Busch, Annette: Minderung der allogenen Immunogenität künstlicher Gewebe am Modell Epithelien durch Suppression der MHC-I-Oberflächenexpression

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Kapitel 4. Ergebnisse

4.1 Erste Generierung MHC-I-"downregulatorischer" Proteine:
Das anti-Ratten-MHC-I- (RT1.A) Intrabody-Konstrukt Ox18Fab

4.1.1 In vitro-Translation des Intrabody-Konstrukts

Als erstes MHC-I-"downregulatorisches" Protein wurde der Ox18Fab-Intrabody kloniert. Das Konstrukt besteht aus den beiden Ketten VHCH1 und VLCL des OX-18-Antikörpers in einem bicistronischen Vektor. Vor Herstellung des Fab-Intrabodies konnte durch Papainspaltung des parentalen Antikörpers und nachfolgender FACS-Analytik ermittelt werden, dass das OX-18-Fab-Fragment eine ausreichende Affinität zum Ratten-MHC-I-Molekül besaß.

Um nachzuweisen, dass das synthetisierte Konstrukt einen "open reading frame" besitzt, d.h. vom Start- bis zum Stoppcodon durchgängig abgelesen wird, wurde eine in vitro-Translation, d.h. ein in vitro-System, das alle Komponenten zur Translation eines Proteins enthält, durchgeführt. Diese Experimente waren nötig, da bei der Klonierung z.B. Fehler aufgetreten sein könnten, die eine Entstehung von Stoppcodons innerhalb der Sequenz zur Folge haben könnten.

Ferner sollte die Funktionalität der IRES-Sequenz untersucht werden. Nach der Translation sollten zwei Ketten detektierbar sein. Schwere und leichte Kette sollten ein unterschiedliches Molekulargewicht besitzen, so dass bei Translation des Ox18Fab Konstrukts zwei Ketten unterschiedlicher Größe zu erwarten waren. In jedem Fall sollte sich die leichte Kette des Ox18FabKDEL von der des Ox18Fab unterscheiden, da hier die leichte Kette die zusätzliche Retentionssequenz (SE)KDEL enthält.

Abbildung Abb. 10 zeigt, dass beide Ketten in der richtigen Größe sowie in gleich großer Menge translatiert wurden (Größe von Fd-Fragment/leichter Kette ˜ 25 kD). Es zeigt sich, daß die leichte Kette glykosyliert und somit schwerer als die schwere Kette ist; da beide Konstrukte die gleiche schwere Kette besitzen, sich in der leichten Kette jedoch um die KDEL-Sequenz unterscheiden. Die leichte Kette mit dem Retentionssignal hat ein höheres Molekulargewicht (theor. ˜ 0,72 kD).


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Abb. 10: In vitro-Translation von pCMV-Ox18Fab und pCMV-Ox18FabKDEL. Als Positivkontrolle für die Funktionalität des Tests wurde die im Kit enthaltenen Luzi-ferase-Kontrolle, als Negativ-Kontrolle wurde H2O eingesetzt.

4.1.2 Bestimmung der Nukleinsäuresequenz des anti-RT1.A-Intrabodies

Nach der in vitro-Translation der Ox18-Intrabody-Konstrukte wurden diese sequenziert. Da die Sequenz des parentalen Antikörpers OX-18 nicht publiziert war, musste das synthetisierte Konstrukt mit den Sequenzen anderer Immunoglobuline verglichen werden. Die Sequenz wurde anschließend mit Hilfe des BLAST-Programms mit den Sequenzen anderer Proteine der NCBI- (National Center for Biotechnology Information) Datenbank verglichen, um nachzuweisen, dass funktionelle Immunoglobulinfragmente sythetisiert wurden. Außerdem können so ungewöhnliche Charakteristika der Sequenz, die durch Fehler bei der Klonierung oder Sequenzierung aufgetreten sein könnten, identifiziert werden.

Es zeigte sich, dass tatsächlich Antikörperfragmente kloniert wurden, die eine Homologie von bis zu 95% zu anderen Antikörpern aufwiesen (vgl. Abschnitt 0 ).

Ferner wurde gemäß dem Kabat/Chothia-Nummerierungs-Schema für Antikörper [ 185 , 186 ] die Struktur der Antikörperfragmente, d.h. die Lokalisation der CDR- (complementary determined regions) bzw. der Framework-Bereiche determiniert.

Dargestellt sind die Sequenzen beider Antikörperketten, sowie die CDR- und Framework-Bereiche (FR).


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4.1.2.1 DNA-Sequenz der variablen schweren Kette des Ox18-Intrabodies:


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4.1.2.2 DNA-Sequenz der variablen leichten Kette des Ox18-Intrabodies:


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4.1.2.3 Vergleich mit anderen Immunoglobulinen

Es konnten sehr viele homologe Proteine gefunden werden, bei denen es sich ausnahmslos um Immunoglobulinfragmente handelte. Dies beweist, dass tatsächlich funktionelle Antikörperfragmente kloniert wurden. Es ist jeweils nur ein Homologievergleich für jede Kette aufgeführt. Die CDR sind fett dargestellt.


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Auffallend ist die große Divergenz zwischen der CDR3 der schweren Kette und denen anderer Immunoglobuline. Auch eine erneute Suche nach nur dieser Domäne zeigte, dass es sich um eine höchst ungewöhnliche Sequenz handelt. Es wurden nur zwei identische bzw. ähnliche Sequenzen gefunden:


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4.1.3 Expression von anti-RT1.A-Fab-Intrabodies in COS-1-Zellen

Zur Expression des Intrabody-Proteins in eukaryotischen Zellen wurden zunächst COS-1-Zellen gewählt, da diese leicht transfizierbar sind und das große T-Antigen besitzen, das durch Bindung im SV40 ori-Bereich (im pRC/CMV-Vektor enthalten) zu verstärkter Replikation des Plasmids führt. So besteht die Möglichkeit, schon eine transiente Expression des Proteins nachzuweisen. COS-1-Zellen wurden mit den Ox18-Intrabody-Konstrukten mit Hilfe der Kalzium-Phosphat-Methode transfiziert.

Abb. 11 zeigt, daß das Intrabody-Protein auch in eukaryotischen Zellen exprimiert wird, wenn auch schwach. Dies beweist neben dem Vorhandensein eines offenen Leserahmens (vgl. Abschnitt 0 ) die Stabilität der mRNA in eukaryotischen Zellen. Beide Konstrukte werden im endoplasmatischen Retikulum zurückgehalten. Im Kulturüberstand sind keine Intrabody-Fragmente erkennbar.

Abb. 11: Immunopräzipitation der exprimierten Proteine Ox18Fab und Ox18FabKDEL in COS-1-Zellen. In Reihe 1 und 2 wurden Maus-Immunoglobuline des (serumfreien) Mediums präzipitiert, in Reihe 3 und 4 Maus-Immunoglobuline bzw. -Immunoglobulinfragmente des Zelllysats.


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4.1.4 Stabile Expression von anti-RT1.A-Fab-Intrabodies in NBT-II-Zellen

Um die Funktionalität der Ox18Fab-Intrabodies zu ermitteln, d.h. die MHC-I-Retentionskapazität, wurde zunächst die Rattenepithelzelllinie NBT-II mit der Kalziumphosphat-Methode transfiziert und auf ihre RT1.A-Expression auf der Zelloberfläche mittels FACS-Analytik untersucht. Obwohl 48h nach Transfektion keine Veränderung der RT1.A-Expression zu verzeichnen war, wurden mittels G418-Selektion stabile Zellklone generiert. Es bestand die Möglichkeit, dass nur ein sehr geringer Prozentsatz der Zellen transfiziert worden war und diese in der Gesamtpopulation nicht detektierbar waren.

Abb. 12: Stabil-Ox18Fab- bzw. Ox18FabKDEL-exprimierende NBT-II Zellklone. Selektion der Einzelklone durch G418. Keiner der selektierten Klone zeigt eine signifikante Reduktion der MHC-I-Expression.


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Nach Selektion der Einzelklone zeigte sich jedoch, dass keine ausreichende Reduktion der RT1.A-Oberflächenexpression erreicht wurde. Nur wenige Klone zeigten überhaupt eine Reduktion, während der größte Teil der Klone eine unveränderte RT1.A-Expression aufwies. Da dies nur eine erste Beurteilung der Funktionalität der Intrabody-Konstrukte war, wurden keine Kontrollkonstrukte, wie z.B. unspezifische Intrabodies, eingesetzt. So konnte nicht entschieden werden, ob die Reduktion, die einzelne Klone zeigten, tatsächlich durch die Expression der Ox18-Intrabodies bewirkt wurde, oder ob nur aus der Gesamtpopulation, die eine Bandbreite verschieden stark RT1.A-exprimierender Zellen enthält, schwächer exprimierende Zellen isoliert wurden. Abb. 12 zeigt vier der über 150 isolierten Klone. Bei keinem Klon wurde eine deutliche Reduktion der RT1.A-Oberflächenexpression detektiert, keinesfalls jedoch ein phänotypischer "knock-out".

4.2 Zweites MHC-I-"downregulatorisches" Protein:
Das anti-human-MHC-I-Intrabody-Konstrukt 8KsFv

Da mit dem Ox18-Intrabody Konstrukt keine befriedigenden Ergebnisse erzielt werden konnten, wurde mit dem anti-human-MHC-I- (8KsFv) Intrabody weitergearbeitet, um das Prinzip zu überprüfen. Hierbei wurde zunächst das von Abner Mhashilkar (Arbeitsgruppe von Wayne Marasco, Boston) klonierte Konstrukt pCMV-8KsFv auf seine Funktionalität in 293-Zellen untersucht. Weiterhin wurde es in einen adenoviralen Vektor umkloniert und primäre humane Keratinozyten mit dem Konstrukt infiziert.

293-Zellen sind sehr gut transfizierbar und somit kann eine große Menge an Intrabody-DNA integrieren. Damit ist eine hohe Intrabody-Expression gewährleistet. Außerdem besitzen 293-Zellen eine relativ geringe konstitutive MHC-I-Expression, so dass keine extrem hohe Expression an Intrabody-Molekülen erforderlich ist.


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4.2.1 Expression von anti-human-MHC-I-Intrabodies in 293-Zellen

293-Zellen wurden mit Hilfe der Kalzium-Phosphat-Methode mit dem Plasmid pCMV-8KsFv transfiziert und die transiente MHC-I-Oberflächenexpression mittels FACS-Analytik bestimmt (vgl. Abb. 13 ). Nachdem hier eine deutliche Reduktion der MHC-I-Expression gemessen werden konnte, wurden Einzelklone durch G418-Selektion generiert und ebenfalls analysiert. Auch konnten reduziert MHC-I-exprimierende Klone detektiert werden; einige Klone besaßen sogar einen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp.

Abb. 13: Stabile bzw. transiente 8KsFv-Intrabody-Expression in 293-Zellen. FACS-Analyse der MHC I Expression.Neben der starken MHC-I-"Downregulation" bei stabilen Klonen zeigten 35% der Zellen schon 48h post-Transfektion eine signifikant verminderte MHC-I-Oberflächenexpression.


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4.2.2 Expression von anti-human-MHC-I-Intrabodies in humanen Keratinozyten durch Adenovirus-Infektion

Da primäre humane Keratinozyten nur schwer mit den gängigen Methoden transfizierbar sind, wurden sie mit einem 8KsFv-Konstrukt enthaltenen Adenovirusvektor (Ad-8KsFv) infiziert, der zuvor hergestellt wurde (vgl. Abschnitt 0 ).

Es konnte ein großer Teil der Zellen infiziert werden, die einen MHC I herunterregulierten Phänotyp zeigten (vgl. Abb. 14 ). Ein kleiner Anteil der Zellen zeigte bei dem beta-Gal-enthaltenden Adenovirus-Kontrollvektor ebenfalls eine Herunterregulation der MHC-I-Oberflächenexpression. Dieses Phänomen wurde auch bei vielen Zelllinien beobachtet und ist Resultat der Adenovirus-Infektion, wenngleich der Mechanismus unklar ist.

Abb. 14: Adenovirus-Infektion von humanen Keratinozyten mit 8KsFv-Intrabody bzw. beta-Gal-Kontrollkonstrukt. FACS-Analyse der MHC-I-Expression.


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4.3 Dritte Generation der MHC-I-"downregulatorischen" Proteine:
Das anti-RT1.A-Intrabody-Konstrukt als single chain: Ox18sFv

Da mit dem 8KsFv-Intrabody recht gute Resultate erzielt wurden, wurde nun auch das anti-Ratten-MHC-I- (Ox18Fab) Konstrukt als single chain kloniert und wieder in NBT-II Zellen transfiziert.

4.3.1 stabile Expression von anti-RT1.A-sFv-Intrabodies in NBT-II Zellen

Die Ergebnisse waren enttäuschend. Stabile und transiente Expression des Ox18sFv-Intrabodies in den Rattenepithelzellen ergaben das gleiche Resultat wie schon die Transfektion mit dem Fab-Intrabody. Da die Histogramme der FACS-Analyse denen der Ox18Fab-Transfektion glichen, werden hier keine separaten Ergebnisse aufgeführt.

4.4 Die Lösung:
MHC-I-"downregulatorische" Proteine als GFP-Fusionsproteine

In keinen der bisher durchgeführten Experimente konnte definitiv nachgewiesen werden, dass die MHC-I-"Downregulation" tatsächlich durch den Intrabody verursacht wurde. Auch toxische Proteine beeinträchtigen beispielsweise den physiologischen Zustand der Zelle und können so zu einer veränderten Expression induzierbarer/regulierbarer Rezeptoren führen, wie die von ICAM-1 oder der Haupthistokompatibilitätsantigene HLA Klasse I und II.

Durch die Fusion der Intrabodies mit dem GFP können sowohl Aussagen über die Transfektionseffizienz gemacht werden, d.h. wieviele Zellen das Transgen exprimieren, als auch im FACS selektiv die grün-fluoreszierenden Zellen auf ihre MHC-I-Expression untersucht und mit den übrigen Zellen verglichen werden.

4.4.1 Expression von GFP-Fusionsproteinen in Rattenkeratinozyten: Ox18sFv und p19

Zum Zeitpunkt der Fertigstellung der GFP-Intrabodies war die primäre Rattenkeratinozytenkultur etabliert. Im Hinblick auf die finale Zielsetzung der Hauttransplantation wurden, ohne Vorversuche mit anderen Rattenzelllinien, sofort primäre Rattenkeratinozyten für die Transfektion der Ox18GFP-Intrabodies eingesetzt.


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4.4.1.1 Optimierung der Transfektion von Rattenkeratinozyten

Um eine möglichst hohe Effizienz des Gentransfers zu erreichen, d.h. eine Vielzahl von Kopien des Transgens in die Zelle zu bringen und eine hohe Anzahl an Zellen zu transfizieren, musste die Transfektion der Primärzellen zunächst optimiert werden. Es wurden die Transfektionsmethoden mit Kalziumphoshat, Superfect™ (Qiagen) und DMRIE-C™ (Life Sciences) getestet. Dabei wurde das in den Vektor pcDNA3.1-Zeo klonierte GFP (pZeo-GFP) zur Detektion eingesetzt.

Die transiente Expression des GFP 48h nach Transfektion zeigte, dass durch Transfektion mit DMRIE-C™ die beste Transfektionseffizienz erzielt wurde. Es konnten bei diesem Vorversuch bis zu 20% der Zellen transfiziert werden - bei einer sehr hohen Expression des Gens (starke Grün-Fluoreszenz).

Abb. 15: Transfektion von primären Rattenkeratinozyten mit verschiedenen Transfektionsagenzien: Kalziumphosphat-Methode (links)und die beiden liposomvermittelten Transfertechniken mittels Superfect™ (Mitte) und DMRIE-C™ (rechts). 48h nach Transfektion: FACS-Analyse.


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4.4.1.2 Bestimmung der Expression durch Fluoreszenzmikroskopie

Nachdem die Wahl der Transfektionsmethode auf die DMRIE-C™-Methode gefallen war, wurden die Rattenkeratinozyten mit dem in den Expressionsvektor pcDNA3.1-Zeo klonierten GFP-Fusionsintrabody (pZeo-Ox18GFP) transfiziert und stabile Klone durch Zeocin™-Selektion generiert.

Schon bei der Selektion erwies sich das fusionierte GFP als hilfreich. Es konnten dadurch selektiv nur grün-fluoreszierende Klone gepickt und expandiert werden. Dies bedeutet eine enorme Reduktion des Arbeitsaufwandes mit gleichzeitiger Erhöhung der Erfolgschancen (an dieser Stelle sei daran erinnert, dass bei der Selektion der NBT-II Klone über 150 Klone isoliert und analysiert wurden).

Die isolierten Zellklone konnten nach der Selektion in normalem Kulturmedium ohne Zeocin™ weiterkultiviert wurden, ohne dass eine Abnahme der Fluoreszenz zu beobachten war.

Abb. 16#/LINKCONTENT# zeigt einen Keratinozyten-Klon vor der Isolierung als einzelnes Zellnest (A+B), nach der Isolierung und Expansion (C+D) sowie mit bereits vielschichtigem Wachstum in Kultur (E+F). Die Zellen konnten über viele Passagen (bis über 100) kultiviert werden, ohne dass ein Verlust des exprimierten Gens zu verzeichnen war.


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Abb. 16: Ox18sFvGFP-Expression in stabil-transfizierten Rattenkeratinozyten. Links: lichtmikroskopische Aufnahme, 400× Vergrößerung; rechts: der identische Bildausschnitt im Fluoreszenzmodus (Filter = 510 nm). A+B: einzelner Klon; C+D: expandierende Zellen; E+F: mehrschichtiges "Sheet"


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4.4.1.3 Bestimmung der MHC-I-Oberflächenexpression mittels FACS-Analytik

Um die GFP-Expression in Korrelation mit der MHC-I-Expression zu setzen, wurden die Zellen mit dem Antikörpers des F-16-4-4-11 Hybridoms (kurz: F16), ein anti-RT1.A-Antikörper, der nicht mit dem OX-18-Antikörper identisch ist, gefärbt. Damit sollte gewährleistet sein, dass das MHC-I-Epitop nicht von Ox18-Intrabodies besetzt ist, die nicht im ER zurückgehalten wurden, sondern möglicherweise mit dem RT1.A-Molekül an die Zelloberfläche gelangt sind, und so der anti-RT1.A-Antikörper nicht binden kann. Dies würde zu einem verfälschten Ergebnis führen.

Die Zellen wurden zuerst mit dem F16-Antikörper und danach mit einem PE-markiertem anti-Maus-IgG-Antikörper markiert. Diese sekundäre Färbung gewährleistet eine starke Markierung mit einem resultierenden intensiven Signal der Zellen in der Rot-Fluoreszenz, die benötigt wird, um eine elektronische Kompensation der sehr starken Grün-Fluoreszenz des GFP zu ermöglichen, die sonst in den "roten" Kanal überstrahlt.

Parallel zu dem Ox18sFvGFP-Konstrukt wurden bei der Transfektion der bicistronische Vektor pIE-Ox18sFv, der neben dem Ox18sFv das GFP in der zweiten Kassette des Vektors enthält, und das adenovirale Protein p19 eingesetzt.

Abb. 17#/LINKCONTENT# zeigt die deutliche Korrelation zwischen GFP-Fluoreszenz und MHC-I-"Downregulation". Das p19-Protein, welches das humane MHC-I-Molekül und einige Maus-Haplotypen bindet, führt zu keiner Reduktion der MHC-I-Oberflächenexpression in Rattenkeratinozyten, es bindet also zumindest nicht den RT1.Aavl-Haplotyp von DA-Ratten. Das GFP-Fusionprotein ist wesentlich effektiver als der bicistronisch exprimierte Intrabody. Insgesamt kann festgestellt werden, dass eine sehr gute Reduktion der RT1.A-Expression erzielt wurde, die sogar zur Generierung von Zellen mit phänotypischen "knock-out" führte (nicht gezeigt: identische Färbung mit der Isotyp-Kontrolle). Ferner wird deutlich, dass eine bestimmte basale Expression des Intrabodies benötigt wird, um effektiv zu sein: erst bei einer Grün-Fluoreszenz von >110 Einheiten (mittlere Fluoreszenzintensität) tritt eine Reduktion der RT1.A-Expression ein. Als Kontrollkonstrukt wurde der anti-human-MHC-I-Intrabody 8FsFv eingesetzt, der nicht an das Ratten-MHC-Molekül bindet.

Von den transfizierten Keratinozyten konnten Einzelklone generiert werden, die einen RT1.A-"knockout"-Phänotyp zeigten und diesen über die gesamte Kulturdauer beibehielten. Diese Klone wurden weiter charakterisiert (Abschnitt 0 ) und für Funktionstests (Abschnitt 0 ) eingesetzt.


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Abb. 17: Primäre Rattenkeratinozyten wurden mit den spezifizierten Konstrukten transfiziert und 48h nach Transfektion im FACS analysiert. Die Ratten-MHC-I- (RT1.A) "Downregulation" kann effizienter durch das GFP-Fusionsprotein erreicht werden (a), als durch den anti-RT1.A- (Ox18) Intrabody allein (d). Diese "Downregulation" ist abhängig von der Stärke der Intrabody-Expression. Die Expression des Kontrollintrabodies (anti-human-MHC-I-Intrabody, 8KsFv) führt zu keiner Reduktion der RT1.A-Oberflächenexpression (b+e). Das adenovirale Protein p19 hat ebenfalls keinen Effekt auf die RT1.A-Expression von DA-Keratinozyten (c+f).

Verwendete Konstrukte:


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Expression von GFP-Fusionsproteinen in humanen 293-Zellen: 8KsFv und p19

Nachdem mit dem anti-Ratten-MHC-I- (RT1.A) Intrabody-Konstrukten gute Ergebnisse hinsichtlich der "Downregulation" der RT1.A-Oberflächenexpression erzielt wurden, sollte nun auch der anti-human-MHC-I-Intrabody auf seine Funktionalität bezüglich der Reduktion der MHC-I-Oberflächenexpression untersucht werden. Hierfür wurde die humane Zelllinie 293 analog zu den Rattenkeratinozyten transfiziert und analysiert.

4.4.1.4 Bestimmung der MHC-I-Oberflächenexpression mittels FACS-Analytik

293-Zellen wurden mit der Kalziumphosphat-Methode transfiziert und 48h nach Transfektion analysiert. Die FACS-Analyse zeigt das gleiche Ergebnis wie für die Rattenkeratinozyten (vgl.

Abb. 18#/LINKCONTENT#). Es ist eine deutliche "Downregulation" der MHC-I-Expression beim Einsatz des anti-humanen 8KsFv-Intrabody zu beobachten - im Gegensatz zu dem Ox18sFv-Kontrollantikörper. Hier ist keine Reduktion der MHC-I-Expression zu beobachten, abgesehen von der leichten Minderung der Expression bei stark exprimierenden Zellen. Dieses Phänomen trat schon bei der adenoviralen Infektion von 293-Zellen mit dem beta-Gal-Kontrollkonstrukt (vgl. Abschnitt 0 ) und bei vielen weiteren Transfektionen mit anderen Zelllinien auf und könnte an der Beeinträchtigung des physiologischen Zustands der Zellen durch die starke Expression des Transgens liegen.


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Abb. 18: 293-Zellen wurden mit den spezifizierten Konstrukten transfiziert und 48h nach Transfektion im FACS analysiert. Wie schon für den anti-Ratten-MHC-I-Intrabody gezeigt, kann auch hier eine human-MHC-I-"Downregulation" effizienter durch das GFP-Fusionsprotein erreicht werden (a), als durch den anti-MHC-I- (8KsFv) Intrabody allein (d). Diese "Downregulation" ist ebenfalls abhängig von der Stärke der Intrabody-Expression. Die Expression des Kontrollintrabodies (anti-Ratten-MHC-I-Intrabody, Ox18sFv) führt zu keiner Reduktion der RT1.A-Oberflächenexpression (b+e). Das adenovirale Protein p19 ist nicht so effizient in der MHC-I-"Downregulation" wie das 8KsFv-Konstrukt (c+f).

Verwendete Konstrukte:


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4.5 Charakterisierung Intrabody-exprimierender Zellen

In den folgenden Abschnitten werden die anti-MHC-I-Intrabody-exprimierenden Zellen näher charakterisiert. Erstens wird überprüft, ob andere Oberflächenmoleküle durch die Intrabody-Expression beeinträchtigt werden. Darüber hinaus wird das Schicksal der durch die Intrabodies im ER zurückgehaltenen MHC-I-Moleküle untersucht. Und letztlich wird der Einfluss von Interferon-gamma auf die MHC-I-Expression auf Intrabody-exprimierende Zellen untersucht.

4.5.1 Wird die Expression anderer Oberflächenmoleküle beeinträchtigt?

Bei der Manipulation von Zellen stellt sich immer die Frage, ob neben dem gewünschten Effekt auch noch andere Zellparameter verändert wurden. Die Expression des Transgens sollte weder Nebeneffekte auf den physiologischen Zustand der Zelle haben noch andere Proteine der Zelle verändern oder ihre Expression beeinträchtigen.

Zunächst konnte festgestellt werden, dass weder die Klone der MHC-I-herunterregulierten Rattenkeratinozyten noch die der 293-Zellen Wachstumsnachteile gegenüber untransfizierten Zellen zeigten. Auch die Morphologie der Zellen unterschied sich nicht merklich von der normaler Zellen bis auf die Tatsache, dass sie durch die Akkumulation von GFP-MHC-I-Molekülen in der Zelle lediglich etwas größer und granulärer erschienen. Es konnten mehrschichtige "Keratinozyten-Sheets" gezüchtet werden, die durch Dispase-Behandlung abgelöst und für die Transplantation eingesetzt werden sollten.

Es wurden sowohl konstitutiv exprimierte (z.B. Integrine) als auch regulierbare bzw. induzierbare (z.B. MHC I+II) Rezeptoren bei transient transfizierten 293-Zellen und stabilen Rattenkeratinozytenklonen untersucht.

Abb. 19#/LINKCONTENT# zeigt, dass sich untransfizierte und transfizierte Zellen in der transienten Expression nicht voneinander unterscheiden und stabile Klone die selbe Morphologie aufweisen wie untransfizierte Zellen.


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Abb. 19: 293-Zellen wurden mit dem anti-human-MHC-I-Intrabody 8KsFv transfiziert. 48h nach Transfektion wurden die aufgeführten Oberflächenmoleküle im FACS analysiert. Die Oberflächenexpression der untersuchten Moleküle (CD46, CD49b, CD49d, CD55, CD58) wurde durch die 8KsFv-Intrabody-Konstrukte nicht beeinflusst.

Die Analyse von stabil Intrabody-exprimierenden Rattenkeratinozyten zeigte keine generellen Unterschiede bei der Expression von RT1.B und ICAM-1 (vgl.

Abb. 20#/LINKCONTENT#). Das MHC-Klasse-II-Antigen der Ratte, RT1.B, wird bei Interferon-gamma-Stimulation auf Keratinozyten induziert. Der Ox18sFv- (anti-Ratten-MHC-I) transfizierte Klon zeigte eine etwas stärkere Erhöhung als mit dem Kontrollintrabody 8KsFv transfizierte oder untransfizierte Keratinozyten. ICAM-1 exprimieren alle untersuchten Zellen stark; bei allen drei untersuchten Populationen konnte nur eine schwache Erhöhung durch Interferon-gamma beobachtet werden. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass sowohl Intrabody-transfizierte Zellen, als auch untransfizierte Zellen durch Interferon-gamma aktivierbar sind und sich bezüglich der untersuchten Antigen-Expression nicht voneinander unterscheiden.


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Abb. 20: Rattenkeratinozyten wurden mit den aufgeführten Konstrukten (RT1.B, Ratten-MHC-II & ICAM-1) stabil transfiziert. Generierte Einzelklone wurden 48h mit bzw. ohne 10 ng/ml IFN-gamma kultiviert und anschließend auf die Expression von RT1.B und ICAM-1 durch FACS-Analyse untersucht. RT1.B kann durch Interferon-gamma-Stimulation bei untransfizierten (a), Kontrollintrabody- (8KsFv) transfizierten (b) und anti-Ratten-MHC-I- (Ox18sFv) Intrabody-transfizierten (c) Rattenkeratinozyten ähnlich stark induziert werden. Ebenfalls zeigen sowohl uninfizierte (d) als auch Kontroll- bzw. anti-Ratten-MHC-I-Intrabody-exprimierende (e bzw. f) Keratinozyten eine starke ICAM-I-Expression, was durch Interferon-gamma leicht steigerbar ist.


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4.5.2 Was passiert mit den MHC-I-Molekülen in der Zelle?

Für die intrazelluläre Detektion von MHC-I-Molekülen wurden stabil transfizierte 293-Zellen und Rattenkeratinozyten angefärbt. Dabei war darauf zu achten, dass die extrazellulären MHC-I-Moleküle nicht mitangefärbt wurden. Es wurden zwei Verfahren angewendet:

293-Zellen wurden extrazellulär mit einem FITC-gekoppelten anti-MHC-I-Antikörper gefärbt, permeabilisiert und der intrazelluläre Teil an MHC-Molekülen mit einem schwächer konzentrierten PE-markierten Antikörper markiert. Beide Antikörper stammten von dem selben Klon, d.h. sie erkannten das selbe Epitop.

Für die Rattenkeratinozyten stand kein direkt-markierter anti-RT1.A-Antikörper zur Verfügung. Daher wurden vor der intrazellulären Färbung sämtliche Oberflächenmoleküle mittels Papain-Verdau entfernt. Es wurde wieder der F16-Antikörper mit einem PE-markiertem Sekundärantikörper eingesetzt.

Das Schicksal der Intrabody-gebundenen MHC-I-Moleküle ist ungewiss. Fest steht, dass im Laufe der Zeit ein Abbau geschehen muss, da die Zelle ein so großes Ausmaß an intrazellulär akkumulierten Molekülen nicht tolerieren würde. Es könnte sein, dass die Komplexe sofort nach ihrer Bindung ins Zytosol exportiert werden und dort proteolytisch verdaut werden. Denkbar ist aber auch ein negatives "Feedback" auf die MHC-I-Proteinsynthese durch die erhöhte Anzahl von MHC-I-Molekülen in der Zelle. Darüber hinaus ist eine Akkumulation bis zu einem gewissen Ausmaß, das von der Zelle toleriert wird und sicherlich vom Zelltyp abhängig ist möglich.

Abb. 21#/LINKCONTENT# und Abb. 22#/LINKCONTENT# zeigen, dass dies, (zumindest bei den untersuchten 293-Zellen und Rattenkeratinozyten) der Fall ist.


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Abb. 21: Vor der intrazellulären Färbung von RT1.A (Ratten-MHC-I) in Rattenkeratinozyten wurden diese mit Papain behandelt. Die beiden oberen Histogramme zeigen die erfolgreiche Entfernung aller RT1.A-Oberflächenmoleküle. Die beiden unteren Histogramme zeigen durch die nachfolgende intrazelluläre Färbung die verstärkte Detektion an intrazellulär lokalisierten RT1.A-Molekülen in anti-RT1.A-Intrabody-transfizierten Keratinozyten (unten, rechts) im Gegensatz zu untransfizierten Zellen (unten, links).

Abb. 22#/LINKCONTENT# zeigt am Beispiel der untersuchten 293-Zellen deutlich: je stärker die MHC-I-Reduktion auf der Zelloberfläche ist, desto stärker ist das Ausmaß an intrazellulärer MHC-I-Akkumulation, d.h. Klon A mit reduzierter MHC-I-Oberflächenexpression zeigt eine erhöhte intrazelluläre MHC-I-Färbung - Klon B mit der schwächsten Expression von MHC I auf der Zelloberfläche weist die stärkste intrazelluläre Färbung auf.


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Abb. 22: Stabil anti-MHC-I- (8KsFv) Intrabody exprimierende (Mitte & rechts) sowie untransfizierte (links) 293-Zellen wurden extra- und intrazellulär mit anti-MHC-I -Antikörpern gefärbt und im FACS analysiert. Deutlich wird die verstärkte intrazelluläre Detektion in Intrabody-exprimierenden Zellklonen (Mitte & rechts). In Zellen, welche die stärkste MHC-I-Oberflächenreduktion zeigen, kann die größte Akkumulation an intrazellulären MHC-I-Molekülen detektiert werden (rechts).


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4.5.3 Wie wirkt sich Interferon-gamma auf die MHC-I-Expression aus?

Interferon-gamma ist ein proinflammatorisches Zytokin, das die MHC-I-Expression auf Zellen heraufreguliert. Es stellt sich also die Frage, ob auch in Intrabody-exprimierenden Zellen mit phänotypischem MHC I "knock-out" diese Expression wieder durch IFN-gamma-Stimulation gesteigert werden kann.

Zu diesem Zweck wurden untransfizierte sowie stabil-transfizierte Rattenkeratinozyten für 48h mit IFN-gamma stimuliert und auf ihre RT1.A-Expression untersucht. Wie zu erwarten war, steigerte IFN-gamma die Expression auf untransfizierten Keratinozyten. Bei dem Intrabody-exprimierenden Klon wurden zwei Populationen detektiert: eine RT1.A-positive und eine RT1.A-negative Population. Es lag die Vermutung nahe, dass es sich hier um zwei verschieden Populationen handelte. Daraufhin wurden die RT1.A-negativen von den RT1.A-positiven Zellen durch Magnetpartikel separiert und nochmals mit Interferon-gamma stimuliert. Es zeigte sich, dass diese separierten Zellen nach erneuter Interferon-gamma-Stimulation keine Reexpression mehr an RT1.A hatten. Dies war auch bei späteren Stimulationen der Fall (vgl. Abb. 23 ).

Dies bestätigt die Annahme, dass vor der Separation zwei Populationen vorlagen: eine mit sehr hoher Expression an Intrabody-Molekülen, die auch durch Interferon-gamma-Stimulation zusätzliche RT1.A-Moleküle intrazellulär zurückhalten können und eine andere Population, deren Intrabody-Produktion zwar für die intrazelluläre Bindung von konstitutiv-exprimierten RT1.A-Molekülen ausreicht, jedoch nicht für deren durch Interferon-gamma erhöhte Anzahl.

Es wird an dieser Stelle erwähnt, dass durch die hohe Zelldichte nach der Selektion der transfizierten Zellen in Selektionsmedium durchaus die Möglichkeit bestand, Mehrfachklone statt Einzelklone zu isolieren. Durch die Stimulation mit Interferon-gamma und die anschließende Selektion durch Magnetpartikel konnten diese Mehrfachklone vereinzelt werden.


95

Abb. 23: Rattenkeratinozyten wurden mit 10 ng/ml IFN-gamma für 48h stimuliert, und auf ihre RT1.A- (Ratten-MHC-I) Oberflächenexpression untersucht.

  1. Die RT1.A-Expression in untransfizierte Rattenkeratinozyten wird durch IFN-gamma gesteigert.
  2. Der stabil-Ox18sFv-transfizierte Keratinozytenklon teilt sich nach IFN-gamma-Stimulation in zwei Populationen: die eine zeigt eine verstärkte RT1.A-Oberflächenexpression, die andere behält den RT1.A-"downregulierten" Phänotyp.
  3. links: Die RT1.A-negativen Zellen des IFN-gamma-stimulierten Ox18sFv-transfiziertem Klons werden von
    den RT1.A-positiven Zellen mittels Magnetpartikelseparation getrennt und weiter kultiviert.
    rechts: Diese separierten Zellen können 48h nach IFN-gamma-Stimulation keine RT1.A-Moleküle mehr an
    der Zelloberfläche exprimieren.


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4.6 Funktionelle Bedeutung der MHC-I-"downregulatorischen" Proteine

Am Ende aller bisher gezeigten molekularbiologischer Resultate und in vitro erhaltener Ergebnisse steht die Frage: wie wirkt sich der MHC-I-"knock-out"-Phänotyp der Zellen funktionell auf die Immunogenität der Zellen aus? Es wurde untersucht, ob Intrabody-exprimierende Rattenkeratinozyten von zytotoxischen Zellen in vitro erkannt und lysiert werden können.

4.6.1 Zytotoxizitäts-Test mit Intrabody-exprimierenden Rattenkeratinozyten als Targetzellen

Für den Zytotoxizitäts-Test wurden allogene Ratten-Milzzellen durch eine 4-tägige Kokultur mit allogenen, d.h. dem Haplotyp der Keratinozyten entsprechenden, Milzzellen vorstimuliert. Stimulator- bzw. Targetzellen stammten in diesem Fall Zellen von DA-Ratten, Responderzellen von Lewis-Ratten. Nach der Vorstimulation der Responderzellen wurden diese in verschiedenen Ratios mit den mit Europium markierten Rattenkeratinozyten für zwei Stunden inkubiert und das freigesetzte Europium im Überstand fluorimetrisch bestimmt. Zur besseren Übersicht sind die relevanten Zellen des Testsystems noch einmal dargestellt:


97

4.6.1.1 Optimierung der Europium-Konzentration

Zunächst musste die Konzentration an Europium ermittelt werden bei der die Zellen am meisten Moleküle aufnehmen und dabei einen geringe spontane Freisetzung haben. Zu diesem Zweck wurden die Zellen mit Markierungspuffer verschiedener Europium-Konzentrationen inkubiert. Anschließend wurden Verdünnungsreihen dieser Zellen in 96-Well Platten pipettiert und 2h mit (maximale Freisetzung) oder ohne (spontane Freisetzung) Triton-X 100 inkubiert. Die so ermittelten Werte für die maximale bzw. spontane Freisetzung sind in Abb. 24#/LINKCONTENT# grafisch aufgetragen. Es wurde eine Europium-Konzentration von 800 µM für alle nachfolgenden Markierungen gewählt, bei der die Differenz zwischen maximaler und spontaner Freisetzung für die eingesetze Zellzahl von 10.000 Targetzellen am höchsten war. Außerdem zeigt die Kurve für die maximale Freisetzung einen linearen Verlauf, d.h. die Messwerte für die freigesetzten Europium-Moleküle korrelieren mit der Anzahl an lysierten Zellen.


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Abb. 24: Markierung von Rattenkeratinozyten mit unterschiedlichen Europium-Konzentrationen. Ermittlung der optimalen Konzentration bei 10000 Zellen durch:
maximale Freisetzung - spontane Freisetzung = max


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4.6.1.2 Zytotoxizitäts-Test

Abb. 25 zeigt die Ergebnisse sämtlicher durchgeführter Zytotoxizitäts-Tests. Zur besseren Übersicht wurden nur Kontrollintrabody-transfizierte (8KsFv), anti-Ratten-MHC-I- (RT1.A) Intrabody-transfizierte (Ox18sFv) und "third-party"-Zellen (NRK-52E, Rattenepithelzellen mit differentem MHC-I-Haplotyp, gegen welche die Effektorzellen nicht vorstimuliert wurden) dargestellt. Die Werte der (nicht aufgeführten) untransfizierten Keratinozyten waren weitestgehend mit denen der Kontrollintrabody-transfizierten Zellen identisch.

    Alle Experimente zeigen eine deutlich geringere zytolytische Aktivität der zytotoxischen T-Zellen (Effektorzellen) gegenüber anti-RT1.A-Intrabody-transfizierten Rattenkeratinozyten - im Gegensatz zu Kontrollintrabody-transfizierten oder "third-party"-Zellen.

    Zur Ermittlung der statistischen Signifikanz wurden die Werte der Paare 8KsFv/Ox18sFv bzw. 8KsFv/NRK für eine bestimmte Effektor-zu-Target Ratio einem Wilcoxon-Test unterworfen. Die Ergebnisse aller Wertepaare (Effektor-zu-Target-Ratio = 120:1 bis 3:1) zeigten, dass diese geringere spezifische Lyse der anti-RT1.A-Intrabody-transfizierten Keratinozyten signifikant war (p = 0,0051 - 0,0022 für den Vergleich mit Kontrollplasmid transfizierten Keratinozyten; p = 0,0051 - 0,0277 für den Vergleich mit "third-party"-Zellen).


100

Abb. 25: (nächste Seite): Zytotoxizitäts-Test. Inkubiert wurden 1 ( 104 Targetzellen mit der entsprechenden Ratio an Effektorzellen. Gezeigt sind zehn verschiedene Experimente. Deutlich wird, dass anti-Ratten-MHC-I-Intrabody-transfizierte Rattenkeratinozyten (offene Kreise) wesentlich weniger lysiert werden als Kontrollintrabody-infizierte (geschlossene Kreise) oder "third-party"-Zellen (Dreiecke).

Targetzellen:
anti-Ratten-MHC-I-Intrabody- (Ox18sFv) transfizierte DA-Rattenkeratinozyten
Kontrollintrabody (anti-human-MHC-I-Intrabody, 8KsFv) transfizierte DA-Rattenkeratinozyten
Zellen mit differenten MHC-I-Haplotyp ("third-party", NRK-52E)
Effektorzellen:
allogen (mit DA-Rattenmilzzellen) vorstimulierte Lewis-Rattenmilzzellen


101

4.6.2 Transplantation von gezüchteten Rattenhautstücken

Die Transplantation von gezüchteten Rattenhautstücken wird derzeit noch etabliert. Bei der Transplantation von in vitro-generierten Hautschichten ohne ein unterstützendes Trägermaterial (vgl. Abschnitt 0 ) konnten aus technischer Sicht keine befriedigenden Ergebnisse erzielt werden. Hierbei wurden auf vasilinisiertes Gasegewebe aufgezogene Rattenkeratinozytenschichten auf den dorsalen Muskel von Lewis-Ratten transplantiert. Auch die Transplantation von auf Hyaloronsäuremembranen ausgesäten Keratinozyten verlief unbefriedigend.

Die sehr dünnen Hautschichten zeigten eine hohe Scherkraftempfindlichkeit, so dass schon das Aufziehen der kultivierten Keratinozytenschichten auf vasilinisiertes Gasegewebe zur Transplantation problematisch war. Die Ablösung der Gase, auf welche die Keratinozytenschichten zur Transplantation aufgezogen worden waren, gestaltete sich schwierig, da sie zum Teil in die Haut des Tieres eingewachsen war, was eine Zerstörung von potentiell gewachsenem Gewebe möglich machte. Zum Teil entwickelten sich bei den Tieren Infektionen im Transplantatareal, so dass auch hier eine Auswertung unmöglich war. Die histologischen Befunde ergaben, dass bei syngener Transplantation kein epitheliales Gewebe auf dem Muskel gewachsen war. Zudem kam es zur Entwicklung von Granulationsgewebe mit vielen Gefäßen und starker Fibroblastenproliferation - zum Teil auch zur Bildung von Ödemen und Abzessen.

Bei der Verwendung von Hyaloronsäuremembranen zur Generierung der Hautstücke wurden ähnlich schlechte Ergebnisse erzielt, wie ohne unterstützendes Trägermaterial. Histologische Befunde ergaben das Vorhandensein von viel Granulations- und Bindegewebe, keine Existenz Zytokeratin-positiver Zellen und eine starke Proliferation von Fibroblasten.

Zur Zeit werden alternative Methoden für die Transplantation getestet, wie die Aussaat von Keratinozyten auf Hyaloronsäuremembranen oder Kollagengelen, die Verwendung eines Fibrinklebers und das Aufbringen von Keratinozyten auf dermisähnliche Trägermaterialien.


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