Busch, Annette: Minderung der allogenen Immunogenität künstlicher Gewebe am Modell Epithelien durch Suppression der MHC-I-Oberflächenexpression

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Kapitel 5. Diskussion

Die Hauptursache für die immunologische Erkennung und die Rejektion allogener Transplantate ist die Expression von Haupthistokompatibilitätsantigenen auf der Oberfläche eukaryotischer Zellen ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals versucht, die Oberflächenexpression von MHC I durch den Einsatz von Intrabodies zu inhibieren. Bisher wurde dieses Ziel durch die Eliminierung von Genen, deren Produkte zur vollständigen Assemblierung des MHC-I-Komplexes benötigt werden, im Tiermodell verfolgt. Im Gegensatz zu Zellen aus TAP- oder beta2-Mikroglobulin-knock-out Mäusen, die eine Restexpression an MHC-I-Molekülen aufweisen, konnte durch den Einsatz von anti-MHC-I-Intrabodies ein vollständiger "knock-out"-Phänotyp in Ratten- und humanen Zellen erzielt werden, der auch durch Interferon-gamma nicht aufgehoben werden konnte. Die Effektivität der Intrabodies bezüglich ihrer Fähigkeit, die MHC-I-Oberflächenexpression zu senken, wurde durch Vergleich mit einem anderen MHC-I-"downregulatorischen" Molekül, dem adenoviralen Protein p19, das ebenfalls die MHC-I-Expression durch Bindung verhindert, in humanen 293-Zellen untersucht. Dieser qualitative Vergleich ergab, dass der in dieser Arbeit eingesetzte anti-human-MHC-I-Intrabody wesentlich effektiver eine Reduktion der MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche bewirken konnte als p19. Darüber hinaus war die Lyse Intrabody-exprimierender, MHC-I-defizienter Rattenkeratinozyten durch zytotoxische T-Zellen in vitro signifikant schwächer als die untransfizierter Zellen. Der Einsatz anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Keratinozyten im Tissue Engineering und die Transplantation MHC-I-defizienter gezüchteter Hautstücke könnte zu einer verbesserten Akzeptanz des Transplantats führen und eröffnet neue Möglichkeiten, den Bedarf an menschlicher allogener Haut für die Transplantation zu decken. Außerdem könnten diese genetisch manipulierten Hautstücke auf "Vorrat" produziert werden, was die Einsatzzeit dramatisch verkürzen würde. Darüber hinaus wäre dieses Prinzip übertragbar auf andere Zell- bzw. Gewebetransplantate.

5.1 Ein anti-Ratten-MHC-I-Intrabody als Fab-Fragment: Ox18Fab

5.1.1 Synthese und Proteinnnachweis

Nach Klonierung der Genfragmente für die Ketten VLCL und VHCH1 des OX-18-Antikörpers in einen Expressionsvektor wurden diese zunächst auf einige Charakteristika untersucht, um sicherzustellen, dass für alle weiteren Experimente funktionelle Produkte eingesetzt wurden.


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Zuerst wurde durch in vitro-Translation gezeigt, dass Fragmente mit korrekter Länge kloniert wurden. Nach Bestimmung der Sequenz konnten die Antikörperfragmente nach dem Kabat/Chothia-Nummerierungs-Schema in CDR- und Framework-Bereiche eingeteilt werden. Ferner wurden durch den Vergleich der Proteinsequenzen mit denen anderer Proteinen der NCBI-Datenbank ausschließlich Homologien mit Immunoglobulinsequenzen ermittelt, wodurch der Nachweis erbracht wurde, dass tatsächlich funktionelle Antikörperfragmente kloniert wurden.

Durch die Expression des Ox18Fab-Intrabodies in COS-Zellen konnte zum einen bewiesen werden, dass die Stabilität der mRNAs beider Ketten in eukaryotischen Zellen gewährleistet war, zum anderen, dass beide Ketten in gleicher Quantität exprimiert wurden.

5.1.1.1 ER-Retention der Intrabodies: mit oder ohne KDEL?

Das in vielen ER-residenten Proteinen zu findende carboxy-terminale Tetrapeptid KDEL, ist notwendig und ausreichend für die Lokalisation und Retention von Proteinen im Lumen des Endoplasmatischen Retikulums [ 187 , 188 ]. Der Rezeptor für die KDEL-Sequenz, erd 2, ist im cis-Golgi lokalisiert [ 189 ] und bindet dort das KDEL-enthaltende Protein bei einem pH-Optimum von 5,0 [ 190 ]. Da der pH-Wert vom ER in Richtung des trans-Golgi-Netzwerkes sinkt, kann hier erd 2 seinen Liganden mit hoher Affinität binden. Durch die Bindung an erd 2 wird dem Rezeptor signalisiert, das Protein zurück ins ER zu transportieren, wo es aufgrund des neutraleren pH Wertes wieder freigelassen wird und erd 2 wieder an seine Ursprungsstelle zurückkehren kann, wo es für die Bindung neuer Liganden zur Verfügung steht.

Der Ox18Fab-Intrabody wurde sowohl mit als auch ohne KDEL-Retentionssequenz kloniert, da zum Teil auch Intrabodies ohne diese Retentionssequenz im ER zurückgehalten wurden und in einigen Fällen Intrabodies durch die Addition der KDEL-Sequenz im ER degradiert wurden [ 54 ]. Für die meisten Fälle ist jedoch die Addition der KDEL-Sequenz das geeignete Mittel, funktionelle Antikörper im ER zurückzuhalten, wo sie an ihr frisch synthetisiertes Antigen binden können. Um die erwähnten, eventuell deletiösen Effekte durch das KDEL-Signal einkalkulieren zu können, wurden beide Varianten des Intrabodies synthetisiert. Bei der Expression in Cos Zellen zeigte sich jedoch, dass beide Varianten in gleich großer Quantität vorlagen, so dass davon ausgegangen werden konnte, dass dies auch in anderen Zellen der Fall ist.


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5.1.2 Expression von Ox18Fab in der epithelialen Rattenzelllinie NBT-II

Es konnte kein signifikanter Effekt des Ox18Fab- bzw. Ox18FabKDEL-Intrabodies auf die RT1.A-Expression von NBT-II-Zellen festgestellt werden. Da Intrabodies als "single chain"-Fragmente oft eine höhere Stabilität besitzen als Fab-Fragmente [ 72 , 73 ], wurde der Ox18-Intrabody dann als sFv-Fragment kloniert. Des Weiteren wurde ein vom amerikanischen Kooperationspartner parallel hergestellter sFv-Intrabody gegen das humane MHC-I-Molekül getestet.

5.2 Intrabodies als "single chain"-Fragmente: 8KsFv und Ox18sFv

Schon bei transienter Expression des anti-human-MHC-I-Intrabodies 8KsFv in 293-Zellen konnte eine deutliche Reduktion der MHC-I-Oberflächenexpression detektiert werden. Es konnten weiterhin stabil-Intrabody-exprimierende Einzelklone mit einer starken "Downregulation" der MHC-I-Oberflächenexpression generiert werden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden primäre humane Keratinozyten durch adenoviralen Gentransfer mit dem 8KsFv-Intrabody transduziert. Auch hier konnte im Gegensatz zu uninfizierten oder mit Kontrollkonstrukt transduzierten Keratinozyten eine starke Reduktion der MHC-I-Oberflächenexpression erreicht werden.

Die positiven Ergebnisse bei dem Einsatz des 8K-"single chain"-Intrabodies konnten jedoch nicht für den Ox18sFv-Intrabody reproduziert werden. Die generierten NBT-II-Klone zeigten keine signifikante Änderung ihrer RT1.A-Oberflächenexpression gegenüber untransfizierten Zellen. Es lag die Vermutung nahe, dass eine unzureichende Intrabody-Expression der Zellen die Ursache für das Ausbleiben des phänotypischen Effekts war. Daher wurden einige der Klone mittels Immunopräzipitation auf das Vorhandensein von Intrabody-Proteinen untersucht: es konnten auf Proteinebene keine Intrabody-Expression in den Zellen nachgewiesen werden. Da diese Analytik für alle Klone zu aufwendig gewesen wäre, wurde eine neue Strategie entwickelt, Intrabody-exprimierende Zellen zu detektieren.

5.3 Intrabody-GFP-Fusionsproteine: Ox18sFvGFP, 8KsFvGFP

Eine gute Möglichkeit zur Detektion exprimierter Proteine ist ihre Fusion mit dem "green fluorescent protein" GFP. Dabei ist nicht immer gewährleistet, ob die fusionierten Proteine ihre Funktion beibehalten. Durch die Fusion können wichtige Domänen umgefaltet oder sterisch behindert werden, so dass die ursprüngliche Funktion des Proteins verloren geht. Bei Intrabodies war dies nicht zu erwarten, da das GFP am C-Terminus fusioniert wird und die Antigen-Bindungsstelle am N-Terminus der beiden Ketten lokalisiert ist. Durch die Fusion der Intrabodies mit dem GFP-Molekül war erstmals eine Korrelation zwischen Intrabody-


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Expression und MHC-I-Oberflächenexpression möglich. Transient-Intrabody-exprimierende Rattenkeratinozyten sowie 293-Zellen zeigten bei Transfektion mit dem spezifischen anti-MHC-I-Intrabody eine deutliche Reduktion der MHC-I-Oberflächenexpression - im Gegensatz zu Kontrollintrabody-transfizierten oder uninfizierten Zellen.

Die Fusion des Intrabodies mit dem GFP-Molekül resultierte außerdem in einer besseren Effektivität der MHC-I-"Downregulation" als ein parallel untersuchtes Ox18sFv-Intrabody-Konstrukt in einem bicistronischer Vektor mit GFP in der zweiten Kassette. Der Grund hierfür könnte in der Größe des Fusionsmoleküls liegen, wodurch es besser im ER zurückgehalten wird oder eine längere Halbwertzeit besitzt. Möglich wäre auch, dass die Addition der KDEL-Sequenz an den C-Terminus des GFP eine bessere Bindung des erb-2-Rezeptors an das Fusionsmolekül ermöglicht als die Addition der Sequenz an das Intrabody-Molekül. Mögliche sterische Vorteile könnten bei der Bindung eine Rolle spielen. Als Resultat würde das Fusionsmolekül effektiver im ER zurückgehalten werden.

An dieser Stelle ist anzumerken, dass davon ausgegangen werden kann, dass die exprimierten Intrabodies nicht zusammen mit RT1.A-Molekülen an die Zelloberfläche transportiert werden und die Bindung des für die RT1.A-Oberflächenmarkierung eingesetzten F16-Antikörpers sterisch behindern (was zu falschen Ergebnissen führen würde), da intrazellulär eine erhöhte Anzahl an RT1.A-Molekülen in Intrabody-exprimierenden Zellen detektierbar war (vgl. Abschnitt 0 ) - hier also keine Blockierung der Bindung von anti-RT1.A-Antikörpern durch die (in großer Menge vorhandenen) Intrabodies zu verzeichnen war.

5.3.1 Eine hohe Quantität an anti-MHC-I-Intrabodies ist essentiell für eine effektive Reduktion der MHC-I-Oberflächenexpression

Ein wichtiger Faktor für eine effektive RT1.A-"Downregulation" ist eine ausreichende Quantität an Intrabody-Molekülen. Erst bei einer bestimmten Menge an intrazellulär produzierten Intrabody-Molekülen wurde eine Reduktion der RT1.A-Oberflächenexpression erreicht. Es müssen alle schweren Ketten des RT1.A-Moleküls intrazellulär durch Intrabodies gebunden werden. Möglich ist außerdem eine geringere Halbwertzeit des Intrabodies als die des RT1.A-Moleküls mit einer Überproduktion an Intrabodies kompensiert werden muss. Jeder (transient) RT1.A-bindende Intrabody würde in diesem Fall durch einen zweiten, neu synthetisierten Intrabody ersetzt werden, welcher die weitere Retention des RT1.A-Moleküls gewährleistet. Um hier jedoch eine definitive Aussage treffen zu können, müsste die


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Halbwertszeit des Ox18-Intrabodies mit der des RT1.A-Moleküls verglichen werden. Hierfür müssten z.B. "pulse chase"-Assays durchgeführt werden, bei denen in der Zelle der Einbau radioaktiver Aminosäuren in das Protein erfolgt und die Präsenz der so markierten Proteine über einen bestimmten Zeitraum untersucht wird.

5.3.2 Anti-human-MHC-I-Intrabodies sind effektiver in der Reduktion der MHC-I-Oberflächenexpression als das adenovirale Protein p19

Ein interessanter Aspekt im Rahmen dieser Arbeit war es, zwei hochdifferenzierte Moleküle bezüglich der Fähigkeit, eine MHC-I-"Downregulation" auf der Zelloberfläche zu erzielen, miteinander zu vergleichen: das adenovirale Protein p19, das von dem Virus synthetisiert wird, um eine Präsentation viraler Proteine durch die Wirtszelle zu vermeiden und so der Immunantwort zu entkommen - und das (intrazellulär lokalisierte) monoklonale Antikörperfragment, das sein Antigen, das MHC-I-Molekül, mit einer sehr hohen Spezifität bindet.

Beim Vergleich des anti-human-MHC-I-Intrabodies 8KsFvGFP mit dem adenoviralen Protein p19 bezüglich der Fähigkeit, eine MHC-I-"Downregulation" in 293-Zellen zu erzielen, zeigte sich der Intrabody als das wesentlich effektivere Molekül. Erklärbar wäre dieses Phänomen mit einer geringeren Affinität von p19 zum MHC-I-Molekül. Es ist bekannt, dass p19 eine unterschiedliche Affinität zu verschiedenen HLA-Haplotypen aufweist: so bindet es mit hoher Affinität an HLA-A2.1 und -B7, jedoch weniger stark an HLA-A3 [ 191 ]. Die 293-Zelllinie besitzt den Haplotyp HLA-A3/HLA-B7. Die verminderte Bindung an HLA-A3 könnte für die geringere "Downregulation" der MHC-I-Gesamt-Oberflächenexpression auf 293-Zellen verantwortlich sein. Die zusätzliche Funktion von p19 als Tapasin-Kompetitor scheint in diesem Fall nicht auszureichen, um die schwächere Affinität zum MHC-I-Molekül zu kompensieren. Des Weiteren könnte die geringere Affinität des p19-Proteins gegenüber dem MHC-Molekül in seiner Funktion für das Adenovirus begründet sein: da die Verbreitung des Virus in der Regel über periphere Blutzellen erfolgt, die bei vollständiger MHC-I-Defizienz ein potentielles Ziel für NK-Zellen darstellen würden, könnte es für die Propagierung des Virus besser sein, nur eine verminderte MHC-I-Oberflächenexpression zu erzielen. Möglich ist jedoch auch, dass im Virusgenom weitere Proteine kodiert werden, die synergistisch mit p19 wirken. Dieses aufzuklären war jedoch nicht Ziel dieser Arbeit.

Es kann ausgeschlossen werden, dass der Grund für die unterschiedliche Retentionsfähigkeit in den unterschiedlichen Retentionssequenzen (KDEL vs. K(X)KXX) der beiden Moleküle


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liegt, da beide als GFP-Fusionsmoleküle eingesetzt wurden und somit beide das carboxyterminale Ende "-GFPKDEL" enthielten.

Die Verwendung von Intrabodies ist die bessere Lösung, um eine effektive "Downregulation" der MHC-I-Oberflächenexpression zu erzielen, da hier eine gleich starke Bindung an alle MHC-I-Haplotypen gewährleistet ist und sie - im Gegensatz zu MHC-I-bindenden viralen Proteinen - universell einsetzbar sind.

Um die Effizienz der MHC-I-"Downregulation" noch weiter zu steigern, wäre eine Kombination von viralen Proteinen wie US2 oder US11 und anti-MHC-I-Intrabodies denkbar. Bei Zellen beispielsweise, die keine so hohe Intrabody-Expression tolerieren, wie die in dieser Arbeit verwendeten Rattenkeratinozyten, könnte dieser Ansatz von Bedeutung sein. Durch den durch die viralen Proteine vermittelten Export an MHC-I-Molekülen aus dem ER und die nachfolgende Proteolyse wären weniger Intrabodies erforderlich, um die verbleibenden MHC-I-Moleküle zu binden. Außerdem könnte dieser Kombinationsansatz eine geringere Belastung der Zelle zur Folge haben, da weniger MHC-I-Moleküle intrazellulär akkumuliert vorliegen würden.

5.4 Charakterisierung anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Zellen

Es konnte gezeigt werden, dass die anti-MHC-I-Intrabody-exprimierenden Zellen sich morphologisch und physiologisch nicht von untransfizierten Zellen unterscheiden. Diese Erkenntnis ist für den Nachweis der ausschließlichen Spezifität der Intrabodies für ihre Antigene als auch für den weiteren Einsatz der Zellen in vivo von Bedeutung.

5.4.1 Andere Oberflächenmoleküle werden durch die Expression von Intrabodies nicht beeinträchtigt

Die Untersuchung der konstitutiv exprimierten Antigene CD46, CD49b, CD49d CD55 sowie CD58 als auch der regulierbaren bzw. induzierbaren Antigene RT1.B und ICAM-1 ergab keine signifikant differente Expression auf Intrabody-exprimierenden Zellen im Vergleich zu untransfizierten Zellen. Außerdem waren sowohl Intrabody-transfizierte als auch uninfizierte Zellen durch Interferon-gamma aktivierbar, was sich vor allem in der Induktion von RT1.B (Ratten-MHC-Klasse-II) wiederspiegelte.


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5.4.2 Akkumulation von MHC-I-Molekülen in Intrabody-exprimierenden Zellen

Es wurde eine deutlich erhöhte Anzahl an MHC-I-Molekülen in Intrabody-exprimierenden Keratinozyten und 293-Zellen im Vergleich zu untransfizierten Zellen nachgewiesen. Die Stärke der MHC-I-Akkumulation ist Zelltyp-abhängig. In den im Rahmen der Arbeit untersuchten Zellen war ein beträchtliches Ausmaß an akkumulierten Molekülen erkennbar, in Experimenten anderer Mitarbeiter, z.B. bei adenoviralem Gentransfer von Intrabodies in HaCat Zellen, war keine so hohe Akkumulation detektierbar. Wie der finale proteolytische Abbau der MHC-I-Moleküle in der Zelle erfolgt, ist unklar.

5.4.3 In stark Intrabody-exprimierenden Zellen kann der MHC-I-"knock-out"-Phänotyp nicht durch Interferon-gamma aufgehoben werden

Da bei Hauttransplantationen oft ein Entzündungmilieu vorherrscht, wurde diese Entzündungsreaktion in vitro durch Zugabe des proinflammatorischen Zytokins Interferon-gamma, das die MHC-I-Expression auf Zellen heraufreguliert, simuliert und die MHC-I-Expression Intrabody-exprimierender Zellen analysiert. Bei dieser Untersuchung wurde noch einmal deutlich, dass eine sehr starke Expression von anti-MHC-I-Intrabodies benötigt wird, um alle MHC-I-Moleküle intrazellulär zurückzuhalten - es ist jedoch möglich, diese Expressionsraten zu erreichen.

5.5 Immunogenität anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Zellen in vitro

5.5.1 Geringere lytische Aktivität zytotoxischer T-Zellen gegenüber Intrabody-exprimierenden Zellen

Ein wichtiger Beweis für die funktionelle Bedeutung der MHC-I-"Downregulation" durch Intrabodies war die stark verminderte zytolytische Aktivität zytotoxischer T-Zellen gegenüber Intrabody-exprimierenden Rattenkeratinozyten: diese Zellen mit einem RT1.A-"knock-out"-Phänotyp sind in vitro weitaus weniger immunogen als unmodifizierte Keratinozyten. Dieses Ergebnis lässt auf eine ebenfalls geringere Immunogenität eines Hauttransplantats mit verbesserter Akzeptanz in vivo hoffen.


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5.6 Immunogenität anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Zellen in vivo

5.6.1 Das "NK-Zell-Problem"

NK- (natural killer) Zellen sind große granuläre Lymphozyten, die die Fähigkeit besitzen, Tumore, virus-infizierte Zellen und allogene Lymphoblasten zu erkennen und zu töten. Hierzu bedarf es keines vorherigen Kontakts mit dem Antigen: NK-Zellen leisten damit einen wichtigen Beitrag zur angeborenen Immunität. Ein Hauptmerkmal der NK-Zell-Aktivität ist ihre Inhibierung durch MHC-I-Moleküle, die auf der Oberfläche ihrer Zielzellen exprimiert werden. Durch diesen Mechanismus kann das Immunsystem Zellen eliminieren, die durch Virus-Infektion oder Transformation eine verminderte MHC-I-Oberflächenexpression aufweisen.

NK-Zellen und einige T-Zellpopulationen erkennen MHC-I-Moleküle spezifisch durch die inhibitorische Rezeptorfamilie der KIRs ("killer immunoglobulin-like receptors"), die Familie der ILTs ("immunoglobulin-like transcripts") und dem Rezeptorkomplex CD94-NKG2 [ 192 ].

Die Familie der KIRs ist in strukturell in zwei Unterfamilien eingeteilt: einige KIRs haben zwei Immunoglobulin-Domänen (KIR2D), andere drei (KIR3D). KIRs variieren außerdem in der Länge ihrer zytoplasmatischen Domäne: KIRs mit einer langen zytoplasmatischen Domäne (L = "long") vermitteln ein inhibitorisches Signal, KIRs mit einer kurzen Domäne (S = "short") bewirken eine Aktivierung der NK-Zell- (oder T-Zell-) Antwort [ 193 ]. So werden den Mitgliedern der KIR-Familie z.B. die Namen KIR3DL oder KIR2DS zugeordnet. Das inhibitorische Signal wird durch sogenannte ITIMs ("immunoreceptor tyrosine-based inhibition motivs") innerhalb des zytoplasmatischen Teils vermittelt, die die Tyrosinphosphatasen SHP-1 und SHP-2 rekrutieren, welche potentiell an der Inhibierung der NK-Zellfunktion beteiligt sind [ 194 ]. Das aktivierende Signal der Rezeptoren KIR2DS/KIR3DS wird durch die Bindung von DAP12-Dimeren eingeleitet [ 195 ]. Diese ITAM- (immunoreceptor tyrosine-based activation motiv) enthaltenden Proteine rekrutieren ihrerseits die Tyrosinkinasen ZAP70 und syk, was in einer finalen Aktivierung der Zelle resultiert. Jeder KIR-Rezeptor erkennt eine Reihe von klassischen MHC-I-Alloantigenen.

Auch die Familie der ILTs unterteilt sich in ITIM-enthaltende und ITIM-negative Moleküle. Die ersteren vermitteln (möglichweise auch über SHP-1) bei Bindung von MHC-I-Molekülen wie KIR2DL/KIR3DL ein inhibitorisches Signal, das zur Herabregulierung der zytotoxischen Aktivität in T- und NK-Zellen führt [ 196 ]. Die Erkennung von MHC-I-Molekülen durch inhibitorische Rezeptoren scheint also einen generellen immunoregulatorischen Mechanismus darzustellen.


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Der spezifische Ligand für die lektin-ähnlichen CD94-NKG2-Rezeptoren ist das nicht-klassische MHC-I-Molekül HLA-E [ 197 - 199 ]. HLA-E wird durch einen TAP-abhängigen Mechanismus zusammen mit Peptiden aus Signalsequenzen anderer MHC-I-Alloantigene assembliert [ 200 , 201 ]. Daher wird angenommen, dass durch die Detektion von HLA-E die generelle Biosynthese an MHC-I-Molekülen überwacht werden kann. Auch die CD94-NKG2-Rezeptoren können ein inhibitorisches oder ein aktivierendes Signal vermitteln: der Komplex CD94-NKG2A bildet einen inhibitorischen Rezeptor, der durch die ITIM-enthaltene NKG2A-Untereinheit SHP-Tyrosinphosphatasen rekrutiert [202] - dagegen bildet CD94 durch Assoziation mit dem NKG2C-Protein einen aktivierenden Rezeptor, der an DAP12 bindet [ 203 ].

Über die aktivierenden NK-Zell-Rezeptoren und ihre Liganden ist noch wenig bekannt. Neben den schon erwähnten Rezeptoren scheint die lektin-ähnliche NKR-P1-Familie mit der Spezifität für bestimmte Oligosaccharide auf der Zelloberfläche ein aktivierendes Signal zu vermitteln [ 204 , 205 ]. Es wird spekuliert, ob transformierte Zellen wie z.B. Tumorzellen durch den NKR-P1-Rezeptor erkannt werden. Weitere aktivierende Rezeptoren sind NKp46, NKp44 und NKp30 [ 206 - 210 ]. Es sind wahrscheinlich noch viele weitere Rezeptoren in der Aktivierung von NK-Zellen involviert; ebenso sind vermutlich auch noch nicht alle inhibitorischen Rezeptoren bekannt.

Ob NK-Zellen bei der Erkennung MHC-I-defizienter Organe eine Rolle spielen wurde bis jetzt nicht beschrieben Sie sind jedoch in der Lage, syngene MHC-I-defiziente Lymphoblasten und Knochenmarkzellen von beta2-Mikroglobulin- oder TAP-knock-out Spendern zu lysieren [ 211 - 213 ]. Die Transfektion dieser NK-Zell-sensitiven Zellen mit HLA-A- oder -B-Molekülen resultierte in einer Resistenz der Zellen gegenüber der NK-Zell-vermittelten Zytotoxizität [ 214 , 215 ]. Die Transplantation allogener Hauttransplantate beta2-Mikroglobulin-defizienter Mäuse führte hingegen zu keiner NK-Zell-vermittelten Zytotoxizität in Wildtyp-Empfängern [ 49 ]. Diese Nicht-Reaktivität könnte damit erklärt werden, dass Zellen in Organverband - im Gegensatz zu hämatopoetischen Einzelzellen - keine NK-Zell-aktivierenden Signale vermitteln, sei es durch das Fehlen entsprechender Oberflächenproteine oder durch das sie umgebende Milieu.

Sollten NK-Zellen bei der Rejektion anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Hauttransplantate dennoch eine Rolle spielen, wäre die zusätzliche Transfektion der Keratinozyten mit NK-Zell-inhibitorischen Molekülen, wie dem nicht-klassischen MHC-I-Molekül HLA-G, ein Lösungsansatz. HLA-G wird auf Plazentazellen, die vom Fetus stammen und in die Gebärmutterwand einwandern, exprimiert [ 216 - 218 ]. Die Kombination aus dem Fehlen klassischer MHC-I-Moleküle und der Expression von HLA-G schützt möglicherweise den Fetus vor einem Angriff durch zytotoxische T-Zellen und NK-Zellen. Ferner ist es auf der


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Oberfläche einiger Melanomzellen exprimiert, was - durch den Schutz vor NK-Zellen - eine Tumorprogression begünstigen würde [ 219 ]. Des Weiteren konnte die MHC-I-negative, NK-Zell-sensitive Zelllinie 721.221 durch die Transfektion mit HLA-G vor der NK-Zell-vermittelten Zytotoxizität geschützt werden [ 220 ].

Die Rezeptoren für HLA-G sind teilweise aufgeklärt. Ob KIRs eine Rolle spielen ist unklar - es wird vermutet, dass der KIR2DL4-Rezeptor eine Rolle spielt [ 221 ]. Ein spezifischer Ligand für das HLA-G-Molekül ist eindeutig der ILT2-Rezeptor, der neben HLA-G ein breites Spektrum an MHC-I-Molekülen erkennt [ 196 ]. Eine weitere Interaktion der NK-Zelle mit dem HLA-G-Molekül findet durch den CD94-NKG2-Komplex statt: HLA-G enthält in der Leadersequenz ein Nonamer-Peptid, das HLA-E stark stabilisiert (und so in einer verstärkten Oberflächenexpression resultiert) und durch den CD94-NKG2-Komplex erkannt werden kann [ 199 ]. Ein solches Signalpeptid ist ebenfalls in dem kürzlich entdeckten UL40-Protein des Zytomegalievirus enthalten und führt auch hier zur Stabilisierung und verstärkten Expression an HLA-E [ 222 ]. CD94-NKG2 bindet nicht direkt an HLA-G, da HLA-E-deletierte Zellen nicht gegen die Lyse durch CD94-NKG2-positive NK-Zellklone geschützt sind [ 223 ].

5.7 Ausblick: Einsatz anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Zellen beim Tissue Engineering

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte keine Aussage darüber gemacht werden, ob der Einsatz von anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Keratinozyten im Hauttransplantationsmodell zu einer verminderten Abstoßungsreaktion führt, da die Transplantation von gezüchteten Rattenhautstücken technisch noch nicht etabliert war. Eine weitere Möglichkeit für die Hauttransplantation im Rattenmodell wäre die Aussaat einer Keratinozytensuspension in das Wundbett, unter die Transplantationskammer. Durch die Verwendungen eines kommerziell erhältlichen Fibrinklebers könnte eine Stabilisierung der Wunde erreicht werden und die Zellen hätten die Möglichkeit, auf dem Wundbett zu proliferieren und einen Zellverband in situ zu bilden. Bei mehrschichtigem Wachstum der Zellen wäre die Ausbildung einer dünnen Hautschicht auf der Wunde möglich. Diese vielversprechende Methode wurde auch tierexperimentell im Vergleich mit "Keratinozyten-Sheets" getestet [ 224 ]. Erste Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Einsatz von Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspensionen im athymischen Nacktmausmodell zu einer makroskopisch und mikroskopisch vergleichbaren Wundheilung führt wie der konventioneller "Sheet-Transplantate". In der Frühphase der Wundheilung entwickelt sich nach Transplantation der Keratinozyten-Fibrinkleber-Suspension eine reifere Basalmembran als nach "Sheet-Transplantation", was eine stabilere Haftung an der Dermis bewirkt, welche die Belastbarkeit des Hauttransplantats steigert. Eine weitere Möglichkeit wäre die in vitro-


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Herstellung eines Kollagengels aus Rattenschwanzkollagen mit oder ohne Fibroblasten und ausgesäten Keratinozyten. Diese Methode wird derzeit erfolgreich im Mausmodell von der Gruppe Fusenig (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg) eingesetzt [ 225 ]. Eine dritte Strategie zur Generierung transplantierbarer Hautschichten wäre das Aufbringen der kultivierten Keratinozyten auf eine dermisähnlichen Basis (Epiflex®, Deutsches Institut für Zell- und Gewebeersatz GmbH, DIZG, Abteilung Gewebebank Leipzig). Durch diese stabile Unterlage wären die sehr dünnen "Keratinozyten-Sheets" weniger scherkraftempfindlich und besser transplantierbar.

Sollten sich allogene anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Keratinozyten tatsächlich im Tiermodell als vermindert immunogen und ohne Abstoßungsreaktion transplantierbar erweisen, wären sie in der Transplantationsmedizin vielfältig einsetzbar. Sie könnten anstelle autologer bzw. allogener epidermaler Transplantate eingesetzt werden. Beim Ersatz autologer Keratinozyten könnte die langen Wartezeiten vermieden werden, beim Ersatz allogenener Keratinozyten die stille Abstoßungsreaktion. Obwohl diese stille Rejektion ohne klinische Merkmale verläuft, könnte bei großflächigen Wunden problematisch werden und außerdem eine Sensibilisierung zur Folge haben, die bei mehrmaliger Transplantation (chronische Wunden) zu einer akzelerierten Abstoßungsreaktion führen könnte.

Bereits kommerziell erhältliche synthetische Wundabdeckungen wie Alloderm, Integra oder Dermagraft-TC könnten durch die Kombination mit diesen MHC-I-defizienten Keratinozyten in ihrer Qualität verbessert werden. In die Dermalschicht könnten die modifizierten Keratinozyten eingesät werden, die dann die epidermale Komponente der Haut synthetisieren würden. Intrabody-exprimierende Keratinozyten würden in Kombination mit Alloderm dessen synthetische Dermis mit einer vitalen Epidermis ausstatten, die in der Lage wäre, heilungsfördernde Faktoren zu sezernieren. Ferner könnte die MHC-I-defiziente epidermale Schicht die Silikon-Epidermis von Integra oder Dermagraft-TC ersetzen. Hierdurch könnte die Entfernung der Silikonmembran und die notwendige Zweittransplantation autologer Haut vermieden werden.

Eine weitere Möglichkeit wäre, die bisher verwendeteten allogenen fetalen Keratinozyten in Apligraf zu ersetzten. Zusätzlich könnten durch Intrabody-Expression auch MHC-I-defiziente Fibroblasten generiert werden, die ebenfalls anstelle der fetalen Zellen eingesetzt werden könnten. Da es bei der derzeitigen Gesetzeslage in Deutschland in naher Zukunft nicht möglich sein wird, Zellen fetalem Ursprungs zu Transplantationszwecken einzusetzen, wäre eine Verwendung dieses "modifizierten Apligraf"-Produkts in der deutschen Transplantationsmedizin möglich. Hinzu kommt, dass ein Großteil der Bevölkerung die kommerzielle Verwendung fetalen Materials in der Medizin aus ethischen Gründen ablehnt.


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Bei dem Einsatz anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Keratinozyten in der Hauttransplantation muss selbstverständlich gewährleistet sein, dass mit den Zellen keine Viruserkrankungen auf den Patienten übertragen werden. Ein Restrisiko wird dabei - wie bei jeder Verwendung lebendigen Materials - leider nicht auszuschließen sein. Da die Zellen jedoch nur eine beschränkte Lebenszeit haben und später durch körpereigene Zellen ersetzt werden, ist das Risiko jedoch relativ gering.

Der Ansatz der Züchtung (anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender) nicht-immunogener, allogener Zellen für das Tissue Engineering kann auf weitere Transplantate übertragen werden: z.B. können Chondrozyten für die Knorpeltransplantation gezüchtet werden, Hepatozyten in der Entwicklung artifizieller Leberorganoide eingesetzt werden, Inselzellen bei von Diabetes mellitus transplantiert werden, Nervenzellen in der Zelltransplantation beim Parkinson-Syndrom eingesetzt werden oder die Endothelialisierung künstlicher Bypässe verwirklicht werden.

Neben dem großen Einsatzgebiet in der Transplantation ist eine Testung der Intrabody-exprimierenden Keratinozyten im Rattentransplantationsmodell auch für die Grundlagenforschung sehr interessant. Alle bisher publizierten Transplantations-Experimente wurden mit Transplantaten aus beta2-Mikroglobulin- oder TAP-knock-out Mäusen durchgeführt, bei denen keine vollständige Entfernung aller MHC-I-Moleküle auf der Zelloberfläche erreicht werden konnte. Hinzu kommt, dass in diesen Modellen nie die MHC-I-Expression unter inflammatorischen Bedingungen, wie dem Vorhandensein von Interferon-gamma, quantifiziert wurde. Die wenigen nicht zurückgehaltenen MHC-I-Moleküle könnten für die Erkennung durch zytotoxische T-Zellen ausreichend sein und vor allem bei der Transplantation von Haut zu einer (in der Regel sehr starken) Rejektion führen. So wurden z.B. Hauttransplantate beta2-Mikroglobulin-defizienter Mäuse von Wildtyp-Mäusen abgestoßen und es wurde von den Autoren Lee et al. diskutiert, dass hierfür die Restexpression an MHC-I-Molekülen auf der Zelloberfläche verantwortlich sein könnte [ 42 ]. Durch den in vivo-Einsatz von Intrabody-exprimierenden, phänotypischen MHC-I-"knock-out"-Keratinozyten im allogenen Transplantationsmodell ist es nun möglich, die Bedeutung des MHC-I-Moleküls für die allogene Rejektion näher zu charakterisieren.


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