Funktionelle Charakterisierung von BACE,
einer für die Alzheimer Krankheit relevanten Protease

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von Dipl.-Ing. (FH) Anja Capell

geboren am 23. Dezember 1960 in Hamburg

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Dekan: Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Thomas Buckhout, PhD

Gutachter:
1. Prof. Dr. Peter-Micael Kloetzel
2. Prof. Dr. Christian Haass
3. Prof. Dr. Gerd Multhaup

Datum der Abgabe: 2. März 2005

Datum der Promotion: 5. Juli 2005

für Manfredo Manfredi

Die Ergebnisse der folgenden Arbeit wurden bereits teilweise in folgenden Publikationen veröffentlicht:
Capell A., Meyn L., Fluhrer R., Teplow D.B., Walter J., Haass C. (2002) Apical sorting of ß-secretase limits amyloid ß-peptide production. 277 (7); 5637-5643.
Capell A., Steiner H., Willem M., Kaiser H., Meyer C., Walter J., Lammich S., Multhaup G., Haass C. (2000) Maturation and pro-peptide cleavage of beta -secretase. 275 (40); 30849-30854.

Zusammenfassung

Die Alzheimer Krankheit ist die am häufigsten vorkommende Altersdemenz. Neben der Entstehung von neurofibrillären Bündeln ist das spezifische pathologische Merkmal der Alzheimer Krankheit die Amyloid-Ablagerung im Gehirn. Die Hauptkomponente der so genannten Amyloid-Plaques ist das Amyloid β-Peptid (Aβ). Aβ entsteht durch sequenzielle proteolytische Spaltung aus einem membrangebundenen Vorläuferprotein, dem βAPP (βamyloid precursor protein). Die kürzlich identifizierte β-Sekretase (BACE, β-site APPcleaving enzyme) generiert den Schnitt am N-Terminus von Aβ. Es entsteht ein C-terminales, membrangebundenes βAPP-Fragment, das βAPP-CTF. βAPP-CTF ist das direkte Substrat für die γ-Sekretase, die innerhalb der Membrandomäne schneidet, wodurch Aβ freigesetzt wird.

In der vorliegenden Arbeit kann erstmalig gezeigt werden, dass BACE auf dem sekretorischen Transportweg aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER), über den Golgi-Apparat zur Zelloberfläche transportiert wird. Auf dem Transport wird BACE durch N-Glycosylierung und Propeptidabspaltung posttranslational modifiziert. BACE wird im ER N-glycosyliert und die mannosereichen Zucker werden auf dem Transport durch den Golgi-Apparat in Endoglycosidase H resistente Zucker des komplexen Typs modifiziert. Der Umbau der Zucker bewirkt eine Zunahme im Molekulargewicht, obwohl die größere komplex glycosylierte, mature Form von BACE das Propeptid nicht mehr enthält. Die Propeptidabspaltung, durch Furin oder furinähnliche Propeptidkonvertasen, findet unmittelbar vor dem Aufbau der komplexen Zucker statt.

Ferner konnte gezeigt werden, dass der Transport von BACE die Aβ-Entstehung limitieren kann. Da es in der Alzheimer Krankheit ausschließlich in dem an polarisierte Zellen angrenzenden extrazellulären Raum zur Bildung von Amyloid-Plaques kommt und da βAPP polarisiert transportiert wird, wurde in dieser Arbeit der polarisierte Transport von BACE untersucht. In polarisierten Madin-Darby canine kidney (MDCK) Zellen wird BACE überwiegend zur apikalen Plasmamembran transportiert. Interessanterweise wurde im selben Modellsystem für das BACE-Substrat βAPP ein Transport zur basolateralen Plasmamembran detektiert. Der gegensätzliche Transport von BACE und βAPP limitiert die Aβ-Entstehung. Wird der apikale Transport von βAPP durch Deletion seines basolateralen Sortierungssignals erhöht, entsteht vermehrt Aβ. Der differenzielle Transport von BACE und βAPP könnte ein Hinweis darauf sein, dass βAPP nicht das physiologische Substrat von BACE ist.

Abstract

Alzheimer`s disease is the most common cause of progressive cognitive decline in the aged population. Pathologically Alzheimer`s disease is characterized by the invariant accumulation of senile plaques. Senile plaques are predominantly composed of the amyloid β-peptide (Aβ), which is derived from the membrane bound β-amyloid precursor protein (βAPP) by sequential proteolytic cleavage. The recently identified β-secretase (BACE) is responsible for the cleavage at the N-terminus of the Aβ domain. This cleavage generates membrane-bound βAPP Cterminal fragments (βAPP-CTF) which are the immediate precursor for γ-secretase cleavage and therefore for liberation of Aβ.

The present work shows that BACE moves along the secretory pathway, while it undergoes post-translational modifications, which can be monitored by a significant increase in the molecular mass and cleavage of its pro-peptide. BACE becomes N-glycosylated within the ER and the increase in molecular mass is caused by complex N-glycosylation. The mature form of BACE is resistant to endoglycosidase H treatment; this indicates that BACE traffics through the Golgi. Furthermore the mature form of BACE does not contain the pro-peptide anymore. Pro-BACE is predominantly located within the endoplasmic reticulum. Pro-peptide cleavage occurs immediately before full maturation by furin or a furin-like proprotein convertase.

Moreover traffic of BACE can limit Aβ generation. Since polarized cells are associated with two invariant pathological features of Alzheimer`s disease, namely the formation of senile plaques and the cerebral amyloid angiopathy, sorting mechanism of BACE were analyzed. In the well established model system of polarized Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells, the majority of BACE is sorted to the apical domain. Interestingly it has been shown previously that the substrate of BACE, βAPP is transported to the basolateral surface of MCDK cells. Therefore, substantial amounts of BACE are targeted away from βAPP to a non-amyloidogenic compartment, a cellular mechanism that limits Aβ generation. Upon deletion of the basolateral sorting signal of βAPP, apically missorted βAPP is processed by BACE. The differential targeting of BACE and its substrate βAPP suggest that βAPP might not be the major physiological substrate of BACE.

Eigene Schlagworte: Alzheimer Krankheit, βAPP, BACE, Maturierung, Polarisierter Transport

Keywords: Alzheimer`s disease, βAPP, β-secretase, BACE, Maturation, Polarized transport

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04.07.2006