Busch, Annette: Minderung der allogenen Immunogenität künstlicher Gewebe am Modell Epithelien durch Suppression der MHC-I-Oberflächenexpression

42

Kapitel 3. Methoden

3.1 Überblick über die Abfolge derangewendeten Methoden

Synthese der MHC-I-"downregulatorischen" Proteinen via PCR [ 0 ]

a) Ox18sFv, Ox18Fab: anti-Ratten-MHC-I-Intrabody [ 0 + 0 ]

b) 8KsFv: anti-human-MHC-I-Intrabody [ 0 ]

c) p19: Adenovirus E3-Protein p19 [ 0 ]

darr

Klonierung der MHC-I-"downregulatorischen" Proteine in Expressionvektoren] [ 0 ]

a) Expression von Gen x allein

b) bicistronische Vektoren: duale Genexpression von Gen x und GFP

c) GFP-Fusionsprotein: Fusionsprotein aus Gen x und GFP

darr

Expression der MHC-I-"downregulatorischen" Proteine in vitro

a) in vitro-Translation [ 0 ]

b) transiente Expression in COS-1 Zellen und 293-Zellen [ 0 + 0 ]

c) stabile Expression in primären Rattenkeratinozyten und diversen Ratten-Zelllinien durch Zeocin- bzw. G418-Selektion [ 0 + 0 ]

d) Expression durch Adenovirus-Infektion in primären humanen Keratinozyten [ 0 ]

darr

Nachweis der intrazellulären Expression der MHC-I-"downregulatorischen" Proteine

a) Immunopräzipitation [ 0 ]

b) indirekter Nachweis über Grünfluoreszenz des GFP-Fusionsproteins bzw. bicistronisch exprimierten GFP im Fluoreszenzmikroskop und Durchflusszytometer

darr

Analytik der Intrabody-exprimierenden Zellen

a) Quantifizierung der intra- und extrazellulären MHC-I-Expression durch FACS-Analyse [ 0 + 0 ]

b) Untersuchung der Expression anderer Oberflächenmoleküle durch FACS-Analyse [ 0 ]

darr

Untersuchung der Immunogenität von Intrabody-exprimierenden Zellen in vitro

Zytotoxizitäts-Test mit Rattenkeratinozyten als Targets [ 0 ]

darr

Untersuchung der Immunogenität von Intrabody-exprimierenden Zellen in vivo

Generierung von Ratten-Hautstücken aus Primär-Keratinozyten und Transplantation im Rattenmodell [ 0 + 0 ]


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3.2 Molekularbiologische Methoden

Soweit nicht anders vermerkt, wurden die Methoden entsprechend den Protokollen molekularbiologischer Handbücher [ 161 , 162 ] durchgeführt.

3.2.1 Synthese der MHC-I-"downregulatorischen" Konstrukte

Es wurden folgende Konstrukte synthetisiert, mit bzw. ohne KDEL-Retentionssequenz:

3.2.1.1 Ox18Fab-Intrabodies

Ausgangsmaterial für die anti-Ratten-MHC-I-Intrabodies war die mRNA des OX-18 Hybridoms. Zunächst wurde die gesamt-mRNA aus den Zellen präpariert, danach die VHCH1- bzw. VLCL-Domänen des OX-18-Antikörpers mittels PCR amplifiziert und in den bicistronischen Vektor pCMV-F105GPI (vgl. Abb. 6 ) [ 163 ] mit den Restriktionsenzymen Asc I/Not I und Nhe I/Pac I kloniert.

Abb. 6: Bicistronischer Expressionsvektor pCMV-F105GPI mit IRES-Sequenz (intraribosomal entry site) für die Expression der zweiten Kassette.


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3.2.1.2 Ox18sFv-Intrabodies

Ausgehend von dem Konstrukt pCMV-Ox18Fab wurden die variablen Domänen reamplifiziert und durch eine Assemblierungs-PCR (vgl. Abschnitt 0 ) zusammengefügt. Das Konstrukt wurde anstelle der Fab-Sequenz (inklusive IRES) in den vorhandenen Vektor pCMV-Ox18Fab kloniert.

Ferner wurde das Konstrukt nach zweimaliger Reamplifikation mit den Primern A+J und A+K in den Vektor pIE-8KsFv kloniert, welcher in der zweiten Kassette das "Enhanced Green Fluoresent Protein" (EGFP) zur Visualisierung und Selektion exprimierender Zellen enthält. Dabei wurden die Sequenzen für das myc-Epitop (zur Detektion des Proteins durch entsprechende Antikörper) und die KDEL-Retentionssequenz eingeführt.


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Des Weiteren wurde das Fusionsprotein Ox18sFvGFP synthetisiert. Dies wurde nach Reamplifikation mit den Primern A und L anstelle des p19-Proteins in den bereits vorhandenen Vektor pIE-p19 kloniert.


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3.2.1.3 Adenovirus p19

Das adenovirale E3-Protein p19 wurde als GFP-Fusionsprotein kloniert. Hierzu wurde zunächst die EGFP-Sequenz aus dem Vektor pEGFP-N2 mit den Primern M und N amplifiziert und in den Vektor pcDNA3.1-Zeo(+) kloniert. Anschließend wurde aus der Adenovirus-Typ-2-DNA das p19-Protein amplifiziert und im Leseraster vor die GFP-Sequenz kloniert.

Für den bicistronischen Expressionsvektor wurde das 8KsFv-Konstrukt aus dem Vektor pIE-8KsFv (vgl. Abschnitt 0 ) herausgeschnitten und durch das mit dem Primern O und Q reamplifizierte p19-Protein ersetzt.

3.2.1.4 8KsFv-Intrabodies

Der Intrabody wurde von Wayne Marasco, Boston in dem Vektor pRC/CMV (Invitrogen) zur Verfügung gestellt. Nach zweimaliger Reamplifikation mit den Primern R+J und R+K wurde er in den bicistronischen Vektor pIRES-EGFP (Clontech) kloniert.

Für das GFP-Fusionsprotein wurde die p19-Sequenz im Vektor pZeo-p19GFP durch den Intrabody (nach Reamplifikation mit Primern S und T) ersetzt.

Für das Adenovirus-Konstrukt wurde der Intrabody mit den Primern U und V reamplifiziert und in den Vektor PACCMV [ 164 ] kloniert. Anschließend wurden 293-Zellen, die Adenovirus-Verpackungsproteine zur vollständigen Synthese infektiöser Viruspartikel zur Verfügung stellen, mit dem Vektor pACCMV-8KsFv und dem adenoviralen Plasmid pJM17 [ 165 ] kotransfiziert. Durch die homologe Rekombination beider Plasmide entstehen replikationsdefekte adenovirale Genome. Nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten, wurden sie mit 1,3 % Noble-Agar überschichtet und weiter bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert.


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Nach 10 bis 14 Tagen bildeten sich Plaques, welche gepickt und weiter mit Hilfe von 293-Zellen vermehrt wurden. Hierzu wurden die Zellen nach Eintreten des zytopatischen Effekts geerntet und die Viruspartikel durch fünfmaliges Frieren-Tauen isoliert. Anschließend erfolgte die Aufreinigung über einen CsCl-Gradienten (zweimal) und die Entsalzung des rekombinanten Virus über Sephadex G25-Säulen. Um die Konzentration der Viruslösung zu bestimmen wurden 293-Zellen mit unterschiedlichen Verdünnungen an Virus infiziert und die durch die Viren gebildeten Plaques je Kulturschale gezählt. Die Viruslösung wurde bis zur Verwendung in Viruspuffer bei -70 °C gelagert. Bestimmung der Viruskonzentration:

Die Konzentration des aufgereinigten Ad-8KsFv betrug 1 × 1011 pfu/ml. Sämtliche Aufreinigungsschritte wurden von Heinz Tanzmann durchgeführt.

3.2.2 mRNA Isolierung

Alle Isolierungsschritte werden prinzipiell auf Eis durchgeführt. Um eine Kontamination mit den ubiquitär vorkommenden Ribonukleasen zu vermeiden, wurden alle Verbrauchsmaterialien autoklaviert und alle Lösungen mit DEPC-Wasser angesetzt und autoklaviert.

5 × 106 Zellen wurden nach dem Waschen in PBS abzentrifugiert (250 × g, 5', RT) und sofort auf Eis mit eiskaltem Lysispuffer D versetzt.

Lysispuffer D

0,7 % Natriumcitrat-2-Hydrat

47,3 % Guanidiniumthiocyanat

0,5 % N-Lauroylsarcosin

Nachfolgend wurden

0,1× Volumen 2M Na-Acetat, pH 4,0

1× Volumen Phenol

0,2× Volumen Chloroform/Isoamylalkohol 24:1


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zugegeben und durch kräftiges Schütteln auf dem Vortex-Schüttler aufgeschlossen. Nach 15' Inkubation auf Eis wurden die Zelltrümmer bei 14.000 UpM 20' bei 4 °C abzentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde wieder mit

0,1× Volumen 2M Na-Acetat, pH 4,0

1× Volumen Phenol

0,2× Volumen Chloroform/Isoamylalkohol 24:1

versetzt, gemischt, 15' inkubiert und bei 14.000 UpM 20' bei 4 °C zentrifugiert. Anschließend wurde zur oberen wässrige Phase 10 µl Glasmilch gegeben und die Probe 5' bei Raumtemperatur bei zeitweiligem Mischen inkubiert. Die an die Glasmilch gebundene Gesamt-RNA wurde dann durch einminütige Zentrifugation pelletiert und zweimal mit 1 ml 80 %igem Ethanol gewaschen. Nachfolgend wurde das Pellet in einer Vakuum-Zentrifuge getrocknet und zweimal mit 15 µl DEPC-Wasser bei 55 °C für 5' eluiert. Zur Visualisierung von intakter RNA wurde ein Aliquot von 2 µl gelelektrophoretisch über ein 0,8 %iges Agarose-Gel (in TBE) aufgetrennt und die Konzentration photometrisch bestimmt.

3.2.3 Reverse Transkription von RNA

Es wurden 2 µg RNA in 20 µl H2O vorgelegt. Dann wurde die Probe 5' auf 72 °C erhitzt, um eventuell vorhandene Tertiärstrukturen aufzuheben, auf Eis abgekühlt und 40 µl cDNA-Mix zugegeben. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch 10' bei Raumtemperatur inkubiert (Anlagerung der Primer), dann 75' bei 42 °C (Umschreibung in cDNA) und nachfolgend 10' bei 95 °C (Inaktivierung des Enzyms). Der Zyklus wurde mit 4 °C beendet.

40 µl cDNA-Mix

8 µl First strand buffer (5×)

4 µl dNTP (final = 250 µm je Nukleotid)

4 µl oligo-dT-Primer (= 10 pmol)

1 µl RNAsin

1 µl Reverse Transkriptase

4 µl DTT (final = 3 mM)

ad 40 µl DEPC-Wasser


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3.2.4 PCR-Reaktion

25 µl oder 50 µl Reaktionsmix wurde entsprechend den Angaben des Herstellers pipettiert. Es wurde grundsätzlich mit der Polymerase Vent™ (New England Biolabs) gearbeitet, da diese eine Proof-Reading-Eigenschaft besitzt. Primerpaare zur Amplifikation können Abschnitt 0 entnommen werden. Reverse Primer für den c-Terminus des Proteins enthalten wahlweise die KDEL-Retentionssequenz, die Proteine im ER zurückhält.

PCR-Ansatz

10 pmol 3'-Primer

10 pmol 5'-Primer

16 U/ml Vent™ Polymerase

je 0,1 µM dNTP

in 1× TermoPol Buffer (enthält MgCl2)

Die angegebenen Bedingungen konnten für alle PCR-Reaktionen mit einer Variation von 30 - 35 Zyklen angewendet werden.

Reaktionsbedingungen (A):

Denaturierung 5' 94 °C

30 Zyklen à

(Denaturierung) 30'' 94 °C

(Primeranlagerung) 30'' 55 °C (oder höher, entsprechend des eingesetzten Primers)

(Polymerisation) 30'' 72 °C

End-Polymerisation 7' 72 °C


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Reaktionsbedingungen für die Assemblierungs-PCR (overlap-extension; B):

Ansatz : Templates Ox18-VH, -VL, Primer F+G (vgl. Abschnitt 0 ), dNTP, Vent, ThermoPol Buffer

Denaturierung 5' 94 °C

7 Zyklen à

(Denaturierung) 2' 94 °C

(Primeranlagerung) 30'' 72 °C

End-Polymerisation 7' 72 °C

Anschließend wurden Primer A und H bzw. I zugegeben und das PCR-Programm unter normalen Reaktionsbedingungen (A) durchlaufen.

Beim Einsatz degenerierter Primer, wie für die Amplifikation der polymorphen Leadersequenzen von Immunoglobulinen benötigt, wurde zwischen Denaturierung und Anlagerung der Primer eine 60-sekündige Rampe geschaltet, d.h. die Anlagerung erfolgte langsamer, bei allmählich sinkender Temperatur.

3.2.5 Klonierung der Konstrukte in Expressionsvektoren

Der Restriktionsverdau der PCR-Fragmente und der Plasmide erfolgte nach Angaben des Herstellers. Alle Restriktionsendonukleasen wurden von dem Hersteller New England Biolabs (NEB) bezogen.

Die Aufreinigung der Fragmente aus Agarose-Gelen wurde mit Hilfe des Gel-Extraktionskits Jetquick von Genomed über sogenannte spin columns durchgeführt. Es wurde nach Angaben des Herstellern verfahren.

3.2.5.1 Auftrennung der DNA-Fragmente durch horizontale Agarosegelelektrophorese

Da die Auftrennung der PCR-Amplifikate sowohl von deren Länge, als auch von der Polymerisationsdichte der Agarose abhängig ist, wurden je nach der Länge der erwarteten Fragmente Gele mit einem Agarosegehalt zwischen 0,8 % und 1,2 % hergestellt. Die Agarose wurde in einem entsprechenden Volumen 1× TAE-Puffer durch 2-3 minütiges Kochen in der Mikrowelle vollständig gelöst. Nach Abkühlen der Lösung auf ca. 50-60 °C wurde die Lösung mit Ethidiumbromid (ca. 20 µg EB/100 ml) versetzt und in ein gekühltes Gelbett mit Kamm


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für die Auftragstaschen gegossen. Nach Erstarren des Gels wurde der Kamm entfernt und das Gel so in die Elektrophoresekammer überführt, dass das Gel vollständig mit TAE-Puffer bedeckt war. Die aufzutragenden Proben (ca. 15-20 µl) sowie ein DNA-Molekulargewichtsmarker (1 kb-Leiter) wurden mit 1/10 Volumen des bromphenolblauhaltigen Probenpuffers versetzt und quantitativ in die Taschen überführt. Nach der elektrophoretischen Trennung wurden die DNA-Fragmente mit UV-Licht anhand des fluoreszierenden, interkalierten Ethidiumbromids detektiert. Zur Dokumentation wurde bei Anregung der Fluoreszenz auf einem Transilluminator (lambda = 254 nm) mit einer Videokamera über das E.A.S.Y.-System (HeroLab) ein digitalisiertes Bild erzeugt und ausgedruckt.

3.2.5.2 Herstellung kompetenter Zellen

Zunächst wurde eine Vorkultur von Bakterien über Nacht angelegt. Diese Vorkultur wurde 100-fach in 500 ml LB-Medium verdünnt und bei 37 °C bis zu einer Zelldichte entsprechend einer Absorption von O.D.600 nm = 0,5 bei 220 UpM geschüttelt. Die Zellen wurden nach Erreichen dieser Zelldichte für 5' auf Eis inkubiert, anschließend durch Zentrifugation (2500 × g, 5', 4 °C) geerntet, und das Zellsediment mit 40 ml eiskaltem Ca/Glycerol-Puffer gewaschen und anschließend wieder in 40 ml eiskaltem Ca/Glycerol-Puffer resuspendiert. Nach einer Inkubation auf Eis für 30' wurden die Zellen erneut zentrifugiert, anschließend erneut in 12 ml eiskaltem Ca/Glycerol-Puffer resuspendiert, aliquotiert und bei -80 °C gelagert.

Ca/Glycerol-Puffer

100 ml 0,6 M CaCl2

20 ml 0,5 M PIPES pH 7,0

730 ml H2O

3.2.5.3 Transformation von Bakterien

Nach Auftauen der kompetenten Zellen (100 µl) auf Eis wurden 1 bis 100 ng DNA zu der Zellsuspension gegeben und für 15' auf Eis inkubiert. Danach erfolgte für 2' ein Hitzeschock bei 42 °C und eine erneute Inkubation auf Eis. Nach Zugabe von 1 ml LB-Medium wurden


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die Bakterien für 1h bei 37 °C inkubiert, 50 - 100 µl der Suspension direkt auf LB-Ampicillin-Agar ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

3.2.5.4 Präparation von Plasmid-DNA: "Maxiprep"-Methode

Größere Mengen an DNA ("Maxiprep") wurden mit Hilfe des JetStar Extraktionskit (Genomed) aufgereinigt. Es wurde nach den Angaben des Herstellers verfahren.

Zur Konzentrationsbestimmung wurde die optische Dichte (O.D.) bei einer Wellenlänge von 260 nm im Pharmacia GeneQuant RNA/DNA-Calculator mittels einer Quarzküvette mit einer Schichtdicke von d = 1 cm bestimmt. Die Konzentration der DNA [ 161 , 162 ] berechnete sich aus der Formel

3.2.5.5 Präparation von Plasmid-DNA: "Miniprep"-Methode

Zur Präparation geringer Mengen an DNA wurde in Anlehnung an die Methode von J.D. Brown [ 166 ] verfahren.

Hierfür werden zunächst 2 ml einer Übernacht-Bakterienkultur bei 14.000 UpM für 1' in einer Mikrozentrifuge pelletiert und der Überstand dekantiert. Anschließend werden die Zellen in 200 µl Resuspensionslösung P1 resuspendiert und weitere 200 µl Lyse-Lösung P2 zugegeben. Die Probe wird durch mehrmaliges Invertieren vorsichtig gemischt und bei Raumtemperatur 5' inkubiert. Danach werden 200 µl Neutralisierungslösung P3 zugegeben, die Probe durch kräftiges Schütteln gemischt und 5' abzentrifugiert. Im Anschluß an die Zentrifugation wird der Überstand in ein neues Gefäß überführt und mit 200 µl Silica-Suspension versetzt und vermischt. Die an die Glasmilch gebundene DNA wird im folgenden Schritt für 1' abzentrifugiert und einmal mit 500 µl Waschlösung gewaschen. Die Waschlösung wird nach Zentrifugation mittels Vakuumpumpe abgesaugt und das Pellet in einer Vakuumzentrifuge für 5' getrocknet. Zur Elution der DNA werden 42 µl H2O zugegeben, bei 55 °C für 2' inkubiert und nach einminütiger Zentrifugation 38 µl davon in ein neues Gefäß mit 10 µl 500 µg/ml Ribonuklease A transferiert.


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3.3 Immunochemische Methoden

3.3.1 in vitro-Translation im TNT™ Retikulozytenlysat

Ox18Fab (schwere und leichte Kette) in pCMV wurde im TNT™ Retikulozytenlysat nach dem Protokoll von Promega transkribiert und translatiert. Die Transkription erfolgte mit der T7-Polymerase unter Zugabe von 35S-Methionin (10 mCi/ml) in einem 10 µl Reaktionsansatz bei 30 °C für 90'. Für die post-translationale Analyse wurden die translatierten Proteine über ein 12,5 %iges Polyacrylamidgel (Acrylamid-Bisacrylamid) in der SDS PAGE Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Autoradiographie detektiert.

3.3.2 Immunopräzipitation

Die Immunopräzipitation radioaktiv-markierter Proteine wurde für die Detektion der schweren und leichten Kette des Ox18Fab-Fragments am Dana-Farber Cancer Institute in Boston durchgeführt. Zur Expression der Proteine wurden COS-1 Zellen mit der DEAE-Dextran Transfektionsmethode (vgl. Abschnitt 0 ) transfiziert.

Sich in der logarithmischen Wachstumsphase befindende COS-1 Zellen wurden 48-60h nach Transfektion dreimal mit PBS gewaschen und für 3h mit 5 ml Cystein-freiem (antibiotikahaltigem, serumfreien) RPMI bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden 100 µCi 35S -Cystein zugegeben und die Zellen weitere 3h inkubiert.

Es wurden zwei Proben anti-Maus-IgG-Sepharose vorbereitet: eine zur Präzipitation des Zelllysats und eine zur Präzipitation des Überstands. 1h vor Ablauf der Inkubationszeit wurden bei der anti-Maus-IgG-Sepharose unspezifische Bindungsstellen abgesättigt. Hierfür wurde die anti-Maus-IgG-Sepharose zweimal mit je 750 µl PBS und einmal mit 4 % BSA (in PBS) gewaschen. Die gewaschene Sepharose wurde darauf wieder mit 700 µl 4 % BSA für 30' bei 4 °C unter Schütteln inkubiert. Danach wurde, nach Zentrifugation und Abnahme des Überstands, das Lysat bzw. der Überstand nicht-radioaktiver, untransfizierter COS-1 Zellen zugegeben und der Ansatz 30' bei 4 °C inkubiert.

Für die Lyse wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen, 1 ml eiskalter RIPA-Puffer mit Protease-Inhibitor zugegeben und 10' bei 4 °C inkubiert. Die Zellen wurden nach der Inkubation mit einem Zellschaber abgelöst, in ein Reaktionsgefäß überführt und 10'' bei höchster Stufe auf dem Vortex-Schüttler aufgeschlossen. Abschließend wurden die Zelltrümmer für 3' bei maximaler Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge abzentrifugiert und das Lysat überführt.


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Im folgenden Schritt wurden die radiokativ-markierten, Ox18Fab-transfizierten COS-1 Zellen nach obiger Beschreibung lysiert. Das Lysat wurde mit 60 µl, der Überstand (5 ml) mit 75 µl der vorbehandelten anti-Maus-IgG-Sepharose versetzt und bei 4 °C über Nacht unter Schütteln inkubiert.

Am nächsten Tag wurde die Sepharose fünfmal mit RIPA-Puffer gewaschen, wobei sie nach dem ersten Waschschritt in ein neues Reaktionsgefäß überführt wurde. Danach wurde sie zweimal mit H2O gewaschen. Der Überstand wurde bis auf ca. 50 µl verworfen. Abschließend wurde 50 µl SDS-Probenpuffer (vgl. Abschnitt 0 ) zugegeben, die Probe 5' bei 100 °C gekocht und auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen.

Nach Auftrennung der Proteine im Polyacrylamid-Gel wurde das Gel für die Autoradiographie vorbereitet. Hierzu wurde es 30' in 50 % Ethanol, 10 % Eisessig fixiert, 20' mit EN3HANCE-Lösung inkubiert, dreimal mit H2O gewaschen und 30' in 2 % Glycerol inkubiert. Abschließend wurde es im Geltrockner unter Vakuum für 1h bei langsam ansteigender Temperatur bis zu 72 °C auf einen Filter getrocknet. Der Filter mit dem aufgetrockneten Gel wurde dann auf einen Röntgenfilm gelegt, über Nacht bei -70 °C gelagert und entwickelt.

Reagenzien für die Immunopräzipitation:


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3.3.3 SDS-PAGE Gelelektrophorese

Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde entsprechend der Vorschrift nach Laemmli [ 167 ] durchgeführt. Die Proteinproben wurden im Verhältnis 1:1 mit Probenpuffer verdünnt und nach 5' Kochen in die Probentasche aufgetragen.

Die Proteinproben wurden zunächst im Sammelgel bei 10 mA für 10', danach im Trenngel bei einer konstanter Stromstärke von 25 mA für ca 90' aufgetrennt.

Reagenzien für die Mini-Gel-Apparatur (Biometra):

3.4 Methoden der Durchflusszytometrie

3.4.1 Oberflächenmarkierung mit Antikörpern für die Durchflusszytometrie

Die benötigte Antikörper-Menge zur Oberflächenmarkierung der Zellen wurde für jeden Antikörper zuvor austitriert. Im Durchschnitt wurden ca. 5 × 105 /50 µl Zellen mit 0,5 µg /20 µl Antikörper-Lösung für 20' bei 4 °C inkubiert. Die Zellen befanden sich entweder in Wachstumsmedium (z.B. DMEM) mit = 2 % FKS oder in FACS-Puffer. Anschließend wurde mit 1 ml FACS-Puffer aufgefüllt und bei 200 × g bei 4 °C für 4' zentrifugiert. Der Überstand wurde bis auf ca. 50 µl abgenommen und die Zellen durch Zugabe von 150 µl


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Paraformaldehyd-Lösung fixiert. Die fixierten Zellen können bis zur FACS-Analytik (vgl. Abschnitt 0 ) maximal Tage bei 4 °C gelagert werden.

Beim Einsatz eines unmarkierten Antikörpers wurde nach der Zentrifugation ein fluoreszenzmarkierter sekundärer Antikörper (0,5 µg /50 µl) zugegeben und obige Inkubations- und Waschprozedur wiederholt. Die Zellen wurden wie bei der primären Färbung fixiert.

Alle Zentrifugationsschritte für die extra- und intrazelluläre FACS-Färbung wurden bei 200 × g bei 4 °C für 4' durchgeführt.

Reagenzien für die FACS-Färbung

3.4.2 Intrazelluläre Färbung mit Antikörpern für die Durchflusszytometrie

Zur Färbung von intrazellulär lokalisierten MHC I-Molekülen wurde der Cytofix/Cytoperm-Kit von PharMingen eingesetzt. Um eine Anfärbung der Oberflächen-MHC-Moleküle zu vermeiden, wurden diese entweder zuvor durch Papainverdau abgespalten oder durch FITC-markierte anti-MHC-I-Antikörper vollständig besetzt (siehe Oberflächenmarkierung Abschnitt 0 ). Die Färbung der intrazellulären MHC I-Moleküle erfolgte dann mit dem gleichen, in einer geringeren Konzentration eingesetzten, PE-markierten Antikörper, so dass eine Verdrängung des FITC-markierten Antikörpers gewährleistet war.

Zur Färbung wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und in 200 µl Cytofix/Cytoperm-Lösung resuspendiert und für 20' bei 4 °C inkubiert. Anschließend wurden sie mit 1 ml Perm-Wash-Lösung gewaschen und mit 0,5 µg /50 µl (bei Papainverdau) bzw. 0,2 µg /50 µl anti-MHC I (in Perm-Wash-Lösung) für 30' bei 4 °C inkubiert. Danach wurden die Zellen mit 1 ml Perm-Wash-Lösung gewaschen und in 150-200 µl PBS resuspendiert und analysiert.

Die Zellen können bis zur FACS-Analytik ca. fünf Tage bei 4 °C gelagert werden.


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3.4.2.1 Papainverdau von Oberflächenmolekülen

Um die MHC-I-Moleküle von der Zelloberfläche zu entfernen und so nur noch die intrazellulär exprimierten Moleküle markierbar zu machen, wurden die Zellen mit Papain behandelt. Hierzu wurden die Zellen für 30' mit Papainlösung bei 37 °C inkubiert, zweimal mit serumhaltigem Medium gewaschen und für die intrazelluläre Färbung eingesetzt.

3.4.3 FACS-Analytik

Die Messung der Zellen erfolgte an einem FACSort Durchflusszytometer (Becton Dicinson). Für die in dieser Arbeit enthaltenen Grafiken wurden die Messdaten mit der Software FlowJo (Tree Star) ausgewertet, generell jedoch mit Hilfe der Cellquest-Software (Becton Dicinson).


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3.5 Methoden der Zellkultur

3.5.1 Kultivierung von eukaryotischen Zellen

Alle Zelllinien wurden nach Standardprotokollen [ 168 ] kultiviert. Die Kultur von primären Keratinozyten ist in Abschnitt 0 aufgeführt. Die Zusammensetzung der Medien für die einzelnen Zelllinien oder Primärzellen ist dem Abschnitt 0 zu entnehmen.

3.5.2 Etablierung einer primären Keratinozytenkultur

Die Isolierung und Anzucht der Rattenkeratinozyten wurde von Elke Effenberger durchgeführt. Als Ausgangsmaterial für die Isolierung wurden die Ohren von DA-Ratten verwendet. Das Ohr wurde mit Pinzetten gespalten, in kleinere Stücke zerschnitten und dann in einer Glas-Petrischale über Nacht in 0,25 % Trypsin, 0,1 % EDTA bei 4 °C trypsiniert. Am nächsten Tag wurde die Dermis von der Epidermis mit einer Pinzette abgezogen und verworfen. Das verbleibende Epidermisgewebe wurde in Trypsin/EDTA-Lösung für ca. 5' vorsichtig pipettiert und anschließend durch sterile Nylon-Zellsiebe (100 µm Porendurchmesser) in ein steriles 15-ml-Röhrchen überführt. Der Trypsinverdau wurde mit einem äquivalenten Volumen an FKS abgestoppt und die Zellen bei 250 × g für 5' abzentrifugiert. Abschließend wurden die Zellen in Keratinozytenmedium (vergl. Abschnitt 0 ) aufgenommen und in Kulturflaschen in einer Zelldichte von 1 × 105 Zellen /cm2 zusammen mit NIH3T3-Fibroblasten als Feederzellen ausgesät. Nach 48h waren bereits adhärente Zellen mit typischer polygonaler Form ("Pflastersteine") als kleine Zellnester zu erkennen. Der Nachweis, dass es sich tatsächlich um Keratinozyten handelte wurde durch Anfärbung mit anti-Keratin-Antikörpern erbracht.

Das Passagieren der stark adhärenten Zellen erfolgte alle 3 - 4 Tage mit einer relativ hohen Trypsin/EDTA-Konzentration von 0,25 % Trypsin und 0,1 % EDTA, was der fünffachen Menge der normal eingesetzen Konzentration zum Ablösen von Zellen entspricht. Der Verdau erfolgte für 15' bei 37 °C. Anschließend wurden die Zellen im Verhältnis von 1:3 umgesetzt. Ein Waschschritt war dabei nicht notwendig. Die Anzahl der möglichen Passagen war bei den ca. 50 durchgeführten Präparationen sehr unterschiedlich. Einige Kulturen konnten nur bis zu wenigen Passagen kultiviert werden, andere bis zu über 100 Passagen - bei gleichbleibender Morphologie und unverändertem Wachstumsverhalten.


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3.5.3 Kryokonservierung und Auftauen von eukaryotischen Zellen

Zur Langzeitlagerung müssen Zellen mit einem Gefrierschutzmittel eingefroren werden, das die Kristallisation von intrazellulärem Wasser verhindert und so die Zellmembranen vor der Zerstörung durch die wasserbedingte Volumenzunahme schützt. Dimethylsulfoxyd (DMSO) kann zwar die Wasserkristallisation verhindern, ist für die Zellen bei RT allerdings toxisch, weshalb der Einfriervorgang bei 4°C durchgeführt wurde. 1 - 20 × 106 Zellen pro Ampulle wurden in 1,8 ml-Aliquots zunächst bei -80°C eingefroren, bevor die Ampullen zu ihrer Langzeitlagerung in Tanks mit flüssigem Stickstoff bei -196°C aufbewahrt wurden.

Zum Auftauen wurden die Ampullen zügig im 37°C-Wasserbad aufgetaut und tropfenweise in Kulturmedium transferiert und abzentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen in entsprechendem Medium resuspendiert und in geeigneter Zelldichte in Kulturgefäße ausgesät.

3.5.4 Transfektion von eukaryotischen Zellen

Je nach Zelltyp wurde eine der nachfolgenden Transfektionsmethoden eingesetzt. 293-Zellen, NRK-52E- und NBT-II-Zellen ließen sich am Besten mit der Calzium-Phosphat-Methode transfizieren, Rattenkeratinozyten mit dem Transfektionsagenz DMRIE-C™ und für COS-1 Zellen stellte sich die Transfektion mit DEAE-Dextran als beste Methode heraus. Für alle Methoden sollten sich die Zellen am Tag der Transfektion in der logarithmischen Wachstumsphase befinden, bei ca. 50 % Konfluenz.

Für die transiente Expression wurden die Zellen 48h nach Transfektion analysiert. Zur Etablierung stabil exprimierender Klone wurden die Zellen 48h nach Transfektion entsprechendem Selektionsmedium ausgesetzt (vgl. Abschnitt 0 ).

3.5.4.1 Transfektion mit Calziumphosphat

Nachfolgende Methode ist für 10-cm-Petrischalen beschrieben. Vor der Transfektion wurde das Kulturmedium durch 10 ml frisches Medium ersetzt. Danach wurde das Präzipitat hergestellt: zu 204 µl H2O in einem 15-ml-Röhrchen wurden 15 µl [1µg/ml]] DNA und 31 µl 2M CaCl2 gegeben und gemischt. Anschließend wurden 250 µl 2× HBSP-Puffer zugegeben und vorsichtig vermischt. Dazu wurde eine 1 ml Pipette bis auf den Röhrchenboden geführt


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und der Puffer langsam herauspipettiert; am Ende wurden noch vorsichtig ca. 15 Luftblasen zur Vermischung durch die Pipette gedrückt. Zur Präzipitat-Formierung wurde der Ansatz 15' bei Raumtemperatur inkubiert, danach durch einmaliges Auf- und Abpipettieren gemischt und tropfenweise zu den Zellen gegeben. Die Platte wurde dann einige Male geschwenkt und je nach Zelltyp 4 - 24h bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert. 293-Zellen wurden 12h, die Ratten-Zelllinien NRK-52E und NBT-II ca. 20h inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und mit frischem Kulturmedium weiterkultiviert.

3.5.4.2 Transfektion mit DMRIE-C™

Nachfolgende Methode ist für 6-Well-Multischalen beschrieben. Zunächst wurde 2 µg DNA in 500 µl OPTI-MEM gelöst. Die zweite Lösung wurde durch kräftiges Mischen von 5 µl DMRIE-C™ Reagenz in 500 µl OPTI-MEM hergestellt. Anschließend wurden beide Lösungen zusammengegeben, durch einmaliges Pipettieren vermischt und 30' bei Raumtemperatur zur Bildung der Komplexe inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und mit dem 1-ml-Transfektionansatz für 5h inkubiert. Anschließend wurde die Flüssigkeit abgezogen und durch normales serumhaltiges Medium ersetzt.

3.5.4.3 Transfektion mit Superfect™

Bei dieser Transfektionsmethode wurde ohne Modifikationen nach den Angaben des Herstellers verfahren.

3.5.4.4 Transfektion mit DEAE-Dextran

Zu einmal mit PBS gewaschenen Zellen wurde eine Lösung aus 2 ml PBS, 15 µg DNA und 100 µl 50 mg/ml DEAE-Dextran (in PBS) gegeben und die Zellen für 30' bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurden 5 ml serumfreies DMEM mit 100 µM Chloroquine zugegeben und die Zellen für weitere 2,5h inkubiert. Danach wurde das Medium abgenommen, 5 ml serumfreies DMEM, 10 % DMSO zugegeben und die Zellen 3' bei


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Raumtemperatur inkubiert. Abschließend wurden sie dreimal mit PBS gewaschen und in serumhaltigem Kulturmedium weiterkultiviert.

3.5.5 Etablierung stabil exprimierender Zellklone

Um Zellklone, bei denen das Zielgen stabil in die genomische DNA integriert ist, zu isolieren und separieren, wurden die Zellen zunächst 48h nach Transfektion mit dem entsprechenden Antibiotikum kultiviert. Dazu wurden die (adhärenten) Zellen unter Zumischen von untransfizierten Zellen in verschieden Ratios in 14-cm-Petrischalen umgesetzt. Bei Transfer des Neo- (Neomycin-phosphotransferase) Gens wurden die Zellen mit G418 (Neomycin) kultiviert, bei Transfer von Zeocin™-Resistenz wurde mit Zusatz von Zeocin™ kultiviert. Nach etwa 10 Tagen Kultur in Selektionsmedium waren einzelne Zellklone deutlich als kleine Zellnester makroskopisch zu erkennen. Bei zusätzlichem Transfer des GFP-Gens wurden diese unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und nur grün-fluoreszierende Zellklone isoliert. Zur Isolierung wurden die Zellen einmal mit PBS gewaschen und darauf geachtet, dass keine Flüssigkeit mehr zurückblieb. Anschließend wurden auf eine Größe von etwa 4 cm2 ausgeschnittene Filterpapiere in Trypsinlösung angefeuchtet und auf die Zellklone gelegt. Nach ca. 15-minütiger Inkubation bei 37 °C konnten diese mit den anhaftenden Zellen mittels einer Pinzette in vorbereitete 24-Well Multischalen mit Medium transferiert werden. Die so isolierten Zellen setzten sich im Laufe der Kultur auf dem Boden der Wells ab und expandierten. Bei Konfluenz wurden sie in größere Kulturgefäße passagiert.

3.5.6 Infektion von eukaryotischen Zellen mit Adenovirus

Für die Adenovirus-Infektion wurden die humanen Keratinozyten bei ca. 90 % Konfluenz mit Infektionslösung für 30' bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde Kulturmedium zugegeben und die Zellen bis zur Analytik für 48h bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert. Die Infektionen wurden von Cornelia Doebis durchgeführt.


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3.5.7 Separation von Zellen mittels Magnetpartikel

Um kontaminierende (MHC-I-positive) Zellen von den übrigen Zellen zu trennen wurden diese zunächst mit dem entsprechenden Antikörper markiert und dann mit an Sekundärantikörper gekoppelten Magnetpartikeln (Dynal) besetzt. Die so markierten Zellen konnten dann über einen Magneten entfernt werden.

Hierzu wurden zunächst die Zellen mit dem entsprechenden Antikörper wie in Abschnitt 0 beschrieben markiert, wobei grundsätzlich 1 µg Antikörper pro 1 × 106 Zellen eingesetzt wurde. Nach Auswaschen der Antikörper wurden die Zellen in ein 10-ml-Röhrchen mit zuvor mit Medium gewaschenen Magnetpartikeln in möglichst kleinem Volumen (ca. 1 ml) gegeben. Zum Waschen der Magnetpartikel wurde das Röhrchen an einen Magneten gehalten, wobei dann das zugegebene Medium durch Abpipettieren von den an der Röhrchenwand haftenden Partikeln getrennt werden konnte. Eingesetzt wurde, in Bezug auf die abzutrennende Zellzahl, die zehnfache Menge an Magnetpartikeln. Es folgte eine 30-minütige Inkubation bei leichtem Schütteln bei 4 °C. Im Anschluss wurden die markierten Zellen durch magnetische Separation abgetrennt und die verbleibenden Zellen in entsprechende Kulturgefäße transferiert.

3.5.8 Die Gemischte Lymphozytenkultur

Zur Vorstimulation der im Zytotoxizitäts-Test eingesetzten Lymphozyten wurden diese für vier bis fünf Tage mit allogenen Leukozyten kokultiviert. Als Responderzellen wurden Lewis-, als Stimulatorzellen DA-Milzzellen eingesetzt. Das verwendete Medium ist dem Abschnitt 0 zu entnehmen.

Nach Entnahme der Ratten-Milzen wurden diese mit einem Potter in 30 ml PBS homogenisiert, durch 40-µm-Nylon-Zellsiebe gegeben und auf 15 ml Ficoll (PAN Biotech, Dichte = 1,091 g/ml) überschichtet. Anschließend erfolgte die Ausbildung des Gradienten bei 370 × g für 40' bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation konnte der die Lymphozyten enthaltende weißliche Ring in der Mitte des Röhrchens abgenommen und in ein neues Röhrchen überführt werden. Nach zwei Waschschritten (einmal mit PBS, einmal mit Medium) wurden die Stimulator-Zellen mit 30 Gray bestrahlt und im Verhältnis von 1:5 mit


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den Responderzellen kultiviert. Es wurden 1 × 108 Stimulatorzellen mit 2 × 107 Responderzellen in senkrecht-stehenden 75- cm2-Kulturflaschen in 40 ml Medium kultiviert.

3.5.9 Zytotoxizitäts-Test

Der Zytotoxizitäts-Test basiert auf der Lyse zuvor markierter Targetzellen durch Effektorzellen. In diesem Fall handelt es sich bei den Targetzellen um Rattenkeratinozyten und bei den Effektorzellen um in der Gemischten Lymphozytenkultur (vgl. Abschnitt 0 ) allogen vorstimulierte zytotoxische T-Zellen aus Ratten-Milzen.

3.5.9.1 Markierung der Targetzellen mit Europium

Zytotoxizitäts-Assays, die auf der Fluoreszenz von Lanthaniden basieren, stellen eine hervorragende Alternativmethode zur gängigen Markierung von Zellen mit radioaktivem Chrom dar. Das am häufigsten beschriebene Lanthanid für den Nachweis von zellvermittelter Zytotoxizität ist Europium [ 169 - 177 ]. Der Test wurde 1986 von Blomerg et al. entwickelt [ 178 , 179 ] und stellt bisher die einzige nicht-radioaktive Methode dar, deren Sensitivität vergleichbar mit der des konventionellen 51Chrom-Assays ist. Das Prinzip beruht auf der zeitauflösenden Fluoreszenzmessung (time-resolved fluorometry), bei der die einzigartigen Eigenschaften von Lanthanid-Chelaten ausgenutzt werden. Da ihre Fluoreszenz 20-35 mal länger als die herkömmlicher Fluorophore ist [ 180 - 182 ], wird die Messung erst gestartet, nachdem die unspezifische Hintergrund-Fluoreszenz abgeklungen ist (vgl. Abb. 9 ).

Für eine quantitative Inkorporation von Europium sollten sich die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase befinden. Pro Färbung wurden ca. 1 × 107 Zellen einmal mit Puffer I gewaschen, mit kaltem Markierungspuffer in 1,5 ml resuspendiert und 15' bei 4 °C inkubiert. Dabei wurden die Zellen alle 5' gemischt. Anschließend wurden 63 µl 100 mM CaCl2 zugegeben (finale Konzentration = 4 mM) und die Zellen weiter 5' bei 4 °C inkubiert. Kalzium bewirkt eine Schließung der (zuvor durch den dextransulfathaltigen Markierungspuffer entstandenen) Poren. Nach dieser Markierungprozedur wurden die Zellen einmal mit kaltem Puffer II und dreimal mit Medium gewaschen, wobei die Temperatur graduell auf Raumtemperatur erhöht wurde. Die so markierten Targetzellen wurden dann sofort zu den bereits vorgelegten Effektorzellen in 96-Rundboden-Wells gegeben.


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Abb. 7: Prinzip des Zytotoxizitäts-Tests mit Europium [modifiziert nach [ 183 ].


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Abb. 8: Messung von Eu-DTPA mit Zusatz von Verstärker-Lösung (modifiziert nach [ 183 ]).

Abb. 9: Prinzip der zeitauflösenden Fluoreszenzmessung. Die Messung von Europium erfolgt nur im Bereich von 400-800 µs (roter Bereich). Zu diesem Zeitpunkt ist die Fluoreszenz anderer mitangeregter Fluorophore (blau dargestellt) bereits abge-klungen und es wird nur noch die Europium-Fluoreszenz (gelb dargestellt) detektiert [modifiziert nach [ 184 ].


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3.5.9.2 Zytotoxizitäts-Test: Ansatz

Es wurden je 100 µl Effektorzellen zu 100 µl 1 × 104 Targetzellen gegeben. Die Zellen wurden dabei in Effektor : Target Ratios von 120:1 bis 3:1 eingesetzt. Zusätzlich wurden Wells mit Targets ohne Killer (100 µl Medium) für die Bestimmung der spontanen Freisetzung und Targets mit 0,9 % Triton-X 100 (in Medium) zur Bestimmung der maximalen Freisetzung angesetzt. Der Ansatz wurde eine Minute bei 250 × g zentrifugiert um einen schnellen Kontakt von Target- und Effektorzellen zu gewährleisten und für 2h bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert. Anschließend wurde ein Aliquot des Überstands abgenommen und gemessen.

3.5.9.3 Messung des freigesetzten Europiums

Je 20 µl Überstand wurden in 200 µl Verstärkerlösung in Flachboden-Miktotiterplatten pipettiert, mit Folie abgeklebt und 5' geschüttelt. Die Verstärkerlösung enthält verschiedene Chelatbildner, welche die Fluoreszenz des Eu-DTPA verstärken (vgl. Abb. 8). Zur Messung wurde die Folie entfernt und die Multiwell-Platte mit einem TECAN-Spectrafluor gemessen. Die spezifische Europium-Freisetzung in Prozent ist ein Maß für die zytotoxische Aktivität der Effektorzellen und wird wie folgt berechnet:

Parameter für die Messung von Europium am SpectraFluor:


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3.6 Transplantation von gezüchteten Rattenhautstücken

Sämtliche Transplantation wurden von Frau Dr. Martina Seifert durchgeführt.

3.6.1 Transplantation von in vitro-generierten Hautschichten ohne ein unterstützendes Trägermaterial

Rattenkeratinozyten wurden sieben bis zehn Tage kultiviert, bis das Gewebe mehrschichtig gewachsen war. Anschließend erfolgte die Ablösung der Hautschichten aus der Kulturschale durch Dispase und das Gewebe wurde auf ein vasilinisiertes Gasegewebe (Adaptic™) aufgebracht. Die so prozessierten Hautstücke wurden dann mit der Gase nach oben auf den dorsalen Muskel von Lewis-Ratten transplantiert. Hierfür wurde ein ca. 1 cm großes Areal auf dem Rücken des Tieres bis hinab zur Muskelfaszie ausgeschnitten und eine Fusenig-Transplantationskammer eingesetzt, um die Einwanderung von Zellen aus der Empfängerhaut zu verhindern. Anschließend wurde das Transplantat in Ringer-Laktatlösung aufgebracht, die Kammer mit einer Silikonkappe verschlossen und die Wunde mit einem Wundverband (Tegaderm™ und elastische Binde) abgedeckt. Die Gase wurde entweder sofort, oder nach sechs bis sieben Tagen entfernt. Das Transplantat wurde frühestens 14 Tage nach Transplantation entnommen und histologisch analysiert.

3.6.2 Transplantation von auf Hyaloronsäuremembran ausgesäten Keratinozyten

Zur Stabilisierung der in vitro-generierten Hautstücke wurden die Zellen subkonfluent (3-4d) als auch konfluent (7-10d) auf Hyaloronsäuremembranen (Laserskin™) kultiviert. Die verwendete Membran enthält Löcher, die ein Durchwachsen der Zellen ermöglicht. Die so bewachsene Membran muss nicht durch enzymatischen Verdau aus der Kulturschale abgelöst werden - nach der Kultur ist ein direktes Aufbringen des Transplantats möglich.

3.6.3 Histologische Analytik

Um den Erfolg der Transplantation zu überprüfen, wurden von dem entnommenden Transplantat Paraffinschnitte und/oder Kryostatschnitte angefertigt. Es erfolgte die Visualisierung der Zellkerne durch HE- (Hämatoxylin-/Eosin) Färbung; ferner erfolgte ein Zytokeratin-Nachweis mittels APAAP- (alkalische Phosphatase - anti-alkalische Phosphatase) Methode.


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