Busch, Annette: Minderung der allogenen Immunogenität künstlicher Gewebe am Modell Epithelien durch Suppression der MHC-I-Oberflächenexpression

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Kapitel 1. Einleitung

1.1 Möglichkeiten und Grenzen des Gewebeersatzes - Problem der Immunogenität allogener/syngener Transplantate

Neben der Organtransplantation zum Ersatz irreversibel geschädigter Organe (Nerven, Herz, Leber, etc.) hat sich in den letzten Jahren zunehmend auch die Zell-und Gewebetransplantation in der Medizin etabliert. So werden z.B. Insel- oder Purkinjezellen zur Restitution defekter Hormon-/Mediatorproduktion bei Diabetes mellitus bzw. Morbus Parkinson transplantiert, um die Thrombosierungsgefahr zu senken werden autologe (von demselben Individuum) Endothelzellen zur Beschichtung künstlicher Bypassmaterialien verwendet, zum Einsatz von Haut- und Brandverletzungen oder anderen ausgebreiteten Hautdefekten werden neben Spalthaut zunehmend in vitro gezüchtete "Keratinozyten-Sheets" eingesetzt und in der Knorpeltransplantation finden autologe Chondrozyten ihre Anwendung. Sogenannte "Tissue-Engineering"-Verfahren ermöglichen uns immer besser, Gewebe in der Zellkultur zu generieren, und diese anschließend zu transplantieren. Die Stammzellforschung hat dieser Entwicklung weiteren Auftrieb gegeben.

Heute wird im Allgemeinen autologes Material verwendet, wodurch immunologische Probleme einer Abstoßungsreaktion weitestgehend vermieden werden (obwohl teilweise auch autologes Material durch die Kultivierung "immunogen" wird, z.B. Knorpel). Autologes Material beinhaltet jedoch viele Limitationen - Verfügbarkeit, Zeitdauer zur Anzucht (wichtig z.B. bei Brandverletzungen). Daher geht die Forschung in die Richtung der Verwendung allogener (von einem anderen Mitglied derselben Spezies) oder xenogener (von einem Mitglied einer anderen Spezies) Zellen bzw. Gewebe. Doch stellt sich dort das Problem der Immunogenität.

Die ex vivo-Herstellung eines artifiziellen Gewebes aus wenigen Zellen erlaubt die Manipulation der antigenen Eigenschaften seiner Zellen in vitro und somit die Eliminierung von Genen, die für die Rejektion des Transplantats verantwortlich sind, oder die Einführung von Genen, die vor immunologischen Angriffen schützen. Dieser Ansatz könnte es ermöglichen, ein allogen oder xenogen transplantierbares Gewebe zu schaffen, das keiner oder nur einer verminderten Immunsuppression zur Verhinderung seiner Rejektion bedarf. Hierbei stellt die Verminderung der MHC-I-Expression einen potentiellen Ansatzpunkt dar, die allogene Immunogenität artifizieller Epithelien oder anderer Gewebe zu minimieren.


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1.2 Grundlagen: Prozesse bei der Rejektion von Transplantaten

Bei der allogenen Transplantation stellen zellvermittelte Rejektionen das Hauptproblem dar. Akute Rejektionen werden durch T-Zellen ausgelöst, die allogene Unterschiede, vor allem der MHC-Antigene, erkennen.

Epithelzellen exprimieren konstitutiv MHC-I-Antigene, aufgrund der sie von CD8-positiven alloreaktiven zytotoxischen T-Zellen erkannt und lysiert werden können. Außerdem produzieren sie lösliche MHC-I-Antigene, die CD4-positiven T-Helferzellen (TH) von wirtseigenen antigenpräsentierenden Zellen (APZ) oder den APZ des Transplantats präsentiert werden können. Diese können wiederum CD8-positive MHC-I-alloreaktive T-Zellen aktivieren.

MHC-I-Antigene werden - im Gegensatz zu MHC-II-Antigenen, die nur auf der Zelloberfläche von APZ oder zytokinaktivierten Gewebezellen vorkommen - auf allen kernhaltigen tierischen Zellen exprimiert. Es handelt sich um Heterodimere, die aus einem transmembranen Protein (human: HLA-A, -B, -C; Maus: H-2K, -D, -L; Ratte: RT1.A) von 45-49 kD (auch schwere oder alpha-Kette bezeichnet), einem nichtkovalent assoziierten Protein (beta2-Mikroglobulin) von 12 kD und einem Peptid aus acht bis zehn Aminosäuren bestehen [ 1 ].

1.2.1 Der Ort des Eingriffs: Die MHC-I-assoziierte Antigenpräsentation

Peptide, die bei dem Abbau von Proteinen im Zytoplasma entstehen, werden ins Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) transportiert. MHC-Ia-Ketten lagern sich im ER mit einem membrangebundenen Protein zusammen, dem Calnexin. Wenn dieser Komplex ein beta2-Mikroglobulin bindet, löst sich die alpha-Kette von Calnexin und das partiell gefaltete MHC-I-Molekül bindet dann an die TAP-1-Untereinheit des TAP-Komplexes (Transporter associated with Antigen Processing), indem es mit einem Chaperon, dem Calreticulin, in Wechselwirkung tritt. Das MHC-I-Molekül wird im ER zurückgehalten, bis es durch die Bindung eines Peptids freigesetzt wird und dabei seine Faltung vollendet (vgl. Abb. 1 ).

Peptide, die von MHC-I-Molekülen gebunden werden, entstehen vorwiegend durch den Abbau von Proteinen im Zytosol [ 3 ]. Sie werden durch proteolytische Spaltung durch einen Proteasekomplex, dem Poteasom, erzeugt und durch den TAP-Transporter in das Lumen des ER gebracht. Dort binden sie an den Komplex des partiell gefalteten MHC-I-Moleküls, wobei sich dieses vom TAP-Tapasin-Komplex löst. So kann der Peptid-MHC-Komplex anschließend über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche gebracht werden. MHC-Klasse-I-Moleküle verlassen das ER nur, wenn sie Peptide gebunden haben.


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Abb. 1: Antigenprozessierung und Präsentation via MHC Klasse I (modifiziert nach [ 2 ]).
(a) Endogene Proteine werden durch das Proteasom gespalten und (b) die Peptide in das ER durch TAP-Dimere transportiert. Mehrere Moleküle im ER sind in dem Assemblierungsprozess involviert: (c) Calnexin und ERp57; (d) Calreticulin und beta2-Mikroglobulin; und (e) Tapasin. (f) Stabile MHC-Peptidkomplexe können das ER via den Golgi-Apparat verlassen und (g) an die Zelloberfläche gelangen, wo sie (h) von zytotoxischen T-Zellen erkannt werden.

Das Proteasom besteht aus einem zylindrischen Komplex von vier Ringen, die jeweils aus sieben Untereinheiten zusammengesetzt sind. Es ist nicht genau bekannt, wie das Proteasom zytosolische Proteine abbaut. Wahrscheinlich müssen Proteine sich entfalten und sich durch das Zentrum der zylindrischen Struktur fädeln, damit ein Abbau erfolgen kann. Es ist nicht bekannt, ob das Proteasom die einzige zytolytische Protease ist, die Peptide für den Transport in das ER erzeugen kann, es wird jedoch als das Haupt-Werkzeug für die Degradation von Proteinen angesehen. Die Deletion von Untereinheiten des Proteasoms führt zu verminderter Oberflächenexpression von MHC I, jedoch nicht zur vollständigen Blockade der MHC-I-Assemblierung [ 4 ]. Dem MHC-I-Molekül selbst wird ebenfalls eine proteolytische Aktivität zugeschrieben [ 4 , 5 ]. Ferner wird angenommen, dass für die finale Zuschneidung von Peptiden auf die optimale Länge von 8-10 Aminosäuren weitere Proteasen zuständig sind [ 6 - 9 ].


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Ein vor kurzer Zeit entdecktes Protein, das ebenfalls am Assemblierungsprozess im ER beteiligt ist, ist das zur Familie der Proteindisulfidisomerasen (PDI) gehörende ERp57, auch ER60 genannt [ 10 - 14 ]. Es handelt sich hierbei um eine Thioloxidoreduktase, die an der korrekten Formation von Disulfidbrücken in Glykoproteinen beteiligt ist. Im Gegensatz zu anderen PDI, bindet ERp57 nur an frisch synthetisierte Glykoproteine. Es bildet Komplexe mit Calnexin und Calreticulin und man nimmt an, dass diese Komplexe für die spezifische Faltung von Glykoproteinen im ER-Lumen verantwortlich sind. Damit ist dieses Chaperon mit verantwortlich für die transiente Stabilisation des noch unvollständig assemblierten Klasse-I-Moleküls.

Ebenfalls an der korrekten Faltung des MHC-I-Moleküls beteiligt ist Calnexin (88kD) [ 15 - 17 ]. Dieses Molekül ist jedoch für den Faltungsprozess nicht essentiell, da Calnexin-negative Zelllinien eine Assemblierung der schweren Kette mit beta2-Mikroglobulin aufweisen und MHC I auf der Zelloberfläche exprimieren [ 18 , 19 ].

Das nächste Protein in der Assemblierungskette ist Calreticulin (60 kD), das eine hohe Homologie zu Calnexin aufweist [ 20 ]. Ähnlich wie Calnexin zeigt es eine hohe Spezifität für monoglykosylierte N-terminale Glykane an der schweren Kette [ 21 ]. Im Gegensatz zu Calnexin bindet Calreticulin jedoch nur Dimere der schweren Kette von MHC I [ 22 ].

TAP ist die letzte Station des assemblierten alpha-Kette- beta2m-Calreticulin-ERp57-Komplexes. Es handelt sich hierbei um ein dimeres Protein, das sich aus den Untereinheiten TAP 1 (70 kD) und TAP 2 (72 kD) zusammensetzt. Beide Untereinheiten sind im der Membran des ER und des cis-Golgi verankert. Nur ein kleiner Teil ragt in das ER-Lumen hinein während der größte Teil einschließlich einer ATP-bindenden Kassette (ATP-binding cassette, ABC) im Zytosol lokalisiert ist [ 23 ]. Die Bindung des MHC-I-Komplexes geschieht an die Untereinheit TAP 1. TAP ist spezialisiert auf die Translokation zytosolischer Proteine in das ER-Lumen [ 24 , 25 ]. Es werden bevorzugt Peptide mit einer Länge von 8-15 Aminosäuren transportiert, jedoch auch Hexamere oder 30-40-mere [ 26 ]. Der Peptidtransport ist ATP-abhängig.

Die Bindung des alpha-Kette- beta2m-Calreticulin-ERp57-Komplexes an TAP wird durch ein weiteres Molekül vermittelt, dem Tapasin (48 kD). Dieses transmembrane, zur Familie der Immunoglobuline gehörende Glykoprotein [ 27 , 28 ] wurde erstmals 1996 durch Koimmunopräzipitation mit der alpha-Kette des MHC-I-Moleküls und TAP identifiziert [ 22 ]. Die Isolierung dieses MHC-I-TAP-Komplexes ließ darauf schließen, dass jedes TAP-Heteromer mit je vier MHC-I-Tapasin-Calreticulin-Komplexen assoziiert ist [ 27 ]. Die Hauptfunktion des Tapasin liegt in der Retention leerer MHC-I-Komlexe im ER bis eine Beladung mit einem geeigneten Peptid stattgefunden hat [ 27 , 29 ]. Somit hat es eine ähnliche Funktion wie das HLA-DM-Molekül in der Prozessierung von MHC Klasse II Molekülen, welches ebenfalls den Ersatz von CLIP durch Peptide höherer Affinität katalysiert [ 30 , 31 ]. Weitere Funktionen


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von Tapasin sind die Vermittlung einer besseren Bindung des MHC-I-Komplexes an TAP sowie die Verstärkung der Peptid-Translokation durch TAP [ 32 ]. Trotz dieser Multifunktionalität in der Antigen-Prozessierung ist Tapasin nicht essentiell für die Expression von MHC I. Während die Expression von einigen MHC-I-Molekülen wie B*4402 und HLA-B8 stark Tapasin-abhängig ist, können andere Moleküle, wie B*2705, HLA-A2, das murine H-2Kb sowie H-2Dd mit Peptiden ohne die qualitative Kontrolle durch Tapasin beladen werden [ 33 - 36 ].

1.3 MHC-I-defiziente Organe: verbesserte Akzeptanz bei Transplantationen?

1.3.1 Eliminierung von TAP und beta2-Mikroglobulin

Die Expression von drei verschiedenen Genen, die eine hohe Allelzahl bei kodominanter Expression aufweisen [ 37 ], macht eine direkte gentechnische Eliminierung der HLA-A-, HLA-B- und HLA-C-Proteine der MHC-I-Moleküle problematisch. So ist bisher auf alternative Methoden zurückgegriffen worden, um eine MHC-I-Defizienz zu erzielen: zum einen die Deletion des MHC-I-assoziierten beta2-Mikroglobulin, zum anderen die Deletion oder Inhibierung des TAP-Transporters.

Die Abwesenheit des monomorphen beta2-Mikroglobulin führt zur Instabilisierung des Komplexes und zu verminderter Oberflächenexpression an MHC I [ 38 ]. Ebenfalls zu einer verminderten MHC-I-Oberflächenexpression führt der Mangel an geeigneten Peptiden. Zellen ohne funktionelle Peptidtransporter sind durch eine reduzierte MHC-I-Oberflächenexpression und eine verminderte Fähigkeit zur


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MHC-I-abhängigen Antigenpräsentation charakterisiert [ 39 ].

Basierend auf dieser Erkenntnis wurden beta2m-knock-out- (beta2m-/--) bzw. TAP-knock-out- (TAP-/--) Transplantate generiert und im Maus-Modell getestet [ 38 , 40 - 43 ]. TAP-/- und beta2m-/- Zellen zeigen immer noch geringe Mengen an MHC-I-Molekülen auf der Zelloberfläche (ca. 10 % der konstitutiven Expression) [ 38 , 41 ]. Die schwere Kette des MHC-I-Moleküls wird also auch ohne eine Assoziation mit beta2-Mikroglobulin an die Zelloberfläche transportiert oder es existieren alternative Wege der Peptid-Beladung, wie die Bildung von Peptiden im ER aus den Signalsequenzen exportierter Proteine [ 44 ].

1.3.2 Transplantation MHC-I-defizienter Organe

Die Relevanz der MHC-I-Expression in der Transplantation allogener Organe ist in einigen Tiermodellen untersucht worden. Es wurden dabei beta2-Mikroglobulin- oder TAP-defiziente Transplantate eingesetzt. Je nach Stärke des Transplantationsmodells konnten verlängerte Überlebenszeiten bis hin zu unbegrenzter Akzeptanz des Transplantats beobachtet werden. So überlebten pankreatische Inseln beta2m-defizienter Mäuse unbegrenzt im allogenen Empfängertier [ 45 ], während im Lebertransplantationsmodell nur drei von sieben und im Herztransplantationsmodell zwei von fünf Transplantaten überlebten [ 46 ]. Weiterhin konnte die Abstoßung von Dünndarmtransplantaten nur von 9 auf 20 Tage hinausgezögert werden [ 47 ]. Ebenfalls wurden bei der Transplantation von T-Lymphomzellen TAP-/ beta2m-doppelnegativer Mäuse diese von Wildtyp-Empfängern abgestoßen [ 41 ]. Bei der Transplantation von Nieren aus beta2m-/--Mäusen konnte eine signifikante Verbesserung der Nierenfunktion im Gegensatz zu Wildtyp-Transplantaten beobachtet werden [ 48 ]. Hauttransplantate von TAP-/ beta2m-/--Mäusen werden innerhalb von 13 Tagen abgestoßen, d.h. nur ca. 5-6 Tage verzögert [ 42 , 43 , 49 ].

An dieser Stelle muss angemerkt werden, dass MHC-Klasse-II-defiziente Hauttransplantate (MHC-I-positiv) ohne Verzögerung abgestoßen werden [ 50 ].

Die im Großen und Ganzen positiven Auswirkungen der MHC-I-Defizienz auf die Überlebensdauer des Transplantats zeigen die Bedeutsamkeit des Klasse-I-Moleküls in der allogenen Transplantation. Dabei muss berücksichtigt werden, dass in allen bisher durchgeführten Experimenten die MHC-I-Defizienz durch Eliminierung des beta2-Mikroglobulins bzw. des TAP-Transporters erreicht worden ist, die jedoch, wie schon erwähnt, keine vollständige Entfernung des Klasse-I-Moleküls von der Zelloberfläche zur Folge hat. Daher besteht die Hoffnung, dass durch einen vollständigen phänotypischen "knock-out" der MHC-I-Expression noch bessere Resultate in der allogenen Transplantation zu erzielen sind. Eine vielversprechende Strategie hierfür könnte der Einsatz sogenannter "Intrabodies" oder viraler MHC-I-modulatorischer Proteine sein.


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1.4 Inhibierung der MHC-Oberflächenexpression durch Intrabodies

1.4.1 Was sind Intrabodies?

Bei Intrabodies handelt es sich um Antikörperfragmente, die durch eine Retentionssequenz im Endoplasmatischen Retikulum (ER) zurückgehalten werden und dort durch Bindung an ihre Zielmoleküle den Transport dieser an die Oberfläche verhindern. Beschrieben wurde der Einsatz intrazellulärer Antikörper in eukaryotischen Zellen zuerst 1990 von der Gruppe Cattaneo et al. (Institute of Neurobiology, Rom, Italien) [ 51 , 52 ]; der Begriff "Intrabody" wurde erstmals 1994 von der Gruppe Marasco et al. (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, USA) definiert [ 53 ]. Im weiteren Sinne können dazu auch Antikörperfragmente gezählt werden, die in anderen Kompartimenten der Zelle, wie z.B. im Zytoplasma oder im Nukleus lokalisiert sind. Die Lokalisation im ER wurde durch die C-terminale Addition eines Retentionssignals Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) erreicht. Allerdings wurde auch ein Intrabody ohne derartiges Signal im ER zurückgehalten [ 54 ]. Die Ursache dieses unerwarteten Verhaltens ist bislang unbekannt. So ist vorerst unklar, ob die Retention im ER ohne Existenz des KDEL-Signals ein singuläres Phänomen ist oder ob sie für alle sFv-Antigenkomplexe zutrifft.

Intrabodies werden meistens als Fab- oder sogenannte "single chain" (sFv)-Fragmente eingesetzt. Je nach Antikörpermolekül ist eine der beiden Varianten stabiler. Oft fällt die Wahl auf die kleinere Form der beiden, das sFv-Fragment, das nur aus den variablen Regionen des Antikörpers (VL bzw. VH) besteht. Zur Vermeidung der Dissoziation der Fragmente von schwerer und leichter Kette sind die beiden über einen Peptidlinker miteinander verknüpft. Als Linker dient meist ein Peptid der Sequenz (Gly4Ser)3 [ 55 ]. Bei einigen sFv-Fragmenten wurden auch Disulfidbrücken zur Verbindung und/oder Stabilisation beider Ketten eingeführt [ 56 ]. Ursprünglich wurden sFv-Fragmente hergestellt, um die Immunogenität der konstanten Domänen für eine in vivo-Applikation am Menschen zu senken, um gentechnisch neue Effektorfunktionen mit der Spezifität eines Antikörpers zu vereinen und um die Fähigkeit zur Gewebspenetration zu verbessern [ 57 ].


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Abb. 2: Intrabodies können als verschiedenen Formen von Antikörperfragmenten synthetisiert werden. Gängige Formen sind a) Fab-Fragmente und b) "single chain"-Fragmente (sFv). Zur besseren Detektion können sie mit fluoreszierenden Proteinen gekoppelt werden, wie im Fall c) mit dem "green fluorescent protein" (GFP). sFv-Fragmente bestehen aus den variablen Regionen eines Antikörpers, die durch einem Peptidlinker miteinander verbunden sind.

1.4.2 Welche Intrabodies wurden bisher beschrieben?

Die intrazelluläre Expression von sFv-Antikörperfragmenten in eukaryotischen Zellen wurde bereits mehrfach erfolgreich praktiziert.

Mit ER-residenten sFv-Fragmenten konnte die Expression diverser Rezeptoren an der Zelloberfläche verhindert werden. Hierbei ist die "Downregulation" des T-Zell-Moleküls CD2 [ 58 ], der alpha-Kette des IL-2-Rezeptors in mehreren T-Zelllinien inklusive HTLV-I-


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transformierter T-Zelle [ 59 , 60 ], des EGF-Rezeptors [ 61 ] sowie des VLA-2-Antigens durch Intrabodies zu nennen [ 62 ].

Sehr erfolgversprechend ist bisher der Einsatz von Intrabodies, die gegen Onkoproteine gerichtet sind. So konnte die Oberflächenexpression und Aktivierung des ErbB-2-Rezeptors, dessen Überexpression in vielen humanen Tumoren, wie beim Ovarial- und Mammakarzinom [ 63 ], vorhanden ist, durch anti-ErbB-2-Intrabodies inhibiert werden [ 63 , 64 ]. Die phänotypischen Effekte, die durch anti-ErbB-2-Intrabodies erzielt wurden, waren unterschiedlich: so wurde in mit ErbB-2-transformierten NIH3T3-Fibroblasten eine Reversion zum untransformierten Phänotyp beobachtet [ 64 ] - auf andere, ErbB-2 überexprimierende Zellen, wie Ovarial-, Lungen- und Brustkarzinomzellen hatte die Intrabody-Expression einen zytotoxischen Effekt, nicht jedoch auf regulär ErbB-2 exprimierende Zellen [ 65 - 68 ]. Durch die Fähigkeit der anti-ErbB-2-Intrabodies, Tumorzellen zu eliminieren, wäre ihr Einsatz als Krebstherapeutikum denkbar. In vivo wurden humane Ovarialkarzinomzellen nach dem Transfer in Nacktmäuse durch die Injektion von anti-ErbB-2-Intrabodies lysiert [ 69 ]. Diese Tumor-transplantierten Mäuse überlebten länger, wenn intraperitonal anti-ErbB-2-Intrabody-Adenoviruskonstrukte appliziert wurden [ 70 , 71 ]. Das Hauptproblem hierbei ist jedoch ein quantitativer gezielter Gentransfer in vivo.

Neben Intrabodies gegen ErbB-2 wurden auch Intrabodies gegen das p21ras Onkogen eingesetzt. Im Zytosol lokalisierte Intrabodies inhibierten in vielen Zelllinien die ras vermittelte Signaltransduktion [ 72 - 76 ]. Vor kurzem konnte in vitro gezeigt werden, dass ein p21ras-neutralisierender Intrabody die Apoptose in humanen Tumorzellen, nicht jedoch in untransformierten Zellen induzieren konnte [ 76 ]. Überdies führte die Transduktion von Kolonkarzinomzellen mit einem anti-p21ras Adenoviruskonstrukt zu anhaltender Tumorregression in Nacktmäusen [ 76 ].

Antivirale Effekte von Intrabodies wurden umfassend für die Inhibierung der HIV-Replikation in vitro untersucht. So konnte ein zytoplasmatischer Intrabody gegen das p17 Matrixprotein die HIV-1-Infektion in mitotischen T-Zellen inhibieren [ 77 ]. Ein weiteres sFv-Fragment mit Spezifität für gp120 inhibierte bei Expression im endoplasmatischen Retikulum (ER) die Prozessierung des Envelope Precursors [ 54 ]. Als Folge wurde eine Verminderung der Infektiösität der produzierten viralen Partikel und eine Inhibierung der Synzytienformation beobachtet. Des Weiteren führten Intrabodies gegen die Reverse Transkriptase und Integrase in T-Zellen zur Resistenz gegen das Virus [ 78 , 79 ]. Schließlich konnte durch anti-Tat- und anti-Rev-Intrabodies die HIV-Replikation in infizierten Zellen inhibiert werden [ 80 - 82 ].


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Inhibierung der MHC-I-Oberflächenexpression durch virale Proteine

DNA-Viren haben diverse Strategien entwickelt, um eine Präsentation von Virus-Peptiden zu verhindern und so der Immunantwort des Wirts zu entkommen. Besonders große persistierende DNA-Viren, wie die zur Familie der Herpesviren gehörenden Herpes Simplex Virus (HSV) und humanes Zytomegalievirus (HCMV), haben sich im Laufe der Koevolution mit ihrem Wirt hervorragend an die Wirtszellen angepasst. Einige Virus-Strategien zur Inhibierung der MHC-I-Oberflächenexpression sind nachfolgend beschrieben.

1.4.3 Inhibierung des MHC-I-Transports durch Bindung an MHC I

Die einfachste Variante, den Transport des MHC-I-Moleküls an die Zelloberfläche zu verhindern, ist die Rückhaltung des Moleküls im ER durch Bindung. Diese Strategie wird von den verschiedenen viralen Proteinen p19, US3 und m152 (p34/40) verwendet (vgl. Abb. 3 ).

Der Prototyp des viralen Eingriffs in die MHC-I assoziierte Antigenpräsentation wurde in den nicht-onkogenen Adenoviren entdeckt: das p19-Glykoprotein (19 kD), kodiert durch die E3-Region [ 83 - 86 ]. Es inhibiert den intrazellulären Transport des MHC-I-Moleküls, indem es mit ihm einen stabilen Komplex im ER eingeht. Verantwortlich für die Rückhaltung des p19-Proteins, und so auch des MHC I, ist ein Doppel-Lysin-Motiv am Carboxy-Terminus, das bei vielen ER-residenten Proteinen vertreten ist [ 87 - 89 ]. Es setzt sich aus Aminosäuren in der Reihenfolge KKXX oder KXKXX (Einzelbuchstabencode, X = beliebige Aminosäure) zusammen und ist verantwortlich für die Erkennung durch den Koatomer-Komplex COP I, die "ausgebüchste" Proteine aus Golgi-Vesikeln wieder ins ER zurückbringen [ 89 - 91 ]. p19 setzt sich aus 142 Aminosäuren zusammen, von denen 104 auf der luminalen Seite des ER, 23 in der ER-Membran und 15 im Zytosol lokalisiert sind [ 92 , 93 ]. Da p19 das MHC-Molekül auf der luminalen Seite des ER bindet, kann der gesamte p19-MHC-I-Komplex auf diese Art im ER zurückgehalten werden. Durch Exon-Shuffling-Experimente zwischen zurückgehaltenen und freigesetzten (mutierten) MHC-I-Molekülen sowie durch Analyse von p19-Mutanten in Koimmunopräzipitationen konnte als Bindungsort die Peptidbindungsstelle (die a1/a2-Domäne) des MHC-I-Moleküls determiniert werden [ 94 , 95 ]. Eine weitere Funktion bezüglich der Inhibierung der Antigenpräsentation wurde kürzlich von Bennet et al. beschrieben [ 96 ]. Demnach bindet p19 an TAP und verhindert so die Bindung des Tapasin-MHC-I-Komplexes an TAP. Durch diese duale Funktion kann das Virus auch die Antigenpräsentation von Allelen, welche es nur schwach binden kann, verhindern.

Abb. 3: Durch Bindung von den viralen Proteinen p19, US3 oder m152 wird der Transport des assemblierten und mit Peptid beladenen MHC-I-Moleküls verhindert.

Ein weiteres Protein, das sich ebenfalls dieses Bindungsmechanismus bedient, ist das US3-Protein (32/33 kD) des humanen Zytomegalievirus (HCMV). Es wird in der IE- (immediate early-) Region des Genoms kodiert und ist somit ein sehr früh exprimiertes Protein. Wie p19 kann auch US3 mit MHC-I-Molekülen kopräzipitiert werden [ 97 ], eine ER-Retentionssequenz wie das Doppel-Lysin-Motiv ist jedoch nicht vorhanden [ 98 ]. Der genaue Wirkungsmechanismus der Retention von MHC I durch US3 ist noch unklar.

Das Gen m152 des murinen Zytomegalievirus (MCMV) kodiert ein 40 kD großes Glykoprotein [ 99 ], das ebenfalls in der Lage ist den Transport des MHC-I-Moleküls an die Zelloberfläche zu verhindern. Das Transkriptionsmaximum wird dabei zwischen vier und sechs Stunden nach der Infektion erreicht [ 98 ]. Im Gegensatz zu US3 und p19 ist dieses Protein nicht im ER, sondern durch eine entsprechende carboxyterminale Retentionssequenz im ERGIC (ER-Golgi intermediate compartment) lokalisiert. Am Carboxy-Terminus deletiertes m152 ist immer noch in der Lage, MHC-I-Moleküle in einem pre-Golgi Kompartiment zurückzuhalten [ 98 ], was die Annahme zulässt, das hier ein ähnlicher Mechanismus wie bei dem US3-Protein vorliegt. Neben der ungewöhnlichen Lokalisation des m152-Moleküls ist es bis jetzt nicht als Komplex mit dem MHC-I-Molekül isoliert worden. Ob diese fehlende Assoziation eine sehr schwache Bindung reflektiert, die in den bei der Isolierung verwendeten Detergenzien instabil ist oder überhaupt keine direkte Bindung an das MHC-I-Molekül stattfindet ist unklar.


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1.4.4 Proteolytische Spaltung des MHC-I-Moleküls

Proteine wie US2 und US11 des humanen Zytomegalievirus halten das MHC-I-Molekül nicht nur zurück sondern sind in der Lage, den MHC-I-Komplex aus dem ER in das Zytosol zu exportieren, wo er dann durch das Proteasom proteolytisch abgebaut werden kann (vgl. Abb. 4 ).

Abb. 4: Durch US2 und US11 wird die neu synthetisierte schwere Kette des MHC-I-Moleküls zurück ins Zytosol transloziert, wo sie nach Deglykosylierung durch das Proteasom degradiert wird.

US2 und US11 sind frühe (early) Gene der US-Region, die nach US3 (immediate early) transkribiert werden [ 100 ]. Beide Gene können unabhängig voneinander diese Degradation bewirken [ 101 ]. Es handelt sich um transmembrane Glykoproteine, die in der Lage sind, das neu synthetisierte MHC-I-Molekül vom ER in das Zytosol zu translozieren. Da die schwere Kette des MHC-I-Moleküls trotz Anwesenheit von US11 oder US2 glykosyliert ist, muß sie bereits in der ER-Membran verankert sein, bevor sie aus diesem Kompartiment exportiert wird [ 101 ]. Im Zytosol wird dieses Glykan sofort durch eine N-Glykanase entfernt und die schwere Kette wird mit einer Halbwertzeit von weniger als einer Minute durch das Proteasom degradiert [101]. Proteasom-Inhibitoren konnten diese Degradation verhindern, was die Involvierung desselben im Degradationsprozess beweist [ 102 , 103 ]. Die Translokation


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findet durch das Translocon statt. Dieser zylindrische Komplex setzt sich aus drei bis vier Einheiten von Sec61 Heterotrimeren zusammen die einen internen Kanal von 40-60 Å bilden [ 103 ]. Die Tatsache, dass das MHC-I-Moleküle mit Hilfe von US2 und US11 durch diesen Kanal aus dem ER in das Zytosol exportiert werden, zeigte erstmalig die Fähigkeit des Translocons, Proteine nicht nur zu im- sondern auch zu exportieren [ 103 ].

1.4.5 Inhibierung der Peptid-Translokation/-Beladung

Da der leere, unbeladene MHC-Komplex nicht an die Zelloberfläche exportiert wird, haben einige Viren Strategien entwickelt, den Mechanismus der Peptidbeladung zu verhindern. Neben dem schon erwähnten adenoviralen Protein p19, welches als Tapasin-Kompetitor agiert, sind die Proteine US6 und ICP47 dazu in der Lage, den Transport von zytosolischen Peptiden in das ER zu verhindern (vgl. Abb. 5 ).

Das mit 9 kD relativ kleine, im Zytosol lokalisierte Protein ICP47 des Herpes Simplex Virus (HSV) ist in der Lage, durch die Inhibierung des TAP-Transporters die unbeladenen MHC-I-Komplexe im ER zurückzuhalten. Sowohl in HSV-infizierten als auch in ICP47 transfizierten Zellen konnte eine Retention von unbeladenen MHC-I-Molekülen im ER nachgewiesen werden [ 104 , 105 ]. Weitere Experimente zeigten , dass die TAP-abhängige Translokation von markierten Reporterpeptiden durch ICP47 verhindert werden konnte [ 106 ]. Mit etwa 50 nM hat ICP47 eine weitaus höhere Affinität zu TAP als die meisten Peptide und kann so die TAP-Bindungsstelle blockieren [ 107 , 108 ]. Neben dieser Blockade induziert ICP47 eine konformationelle Änderung des TAP-Heterodimers, welche die ICP47-TAP-Bindung stabilisieren könnte und damit eine weitere Bindung von Peptiden an TAP verhindern würde [ 109 ].


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US6 ist eines der vom humanen Zytomegalievirus kodierten vier US-Gene, die für die Inhibierung der MHC-I-Oberflächenexpression verantwortlich sind [ 110 ]. Das US6-Glykoprotein ist im Gegensatz zum zytosolischen ICP47 im ER lokalisiert [ 96 , 110 , 111 ]. Es interagiert direkt mit TAP, da es zusammen mit TAP und dem assemblierten MHC-I-Komplex koimmunopräzipitiert werden kann [ 110 , 111 ]. Obwohl US6 und ICP47 beide die Binding von ATP an TAP nicht beeinflussen, verhindern sie die ATP-abhängige Translokation via TAP. Im Gegensatz zu ICP47 kann US6 eine Bindung des Peptids an TAP nicht verhindern [ 110 , 111 ]. Ein Grund hierfür ist sicherlich in der Lokalisation von US6 zu suchen: da die Bindungsstelle des Peptids auf der zytoplasmatischen Seite von TAP lokalisiert ist, ist sie für US6 unerreichbar. So ist der genaue Wirkungsmechanismus der Inhibierung des Peptidtransports durch US6 noch unklar. Denkbar wäre eine Konformationsänderung von TAP nach der Bindung an US6, die den Peptidtransporter inaktiviert.

Abb. 5: TAP-Inhibierung durch US6 und ICP47. Leere assemblierte MHC-I-Moleküle bilden einen Komplex mit Tapasin/TAP, da der Petidtransport via TAP inhibiert ist. a) US6 assoziiert mit dem luminalen Teil von TAP und inhibiert so die Peptidtranslokation. Die Bindung der Peptide an die zytoplasmatische Domäne von TAP wird nicht beeinträchtigt. b) Im Gegensatz dazu inhibiert ICP47 die Petidtranslokation durch Bindung an die zytoplasmatische Domäne von TAP.


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1.5 Tissue Engineering: Herstellung von Gewebeverbänden in vitro

Das Problem von in vitro-generierten autologen Transplantaten ist ein sowohl zeit- und kostenintensiver Prozeß. Daher ist die Generierung von Geweben, z.B. zur Abdeckung von Hautdefekten Brandverletzter, nicht für jeden Patienten aus autologem Material möglich, so daß auf allogene künstliche Gewebe zurückgegriffen werden könnte.

1.5.1 Was ist Tissue Engineering?

Tissue Engineering stellt einen sich neu entwickelnden, biotechnologischen Forschungszweig dar, der sehr starke Verbindungen zu den klinischen Fachrichtungen der Medizin besitzt und als eine Weiterentwicklung der Transplantationsmedizin angesehen werden kann. Der Begriff "Tissue Engineering" wurde zuerst 1987 von der Washington National Science Foundation Bioengineering Kommission eingeführt [ 112 ]. Er bezieht sich auf die Anwendung der Methoden und Prinzipien des Ingenieurwesens (engineering) zur Entwicklung von biologischen Ersatzmaterialien. Zum Einsatz kommen dabei lebende Zellen in Kombination mit natürlichen oder synthetischen extrazellulären Komponenten. Es werden sowohl einfache Zellkulturen als auch in zunehmendem Maße komplexere, dreidimensionale Zellsysteme in vitro entwickelt, die für den Ersatz menschlicher Gewebe und Organe geeignet sind.

Gewebe bzw. Organe, die durch Tissue Engineering generiert werden, umfassen Herz, Leber, Haut, Gefäße (Endothelialisierung), Nervengewebe, Muskel, Knochen und Knorpel.

Die Transplantation in vitro gezüchteter Hautstücke ist derzeit noch die weitverbreiteste Anwendung des Tissue Engineering [ 113 , 114 ]. Am weitesten fortgeschritten ist die Herstellung von vitalem Hautersatz für Patienten mit schweren Verbrennungen. Es folgt die Generierung von patienteneigenen Knorpeltransplantaten bei Verletzungen bzw. Veränderungen der Gelenkoberflächen oder bei notwendigen Operationen im Hals-, Nasen- und Ohrenbereich [ 115 - 117 ]. Weitere Einsatzgebiete sind die Entwicklung artifizieller Leberorganoide auf der Basis kultivierter Hepatozyten zur Überbrückung von Komazuständen [ 118 , 119 ], die Transplantation von Inselzellen zur Rekonstitution defekter Hormonproduktion bei Diabetes mellitus [ 120 ], der Einsatz von Neuronen in der Zelltransplantation bei Patienten mit Parkinson-Syndrom [ 121 , 122 ] oder die Endothelialisierung künstlicher Bypässe [ 123 ].


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1.6 Tissue Engineering der Haut - ein potentielles Einsatzgebiet für
MHC-I-modifizierte Epithelzellen?

Die Haut ist mit fast zwei Quadratmetern Fläche das größte Organ des Menschen und ist entscheidend für die Aufrechterhaltung des internen Milieus des Körpers. Neben der Funktion als Schutzmantel fungiert sie als Schaltstelle zwischen dem Inneren und unserer Umwelt.

Menschliche Haut besteht aus verschiedenen Zelltypen, die untereinander in Wechselwirkung stehen: die formgebende Unterhaut (Dermis) enthält überwiegend Fibroblasten, welche die Makromoleküle der extrazellulären Matrix produzieren. Die extrazelluläre Matrix enthält eine Vielzahl anderer Zellen und Strukturen - u.a. Makrophagen, Leukozyten, Endothelzellen, Nervenaxone, Melanozyten, Haarfollikel sowie Schweiß- und Talgdrüsen. Oberhalb der Dermis liegt eine Schicht teilungsfähiger Keratinozyten, die Basalzellen. Durch Teilung dieser Basalzellen entsteht ein mehrschichtiges Epithel, die Epidermis. Neben den Keratinozyten sind in der Epidermis außerdem noch Melanozyten, Merkel-Zellen und Langerhans-Zellen enthalten. Melanozyten produzieren den Farbstoff Melanin und sind für die Pigmentierung der Haut verantwortlich, welche sie vor Schäden durch ultraviolettes Licht schützt. Merkel-Zellen sind mit Nervenenden der Epidermis assoziiert und an der sensorischen Wahrnehmung durch die Haut beteiligt. Die antigenpräsentierenden Langerhans-Zellen spielen eine Schlüsselrolle bei der Kontakt-Sensitivität. Die Hauptrolle spielen jedoch die Keratinozyten. Sie sind der zahlenmäßig dominierende Zelltyp der Epidermis, produzieren Keratin und zeigen eine ausgeprägte Differenzierung. Je weiter die Keratinozyten durch Teilung an die Hautoberfläche gelangen, desto stärker verändern sie ihre Struktur und Funktion. Sie sind die strukturgebenden Elemente der Epidermis.

Spalthaut (netzförmig geschnittene Eigenhaut zur Oberflächenvergrößerung) steht oft nicht in ausreichendem Maße zur Verfügung und hinterläßt außerdem neue Wundflächen und Narben. Xenograft-, Allograft- oder synthetische Wundabdeckungen sind wegen der Abstoßungsreaktionen nur vorübergehend geeignet, bis genügend eigene Keratinozyten (nach ca. drei Wochen) gezüchtet worden sind. Der erste Versuch, Haut für den Einsatz in der Transplantation zu modifizieren, bestand in der Entfernung der antigenpräsentierenden Langerhans-Zellen. Ziel war es, die Transplantaterkennung auf den direkten Weg zu beschränken. Langerhans-Zellen können Antigene (vor allem MHC-I-Antigene) aufnehmen und sie im Kontext mit MHC-II-Antigenen sensibilisierten, durch das Entzündungsmilieu angelockten, T-Zellen im Transplantat präsentieren Darüber hinaus könne sie mit den


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aufgenommenen allo-Antigenen zu den drainierenden Lymphknoten migrieren und dort als potente antigenpräsentierende Zellen eine Primärimmunantwort auslösen.

Eine verminderte allogene Immunogenität wurde jedoch nur bedingt beobachtet: die Transplantate wurden nach etwa 15 Tagen abgestoßen, etwa fünf Tage später, als allogene Spalthaut [ 124 , 125 ]. Bereits elf Tage nach Transplantation konnte die Infiltration von Monozyten und Lymphozyten im Transplantat nachgewiesen werden [ 125 ]. Die Ursache dieser Abstoßungsreaktion war die Migration von autologen Langerhans-Zellen in das Transplantat, welche die Alloantigene präsentierten.

Durch Tissue Engineering hergestellte Haut könnte entweder als Hautersatz fungieren, als Matrixgrundlage, in welche die Zellen des Empfängers einwandern und sich dort ansiedeln könnten oder als Lieferant von heilungsfördernden Faktoren. Diese pharmakologische Wirkung kann durch Hauttransplantate erzielt werden, die lebende Zellen enthalten, welche Zytokine oder unlösliche Matrixproteine wie Kollagen produzieren. Generell können die durch Tissue Engineering hergestellten Hauttransplantate in vier Kategorien aufgeteilt werden: a) epidermale Transplantate, b) dermale Transplantate, c) Transplantate bestehend aus Dermis und Epidermis und d) Transplantate, die aus einer Kombination von künstlicher Dermis und lebenden epidermalen Zellen bestehen. Es gibt bereits eine Vielzahl kommerziell erhältlicher Produkte für die Hauttransplantation [zusammengefasst in 113 , 114 , 126 - 128 ]. Um aufzuzeigen, wo MHC-I-modifizierte Keratinozyten in der Praxis eingesetzt werden könnten, werden einige dieser Produkte nachfolgend beschrieben.

1.6.1 Tissue Enginering der Epidermis

Keratinozyten können in speziellen Wachstumsmedien in Kokultur mit bestrahlten murinen 3T3-Fibroblasten in vitro über mehrere Passagen hinaus kultiviert werden [ 129 , 130 ]. Bei Verwendung von Keratinozyten aus fetaler Haut konnten ca. 50-60 Zellteilungen erreicht werden. Diese Anzahl sinkt mit dem Alter des Spenders [ 131 ]. "Übersetzt" man die Anzahl an erreichten Zellteilungen in Hautfläche, so können Keratinozyten zu einer Fläche expandiert werden, die bis zu 10.000 mal größer ist, als das zuvor entnommende Gewebe. So lassen sich aus einem Quadratzentimeter Hautgewebe von einem schwer verbrannten Patienten nach zwei bis drei Wochen im Extremfall ein Quadratmeter große, neue Hautstücke züchten, die, ins Gewebe des Patienten verpflanzt, später einheilen. Der Einsatz kultivierter Epidermis ist zu einer Standardmethode bei der Behandlung von Verbrennungen und chronischen Wunden geworden [ 132 - 136 ], obwohl die Methode eine Reihe von Nachteilen zeigt: langer Kultivierungszeitraum, schwierige Handhabung und Pflege, unsichere Einheilung und hohe Kosten sind hierbei hervorzuheben.


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Eine sehr neue Methode besteht in der Verwendung von Haarwurzeln als Ausgangsmaterial [ 137 ]. Dazu werden dem Patienten zwischen 50 und 100 Haare mit Stammwurzelzellen entnommen, die dann in speziellen Kulturen in vier Wochen zu transplantierbarer Haut heranwachsen. Diese kann dann auf die Wunde aufgebracht werden. Besonders bei älteren Patienten mit chronischen Wunden ist diese Behandlungsmethode erfolgreicher als die bisher angewendete Methode, bei der Patienten gesundes Hautgewebe entnommen und auf die nicht heilende Wunde aufgelegt wurde. Bei den bisher behandelten Patienten lag die Erfolgsquote bei etwa 80 Prozent.

Allogene Keratinozyten stellen eine sofort verfügbare Alternative zu autologen Transplantaten dar. Als Quelle hierfür eignen sich fetale Keratinozyten. Zellen fetalem Ursprungs sind weniger immunogen [ 138 - 140 ] und haben eine hohe Teilungsrate im Gegensatz zu Keratinozyten erwachsener Menschen. Bei der Transplantation allogener "Keratinozyten-Sheets" konnte keine klinische Rejektion nachgewiesen werden; die Zellen überleben jedoch nicht, sondern werden bereits nach einer Woche "still" durch die Keratinozyten des Empfängers ersetzt [ 140 - 148 ]. Diese transplantierten "Keratinozyten-Sheets" fungieren also nicht als Gewebe-Transplantat, sondern eher - durch von den Keratinozyten sezernierte heilungsfördernden Faktoren - als ein potenter Stimulus des Heilungsprozess. Daher sind sie bei großflächigen Verbrennungen oft eine gute Alternative zu den zeitintensiven autologen "Keratinozyten-Sheets". Bei der Verwendung fetaler Keratinozyten zu Züchtung von Haut muss jedoch bedacht werden, daß gegen die Gewinnung von embryonalem Materials und dessen Einsatz in der Transplantationsmedizin unter verschiedenen Gesichtspunkten rechtliche und ethische Bedenken bestehen.

1.6.2 Tissue Enginering der Dermis

Kultivierte epidermale Transplantate sind wesentlich effektiver, wenn sie auf einer dermalen Schicht kultiviert und transplantiert werden, da so die Stabilität verbessert wird und damit der Wundheilungprozess positiv beeinflusst wird. Die dermale Komponente hat einen positiven Einfluß auf die Migration, Differenzierung, Anheftung und Wachstum epithelialer Zellen [ 149 - 151 ].

Das unter der Bezeichnung Alloderm (Life Cell Sciences) kommerziell vertriebene dermale Transplantat besteht aus chemisch prozessierter, dezelullarisierter Leichenhaut. Nach Entfernung aller lebenden Zellen und der Epidermis bleibt ein komplexes Netzwerk zurück, das viele strukturelle Komponenten der Dermis enthält. Die Anwendungsgebiete für dieses von der FDA (Food and Drug Administration, USA) zugelassene Transplantat liegen heute in der Behandlung von Verbrennungen, Hautkrankheiten, sowie in der zahnärztlichen Chirurgie [ 152 ].


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Die Vorteile der kultivierten epidermalen Transplantate liegen zum einen in der Möglichkeit der starken Expansion der Ausgangszellzahl aus wenig Material mit befriedigendem biomechanischen und kosmetischen Resultaten, zum anderen in dem geringen Risiko bei der Übertragung von Viruserkrankungen. Nachteile sind vor allem die Instabilität des Transplantats (hohe Anfälligkeit gegenüber Scherkräften und Druck, z.B. bei Transplantation im Rücken-, Schulter-, Gesäß- oder hinterem Oberschenkelbereich) [ 153 ], die schlechte Verheilung durch Wundkontraktionen [ 154 , 155 ], die hohen Produktionskosten der Zellkultur und die schlechte Anwendbarkeit bei tiefen Wunden.

1.6.3 Tissue Engineering von kombinierter Dermis und Epidermis

Zwei Hautäquivalente aus kombinierter Dermis und Epidermis, die heute verbreitet als Wundabdeckungen von Brandwunden eingesetzt werden sind Integra (Integra) und Dermagraft-Transitional Covering (Dermagraft-TC).

Integra basiert auf der Entwicklung einer zweischichtigen Membran von Yannas und Burke [ 156 - 158 ]. Sie besteht aus einer äußeren "epidermalen" Silikonschicht, die mit einer inneren Dermalschicht verbunden ist. Die Dermalschicht setzt sich aus einem porenförmigen Netzwerk aus Kollagen und Glukosaminoglykanen zusammen. Die obere Silikonmembran verhindert das Einwandern von Bakterien in die Wunde und einen Wasserverlust des Gewebes. Die innere dermale Schicht fördert ein gutes Anwachsen des Transplantats, indem die porenförmige Struktur eine langsame Biodegradation, Vaskularisierung sowie die Migration von Empfängerzellen zulässt. Einige Wochen nach Transplantation, wenn eine fibrovaskuläres Einwachsen in die dermale Schicht stattgefunden hat, muss die äußere Silikonschicht entfernt werden. Danach kann eine sehr dünne Spalthaut transplantiert werden.

Dermagraft-TC ist eine Weiterentwicklung des Hauttransplantats von Integra. Auch hier besteht die äußere Schicht aus einer Silikonmembran. Die innere dermale Schicht wird von humanen fetalen Fibroblasten synthetisiert, die auf einem aus Nylon bestehenden Netzwerk kultiviert werden. Nachdem die Fibroblasten eine dermale Matrix aus Glucosaminglycanen und Kollagen produziert haben, werden sie durch Einfrieren abgetötet, so dass nur noch die dermale Komponente in der Transplantation eingesetzt wird [ 159 ].

Vorteile dieser Präparate sind die schnelle Verfügbarkeit (gegenüber epidermalen Autotransplantaten), die immunologische Neutralität durch Dezellularisierung, dem besseren optisch-kosmetischen Resultat und der schnelleren Heilung gegenüber Spalthaut, der einfacheren Handhabung als der von epidermalen Allo-/Autotransplantaten, dem geringen Risiko von Virusübertragungen und die mögliche Repopularisierung durch Empfängerzellen.


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Nachteile sind die schlechtere Akzeptanz des Transplantats gegenüber Eigenspalthaut oder epidermalen Autotransplantaten, die Notwendigkeit einer zweiten Transplantation nach Entfernung der Silikonschicht, die erst späte Detektion von Infektionen unter der Silikonschicht und den relativ hohen Produktionskosten. Spezielle Nachteile bei der Verwendung von Dermagraft-TC liegen in der Notwendigkeit der Haltbarmachung durch Preservationsmittel und der möglichen Übertragung von Viren. Außerdem stellt auch hier die Verwendung von Kadaverhaut, wie die von fetalen Zellen in epidermalen Allotransplantaten, für viele Menschen ein ethisches Problem dar.

1.6.4 Tissue Engineering mit Einsatz lebender Zellen: "Living Skin Equivalents"

Anstelle der äußeren Silikonmembran können allogene fetale Fibroblasten in das biologisch abbaubare Polyglaktinnetzwerk von Dermagraft-TC eingesät und die temporäre Wundabdeckung kann damit als "lebendes" Hautäquivalent fungieren [ 132 ]. Für chronische Erkrankungen wie diabetische Ulzera ist dies durchaus praktikabel (im Gegensatz zu akuten Verbrennungen, bei denen oft nicht sofort genügend autologes Material zur Verfügung steht).

Ein weiteres Hautäquivalent, das lebende Zellen enthält, ist Apligraf (Organogenesis). Es setzt sich aus bovinem Kollagen und humanen fetalen Fibroblasten und Keratinozyten zusammen, die Wachstumsfaktoren und Matrixproteine produzieren und somit den Heilungsprozeß fördern. Einsatzgebiet für Apligraf sind vor allem venöse oder diabetische Ulzera [ 160 ]. Bei einer großangelegten Studie in den USA, in der 293 Patienten mit venösen Ulzera über den Zeitraum von einem Jahr beobachtet wurden, zeigte der Einsatz von Apligraf bei schweren Fällen gegenüber der konventionellen Kompressionstherapie gute Ergebnisse. Bei großen und tiefen Ulzera, sowie bei persistierenden (länger als sechs Monate) Geschwüren wurde eine komplette Schließung der Wunde bei mehr Patienten gegenüber der Kontrollgruppe erreicht (63% vs. 49%) und dies wesentlich schneller (61 vs. 181 Tage). Bei weniger als sechs Monate anhaltenden Ulzera zeigten beide Gruppen jedoch ähnliche Ergebnisse [ 160 ].

Vorteile beim Einsatz dieser mit vitalen Zellen kombinierten Transplantate liegen in der sofortigen Verfügbarkeit, der leichten Handhabung und der Tatsache, dass eine Re- oder Zweittransplantation nicht notwendig ist. Nachteile liegen in der Möglichkeit von Virusübertragungen, sowie dem limitierten Zeitrahmen zwischen Fertigstellung des Transplantats und Transplantation desselben (Viabilität: 5 Tage). Wie bei anderen allogenen Transplantaten ist auch hier die ethische Problematik des Einsatzes fetaler Zellen zu erwähnen. Darüber hinaus ist die Verwendung von bovinem Material in Deutschland nicht zugelassen.


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1.7 Aufgabenstellung

In der vorliegenden Arbeit sollten allogene Keratinozyten bezüglich ihrer MHC-I-Expression modifiziert werden, um ihre Immunogenität zu senken und sie im Bereich des Tissue Engineerings für einen transplantierbaren Hautersatz potentiell einzusetzen. Dieses Prinzip wäre dann übertragbar auf andere Zellen bzw. Gewebe.

Zu diesem Zweck sollten primäre, anti-MHC-I-Intrabody-exprimierende Keratinozyten generiert werden. Ziel dieser Intrabody-Expression war eine Verminderung der MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche. Das Potential der Intrabodies, eine Senkung der MHC-I-Oberflächenexpression zu bewirken, sollte im Vergleich mit anderen MHC-I-"downregulatorischen" Proteinen, wie dem adenoviralen p19-Protein untersucht werden. Darüber hinaus sollte die Funktionalität der Intrabodies unter proinflammatorischen Bedingungen, z.B. in der Gegenwart von Interferon-gamma, untersucht werden. Die modifizierten Keratinozyten dürften sich morphologisch und physiologisch nicht von untransfizierten Zellen unterscheiden. Des Weiteren sollten die Zellen bezüglich ihrer intrazellulären Anzahl an MHC-I-Molekülen untersucht werden, um den Wirkungsmechanismus der Intrabodies näher zu charakterisieren. Funktionell sollten zytotoxische T-Zellen gegenüber Intrabody-exprimierenden, MHC-I-defizienten Keratinozyten eine geringere lytische Aktivität zeigen als gegen untransfizierte Zellen. Das finale Ziel des Einsatzes Intrabody-exprimierender Keratinozyten war die Generierung transplantierbarer Hautstücke, die im Rattentransplantationsmodell eingesetzt werden sollten.


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