Busch, Annette: Minderung der allogenen Immunogenität künstlicher Gewebe am Modell Epithelien durch Suppression der MHC-I-Oberflächenexpression

32

Kapitel 2. Material

2.1 Allgemeine technische Geräte

Autoklav

Gössner, Hamburg

Eismaschine AF-10

Scotsman, Mailand, Italien

Gefrierschränke

Bosch, Stuttgardt

Glaswaren

Schott, Mainz

Kühlschränke

Liebherr, Ochsenhausen

pH-Meter PHM 62

wiss.-techn. Werkstätte, Weilheim

Pipetten

Pipettierhilfe Pipetboy plus

Tecnomara/Integra Biosciences, Fernwald

Feinpipetten Research

Eppendorf, Hamburg

Einwegpipetten (5ml, 10 ml, 25 ml)

Greiner, Nürtingen

Einweg-Pasteurpipetten

Greiner, Nürtingen

Schüttelinkubator Thermostat 5320

Eppendorf, Hamburg

Schüttler, Vortex MS2 Minishaker

IKA-Werke GmbH & Co KG, Staufen

Waagen

Sartorius, Göttingen

Wasserbad

GFL, Burgwedel

2.2 Geräte und Material für die Zellkultur

24-Well Multischalen

Falcon, Oxnard, USA

6-Well Multischalen

Falcon, Oxnard, USA

96-Well Rundbodenplatten

Nunc, Roskilde, Dänemark

Bestrahlungsanlage Gamma Cell 40

Atomic Energy, Mississauga, Canada

Durchflußzytometer FACSort

Becton Dicinson, San Jose, USA

Einfrierröhrchen

Nunc, Roskilde, Dänemark

Fluorenzenzmikroskop

Nikon, Tokyo, Japan

Fluorimeter Spectrafluor

Tecan, Crailsheim

Glas-Petrischalen

Nunc, Roskilde, Dänemark

Inkubationsschränke

Jouan, Unteraching

Kulturflaschen (50 ml, 250 ml)

Falcon, Oxnard, USA

Lichtmikroskop

Nikon, Tokyo, Japan

Magnetpartikelkonzentrator MPC-1

Dynal, Oslo, Norwegen


33

Neubauer Zählkammer

Fein-Optik, Blankenburg

Potter

Kontes Glass Co., Vineland, NJ, USA

Sterilwerkbänke

Heraeus, Hanau

Stickstofftanks

Taylor-Wharton, Theodore, AL, USA

Zellkulturschalen (10 cm und 14 cm Durchmesser)

Falcon, Oxnard, USA

Zellschaber

Falcon, Oxnard, USA

Zellsiebe, 40 und 100 µm Porendurchmesser

Becton Dicinson, San Jose, USA

Zentrifugen

Biofuge Fresco

Heraeus, Hanau

Centrikon T-324

Kontron, Neufahrn

Centrifuge 5402

Eppendorf, Hamburg

Megafuge 1.0

Heraeus, Hanau

2.3 Geräte und Material für die Molekularbiologie und Biochemie

96-Loch Flachbodenplatten für die Fluorimetrie

Dynatech Laboratories Ltd., Sussex, GB

Autoradiographiekassette

Amersham Buchler, Braunschweig

Blotting-Apparatur Semidry-Blotter (Fastblot)

Biometra, Göttingen

Chromatographie-Säule

Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden

Elektrophoresekammer, horizontal & Zubehör

Renner GMBH, Dannstadt

Gel-Imager & E.A.S.Y. Enhanced Analysis System

Herolab, Wiesloh

Heizblock

Kleinfedt Labortechnik Berlin

Heizrührer 502

Neolab, Heidelberg

Mikrowellengerät

Bosch, Stuttgart

Minigel-System für SDS-PAGE
(Glasplatten, Abstandshalter, Kämme)

Biometra, Göttingen

RNA/DNA Kalkulator GeneQuant II

Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden

Spannungsgerät Consort 835

AGS, Heidelberg

Termocycler 9600

Perkin Elmer, Branchburg, USA

Termocycler 9700

Perkin Elmer, Branchburg, USA

Vakuum-Zentrifuge Concentrator 5301

Eppendorf, Hamburg

2.4 Chemikalien

Acrylamid/Bisacrylamid Lösung 30%

Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Agar

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

Agarose

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

Ammoniumpersulfat (APS)

Merck, Darmstadt


34

Ampcillin

Merck, Darmstadt

b-Mercaptoethanol

Merck, Darmstadt

Bactotrypton

DIFCO, Detroit, USA

Borsäure

Merck, Darmstadt

Bovines Serum Albumin (BSA)

Sigma, Steinheim

Bromphenolblau

Serva, Heidelberg

Cäsiumchlorid

Sigma, Steinheim

Chloroquine

Sigma, Steinheim

Choleratoxin

Sigma, Steinheim

Dextransulfat MW 500.000

Fluka, Steinheim

Di-Kaliumhydrogenphosphat

Merck, Darmstadt

Diethyl-Pyrocarbonat (DEPC)

Sigma, Steinheim

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Serva, Heidelberg

DMRIE-CTM (1,2-dimyristyloxypropyl-3-
dimethyl-hydroxy ethyl ammonium

Life Technologies, Rockville, MA, USA

DTPA (Diethylentriamin-pentaessigsäure)

Aldrich, Steinheim

Dulbeco's MEM

Biochrom, Berlin

EN3HANCE-Lösung

NEN Life Science, Boston, USA

Enhancement-Solution DELFIA,
Verstärker-Lsg. für Europium

Wallac, Turku, Finnland

Essigsäure

Merck, Darmstadt

Ethanol

Baker Analyzed, Deventer

Ethidiumbromid

Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Ethyldiamin-Tetraessigsäure-Na-Salz (EDTA)

Sigma, Steinheim

Europiumchlorid

Sigma, Steinheim

fetales Kälberserum (FKS)

Seromed, Berlin

Geniticin (G-418 Sulfat)

Gibco-BRL, Gaithersburg, USA

Glasmilch, RNaid

Bio101, Carlsbad, CA, USA

Glukose

Sigma, Steinheim

Glycerol

Serva, Heidelberg

Guanidiniumthiocyanat

Gibco-BRL, Gaithersburg, USA

Hams F 12

Biochrom, Berlin

Hefeextrakt

Merck, Darmstadt

HEPES-Puffersubstanz

Sigma, Steinheim

Hydrocortison

Sigma, Steinheim

Insulin

Sigma, Steinheim

Interleukin-2, rekombinant

R&D Systems GmbH, Wiesbaden

Isopropanol

Baker Analyzed, Deventer

Kaliumchlorid

Merck, Darmstadt


35

Kaliumdihydrogenphosphat

Merck, Darmstdt

L-Glutamin

Sigma, Steinheim

Lipofectamin

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

Magermilchpulver

Becton Dicinson, San Jose, USA

Magnesiumchlorid

Baker Analyzed, Deventer

Marker, DNA-, 1kb

Gibco-BRL, Gaithersburg, USA

Marker, Protein-, multicolored wide range 6,5-205 kD

NEN Life Science, Boston, USA

Maus-EGF

R&D Systems GmbH, Wiesbaden

N,N,N',N'-Tetraethyldiamin (TEMED)

Serva, Heidelberg

N-Lauroylsarcosin

Sigma, Steinheim

N6-Monomethyl-L-Arginin-Monoazetat (L-NMMA)

Alexis Corporation, San Diego, USA

Natriumacetat-3-hydrat

Merck, Darmstadt

Natriumazid

Sigma, Steinheim

Natriumchlorid

Merck, Darmstdt

Natriumcitrat-2-Hydrat

Merck, Darmstadt

Natriumdeoxycholat

Sigma, Steinheim

Natriumdodecylsulfat (SDS)

Serva, Heidelberg

Natriumhydrogencarbonat

Merck, Darmstadt

Natriumpyruvat

Seromed, Berlin

Natronlauge, 1 M [NaOH]

Merck, Darmstadt

Noble-Agar

Sigma, Steinheim

Nonidet P-40

Sigma, Steinheim

Olinukleotide, synthetisch

metabion, Martinsried

OPTI-MEM™

Gibco-BRL, Gaithersburg, USA

Pancoll Rat

PAN Biotech, Aidenbach

Paraformaldehyd

Sigma, Steinheim

Penicillin-Streptomycin

Gibco BRL, Gaithersburg, USA

Phenol, Tris-gesättigt

Carl Roth GmbH, Karlsruhe

Phenylmethylsulfonsäure (PMSF)

Calbiochem, San Diego, USA

Piperazin-N,N'-bis-Ethansulfonsäure (PIPES)

Sigma, Steinheim

Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween 20)

Serva, Heidelberg

Protein-A Sepharose

Boehringer, Mannheim

RPMI 1640

Biochrom, Berlin

RPMI 1640, ohne Cystein

Gibco-BRL, Gaithersburg, USA

Salzsäure (HCL)

Merck, Darmstadt

Sephadex G25

Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden

Silica (Silikon Dioxid)

Sigma, Steinheim

Superfect™

Qiagen, Hilden

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris-Base)

Merck, Darmstadt

Triton X-100

Serva, Heidelberg

Xylencyanol

Serva, Heidelberg


36

Zeocin™

Invitrogen, Leek, Niederlande

Radioaktive Chemikalien

 

35S-Cystein

Amersham Buchler, Braunschweig

35S-Methionin

Amersham Buchler, Braunschweig

2.5 Enzyme

DNA-Polymerase, Vent™-Polymerase,
ThermoPol Buffer

New England Biolabs, Beverly, MA, USA

DNA-T4-Ligase

Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden

MMLV-Reverse Transkriptase, First strand buffer, DTT

Gibco-BRL, Gaithersburg, USA

Restriktionsenzyme

New England Biolabs, Beverly, MA, USA

Ribonuklease A

Boehringer, Mannheim

Ribonukleaseninhibitor (RNAsin)

Promega, Madison, USA

Streptavidin-Peroxidase (-POD)

Sigma, Steinheim

2.6 Versuchssysteme ("Kits")

Gel-Extraktions-Kit Jetquick

GENOMED, Bad Oeynhausen

in vitro Translationskit TNT™

Promega, Madison, USA

Kit für intrazell. FACS Färbungen Cytofix/Cytoperm

PharMingen, Hamburg

Plasmid-Präparations-Kit JetStar

GENOMED, Bad Oeynhausen

Ribonuklease A

Boehringer, Mannheim

2.7 Zelllinien

293, humane embryonale Nierenepithelzellen

DSMZ, Braunschweig

COS-1, Affen-Nierenfibrobrasten

ATCC, Rockville, MA, USA

F16-4-4-11, Hybridom (anti-RT1.A)

ECACC, Oxford, England

NBT-II, epitheliale Ratten-Tumorzellen

DSMZ, Braunschweig

NRK-52E, epitheliale Ratten-Tumorzellen

DSMZ, Braunschweig

OX-18, Hybridom (anti-RT1.A)

ECACC, Oxford, England


37

2.8 Antikörper

Spezifität

Klon

Markierung

Isotyp

Quelle

CD46, human

122-2

-

Maus IgG1

Dianova, Hamburg

CD49b, human

AK 7

-

Maus IgG1

Dianova, Hamburg

CD49d, human

44H6

-

Maus IgG1

Dianova, Hamburg

CD58, human

BRIC 5

-

Maus IgG1

Dianova, Hamburg

ICAM-1, Ratte

1A/27

-

Maus IgG1

BD/PharMingen, SanDiego, USA

pan-HLA-A,-B,-C

G46.2.6

FITC

Maus IgG1

BD/PharMingen, SanDiego, USA

pan-HLA-A,-B,-C

G46.2.6

PE

Maus IgG1

BD/PharMingen, SanDiego, USA

pan-HLA-A,-B,-C

G46.2.6

-

Maus IgG1

BD/PharMingen, SanDiego, USA

pan-RT1.A

OX-18

-

Maus IgG1

BD/PharMingen, SanDiego, USA

pan-RT1.A

F16-4-4-11

-

Maus IgG1

ECACC, Oxford, England

pan-RT1.B

OX-6

-

Maus IgG1

BD/PharMingen, SanDiego, USA

2.9 Rattenstämme

DA, Haplotyp: RT1avl

M&B A/S, Dänemark

Lewis, Haplotyp: RT1l

M&B A/S, Dänemark

2.10 Bakterienstämme

SCS110

rpsL (Strr) thr leu endA thi-1 lacY galK galT
ara tonA tsx dam dcm supE44 Delta(lac-proAB)
[F' traD36 proAB laclq ZDeltaM15]

Stratagene, La Jolla, USA

SURE

e14-(McrA-) Delta(mcrCB-hsdSMR-mrr) 171
endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recB
recJ sbcC umu::Tn5(Kanr) uvrC [F' proAB lacq
Z
DeltaM15 Tn10(Tetr)]

Stratagene, La Jolla, USA

XL-1 Blue MRF'

Delta(mcrA) 183 Delta(mcrCB-hsdSMR-mrr) 173
endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac
[F' proAB laclq/ ZDeltaM15 Tn10(Tetr)]

Stratagene, La Jolla, USA


38

2.11 Expressionsvektoren

Plasmid

Promoter

Säugetier

Selektionsmarker

Herkunft

 

 

 

E. coli

 

pACC

CMV

-

Amp

Dr. Kolls, New Orleans, USA

pcDNA3.1

CMV

Neo

Amp

Invitrogen, Leek, Niederlande

pcDNA3.1-Zeo (+)

CMV

Zeo

Amp, Zeo

Invitrogen, Leek, Niederlande

pCMV-F105GPI

CMV

Neo

Amp

Si Chen, Boston, USA

pEGFP-N2

CMV

Neo

Amp, Kan

CLONTECH, Palo Alto, USA

pIRES-EGFP

CMV

Neo, EGFP

Amp

CLONTECH, Palo Alto, USA

pJM17

(Ad5 Helferplasmid)

Amp

Dr. Kolls, New Orleans, USA

2.12 Allgemeine Plastikwaren

Einwegpipetten

Greiner, Nürtingen

Pipettenspitzen (10 µl, 100 µl, 200 µl, 1 ml)

Greiner GmbH, Frickenhausen

Polypropylenröhrchen (15 ml, 50 ml)

Falcon, Oxnard, USA

Polystyrolröhrchen (10 ml),

Greiner GmbH, Frickenhausen

Reaktionsgefäße (0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml)

Eppendorf, Hamburg

2.13 Sonstiges Verbrauchsmaterial

3MM-Whatman-Papier

Schleicher & Schuell, Dassel

Nitrozellulose-Membran

Schleicher & Schuell, Dassel

Röntgenfilm

Kodak, Chalon, Frankreich

Röntgenfilmentwicker und -fixierer

Kodak, Chalon, Frankreich

Sterilfilter (0,2 µm, 0,45 µm)

Schleicher & Schuell, Dassel


39

2.14 Allgemein verwendetete Puffer

PBS

8 g NaCl

0,2 g KCl

1,44 g Na2HPO4

0,24 g KH2PO4

in 1 l Aqua dest., pH 7,4

DEPC Wasser

0,5 ml DEPC

ad 500 ml H2O

schütteln und autoklavieren

50xTAE

2 M Tris-Base

0,05 M EDTA

mit Essigsäure auf pH 8,0

10× TBE

0,89 M Tris-Base

0,89 M Borsäure

0,02 M EDTA

DNA-Probenpuffer

5 ml Glycerol

1 ml 10× TBE

50 µl 10% Bromphenolblau

50 µl 10% Xylencyanol

4 ml H2O


40

2.15 Medien für die Kultur eukaryotischer Zellen

Keratinozytenmedium nach Green

1 mM

Natriumpyruvat

2 mM

L-Glutamin

100 U/ml

Penicillin

100 µg/ml

Streptomycin

5 µg/ml

Insulin

1 nM

Choleratoxin

0,4 µg/ml

Hydrocortison

10 ng/ml

Maus-EGF

10%

FKS

 

in DMEM/HAM's F12 (3:1)

Medium für die Gemischte Lymphozytenkultur

2 mM

L-Glutamin

100 U/ml

Penicillin

100 µg/ml

Streptomycin

5 mM

beta-Mercaptoethanol

1 mM

\|[Lgr ]\|-\|[Ngr ]\|\|[Mgr ]\|\|[Mgr ]\|\|[Agr ]\|

10%

FKS

2%

autologes Serum

 

in RPMI 1640

Medium für dden Zytotox-Test

2 mM

L-Glutamin

100 U/ml

Penicillin

100 µg/ml

Streptomycin

5 mM

beta-Mercaptoethanol

10%

FKS

 

in RPMI 1640

Medium für die Kultur von OX-18 und F16-4-4-11 Zellen

2 mM

L-Glutamin

100 U/ml

Penicillin

100 µg/ml

Streptomycin

10%

FKS

in RPMI 1640


41

Medium für die Kultur von NBT-II, NRK-52E, COS-1 und 293-Zellen

2 mM

L-Glutamin

100 U/ml

Penicillin

100 µg/ml

Streptomycin

1 mM

Natriumpyruvat

10%

FKS

 

in DMEM


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