Untersuchungen zur Rolle des Endozytoserezeptors Megalin in
der zellulären Aufnahme von Steroidcarrierproteinen

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
( Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
 
 Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
 
  Diplom-Biologin Regina Burmeister


Geboren am 11.November 1971 in Pinneberg

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr.Michael Linscheid

Gutachter:
1. Prof. Dr. Thomas Willnow
2. Prof. Dr. Wolfgang Lockau
3. Dr. habil. Michael Bader

Tag der mündlichen Prüfung: 27. Februar 2003

Inhaltsverzeichnis

• 1.  EINLEITUNG
  • 1.1. Die Struktur der LDL Rezeptor Gen Familie
  • 1.2. Die Vertreter der LDL Rezeptor Gen Familie bei Säugetieren
    • 1.2.1. LDL R
    • 1.2.2. VLDL R
    • 1.2.3. Apo E R II
    • 1.2.4. MEGF 7
    • 1.2.5.  LRP
    • 1.2.6. LRP1B
    • 1.2.7. LRP 5 und LRP 6
    • 1.2.8. Megalin
  • 1.3. Lipocaline
    • 1.3.1. Apolipoprotein D (Apo D)
    • 1.3.2. 24p3 / Uterocalin
  • 1.4.  CCSP
• 2.  ZIELSETZUNG
• 3.  MATERIAL UND METHODEN
  • 3.1. Antikörper
  • 3.2. Verwendete Tiere und Organismen
    • 3.2.1. Mäusehaltung
    • 3.2.2.  Bakterien
  • 3.3. SDS-PAGE und Western Blot Analysen
    • 3.3.1. Coomassiefärbung
    • 3.3.2. Silberfärbung
    • 3.3.3. Western Blot Analysen
  • 3.4. Immunhistologie
    • 3.4.1. Gefrierschnitte
    • 3.4.2. Parafinschnitte
    • 3.4.3. Mikroskopie
  • 3.5. Urinproben
  • 3.6. Lungen - Lavage
  • 3.7. Synchronisierung des Zyklus
  • 3.8.  Uterine luminale Flüssigkeit (ULF)
    • 3.8.1. Gewinnung
    • 3.8.2. Aufreinigung des Megalin - bindenden Bestandteils in der ULF
  • 3.9.  Klonierung der Konstrukte ApoD und 24p3
    • 3.9.1. Primer
    • 3.9.2. Amplifikation durch PCR
    • 3.9.3.  Ligation in den pGEM - T® Easy I - Vektor
    • 3.9.4. Transformation in Kalzium - kompetente E.coli Bakterien
    • 3.9.5. DNA-Isolierung
    • 3.9.6. Umklonierung in den Zielvektor pCEP-Pu-SP-his-myc-fX
  • 3.10. Zellkultur
    • 3.10.1. Generelle Zellkulturbedingungen
    • 3.10.2. Herstellung eines Membranextraktes aus Dottersackzellen (BN16)
  • 3.11. Aufreinigung und Darstellung der Proteine
    • 3.11.1. RAP
    • 3.11.2. CCSP
    • 3.11.3. ApoD und 24p3
  • 3.12.  125 Jod – Markierung der Proteine
  • 3.13. in vitro Aufnahme - und Degradationsstudien
    • 3.13.1. Degradationsassay
    • 3.13.2.  Steroid - Bindung
  • 3.14.  BIAcore Analysen
  • 3.15. Quantifizierung von RNA - Expression durch TaqMan® PCR
    • 3.15.1. RNA - Präparation
    • 3.15.2. Synthese von cDNA
    • 3.15.3.  Primer und TaqMan®Probes
    • 3.15.4. TaqMan® PCR
• 4.  ERGEBNISSE
  • 4.1. Allgemeines
  • 4.2. 24p3
    • 4.2.1. Aufreinigung von 24p3
    • 4.2.2. Immunisierung
    • 4.2.3. BIAcore Analyse der 24p3 - Bindung an Megalin
  • 4.3.  Apo D
    • 4.3.1. Aufreinigung von Apo D
    • 4.3.2.  Immunisierung
    • 4.3.3. BIAcore Analyse der Apo D - Bindung an vier LDL R Familienmitglieder
    • 4.3.4.  Apo D - Aufnahme und Degradation durch BN 16 Zellen
    • 4.3.5. Apo D - Progesteron
  • 4.4.  CCSP BIAcore Analysen
    • 4.4.1. CCSP - Bindung an Cubilin und Megalin
    • 4.4.2. Bindungsaffinität von CCSP an Cubilin
    • 4.4.3. CCSP Bindung an Cubilin in Abhängigkeit von Kalzium und Magnesium
    • 4.4.4. Inhibierung der CCSP Bindung zu Cubilin durch RAP
  • 4.5.  CCSP in vitro
    • 4.5.1. BN 16 Zellen als Zellmodell
    • 4.5.2. CCSP - Aufnahme und Degradation durch BN 16 Zellen
    • 4.5.3. Inhibierung der CCSP Aufnahme durch Antikörpern
  • 4.6. CCSP in vivo
    • 4.6.1. CCSP im Urin von Patienten mit einer Cubilin Defizienz
    • 4.6.2. CCSP im Urin Megalin defizienter Mäuse
    • 4.6.3. CCSP Lokalisation in der Niere
    • 4.6.4.  Cubilin in der Niere
    • 4.6.5. CCSP in der Lunge
      • 4.6.5.1 Gesamtproteinbild bei Megalin defizienten Tieren und Kontrollen
      • 4.6.5.2 CCSP-Quantifizierung in der Lavage von Megalin Knockout und Kontrolltieren
  • 4.7. Expression von Megalin im Uterus
    • 4.7.1. Megalin Expressionsmuster während der postnatalen Entwicklung
    • 4.7.2. Megalin Expression in Abhängigkeit des Zyklus
  • 4.8. Liganden für Megalin in der uterinen, luminalen Flüssigkeit (ULF)
    • 4.8.1.  Proteinmuster von ULF im Zyklus
    • 4.8.2. Proteinmuster von ULF im Zyklus von Megalin defizienten Mäusen
    • 4.8.3. Aufreinigung und Identifizierung des Megalin bindenden Proteins
  • 4.9. Laktoferrin
    • 4.9.1. Expression im Zyklus
    • 4.9.2. Funktion von Laktoferrin im Uterus
• 5.  DISKUSSION
  • 5.1. Megalin im Uterus
  • 5.2. Apo D
  • 5.3. CCSP
• 6.  ZUSAMMENFASSUNG
• Erklärung
• DANKSAGUNG
• ABKÜRZUNGEN
• LITERATUR
• LEBENSLAUF

Bilder

• Abb. 1.1. Die LDL R Gen Familie
• Abb. 1.2. Die Rolle von Apo E R II und VLDL R bei der Wanderung von Neuronen
• Abb. 1.3. Cubilin
• Abb. 1.4. Endozytose von Lipoproteinen und Liganden / Carrier Komplexen
• Abb. 1.5. Die Struktur der Lipocalinfaltung
• Abb. 3.1. Karte für den pGEM - T® Easy I - Vektor
• Abb. 3.2. Karte für den pCEP-Pu-Vektor
• Abb. 4.1. 24p3 Aufreinigung A Konditioniertes Medium von 24p3 produzierenden 293-EBNA Zellen wurde auf eine Ni-NTA Superflow Säule gegeben. Das Waschen und Eluieren der Säule wurde photometrisch überwacht (y-Achse). Gesammelt wurden inklusive der Waschfraktionen 40 Fraktionen. Die Elution erfolgte mit 400 mM Imidazol. B Es ist die Western-Blot Analyse ausgesuchter Fraktionen abgebildet. Hierzu wurde ein Antikörper genutzt, der den Myc-Bereich des Fusionsproteins detektiert. KM = konditioniertes Medium, NB = Medium nach Bindung auf die Säule, W = Waschfraktion
• Abb. 4.2. Faktor Xa Restriktionsbedingungen Aufgereinigtes 24p3 wurde mit Faktor Xa behandelt: Spur 1 unbehandelt, in Spur 2 mit Faktor Xa behandelt. Die Proteine wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt. Der Erfolg der Proteolyse wurde durch eine Färbung mit Silbernitrat dokumentiert.
• Abb. 4.3. Analyse der drei Blutabnahmen eines Antiserums gegen 24p3
• Abb. 4.4. BIAcore Analyse der 24p3-Bindung an Megalin
• Abb. 4.5. Apo D Aufreinigung
• Abb. 4.6. Faktor Xa Restriktionsbedingungen Aufgereinigtes Apo D wurde mit Faktor Xa behandelt: Spur 1 unbehandelt, in Spur 2 im Verhältnis 1:50 für 24 Stunden bei 37°C und dann in einer SDS-Page aufgetrennt. Das Gel wurde mit Coomassie gefärbt.
• Abb. 4.7. Gewinnung eines polyklonalen Antikörpers gegen Apo D A Je 4 µg Protein (Spur 1, 2 und 3 Apo D mit His-Myc-Anhang, Spur 4 24p3 mit His-Myc-Anhang, Spur 5 Apo E R 2 mit His-Myc-Anhang) wurden in einer SDS-Page aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die in Streifen geschnittene Membran wurde mit den Antiseren der drei Blutabnahmen der Immunisierung inkubiert. B Die Proteine auf der Nitrozellulosemembran sind vor der Antikörperfärbung mit einer Ponceau-Färbung sichtbar gemacht worden. Dieses diente zur Kontrolle einer gleichmäßigen Beladung.
• Abb. 4.8. BIAcore Analyse der Apo D-Bindung an LRP, VLDL R,Apo ER II und Megalin Immobilisiertes LRP (25 fmol/mm²), VLDL R (32 fmol/mm²), Megalin (25 fmol/mm2) und Apo E R II (8 fmol/mm²) auf einem BIA Sensor Chip wurden mit gereinigtem rekombinanten Apo D in einer Konzentration von 1 µM inkubiert. Nach 60 Sekunden wurde begonnen, Apo D mit Puffer wieder ausgewaschen.
• Abb. 4.9. Liganden-Blot Analyse von BN 16 Membranen 5 µg aufgereinigte Membranen von BN 16 Zellen in Spur 1 und 10 µg in Spur 2, sowie 10 µg aufgereinigte Membranen von HeLa-Zellen in Spur 3 wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt. Durch Liganden-Blot Analyse konnte dargestellt werden, dass BN 16 Zellen sowohl rekombinantes 125J-RAP als auch rekombinantes 125J-Apo Dauf ihrer Zelloberfläche binden können. HeLa-Zellen, die kein Megalin besitzen, tun dieses nicht. Die Positionen der Markerproteine mit den Größen 250, 98 und 64 kDa sind angezeigt.
• Abb. 4.10. Degradation von rekombinantem Apo D durch BN 16 Zellen BN16 Zellen in 1 ml glutamin- und serumfreiem DMEM mit 0,1 % BSA (w/v) erhielten 100 ng rekombinantes 125J-Apo D. Es wurde zu den Zellen entweder 50 µg GST/ml, 100 µg GST-RAP/ml oder 200 µM Chloroquin gegeben. Nach einer Inkubation über die angegebenen Zeitintervalle bei 37°C wurde die Menge an radiomarkierten Abbauprodukten im Medium gemessen. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte und die Standartabweichungen von insgesamt drei Versuchen.
• Abb. 4.11. Akkumulation von rekombinantem Apo D im Komlex mitH³-Progesteron durch BN 16 Zellen
• Abb. 4.12. BIAcore Analyse der CCSP - Bindung an Cubilin und Megalin
• Abb. 4.13. Kalkulation der Bindungsaffinität von CCSP an Cubilin
• Abb. 4.14. CCSP-Bindung an Cubilin ist durch EDTA Zugabe inhibierbar
• Abb. 4.15. CCSP-Bindung an Cubilin ist durch RAP blockierbar
• Abb. 4.16. Western Blot Analyse von BN 16 Membranen 10 µg aufgereinigte Membranen von BN 16 Zellen in Spur 1 und 1 µg in Spur 2 wurden in einer SDS - PAGE aufgetrennt. Durch Western-Blot Analyse konnte dargestellt werden, dass BN 16 Zellen Cubilin und Megalin auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Die Positionen der Markerproteine mit den Größen 250 kDa und 98 kDa sind angezeigt.
• Abb. 4.17. Degradation von rekombinantem CCSP durch BN 16 Zellen
• Abb. 4.18. Inhibierung des Abbaus von rekombinantem CCSP durch Zugabe von Anti-Megalin und Anti-Cubilin IgGs
• Abb. 4.19. Exkretion von CCSP im Urin von Imerslund - Grasbeck Syndrom Patienten 5 µl Urin von zwei Patienten mit Imerslund - Grasbeck Syndrom (Imers.), einem mit einem Fanconi - Syndrom (Fanconi) und zwei gesunde Kontrollen (Kontro) wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt und durch Western-Blot Analyse konnte die Ausscheidung von CCSP und β-2 Mikroglubulin dokumentiert werden
• Abb. 4.20. Ausscheidung von CCSP im Urin von Megalin defizienten Mäusen. Je 15 µl Urin von dreiMegalin defizienten Mäusen (-/-) und zwei Kontrollen (+/+) wurden in einer SDS-PAGE aufgetrennt. Durch Western-Blot Analyse konnte die Ausscheidung von CCSP im Urin der Knockout Mäuse dokumentiert werden. Die Positionen der Markerproteine sind angezeigt
• Abb. 4.21. Immunhistochemische Analyse von CCSP in der murinen Niere
• Abb. 4.22. Immunhistochemische Analyse von Cubilin in der murinen Niere
• Abb. 4.23. Elektronenmikroskopische Untersuchung auf Cubilin in der Niere der Maus elektronenmikroskopische Aufnahmen von Schnitten durch die proximalen Tubuli der Nieren von Wildtyp Mäusen (oben, +/+) und Megalin defizienten Tieren (unten, -/-). Die Pfeile im oberen Abschnitt markieren die dichten, apikalen Tubuli. Im unteren Bild markieren die Pfeile Transportvesikel. BS = Bürstensaum, E = Endosomen; Vergrößerung 1: 70000
• Abb. 4.24. Western-Blot Analyse der murinen Nierenmembran auf Cubilin Nierenmembranenproteine (10 µg Protein) von Megalin Knockout Mäusen (Spur 1, 3 und 5) und von Kontrollen (2 und 4) wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt. Durch Western-Analyse wurde Menge an membranassoziiertem Cubilin dargestellt (obere Bande). Als Kontrolle für eine gleichmäßige Beladung wurde RAP angefärbt. Die Positionen der Markerproteine sind angezeigt.
• Abb. 4.25. Analyse der bronchio-alveolaren Lavage von Megalin Knockout Mäusen und Wildtypen Lavage-Flüssigkeit der Lunge (5 µg Protein) von Megalin Knockout Mäusen (Spur 1 und 4) und von Kontrollen (2, 3, 5, 6) wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat gefärbt. Die Positionen der Markerproteine sind angezeigt
• Abb. 4.26. Western-Blot Analyse der bronchio-alveolaren Lavage von Megalin Knockout Mäusen und Wildtypen Lavage-Flüssigkeit der Lunge (5µg Protein) von Megalin Knockout Mäusen (Spur 1) und von Kontrollen (2 und 3) wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und durch Western-Blot Analyse wurde die Anwesenheit von CCSP in allen Proben dokumentiert. Die Positionen der Markerproteine sind angezeigt.
• Abb. 4.27. Vaginalverschluss bei Megalin defizienten Mäusen. Die Geschlechtsöffnung eines Megalin Knockout Weibchens (links) und vergleichend die normale Entwicklung bei einem Kontrolltier (rechts). Die Vagina des Megalin defizienten Tieres bleibt durch eine Haut verschlossen, die sich üblicherweise mit Erreichen der Geschlechtsreife zurückbildet.
• Abb. 4.28. Immunhistochemische Analyse von Megalin im murinen Uterus von Neugeborenen Megalin kann im Uterus von Mäusen am Tag nach ihrer Geburt nicht nachgewiesen werden. Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun Färbelösung. Die Vergrößerung beträgt 1:100.
• Abb. 4.29. Immunhistochemische Analyse von Megalin im murinen Uterus im Alter von ein und zwei Wochen
• Abb. 4.30. Immunhistochemische Analyse von Megalin im adulten, murinen Uterus
• Abb. 4.31. Immunhistochemische Analyse von Megalin im murinen Uterus im Alter von drei Wochen
• Abb. 4.32. Immunhistochemische Analyse von der Megalin Expression am Tag 5,5 p.c. im Bereich der implantierten Embryonen
• Abb. 4.33. Immunhistochemische Analyse von Megalin im murinen Uterus während der Sekretionsphase
• Abb. 4.34. TaqMan®-PCR zur Quantifizierung von Megalin im Uterus
• Abb. 4.35. Immunhistochemische Analyse vom Uterus samt Embryonen einer trächtigen Maus am Tag 5,5 p.c. auf Megalin
• Abb. 4.36. Immunhistochemische Analyse von Megalin im murinen Uterus adulter Weibchen ohne Geburt und direkt nach einer Geburt C Nach einer Geburt ist die Megalin im Epithel und in Drüsen nachweisbar. A und B Vergleich der Expression im mukosen Epithel mit Mäusen, die nie gebärend waren. Bei diesen ist faktisch kein Megalin in Drüsen nachweisbar. Gegenfärbung mit Mayers Hämalaun Färbelösung. Vergrößerung 1:100.
• Abb. 4.37. ULF von hormonell synchronisierten Wildtyp Mäusen. Zur künstlichen Einstellung der sekretorischen Phase oder Proliferationsphase des Zyklus wurde Mäusen 1 µg 17β-Östradiol oder 1µg 17β-Östradiol und 1 mg Progesteron pro Tag s.c. injiziert. Eine Kontrollgruppe erhielt lediglich Öl. Die gewonnene ULF (10 µg Protein) wurden in einer 4-12 % SDS-PAGE aufgetrennt und mit Silbernitrat gefärbt. Der Pfeil ◄ deutet die Position von in der ULF hochregulierten Proteinen im Gel an.
• Abb. 4.38. Die ULF von hormonell synchronisierten Wildtyp und Megalin defizienten Mäusen
• Abb. 4.39. ULF - Fraktionen nach der Superose Säule
• Abb. 4.40. Bindungsverhalten der Fraktionen nach Mono-Q Säule
• Abb. 4.41. Western-Blot Analyse der ULF von Megalin Knockout Mäusen und Wildtypen ULF von hormonell synchronisierten Tieren (10µg Protein) von Megalin Knockout Mäusen (-/-) und von Kontrolltieren (+/+) wurden in einer 10 % SDS-PAGE aufgetrennt. Durch Western-Blot Analyse wurde Laktoferrin in den Proben dokumentiert.
• Abb. 4.42. TaqMan®-PCR zur Quantifizierung von MCOL A im Uterus, dem murinen Homolog zu MMP1
• Abb. 5.1. Freie Hormonhypothese und Endozytose von Steroid / Carrier Komplexen
• Abb. 5.2. Menstruationszyklus der Frau
• Abb. 5.3. Endozytose von CCSP durch Cubilin/Megalin. Der Progesteroncarrier CCSP bindetdirekt an Cubilin. Im Komplexmit CCSP bindet Cubilin an Megalin, welches die Endozytose des Gesamtkomplexes vermittelt. Ohne Megalin kommt es zu keiner Endozytose.