Minderung der allogenen Immunogenität künstlicher Gewebe am Modell Epithelien durch Suppression der MHC-I-Oberflächenexpression
Zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturatium (Dr. rer. nat.)
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin
Dipl.-Ing. (FH) Biotech. Annette Busch
Die Expression von Haupthistokompatibilitätsantigenen auf der Zelloberfläche kernhaltiger Zellen ist die Hauptursache für die Detektion durch das Immunsystem und die Rejektion allogener Transplantate. Eine vielversprechende Strategie, die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche zu senken, ist der Einsatz intrazellulär lokalisierter Antikörpern, sogenannter Intrabodies. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals versucht, eine die Expression an MHC-I-Molekülen auf der Zelloberfläche durch den Einsatz von anti-MHC-I-Intrabodies zu verhindern.
Ein Hauptproblem in der Transplantation ist der Mangel an geeignetem Spendermaterial. Um diesem Zustand entgegenzuwirken, wird versucht, adäquaten Organersatz durch Tissue Engineering bereitzustellen. Die in vitro-Züchtung autologer epithelialer Zellen zur Generierung transplantierbarer Hautstücke spielt heute bereits eine große Rolle bei der Transplantation artifizieller Gewebe. Ferner werden diverse vollsynthetische Materialien für diesen Zweck hergestellt. Eine Verbesserung in diesen Bereich würde die Generierung von nicht-immunogenen allogenen Keratinozyten darstellen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden primäre Rattenkeratinozyten mit anti-MHC-I-Intrabodies transfiziert. Diese Zellen zeigten einen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp, der in stark Intrabody-exprimierenden Keratinozyten auch nicht durch Interferon-
verändert werden konnte. Eine starke Expression der Intrabodies war essentiell für die vollständige Zurückhaltung aller MHC-I-Moleküle in der Zelle. Neben der Applikation von Intrabodies in Rattenkeratinozyten konnte die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche von 293-Zellen und primären humanen Keratinozyten ebenfalls durch die Expression von anti-MHC-I-Intrabodies vermindert werden. Intrabodies als GFP-Fusionsproteine waren in der MHC-I-Retention effizienter als Intrabody-Moleküle allein. Im Vergleich mit dem ebenfalls MHC-I-bindenden adenoviralen Protein p19 bewirkten die eingesetzten anti-MHC-I-Intrabodies bei gleich starker Expression eine wesentlich stärkere "Downregulation" der MHC-I-Oberflächenexpression von 293-Zellen. Intrabody-exprimierende Zellen zeigten keine signifikanten morphologischen oder physiologischen Veränderungen gegenüber untransfizierten Zellen: Wachstum, die Expression anderer Oberflächenmoleküle und morphologische Erscheinung waren unverändert. Es konnte lediglich eine verstärkte intrazelluläre Akkumulation von MHC-I-Molekülen detektiert werden. Die funktionelle Bedeutung der MHC-I-"Downregulation" durch Intrabodies konnte durch die stark verminderte zytolytische Aktivität zytotoxischer T-Zellen gegenüber Intrabody-exprimierender Rattenkeratinozyten im Vergleich zu unmodifizierten Zellen gezeigt werden.
In der vorliegenden Arbeit ist es erstmals gelungen, Zellen mit einem vollständigen MHC-I-"knock-out"-Phänotyp zu erzeugen - bisherige Modifikationen der MHC-I-Oberflächenexpression durch die Generierung 
2-Mikroglobulin- oder TAP-defizienter Mäuse führte zu keinem restlosen Verlust der Klasse-I-Moleküle auf der Zelloberfläche. MHC-I-"downregulierte" Keratinozyten könnten in der Hauttransplantation anstelle der limitiert zur Verfügung stehenden autologen Zellen eingesetzt werden oder in Kombination mit synthetischen Materialien verwendet werden, wo sie durch die Sekretion von heilungsfördernden Faktoren eine Verbesserung des Wundheilungsprozesses bewirken würden.
The expression of major histocompatibility antigens on the surface of eucaryotic cells is the predominant reason for immunologic detection and the rejection of allogeneic transplants. A promising strategy to lower the MHC I expression on the cell surface is the use of intracellular localized antibodies, termed intrabodies. In this work it has been tried for the first time to prevent the expression of MHC class I molecules on the cell surface by intrabody expression.
A major problem in transplantation is the shortage of suitable donor material. To overcome this situation tissue engineering has and will continue to enlarge the scope of organ grafting. Today, the in vitro culture of autologous epithelial cells to generate transplantable skin sheets plays an important role in the transplantation of artificial tissues. Furthermore various fully synthetic materials are produced for transplantation. An improvement in this field could be the generation of non-immunogeneic allogeneic keratinocytes.
Within this work primary rat keratinocytes have been transfected with anti-MHC-I-Intrabodies. These cells show a MHC I “knockout“ phenotype, that could not be altered by IFN-. A strong intrabody expression was essential for the complete retention of all MHC I molecules inside the cell. Besides the application of intrabodies in keratinocytes the MHC I expression on the surface of 293 cells and human primary keratinocytes could be reduced by anti-MHC I intrabodies as well. Intrabodies in the form of GFP fusion proteins were more efficient in retaining MHC I molecules than intrabodies alone. In comparison with the also employed adenoviral protein p19 the applied intrabodies generated at the same expression level a much stronger down-regulation of the MHC I surface expression of 293 cells. Intrabody expressing cells did not show any significant morphologic or physiologic alterations compared to untransfected cells: growth, the expression of other surface molecules and the morphological appearance were unaltered. Merely an enhanced intracellular accumulation of MHC I molecules could be detected. The functional relevance of the MHC I down-regulation by intrabodies could be shown by the strong diminished cytolytic activity of cytotoxic T cells to intrabody expressing rat keratinocytes in comparison to unmodified cells.
In this work cells with a completely MHC I knock-out phenotype has been successfully generated for the first time - modifications of the MHC I surface expression by generation of 2-microglobulin or TAP deficient mice did not lead to a complete loss of all MHC I molecules on the cell surface so far. MHC I down-regulated keratinocytes could be employed in skin transplantation instead of the limited available autologous cells or utilized in combination with synthetic materials where they would induce an improvement of the healing process by the secretion of cytokines.
Inhaltsverzeichnis |
| Titelseite | Minderung der allogenen Immunogenität künstlicher Gewebe am Modell Epithelien durch Suppression der MHC-I-Oberflächenexpression |
| 1
| Einleitung |
| 1.1 | Möglichkeiten und Grenzen des Gewebeersatzes - Problem der Immunogenität allogener/syngener Transplantate |
| 1.2 | Grundlagen: Prozesse bei der Rejektion von Transplantaten |
| 1.2.1 | Der Ort des Eingriffs: Die MHC-I-assoziierte Antigenpräsentation |
| 1.3 | MHC-I-defiziente Organe: verbesserte Akzeptanz bei Transplantationen? |
| 1.3.1 | Eliminierung von TAP und 2-Mikroglobulin |
| 1.3.2 | Transplantation MHC-I-defizienter Organe |
| 1.4 | Inhibierung der MHC-Oberflächenexpression durch Intrabodies |
| 1.4.1 | Was sind Intrabodies? |
| 1.4.2 | Welche Intrabodies wurden bisher beschrieben? |
| 1.4.3 | Inhibierung des MHC-I-Transports durch Bindung an MHC I |
| 1.4.4 | Proteolytische Spaltung des MHC-I-Moleküls |
| 1.4.5 | Inhibierung der Peptid-Translokation/-Beladung |
| 1.5 | Tissue Engineering: Herstellung von Gewebeverbänden in vitro |
| 1.5.1 | Was ist Tissue Engineering? |
| 1.6 | Tissue Engineering der Haut - ein potentielles Einsatzgebiet für
MHC-I-modifizierte Epithelzellen? |
| 1.6.1 | Tissue Enginering der Epidermis |
| 1.6.2 | Tissue Enginering der Dermis |
| 1.6.3 | Tissue Engineering von kombinierter Dermis und Epidermis |
| 1.6.4 | Tissue Engineering mit Einsatz lebender Zellen: "Living Skin Equivalents" |
| 1.7 | Aufgabenstellung |
| 2
| Material |
| 2.1 | Allgemeine technische Geräte |
| 2.2 | Geräte und Material für die Zellkultur |
| 2.3 | Geräte und Material für die Molekularbiologie und Biochemie |
| 2.4 | Chemikalien |
| 2.5 | Enzyme |
| 2.6 | Versuchssysteme ("Kits") |
| 2.7 | Zelllinien |
| 2.8 | Antikörper |
| 2.9 | Rattenstämme |
| 2.10 | Bakterienstämme |
| 2.11 | Expressionsvektoren |
| 2.12 | Allgemeine Plastikwaren |
| 2.13 | Sonstiges Verbrauchsmaterial |
| 2.14 | Allgemein verwendetete Puffer |
| 2.15 | Medien für die Kultur eukaryotischer Zellen |
| 3
| Methoden |
| 3.1 | Überblick über die Abfolge derangewendeten Methoden |
| 3.2 | Molekularbiologische Methoden |
| 3.2.1 | Synthese der MHC-I-"downregulatorischen" Konstrukte |
| 3.2.1.1 | Ox18Fab-Intrabodies |
| 3.2.1.2 | Ox18sFv-Intrabodies |
| 3.2.1.3 | Adenovirus p19 |
| 3.2.1.4 | 8KsFv-Intrabodies |
| 3.2.2 | mRNA Isolierung |
| 3.2.3 | Reverse Transkription von RNA |
| 3.2.4 | PCR-Reaktion |
| 3.2.5 | Klonierung der Konstrukte in Expressionsvektoren |
| 3.2.5.1 | Auftrennung der DNA-Fragmente durch horizontale Agarosegelelektrophorese |
| 3.2.5.2 | Herstellung kompetenter Zellen |
| 3.2.5.3 | Transformation von Bakterien |
| 3.2.5.4 | Präparation von Plasmid-DNA: "Maxiprep"-Methode |
| 3.2.5.5 | Präparation von Plasmid-DNA: "Miniprep"-Methode |
| 3.3 | Immunochemische Methoden |
| 3.3.1 | in vitro-Translation im TNT™ Retikulozytenlysat |
| 3.3.2 | Immunopräzipitation |
| 3.3.3 | SDS-PAGE Gelelektrophorese |
| 3.4 | Methoden der Durchflusszytometrie |
| 3.4.1 | Oberflächenmarkierung mit Antikörpern für die Durchflusszytometrie |
| 3.4.2 | Intrazelluläre Färbung mit Antikörpern für die Durchflusszytometrie |
| 3.4.2.1 | Papainverdau von Oberflächenmolekülen |
| 3.4.3 | FACS-Analytik |
| 3.5 | Methoden der Zellkultur |
| 3.5.1 | Kultivierung von eukaryotischen Zellen |
| 3.5.2 | Etablierung einer primären Keratinozytenkultur |
| 3.5.3 | Kryokonservierung und Auftauen von eukaryotischen Zellen |
| 3.5.4 | Transfektion von eukaryotischen Zellen |
| 3.5.4.1 | Transfektion mit Calziumphosphat |
| 3.5.4.2 | Transfektion mit DMRIE-C™ |
| 3.5.4.3 | Transfektion mit Superfect™ |
| 3.5.4.4 | Transfektion mit DEAE-Dextran |
| 3.5.5 | Etablierung stabil exprimierender Zellklone |
| 3.5.6 | Infektion von eukaryotischen Zellen mit Adenovirus |
| 3.5.7 | Separation von Zellen mittels Magnetpartikel |
| 3.5.8 | Die Gemischte Lymphozytenkultur |
| 3.5.9 | Zytotoxizitäts-Test |
| 3.5.9.1 | Markierung der Targetzellen mit Europium |
| 3.5.9.2 | Zytotoxizitäts-Test: Ansatz |
| 3.5.9.3 | Messung des freigesetzten Europiums |
| 3.6 | Transplantation von gezüchteten Rattenhautstücken |
| 3.6.1 | Transplantation von in vitro-generierten Hautschichten ohne ein unterstützendes Trägermaterial |
| 3.6.2 | Transplantation von auf Hyaloronsäuremembran ausgesäten Keratinozyten |
| 3.6.3 | Histologische Analytik |
| 4
| Ergebnisse |
| 4.1 | Erste Generierung MHC-I-"downregulatorischer" Proteine:
Das anti-Ratten-MHC-I- (RT1.A) Intrabody-Konstrukt Ox18Fab |
| 4.1.1 | In vitro-Translation des Intrabody-Konstrukts |
| 4.1.2 | Bestimmung der Nukleinsäuresequenz des anti-RT1.A-Intrabodies |
| 4.1.2.1 | DNA-Sequenz der variablen schweren Kette des Ox18-Intrabodies: |
| 4.1.2.2 | DNA-Sequenz der variablen leichten Kette des Ox18-Intrabodies: |
| 4.1.2.3 | Vergleich mit anderen Immunoglobulinen |
| 4.1.3 | Expression von anti-RT1.A-Fab-Intrabodies in COS-1-Zellen |
| 4.1.4 | Stabile Expression von anti-RT1.A-Fab-Intrabodies in NBT-II-Zellen |
| 4.2 | Zweites MHC-I-"downregulatorisches" Protein:
Das anti-human-MHC-I-Intrabody-Konstrukt 8KsFv |
| 4.2.1 | Expression von anti-human-MHC-I-Intrabodies in 293-Zellen |
| 4.2.2 | Expression von anti-human-MHC-I-Intrabodies in humanen Keratinozyten durch Adenovirus-Infektion |
| 4.3 | Dritte Generation der MHC-I-"downregulatorischen" Proteine:
Das anti-RT1.A-Intrabody-Konstrukt als single chain: Ox18sFv |
| 4.3.1 | stabile Expression von anti-RT1.A-sFv-Intrabodies in NBT-II Zellen |
| 4.4 | Die Lösung:
MHC-I-"downregulatorische" Proteine als GFP-Fusionsproteine |
| 4.4.1 | Expression von GFP-Fusionsproteinen in Rattenkeratinozyten: Ox18sFv und p19 |
| 4.4.1.1 | Optimierung der Transfektion von Rattenkeratinozyten |
| 4.4.1.2 | Bestimmung der Expression durch Fluoreszenzmikroskopie |
| 4.4.1.3 | Bestimmung der MHC-I-Oberflächenexpression mittels FACS-Analytik |
| 4.4.1.4 | Bestimmung der MHC-I-Oberflächenexpression mittels FACS-Analytik |
| 4.5 | Charakterisierung Intrabody-exprimierender Zellen |
| 4.5.1 | Wird die Expression anderer Oberflächenmoleküle beeinträchtigt? |
| 4.5.2 | Was passiert mit den MHC-I-Molekülen in der Zelle? |
| 4.5.3 | Wie wirkt sich Interferon- auf die MHC-I-Expression aus? |
| 4.6 | Funktionelle Bedeutung der MHC-I-"downregulatorischen" Proteine |
| 4.6.1 | Zytotoxizitäts-Test mit Intrabody-exprimierenden Rattenkeratinozyten als Targetzellen |
| 4.6.1.1 | Optimierung der Europium-Konzentration |
| 4.6.1.2 | Zytotoxizitäts-Test |
| 4.6.2 | Transplantation von gezüchteten Rattenhautstücken |
| 5
| Diskussion |
| 5.1 | Ein anti-Ratten-MHC-I-Intrabody als Fab-Fragment: Ox18Fab |
| 5.1.1 | Synthese und Proteinnnachweis |
| 5.1.1.1 | ER-Retention der Intrabodies: mit oder ohne KDEL? |
| 5.1.2 | Expression von Ox18Fab in der epithelialen Rattenzelllinie NBT-II |
| 5.2 | Intrabodies als "single chain"-Fragmente: 8KsFv und Ox18sFv |
| 5.3 | Intrabody-GFP-Fusionsproteine: Ox18sFvGFP, 8KsFvGFP |
| 5.3.1 | Eine hohe Quantität an anti-MHC-I-Intrabodies ist essentiell für eine effektive Reduktion der MHC-I-Oberflächenexpression |
| 5.3.2 | Anti-human-MHC-I-Intrabodies sind effektiver in der Reduktion der MHC-I-Oberflächenexpression als das adenovirale Protein p19 |
| 5.4 | Charakterisierung anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Zellen |
| 5.4.1 | Andere Oberflächenmoleküle werden durch die Expression von Intrabodies nicht beeinträchtigt |
| 5.4.2 | Akkumulation von MHC-I-Molekülen in Intrabody-exprimierenden Zellen |
| 5.4.3 | In stark Intrabody-exprimierenden Zellen kann der MHC-I-"knock-out"-Phänotyp nicht durch Interferon- aufgehoben werden |
| 5.5 | Immunogenität anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Zellen in vitro |
| 5.5.1 | Geringere lytische Aktivität zytotoxischer T-Zellen gegenüber Intrabody-exprimierenden Zellen |
| 5.6 | Immunogenität anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Zellen in vivo |
| 5.6.1 | Das "NK-Zell-Problem" |
| 5.7 | Ausblick: Einsatz anti-MHC-I-Intrabody-exprimierender Zellen beim Tissue Engineering |
| Bibliographie
| Literaturverzeichnis |
| Anhang A
| Anhang |
| Abkürzungsverzeichnis
| Abkürzungsverzeichnis |
| Danksagung | |
| Lebenslauf | |
| Selbständigkeitserklärung | |
Abbildungsverzeichnis |
| Abb. 1: | Antigenprozessierung und Präsentation via MHC Klasse I (modifiziert nach
[
2
]).
(a) Endogene Proteine werden durch das Proteasom gespalten und (b) die Peptide in das ER durch TAP-Dimere transportiert. Mehrere Moleküle im ER sind in dem Assemblierungsprozess involviert: (c) Calnexin und ERp57; (d) Calreticulin und 2-Mikroglobulin; und (e) Tapasin. (f) Stabile MHC-Peptidkomplexe können das ER via den Golgi-Apparat verlassen und (g) an die Zelloberfläche gelangen, wo sie (h) von zytotoxischen T-Zellen erkannt werden. |
| Abb. 2: | Intrabodies können als verschiedenen Formen von Antikörperfragmenten synthetisiert werden. Gängige Formen sind a) Fab-Fragmente und b) "single chain"-Fragmente (sFv). Zur besseren Detektion können sie mit fluoreszierenden Proteinen gekoppelt werden, wie im Fall c) mit dem "green fluorescent protein" (GFP). sFv-Fragmente bestehen aus den variablen Regionen eines Antikörpers, die durch einem Peptidlinker miteinander verbunden sind. |
| Abb. 3: | Durch Bindung von den viralen Proteinen p19, US3 oder m152 wird der Transport des assemblierten und mit Peptid beladenen MHC-I-Moleküls verhindert. |
| Abb. 4: | Durch US2 und US11 wird die neu synthetisierte schwere Kette des MHC-I-Moleküls zurück ins Zytosol transloziert, wo sie nach Deglykosylierung durch das Proteasom degradiert wird. |
| Abb. 5: | TAP-Inhibierung durch US6 und ICP47. Leere assemblierte MHC-I-Moleküle bilden einen Komplex mit Tapasin/TAP, da der Petidtransport via TAP inhibiert ist. a) US6 assoziiert mit dem luminalen Teil von TAP und inhibiert so die Peptidtranslokation. Die Bindung der Peptide an die zytoplasmatische Domäne von TAP wird nicht beeinträchtigt. b) Im Gegensatz dazu inhibiert ICP47 die Petidtranslokation durch Bindung an die zytoplasmatische Domäne von TAP. |
| Abb. 6: | Bicistronischer Expressionsvektor pCMV-F105GPI mit IRES-Sequenz (intraribosomal entry site) für die Expression der zweiten Kassette. |
| Abb. 7: | Prinzip des Zytotoxizitäts-Tests mit Europium [modifiziert nach
[
183
]. |
| Abb. 8: | Messung von Eu-DTPA mit Zusatz von Verstärker-Lösung (modifiziert nach
[
183
]). |
| Abb. 9: | Prinzip der zeitauflösenden Fluoreszenzmessung. Die Messung von Europium erfolgt nur im Bereich von 400-800 µs (roter Bereich). Zu diesem Zeitpunkt ist die Fluoreszenz anderer mitangeregter Fluorophore (blau dargestellt) bereits abge-klungen und es wird nur noch die Europium-Fluoreszenz (gelb dargestellt) detektiert [modifiziert nach
[
184
]. |
| Abb. 10: | In vitro-Translation von pCMV-Ox18Fab und pCMV-Ox18FabKDEL. Als Positivkontrolle für die Funktionalität des Tests wurde die im Kit enthaltenen Luzi-ferase-Kontrolle, als Negativ-Kontrolle wurde H2O eingesetzt. |
| Abb. 11: | Immunopräzipitation der exprimierten Proteine Ox18Fab und Ox18FabKDEL in COS-1-Zellen. In Reihe 1 und 2 wurden Maus-Immunoglobuline des (serumfreien) Mediums präzipitiert, in Reihe 3 und 4 Maus-Immunoglobuline bzw. -Immunoglobulinfragmente des Zelllysats. |
| Abb. 12: | Stabil-Ox18Fab- bzw. Ox18FabKDEL-exprimierende NBT-II Zellklone. Selektion der Einzelklone durch G418. Keiner der selektierten Klone zeigt eine signifikante Reduktion der MHC-I-Expression. |
| Abb. 13: | Stabile bzw. transiente 8KsFv-Intrabody-Expression in 293-Zellen. FACS-Analyse der MHC I Expression.Neben der starken MHC-I-"Downregulation" bei stabilen Klonen zeigten 35% der Zellen schon 48h post-Transfektion eine signifikant verminderte MHC-I-Oberflächenexpression. |
| Abb. 14: | Adenovirus-Infektion von humanen Keratinozyten mit 8KsFv-Intrabody bzw. -Gal-Kontrollkonstrukt. FACS-Analyse der MHC-I-Expression. |
| Abb. 15: | Transfektion von primären Rattenkeratinozyten mit verschiedenen Transfektionsagenzien: Kalziumphosphat-Methode (links)und die beiden liposomvermittelten Transfertechniken mittels Superfect™ (Mitte) und DMRIE-C™ (rechts). 48h nach Transfektion: FACS-Analyse. |
| Abb. 16: | Ox18sFvGFP-Expression in stabil-transfizierten Rattenkeratinozyten. Links: lichtmikroskopische Aufnahme, 400× Vergrößerung; rechts: der identische Bildausschnitt im Fluoreszenzmodus (Filter = 510 nm). A+B: einzelner Klon; C+D: expandierende Zellen; E+F: mehrschichtiges "Sheet" |
| Abb. 17: | Primäre Rattenkeratinozyten wurden mit den spezifizierten Konstrukten transfiziert und 48h nach Transfektion im FACS analysiert. Die Ratten-MHC-I- (RT1.A) "Downregulation" kann effizienter durch das GFP-Fusionsprotein erreicht werden (a), als durch den anti-RT1.A- (Ox18) Intrabody allein (d). Diese "Downregulation" ist abhängig von der Stärke der Intrabody-Expression. Die Expression des Kontrollintrabodies (anti-human-MHC-I-Intrabody, 8KsFv) führt zu keiner Reduktion der RT1.A-Oberflächenexpression (b+e). Das adenovirale Protein p19 hat ebenfalls keinen Effekt auf die RT1.A-Expression von DA-Keratinozyten (c+f). |
| Abb. 18: | 293-Zellen wurden mit den spezifizierten Konstrukten transfiziert und 48h nach Transfektion im FACS analysiert. Wie schon für den anti-Ratten-MHC-I-Intrabody gezeigt, kann auch hier eine human-MHC-I-"Downregulation" effizienter durch das GFP-Fusionsprotein erreicht werden (a), als durch den anti-MHC-I- (8KsFv) Intrabody allein (d). Diese "Downregulation" ist ebenfalls abhängig von der Stärke der Intrabody-Expression. Die Expression des Kontrollintrabodies (anti-Ratten-MHC-I-Intrabody, Ox18sFv) führt zu keiner Reduktion der RT1.A-Oberflächenexpression (b+e). Das adenovirale Protein p19 ist nicht so effizient in der MHC-I-"Downregulation" wie das 8KsFv-Konstrukt (c+f). |
| Abb. 19: | 293-Zellen wurden mit dem anti-human-MHC-I-Intrabody 8KsFv transfiziert. 48h nach Transfektion wurden die aufgeführten Oberflächenmoleküle im FACS analysiert. Die Oberflächenexpression der untersuchten Moleküle (CD46, CD49b, CD49d, CD55, CD58) wurde durch die 8KsFv-Intrabody-Konstrukte nicht beeinflusst. |
| Abb. 20: | Rattenkeratinozyten wurden mit den aufgeführten Konstrukten (RT1.B, Ratten-MHC-II & ICAM-1) stabil transfiziert. Generierte Einzelklone wurden 48h mit bzw. ohne 10 ng/ml IFN- kultiviert und anschließend auf die Expression von RT1.B und ICAM-1 durch FACS-Analyse untersucht. RT1.B kann durch Interferon--Stimulation bei untransfizierten (a), Kontrollintrabody- (8KsFv) transfizierten (b) und anti-Ratten-MHC-I- (Ox18sFv) Intrabody-transfizierten (c) Rattenkeratinozyten ähnlich stark induziert werden. Ebenfalls zeigen sowohl uninfizierte (d) als auch Kontroll- bzw. anti-Ratten-MHC-I-Intrabody-exprimierende (e bzw. f) Keratinozyten eine starke ICAM-I-Expression, was durch Interferon- leicht steigerbar ist. |
| Abb. 21: | Vor der intrazellulären Färbung von RT1.A (Ratten-MHC-I) in Rattenkeratinozyten wurden diese mit Papain behandelt. Die beiden oberen Histogramme zeigen die erfolgreiche Entfernung aller RT1.A-Oberflächenmoleküle. Die beiden unteren Histogramme zeigen durch die nachfolgende intrazelluläre Färbung die verstärkte Detektion an intrazellulär lokalisierten RT1.A-Molekülen in anti-RT1.A-Intrabody-transfizierten Keratinozyten (unten, rechts) im Gegensatz zu untransfizierten Zellen (unten, links). |
| Abb. 22: | Stabil anti-MHC-I- (8KsFv) Intrabody exprimierende (Mitte & rechts) sowie untransfizierte (links) 293-Zellen wurden extra- und intrazellulär mit anti-MHC-I -Antikörpern gefärbt und im FACS analysiert. Deutlich wird die verstärkte intrazelluläre Detektion in Intrabody-exprimierenden Zellklonen (Mitte & rechts). In Zellen, welche die stärkste MHC-I-Oberflächenreduktion zeigen, kann die größte Akkumulation an intrazellulären MHC-I-Molekülen detektiert werden (rechts). |
| Abb. 23: | Rattenkeratinozyten wurden mit 10 ng/ml IFN- für 48h stimuliert, und auf ihre RT1.A- (Ratten-MHC-I) Oberflächenexpression untersucht. |
| Abb. 24: | Markierung von Rattenkeratinozyten mit unterschiedlichen Europium-Konzentrationen. Ermittlung der optimalen Konzentration bei 10000 Zellen durch:
maximale Freisetzung - spontane Freisetzung = max |
| Abb. 25: | (nächste Seite): Zytotoxizitäts-Test. Inkubiert wurden 1 ( 104 Targetzellen mit der entsprechenden Ratio an Effektorzellen. Gezeigt sind zehn verschiedene Experimente. Deutlich wird, dass anti-Ratten-MHC-I-Intrabody-transfizierte Rattenkeratinozyten (offene Kreise) wesentlich weniger lysiert werden als Kontrollintrabody-infizierte (geschlossene Kreise) oder "third-party"-Zellen (Dreiecke). |
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