-Doppel“ auch in vivo aktiv ist. In der vorliegenden Arbeit werden die ersten experimentellen Beweise beschrieben, dass Cubilin/Megalin als Rezeptoren-Doppel in vivo existent ist und im Zusammenspiel für die Aufnahme von CCSP in die proximalen Tubuli der Niere notwendig sind. Die Zusammenarbeit des Rezeptoren-Doppels sieht schematisch wahrscheinlich wie in Abb. 5.3. dargestellt aus.

Abb. 5.3. Endozytose von CCSP durch Cubilin/Megalin. Der Progesteroncarrier CCSP bindetdirekt an Cubilin. Im Komplexmit CCSP bindet Cubilin an Megalin, welches die Endozytose des Gesamtkomplexes vermittelt. Ohne Megalin kommt es zu keiner Endozytose.

 

Eine Inhibierung von Cubilin in Zellkultur (Abb. 4.18.) oder eine genetische Inaktivierung im Patienten (Abb. 4.19.) verhindert die zelluläre Aufnahme von CCSP. Die gleichen Effekte werden beobachtet, wenn Megalin durch spezifische Antikörper inaktiviert ist (Abb. 4.18) oder das Gen, wie bei der Megalin Knockout Maus, fehlt (Abb. 4.20. und 4.21.).

Die Assoziation von Zelloberflächenproteinen mit Endozytoserezeptoren für eine gemeinsame Endozytose und ein Recycling an die Zelloberfläche sind bereits beschrieben worden. Häufig wurde dieses Phänomen bei Proteinen beschrieben, die durch Glykosyl-Phosphatidyl Inositol (GPI)-Anker mit der Plasmamembran verbunden sind. Ein Beispiel ist der Urokinase Rezeptor, der mit LRP in Verbindung tritt, um Liganden durch Endozytose in die Zellen zu bringen (Nykjaer et al., 1997). Beide Rezeptoren binden zueinander über einen gemeinsamen Liganden, dem Urokinase/Plasminogen Aktivator Inhibitor-1 Komplex. Die Existenz eines Endozytosecorezeptors für das GPI-verankerte Prion Protein wurde vorgeschlagen (Harris, 1999). Das Cubilin/Megalin Rezeptoren-Doppel ist jedoch bisher einzigartig, da ein peripheres Membranprotein ohne GPI-Anker direkt an einen Endozytoserezeptor bindet.

In Abwesenheit von Megalin, wie z.B. in der Niere einer Megalin Knockout Maus, ist die Gesamtmenge an exprimiertem Cubilin auf der Zelloberfläche deutlich reduziert (Abb. 4.22., 4.23., 4.24.). Die wenigen Rezeptormoleküle, die dem Lumen des Tubulus zugewandt sind, können CCSP nicht durch Endozytose in die Zellen aufnehmen (Abb. 4.21.). Sie sind ferner nicht in Endosomen oder in


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Vesikeln des Membranrecyclings auffindbar (Abb. 4.23). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Megalin in zwei unterschiedlichen Bereichen, nämlich dem Transports und der Funktion von Cubilin involviert ist. Zum einen ist Megalin wichtig, aber nicht essentiell für Cubilins Leitung durch den sekretorischen Weg zur Zelloberfläche. Zweitens ist Megalin absolut notwendig für eine Aufnahme Cubilins und eine Weiterleitung zu den Endosomen. Mit den Ergebnissen von Moestrup et al. (1998) und Hammad et al., (2000) kann ein Mechanismus postuliert werden, indem Cubilin überall mit Megalin assoziiert bleibt, sowohl während der Endozytose, als auch auf der Zelloberfläche. Liganden wie IF, Albumin oder CCSP assoziieren mit dem Komplex, indem sie zu Cubilin binden an Stellen, wo der Rezeptor nicht mit Megalin verbunden ist.

Aufgrund der geringen Affinität Cubilins zu CCSP war es technisch nicht möglich, einen Komplex aus Cubilin, Megalin und CCSP zu bilden. Doch die Formung eines solchen Komplexes mit IF als Liganden ist bereits gelungen (Moestrup et al., 1998).

Da die Expression von Megalin und Cubilin nicht auf die proximalen Tubuli der Niere beschränkt ist, drängt sich die Frage auf, ob das Rezeptoren-Doppel auch für die Akkumulation von CCSP in Geweben außerhalb der Niere verantwortlich ist. Und in der Tat decken sich jüngste Studien mit den hier vorgestellten Ergebnissen. So werden in der Lunge die beiden Rezeptoren von Type II Pneumozyten exprimiert. Mit höchster Wahrscheinlichkeit ist hier das Rezeptoren-Doppel aus Megalin und Cubilin verantwortlich für die zelluläre Aufnahme von HDL-Partikeln und somit von Vitamin E in das Lungengewebe (Kollek et al., 2002). Mit dieser Arbeit kann jedoch kein Beweis vorgelegt werden, dass CCSP durch diesen Mechanismus in das respiratorische Epithel aufgenommen wird (Abb. 4.25 und 4.26), wie der unveränderte Metabolismus von CCSP in der Lunge Megalin defizienter Mäuse zeigt. Es bleibt anzumerken, dass in der vorliegenden Arbeit die Menge an CCSP in der bronchio-alveolaren Lavage mittels Western Blot Analyse untersucht wurde, eine Methode, die nur eine starke Veränderung in der Quantität eines Proteins zulässt.

Weitere Gewebe mit bewiesener Coexpression von Megalin und Cubilin sind der Dottersack und der Endbereich des Dünndarms (Hammad et al., 2000). Die


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zelluläre Aufnahme von CCSP ist für die proximalen Tubuli der Niere und das Endometrium beschrieben worden (Bernard et al., 1994, Bochskanl et al., 1984, 1988). Interessant wäre daher eine eingehende Untersuchung, ob Cubilin in Zusammenarbeit mit Megalin CCSP in die Epithelzellen des Endometriums aufnehmen kann.

Die Identifikation eines Aufnahmemechanismus für die CCSP Resorption aus dem glomerulären Filtrat wirft einige interessante Hypothesen über die physiologische Rolle in vivo auf. Die Hauptfunktion von Megalin im proximalen Tubulus der Niere ist die Rückgewinnung von Plasmacarriern, die durch den Glomerulus filtriert wurden (zusammengefasst von Christensen und Willnow, 1999b). Diese Transportproteine sind DBP, RBP, Transcobalamin und Transthyretin. Die Resorption dieser Carrierproteine ist notwendig, um den Verlust von essentiellen Metaboliten wie Vitamin A, D3, B12 und Thyroxin durch die Ausscheidung mit dem Urin zu verhindern (Nykjaer et al., 1999, Christensen et al., 1999a, Sousa et al., 2000).

Die Rückgewinnung von CCSP auf demselben Wege lässt vermuten, dass dieses Protein ebenfalls als Carrier für wichtige Metaboliten fungiert und ein Verlust dieser vermieden werden sollte. Einhergehend mit dieser Hypothese wurde gezeigt, dass Progesteron in der Ligandenbindungsdomäne des CCSP Homodimers bindet (Dunkel et al., 1995). Ob Progesteron der Ligand für CCSP in vivo ist, liegt noch im Unklaren. Die Affinität des Steroidhormons zu den verschiedenen CCSP Spezies schwankt stark, so ist sie für das CCSP bei Mensch und Affe sehr gering. Daher wird angenommen, dass ein bisher unidentifizierter Ligand für CCSP existieren muss.

Cubilin defiziente Patienten und Megalin Knockout Mäuse sollten einen Verlust dieser Metaboliten über den Urin zeigen. Eine Funktion von CCSP im Transport und zellulärer Aufnahme von lipophilen Substanzen ist unterstützt durch die Rolle, die CCSP bei der Akkumulation von PCB zukommt. Es ist denkbar, dass diese lipophilen Xenobiotica die natürlichen endogenen Liganden aus der Bindungsdomäne von CCSP verdrängen und so in die Zielgewebe/-zellen gelangen, die normalerweise CCSP im Komplex mit seinem Liganden aufnehmen würden.


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Die vorliegenden Untersuchungen über CCSP haben einen Aufnahmemechanismus für CCSP in die Niere nachgewiesen.

Neue Studien, die nach der Veröffentlichung dieser Arbeit über den Aufnahmemechanismus von CCSP erschienen sind, unterstützen die hier vorgestellten Ergebnisse. Inzwischen ist für weitere Liganden nachgewiesen worden, dass sie durch das Rezeptoren-Doppel aus Cubilin und Megalin in Zellen aufgenommen werden. Für die Aufnahme des Komplexes aus Transferrin und Eisen im proximalen Tubulus der Niere stellte sich ebenfalls heraus, dass die Rückgewinnung aus dem Primärharn durch Cubilin/Megalin stattfindet, wobei Transferrin ausschließlich an Cubilin bindet (Kozyraki et al., 2001). Der Komplex aus Vitamin D und seinem Carrierprotein DBP wird ebenfalls durch den Doppel-Rezeptorenmechanismus aufgenommen (Nykjaer et al., 2001). Dabei ist zu bemerken, dass DBP zu beiden Rezeptoren bindet. Es verlieren Hunde und Menschen mit einer Cubilin Defizienz geringere Mengen an Vitamin D im Urin als Megalin defiziente Mäuse. Wird Cubilin im proximalen Tubulus der Niere nicht exprimiert, kann der Vitamin D/DBP Komplex weiterhin an Megalin binden und so in die Zellen aufgenommen werden. Fehlt hingegen Megalin, findet keine Endozytose statt, auch wenn der Komplex an Cubilin bindet. Folglich wird Vitamin D mit dem Urin ausgeschieden. Für die zelluläre Aufnahme von Transcobalamin im Komplex mit Vitamin B12 im proximalen Tubulus der Niere ist nach heutigen Kenntnissen Megalin allein verantwortlich, gleiches gilt für Vitamin A mit seinem Carrierprotein RBP. Cubilin scheint bei der Aufnahme dieser Vitamine in die Zellen des proximalen Tubulus der Niere keine Bedeutung zu haben.


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Ausstehende Experimente:
Bei der Untersuchung zur Rolle Megalins in der Entwicklung des Uterus sind in noch viele fragen offen. Erste Hinweise weisen auf eine wesentlichen Anteil des Rezeptors bei der sexuellen Reifung der weiblichen Maus hin, doch stehen detaillierte Erklärungen über die Wirkungsweise aus.

Die Analysen zur Interaktion zwischen Megalin und Apo D könnten durch die Studien zur Progesteronaufnahme vervollständigt werden, doch nach jetzigem Stand der Erkenntnis wäre eine eingehendere Untersuchung einer Apo D / Progesteronaufnahme durch den VLDL R sicherlich von weitreichenderer Relevanz.

Im Falle einer Verfügbarkeit von markierten PCBs im Komplex mit CCSP wäre ein abschließender Beweis der Einlagerung dieser Toxine in die Niere, bzw. dem Ausbleiben bei Megalin Knockout Mäusen oder Cubilin defizienten Hunden zu erbringen.

Weitergehende Studien, die zur Prävention einer PCB-Akkumulation in Lunge und Niere bei einer Exposition dienen, sind ohne Zweifel von medizinischer Bedeutung. Durch sogenanntes „Drugdesign“, also der maßgeschneiderten Synthese z.B. eines PCB-Antagonisten, könnte eine Aufnahme in den Körper verhindert werden. Der Rezeptor wäre durch das im Idealfall ungiftige Medikament blockiert, die krebserregende und fruchtschädigende Wirkung der PCBs wäre vermieden.


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07.03.2004