2 Material und Methoden

2.1 Geräte und Materialien

2.1.1 Allgemein

↓31

Schüttler (KM2)

Edmund Buhler

Überkopf-Schüttler (Roto-shake Genie)

Scientific Industries

Thermoschüttler (Thermomixer compact)

Eppendorf

Magnetrührer (IKAMAG RCT basic)

IKA Labortechnik

Vortex (Vortex Genie 2)

Scientific Industries

Wasserbad mit Schüttelvorrichtung (1083)

GFL

Mikrowelle

Bosch

Heizblöcke

Liebisch

  

Zentrifuge für Eppendorfreaktionsgefäße (Biofuge pico)

Heraeus, Kendro

Kühlzentrifuge für Eppendorfreaktionsgefäße (Biofuge fresco)

Heraeus, Kendro

Vakuumzentrifuge (Speed Vac Concentrator)

Savant

Kühlzentrifuge (Megafuge 1.0R)

Heraeus, Kendro

Kühlzentrifuge (J2-21)

Beckman

 

Rotoren: Type JA10, Type JA 20

Beckman

Ultrazentrifuge (L7-55)

Beckman

 

Rotoren: Ti 60, TH-641,

Beckman, Sorvall

Tischultrazentrifuge (Optima Ultracentrifuge)

Beckman

 

Rotoren: TLA-55, MLA-80, TLA-110

Beckman

  

pH-Elektrode (Blueline 23 pH)

Schott

pH-Meter (Inolab pH Level 1)

WTW

  

Analysenwaage (Analytical+ 200 g - 0,0001 g)

Ohaus

Feinwaage (Standard 2000 g - 0,01 g)

Ohaus

  

Fotometer (SmartSpecTM 3000)

Bio-Rad

 

Einwegküvetten (10 x 11x 45 mm)

Sarstedt

 

Quarzküvetten (10 x 10 x 45 mm)

Hellma

Wärmeschrank 37°C (Function line)

Heraeus

Wärmeschrank 56°C

Heraeus

Gefrierschrank -20°C

Elektolux

Kühlschrank 4°C

Elektrolux

Autoklav (Tuttnauer 3850 EL)

Systec

Wasseraufbereitungsanlage (Ionenaustauscher, Milli-Q academic)

Millipore

Pipettierhilfe (Accu-Jet)

Brand

Einwegauslaufpipetten (25 ml, 10 ml, 5 ml)

Sarstedt

Pipettenspitzen (1 ml, 200 µl, 20 µl, 2 µl)

Sarstedt

Reaktionsgefäße (50 ml, 15 ml, 2 ml, 1,5 ml, 0,5 ml, 0,2 ml)

Sarstedt

Centricon YM-10 -Konzentratoren

Millipore

Dialyseschlauch („cut-off“ 12-14 kDa, 28 mm Durchmesser)

Spectrapor

2.1.2 Molekularbiologie

↓32

PCR-Maschine (Mastercycler personal)

Eppendorf

Schüttelinkubator (Certomat BS-1)

B. Braun Biotech

Elektrophoresekammern (Modell: B1; Modell: B2)

Owl Separation Sys.

Agarosegeldokumentationseinheit

MS Laborgeräte

UV-Lampe (White/Ultraviolet Transilluminator)

 

Kamera (CCD Video Camera Module)

 

Dokumentation (Quickstore plus II)

 

Drucker (p91), Mitsubishi

 

2.1.3 Zellkultur

Sterilwerkbank (Hera Safe HS12)

Heraeus, Kendro

CO2-Inkubator (Hera cell)

Heraeus, Kendro

Bunsenbrenner (Vulcan)

Heraeus, Kendro

Zentrifuge (Megafuge 1,0)

Heraeus, Kendro

Wasserbad (Typ 1002 ; Typ 1003)

GFL

Mikroskop (Wiloverts 10x 4/10/20)

Hund

N2-Tank (Chronos)

Messer Griesheim

Gefrierschrank -80°C (HFU 80)

Heraeus, Kendro

Klonierungszylinder (8x8 mm)

Bellco

Einfriergefäße (Qualifreeze)

Qualilab

Einwegpipetten, steril (2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)

Sarstedt

Einweg-PP-Röhrchen, steril (15 ml, 50 ml)

Sarstedt

Pasteurpipetten

Sarstedt

Zelllifter

Corning Costar

Zellkulturschalen (60 x 15 mm, 100 x 17 mm, 24 well, 12 well)

Nunc

Filterkammern (Transwell, Polycarbonatmembran 3,0 µm)

Corning Costar

Durchmesser je Filter 12 mm (12-well Platte)

 

Durchmesser je Filter 24 mm (6-well Platte)

 

Sterilfiltereinheiten (250 ml, 500 ml)

Nalgene

2.1.4 Proteinbiochemie und Immunocytochemie

Elektrophoresekammern

  

Mini-PROTEAN 3 electrophoresis cell

Bio-Rad

 

X Cell Sure LockTM Mini Cell

Novex, Invitrogen

 

10-20% Tris-Tricine Fertiggele

Novex, Invitrogen

 

Transferkammer: Mini Trans-Blot transfer cell

Bio-Rad

 

Gel Transfer Filterpapier

Schleicher&Schuell

 

Immobilon-P (PVDF Transfer Membran)

Millipore

 

Protran (Nitrozellulose Transfer Membran)

Schleicher&Schuell

 

Spannungsquelle (Power Pac 300)

Bio-Rad

 

Geltrockner (Slab Gel Dryer 2000)

Savant

 

Phosphor-Imager (Storm 840)

Molekular Dynamics

 

Image Quant V4.2 (Software)

Molekular Dynamics

 

Scanner: Umax Astra 1220S

  

Filmentwicklungsgerät (Curix 60)

Agfa

 

Röntgenfilme Kodak-X-Omat DS

Kodak

 

BioMax TMMR

Kodak

 

Fluorimeter (Fluoroscan Ascent FL)

Labsystems

 

Filtersystem: Exitation 530nm / Emission 590 nm

  

Mikrotiterplatten (96-well, schwarz)

Nunc

 

Sonifier (Cell Disruptor B 15)

Branson

 
   

Fluoreszenzmikroskop DMRB

Leica

 

100fach/1.3 Immersionsölobjektiv

  

Standard FITC und TRITC Fluoreszenzfiltersets

  

Kamera: RT Monochrome Spot Camera

Diagnostic Instruments

Software: MetaView Imaging Software

  
   

Konfokales Laser-Mikroskop TCS SP

Leica

 

100fach/1.4 Immersionsölbjektiv plan-apochromatisch

  

Argonlaser: Exitationswellenlänge 488 nm, Emmissionsfilter 490-530 nm

  

Bilder wurden mit 512 x 512 Pixel Auflösung aufgenommen

  

Photoshop 5.5, Universal Imaging Corporation Adobe

  

2.2 Enzyme, Kits (Versuchssysteme), Chemikalien,

2.2.1 Allgemein

↓33

Nicht spezifisch aufgeführte Chemikalien wurden von den Firmen Roth, Merck, Serva oder Sigma bezogen. Sind keine anderen Angaben gemacht, so wurden die Chemikalien mit dem Reinheitsgrad p.a. eingesetzt.

Alle Lösungern wurden mit voll entsalztem H2O angesetzt, das mit einer Milli-Q Anlage zur bidest. Qualität aufgereinigt wurde und einen elektrischen Widerstand >18.2 MΩ cm bei 25°C hat.

Bei Prozentangaben handelt es sich um Volumenprozent, soweit keine anderen Angaben gemacht wurden.

2.2.2 Molekularbiologie

↓34

Agarose (Electrophoresis Grade)

Gibco, Invitrogen

Bacto-Agar

Becton, Dickinson

Bacto-Trypton

Becton, Dickinson

Hefe-Extrakt

Becton, Dickinson

Restriktionsendonukleasen

Gibco, Invitrogen

DNA-Molekulargewichts Marker (0,07–12,2 kb)

Gibco, Invitrogen

Alkaline Phosphatase (Shrimp)

Roche Biochem.

RNAse A

Sigma

T4-Ligase

Roche Biochem.

DNA-Ligations Kit (Rapid Ligation Kit)

Roche Biochem.

PCR-Kits

 

GC-rich PCR-System

Roche Biochem.

Pwo PCR-System

Roche Biochem.

NucleoSpin Extract

Macherey Nagel

PCR-Produkt Aufreinigungs Kit (PCR Clean-up)

 

DNA-Elution aus dem Gel

 

NucleoSpin Plasmid DNA-Aufreinigungs Kit

Macherey Nagel

DNA-Aufreinigung im großen Maßstab (AX500 Nucleobond)

Macherey Nagel

E. coli - K12 Stamm: DH5α

 

2.2.2.1 Vektoren

Eukaryotische Expressionsvektoren

Invitrogen

 

pcDNA3.1 Zeo+

 

pcDNA4/myc-His Zeo

2.2.2.2 Oligonukleotide und cDNA Konstrukte

Tabelle 1: Oligonukleotide für die PCR

Aufgeführt sind die für die PCR-Ansätze der verschiedenen cDNA-Konstrukte verwendeten Oligonukleotide, jeweilsvom m 5’- zum 3’-Ende, die Klonierungsvektoren und die zur Klonierung benutzten Restriktionsschnittstellen.

2.2.3 Zellkultur

↓35

DMEM (mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvate)

PAA

Optimem1 (mit Glutamax-I)

Gibco, Invitrogen

MEM (ohne Methionin, mit L-Glutamin)

Sigma

MEM Select Amine Kit

Gibco, Invitrogen

FKS

PAA

FKS (dialysiert)

Gibco, Invitrogen

Trypsin-EDTA (in HBSS)

Gibco, Invitrogen

L-Glutamin (100x, 200mM)

Gibco, Invitrogen

n-Buttersäure (Na-Salz)

Sigma

DMSO

Merck

Antibiotika

 

Penicillin/Streptomycin (5000 U/ml / 5 mg/ml)

Gibco, Invitrogen

G418 (Geneticin)

Gibco, Invitrogen

Zeocin (100 mg/ml)

Gibco, Invitrogen

Transfektionsreagenz FuGENE,

Roche Biochem.

Poly–L–Lysin (MW 111000)

Sigma

HEK 293 (human embryonic kidney 293) Zellen

ATTC

MDCK strain II (Madin-Darby canine kidney) Zellen

ATTC

  

2.2.3.1 Transfizierte HEK 293 und MDCK Zelllinien

Tabelle 2: Bezeichnung und exogene Proteinexpression der benutzten Zelllinien

Name

Zelllinie

überexprimierte Proteine

Resistenz

Zitat

(für nicht selbst

hergestellte Linien)

β APPwt

HEK 293

βAPP695wt

G 418

(Haass et al., 1992)

β APPsw

HEK 293

βAPP695sw

G 418

(Citron et al., 1992)

BACE-wt

HEK 293/βAPPwt

βAPP695wt

BACE

G 418

Zeocin

 

BACE- Δ C

HEK 293/βAPPwt

βAPP695wt

BACE-ΔC

G 418

Zeocin

 

BACE-L

HEK 293/βAPPwt

βAPP695wt

BACE-L

G 418

Zeocin

 

BACE R45A

HEK 293/βAPPwt

βAPP695wt

BACE R45A

G 418

Zeocin

 

β APP

MDCK

βAPP695wt

G418

(Haass et al., 1994)

β APP Δ C

MDCK

βAPP695ΔC

G418

(Haass et al., 1995)

β APP BACE

MDCK/βAPPwt

βAPP695wt

BACE

G 418

Zeocin

 

BACE STOP 494

MDCK/βAPPwt

βAPP695wt

BACE STOP494

G 418

Zeocin

 

β APP Δ C BACE

MDCK/βAPPΔC

βAPP695ΔC

BACE

G 418

Zeocin

 

PS1wt

MDCK/βAPPwt

βAPP695wt

PS1wt

G 418

Zeocin

 

Aufgeführt sind alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten, genetisch veränderten Zelllinien. Angegeben ist der Name der jeweiligen Ursprungszelllinie, alle exogen exprimierten Proteine und die entsprechenden Resistenzen zur Selektion der Einzelzellklone. Für nicht selbst erstellte Zelllinien ist die entsprechende Referenz angegeben.

2.2.4 Proteinbiochemie und Immunocytochemie

Pro-Mix L-[S] Cell Labelling Mix (530 MBq/ml, 37 TBq/mmol)

Amersham Biosciences

L-[2,3,4,5,6-H] Phenylalanin (37 MBq/ml, 4,85 TBq/mmol)

Amersham Biosciences

  

N-Glycosidase F

Roche Biochem.

Endoglycosidase H

Roche Biochem.

Tunicamycin

Sigma

Monensin (Na-Salz)

Sigma

Brefeldin A

Sigma

EZ-LinkTM-Sulfo-NHS-LC-Biotin

KMF-Laborchemie

Protein Assay (nach Bradford)

Bio-Rad

Rinderserum Albumin (BSA, Fraktion V)

Sigma

N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED)

Merck

Acrylamid-Lösung 40 % (Acrylamid - Bis-Acrylamid 37,5:1)

Q BioGene

Molekulargewichtsmarker

 

Low-Range Marker (2,3-43 kDa)

Gibco, Invitrogen

Full-Range Rainbow Marker (10-250 kDa)

Amersham Biosciences

Protein-A Sepharose CL-4B (PAS)

Sigma

ECL Western Blotting Kit

Amersham Biosciences

ECL-Plus Western Blotting Kit

Amersham Biosciences

Silberfärbe-Kit (Silver Stain Plus)

Bio-Rad

Amplify Fluorografie Reagenz

Amersham Biosciences

Protease Inhibitor Cocktail (for Mammalian Cell Extracts)

Sigma

Ni-NTA-Agarose

Qiagen

Mowiol 4-88 (Höchst)

Kremer-Pigmente

Immersionsöl N518

Zeiss

2.2.4.1  Antikörper

↓36

Bei den in der Maus hergestellten Antikörpern (AK) handelt es sich ausnahmslos um monoklonale AK. Für die Herstellung der polyklonalen AK gegen BACE wurden synthetische Peptide einer potentiell antigenen Region des Proteins an KLH (keyhole limpet hemocyanin) gekoppelt und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Die Synthese und Kopplung der Peptide, sowie die Immunisierung der Kaninchen und die Gewinnung der Antiseren wurden von der Firma Eurogentec durchgeführt.

Tabelle 3: Übersicht der Primär-Antikörper

Bezeichnung

Antigen (AS)

Wirt

IP

WB

IF

Bezugsquelle

 

human Giantin

Maus

---

---

1:10000

Dr. H.-P. Hauri, Basel
(Linstedt und Hauri, 1993)

 

c-myc

(AS 410-419)

Maus

1:500

1:5000

1:500

Hybridomabank, University of Iowa

 

BACE

(AS 22-45)

Kaninchen

1:200

1:500

1:200

Dr. Gerd Multhaup, Berlin

 

BACE

(AS 46-60)

Kaninchen

1:300

1:1000

1:300

 
 

BACE

(AS 482-501)

Kaninchen

1:300

1:1000

---

 
 

βAPP695

(AS 676-695)

Kaninchen

1:300

1:600

---

(Capell et al., 2000)

 

βAPP695

(AS 444-592)

Kaninchen

1:300

1:600

---

(Steiner et al., 1999)

 

βAPP695

(AS 595-611)

Kaninchen

1:300

1:600

---

Dr. D.J. Selkoe, USA

(Haass et al., 1992)

 

(AS 1-40)

Kaninchen

1:300

1:1000

---

(Wild-Bode et al., 1997)

 

PS1

(AS 263-407)

Kaninchen

1:300

1:2000

---

(Capell et al., 1998)

 

PS1

(AS 2-80)

Maus

---

1:2000

---

Dr. Ralph A. Nixon, USA (Capell et al., 1997)

 

NCT

(AS693-709)

Kaninchen

1:500

1:5000

---

Sigma

Angegeben ist die Bezeichnung des Antikörpers (AK), das zur Immunisierung eingesetzte Antigen und die benutzten Verdünnungen in der Immunopräzipitation (IP), im Western Blot (WB) und in der Immunofluoreszenz (IF). Wurde der AK bereits in anderen Arbeiten eingesetzt ist das entsprechende Zitat angegeben. Bei kommerziell erworbenen oder von anderen Arbeitsgruppen freundlicherweise zur Verfügung gestellten AK ist die Bezugsquelle angegeben.

Tabelle 4: Übersicht der Sekundär-Antikörper

Bezeichnung

Antigen

Wirt

Applikation

Verdünnung

Firma

anti-Kaninchen-HRP

Kaninchen IgG

Ziege

WB

1:20000

Promega

anti-Maus-

HRP

Maus IgG

Ziege

WB

1:10000

Promega

anti-Kaninchen-

[I]

Kaninchen

IgG

Esel

WB

1:10

Amersham

Alexa Fluor 488 (grün)

Kaninchen IgG

Ziege

IF

1:250

Molecular Probes

Alexa Fluor 594 (rot)

Kaninchen IgG

Ziege

IF

1:500

Molecular Probes

Alexa Fluor 488 (grün)

Maus IgG

Ziege

IF

1:250

Molecular Probes

Alexa Fluor 594 (rot)

Maus IgG

Ziege

IF

1:500

Molecular Probes

Angegeben sind die Bezeichnungen der AK, die Antigene, gegen die die AK gerichtet sind, die Spezies in denen die AK generiert wurden, die Applikationen und eingesetzten Verdünnungen der AK, sowie die Bezugsquellen.

2.3 Molekularbiologische Methoden

2.3.1 PCR (Polymerasekettenreaktion)

↓37

Die BACE cDNA wurde aus einer humanen cDNA Genbank isoliert und freundlicherweise von Dr. Steiner zur Verfügung gestellt. Für die Umklonierung von humanem BACE und zur Generierung der Stoppkonstrukte wurde die PCR mit dem „Pwo-DNA-Polymerase Kit“ oder dem „GC-rich Kit“ durchgeführt.

Reaktionsansatz:

0,5 μl cDNA Template (ca. 1 µg/μl)

↓38

0,5 μl 3’-Oligonukleotid (100 µM)

0,5 μl 5’-Oligonukleotid (100 µM)

2 μl dNTP-Mix (je 10 mM)

↓39

2 μl Pwo-DNA-Polymerase (1 U/µl)

5 μl Reaktionspuffer komplett (10x)

mit H2O bidest. auf 50 μl Endvolumen

↓40

Die entsprechenden Reaktionsansätze wurden gemischt und in der PCR-Maschine mit folgendem Programm prozessiert:

Denaturierung:

94°C, 2min

10Zyklen:

 

Denaturierung :

94°C, 30 s

Annealing :

50°C, 30 s

Elongation:

72°C, 2 min

20 Zyklen:

 

Denaturierung :

94°C, 30 s

Annealing :

50°C, 30 s

Elongation:

72°C, 2 min

Elongationsverlängerung:

20 s je Zyklus

  

Verlängerte Elongation:

72°C, 5 min

Die Produkte der jeweiligen PCR wurden in 1 % (w/v) Agarosegelen aufgetrennt (2.3.2), die amplifizierten DNA-Fragmente wurden aus dem Gel eluiert und anschließend mit den entsprechenden Restriktionsenzymen nachgeschnitten (2.3.4). Die so erhaltenen DNA-Fragmente wurden in den Expressionsvektor subkloniert (2.3.6).

2.3.2 Agarose-Gelelektrophorese

↓41

TBE-Puffer (Stocklösung 10fach):

900 mM Tris, 900 mM Borsäure, 20 mM EDTA, in dH2O, pH 8,0

DNA-Ladepuffer (Stocklösung 6fach):

↓42

30 %(v/v) Glycerin, 0,25 % (w/v) Bromphenolblau, 0,25 % (w/v) Xylen Cyanol FF in dH2O

Ethidiumbromid (Stocklösung 50000fach):

10 mg/ml in dH2O

↓43

Zur elektrophoretischen Trennung und Analyse von linearisierten DNA-Fragmenten, superhelikaler Plasmid-DNA sowie zur präparativen Isolierung von DNA-Fragmenten wurden 0,8-2 % (w/v) Agarosegele eingesetzt. Die entsprechende Menge Agarose wurde in der Mikrowelle in TBE-Puffer gelöst, nach Abkühlung wurde Ethidiumbromid zu einer Endkonzentration von 0,2 µg/ml zur Agarosegellösung gegeben. Nach Mischung wurde die Gellösung in die Gelkammer gegossen und der gewünschte Probentaschenkamm wurde eingesetzt. Die DNA-Proben wurden vor dem Auftragen mit 1/6 Volumen 6fach DNA-Ladepuffers versetzt. Als Größenstandard diente eine 1 kbp DNA-Leiter. Die Elektrophorese wurde bei konstanter Spannung 80-120 V (je nach Größe des Gels) mit TBE-Puffer in Agarose-Gelkammern durchgeführt.

2.3.3 Isolierung und Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Die gewünschte DNA-Bande wurde mit Hilfe eines UV-Lichtschirms lokalisiert, mit einem Skalpell aus dem Agarosegel ausgeschnitten und mit Hilfe des „Nucleo Spin Extract Kits“ entsprechend der Vorschrift des Herstellers aufgereinigt.

Nach enzymatischen DNA-Modifikationen wurde der Reaktionsansatz ohne Auftrennung im Agarosegel mit dem „Nucleo Spin Extract Kit“ entsprechend der Vorschrift des Herstellers aufgereinigt.

2.3.4 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

↓44

Für analytische Ansätze nach Plasmidpräparationen wurde 1 µg Plasmid-DNA, in dem vom Hersteller empfohlenen Reaktionspuffer, mit 10 U der entsprechenden Restriktionsenzyme, in einem Endvolumen von 20 µl für 3-4 h bei 37°C inkubiert. Die Analyse der Restriktion erfolgte mittels Agarose-Gelelektrophorese (2.3.2).

Für präparative Ansätze im Rahmen der Klonierung wurden 2-5 µg Plasmid-DNA oder das entsprechenden PCR-Produkt, in dem vom Hersteller empfohlenen Reaktionspuffer, mit 10 U der entsprechenden Restriktionsenzyme (2.3.4) in einem Endvolumen von 40 µl für 6-8 h bei 37°C inkubiert. Die DNA-Fragmente wurden anschließend isoliert und aufgereinigt (2.3.3).

2.3.5 Dephosphorylierung von DNA

Vor einer Ligation (2.3.6) wurden die 5’-Phosphatgruppen des linearisierten Vektors (2.3.4) mit Shrimp alkalischer Phosphatase (SAP) entfernt, um intramolekulare Selbstligation zu verhindern (Sambrook und Russel, 2001). Dazu wurden 5-10 µg linearisierte Plasmid-DNA mit 1 U SAP in dem Reaktionspuffer des Herstellers, in einem Gesamtvolumen von 200 µl, 1-2 h bei 37°C inkubiert. Die Plasmid-DNA wurde anschließend unter Verwendung des „Nucleo Spin Extract Kits“ gereinigt (2.3.3).

2.3.6 Ligation von DNA

↓45

Die Insertion des mit den entsprechenden Restriktionsenzymen verdauten DNA-Fragments in den zuvor linearisierten und dephosphorylierten Plasmid Vektor erfolgte mit Hilfe der T4 DNA-Ligase. 200-300 ng Vektor, 0,5-1 µg des entsprechenden DNA-Fragmentes, 1µl (5 U) T4 Ligase im Ligationspuffer des Herstellers wurden in einem Endvolumen von 20 µl, 1 h bei RT inkubiert. Parallel wurde zur Kontrolle der Relegationsfähigkeit des Vektors der Vektor ohne Insert sowie mit und ohne Ligase inkubiert.

Alternativ wurde der „Rapid DNA Ligation Kit“ entsprechend der Herstellerangaben eingesetzt. 10 µl des Ligationsansatzes wurden zur Transformation in kompetente E. coli verwendet (2.3.8).

2.3.7 E. coli Kulturen

LB-Medium (Low Salt Luria-Bertani Medium):

↓46

1 % (w/v) Bacto-Trypton, 0,5 % (w/v) Hefe-Extrakt, 0,5 % (w/v) NaCl in dH2O pH 7,0 mit NaOH eingestellt; autoklaviert (120°C; 1,2 bar, 20 min). Vor Benutzung wurden Selektionsantibiotika zugesetzt (Ampicillin 100 µg/ml).

LB-Agar-Platten (1,5 % (w/v)):

15 g/l Bacto-Agar in LB-Medium, autoklaviert (120°C; 1,2 bar 20 min). Nach Abkühlung auf ca. 50°C wurden die entsprechenden Selektionsantibiotika zusetzen (Ampicillin 100 µg/ml) und Platten (sterile Bakterienschalen, 10 cm Durchmesser) gegossen.

↓47

Ampicillin (Stocklösung 1000fach):

100 mg/ml in dH2O, steril filtriert. Aliquote wurden bei -20°C gelagert.

E. coli Bakterien (DH5α) wurden, soweit nicht anders angegeben, über Nacht bei 37°C, im Schüttelinkubator mit 200 UpM im gewünschten Volumen LB-Medium kultiviert.

↓48

Zur Separierung von Einzelklonen wurden Kulturen auf LB-Agar-Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C im Wärmeschrank inkubiert.

Ampicillin wurde bei Bedarf als Selektionsantibiotikum zugesetzt.

2.3.8 Herstellung kompetenter E. coli Zellen

CaCl 2- Puffer:

↓49

50 mM CaCl2, 10 mM Tris pH 8,0 in dH2O

Eine DH5α-Übernachtkultur einer einzelnen Kolonie wurde 1:100 in LB-Medium verdünnt und im Schüttelinkubator bei 37°C / 200 UpM bis zu einer OD600 von 0,5 inkubiert. Anschließend wurden die Zellen pelletiert (3500 , 10 min, 4°C) und in 1/2 Ausgangs-Kulturvolumen, eiskaltem CaCl2-Puffer resuspendiert. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurden die Zellen erneut, wie oben beschrieben, pelletiert und in 1/20 Kulturvolumen eiskaltem CaCl2-Puffer resuspendiert. Die so hergestellten kompetenten Zellen wurden entweder direkt für die Transformation verwendet oder in 20 % Glycerol/CaCl2-Puffer resuspendiert, aliquotiert und bei -80°C gelagert.

2.3.9 Transformation von DNA-Konstrukten in kompetente Bakterien

100 µl kompetente, evtl. auf Eis aufgetaute, DH5α-Suspension (2.3.8) wurde mit 10 µl Ligationsansatz bzw. Kontrollansätzen (2.3.6) oder 0,2 µg Plasmid DNA versetzt und 30 min auf Eis inkubiert. Um eine Aufnahme der DNA in die Zelle zu ermöglichen, wurden die Zellen für 2 min bei 42°C (Hitzeschock) und weitere 2 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde der Reaktionsansatz mit 1 ml LB-Medium versetzt und 1 h bei 37°C / 800 UpM in einem Thermoschüttler inkubiert. Die Zellen wurden 20 s bei 16000 abzentrifugiert, in 200 µl LB-Medium resuspendiert und auf Ampicillin enthaltende LB-Agar-Platten ausplattiert. Nach 16-24 h Inkubation bei 37°C wurden Klone von der Ligations-Platte gepickt und auf Einbau des gewünschten DNA-Fragments untersucht (2.3.10).

2.3.10 Präparation von Plasmid-DNA in kleinem Maßstab (Mini-Präp)

↓50

Mini-Präp-Lösung:

10 mM Tris pH 8,0; 1 mM EDTA, 0,1 N NaOH, 0,5 % (w/v) SDS in dH2O

Na-Acetat-Lösung:

↓51

3,0 M Na-Acetat, pH 5,2

RNAse (DNAse-frei):

10 mg/ml Ribonuklease A (RNAse) in Tris-Puffer (10 mM Tris, pH 7,5; 10 mM NaCl), 15 min bei 100°C erhitzen, langsam auf RT abkühlen. Aliquote bei -20°C lagern.

↓52

Zur Identifizierung rekombinanter E. coli Klone wurden kleine Mengen Plasmid-DNA nach einer veränderten Version (Zhou et al., 1990) der alkalischen Lyse (Birnboim und Doly, 1979) isoliert. 1 ml einer 2 ml E. coli Übernachtkultur wurde im Eppendorfreaktionsgefäß zentrifugiert (16000 15 s, RT). Der Überstand wurde teilweise dekantiert, wobei ca. 100 µl im Reaktionsgefäß verblieben. Das Sediment wurde durch vortexen resuspendiert und mit 300 µl Mini-Präp-Lösung versetzt und vorsichtig gemischt. Nach ca. 5 min Inkubation bei RT wurden zur Neutralisation 150 µl Na-Acetat-Lösung zugegeben und invertierend gemischt. Die unlöslichen Bestandteile (chromosomale DNA und Zellbruchstücke) wurden durch Zentrifugation (16000 10 min, 4°C) abgetrennt, der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die Plasmid-DNA mit 1 ml -20°C kaltem Ethanol (100 %) aus dem Überstand gefällt. Nach 10 min Inkubation wurde die Plasmid-DNA durch Zentrifugation präzipitiert (16000 15 min, 4°C) und mit 500 µl eiskaltem Ethanol (70 %) gewaschen. Der Überstand wurde dekantiert und das DNA-Pellet bei 37°C bis zur Ethanolfreiheit getrocknet. Das DNA-Pellet wurde anschließend in 30 µl RNAse/dH2O-Lösung (1 µg/µl) resuspendiert und 15 min bei 37°C inkubiert. 5 µl der so erhaltenen Plasmid-DNA wurden zur Kontrolle der DNA-Fragment-Integration im analytischen Maßstab mit Restriktionsendonukleasen verdaut (2.3.4).

Alternativ wurden DNA Mini-Präparationen mit dem „Nucleo Spin Plasmid DNA-Reinigungs Kit“ entsprechend der Herstellerangaben durchgeführt. Die so aufgereinigte DNA konnte direkt zur Sequenzierung und Transfektion eingesetzt werden.

2.3.11 Präparation von Plasmid-DNA in großem Maßstab (Maxi-Präp)

300 ml LB-Medium mit dem entsprechenden Selektionsantibiotikum wurden mit der Vorkultur des gewünschten E. coli Klons angeimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln (800 UpM) inkubiert. Die Bakterien wurden abzentrifugiert (8000 , 20 min, 4°C). Die Lyse des Bakterien-Pellets und die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte mit dem „Nucleobond AX 500 Kit“ nach den Anweisungen des Herstellers. Die von der Säule eluierte Plasmid-DNA wurde mit 0,7 Volumenanteilen Isopropanolgefällt und durch Zentrifugation (10000 , 45 min, 4°C) pelletiert, nach einem Waschschritt mit 70 % Ethanol wurde das DNA-Pellet in 300 µl dH2O aufgenommen. Die DNA Konzentrationwurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Die DNA wurde 1:100 verdünnt und die Absorption gegen H2O gemessen. Die Konzentration berechnet sich aus: A260 x Verdünnung x 50 µg/ml (molarer Extinktionskoeffizient). Zur Überprüfung der DNA auf Fragmenteinbau wurde 1 µg DNA im analytischen Maßstab mit geeigneten Restriktionsendonukleasen verdaut (2.3.4) und im Agarosegel aufgetrennt (2.3.2).

2.3.12 Sequenzierung der DNA-Konstrukte

↓53

Alle hergestellten DNA-Konstrukte wurden zur Verifizierung sequenziert. Die Sequenzierung der DNA wurde von der Firma GATC Biotech AG (Konstanz) durchgeführt. Die ermittelte Sequenz wurde mit der gewünschten Sequenz im Programm „HUSAR ProfAlign“ des Bioinformatik Services der DKFZ (Heidelberg) verglichen.

2.4 Zellkultur

2.4.1  Kultivierung und Verdünnung von HEK 293 Zellen

PBS-Puffer (steril):

140 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,75 mM KH2PO4 in dH2O, pH 7,4 mit HCl eingestellt, autoklaviert (120°C, 1,2 bar, 20 min)

↓54

Kulturmedium (Grundmedium):

10 % FKS, 1 % Penicillin/Streptomycin (Stocklösung (100fach) Endkonzentration: 50 U/ml / 50 µg/ml) in DMEM (mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

Die Kultivierung der HEK 293 Zellen erfolgte, nach Standardprotokollen (Kruse and Patterson, 1973), bei 37°C, 5 % CO2 und Feuchtigkeitssättigung, im CO2-Inkubator. Die Zellen wachsen adherent. Sie wurden bei Konfluenz mit sterilem PBS-Puffer gewaschen und mit Trypsin-EDTA- Lösung abgelöst. Für eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10 cm wurde 1,5 ml Trypsin-EDTA-Lösung eingesetzt. Die abgelösten Zellen wurden sofort in 6 ml Kulturmedium aufgenommen, um den Trypsinierungsvorgang zu stoppen, und in sterile 15 ml Zentrifugationsröhrchen überführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert (400 , 5 min, RT), in Kulturmedium resuspendiert und in einer Verdünnung von 1:4 bis 1:8 wieder ausgesät. Die Verdopplungsrate beträgt ca. 24-36 Stunden.

2.4.1.1 Anlegen von Dauerkulturen (Kryokonservierung)

↓55

Einfriermedium:

90 % FKS, 10 % DMSO

Zum Anlegen von Dauerkulturen wurden konfluente Zellmonolayer einer 10 cm Petrischale wie unter 2.4.1 beschrieben pelletiert. Das Zellpellet wurde in 1 ml Einfriermedium (4°C) resuspendiert und in ein Kryoröhrchen überführt. Die Kulturen wurden in Einfrierboxen, die eine langsame, definierte Abkühlung gewährleisten, bei -80°C eingefroren und zur Dauerlagerung nach ca. 1 Woche in den flüssigen Stickstofftank überführt. Die Zellkonzentration im Einfriermedium beträgt ca. 5x10Zellen /ml.

2.4.1.2 Transfektion von HEK 293 Zellen mit rekombinanter DNA

↓56

Selektionsmedien:

Die gewünschten Selektionsantibiotika wurden in der angegebenen Konzentration zu dem Grundmedium zugegeben:
G418 (Geneticin) Stocklösung (100 mg/ml), Endkonzentration 400 µg/ml, Zeocin Stocklösung (100 mg/ml), Endkonzentration 200 µg/ml.

Die entsprechenden Zellen wurden in einer 10 cm Schale bis zu einer Konfluenz von ca. 80 % kultiviert und mittels FuGENE gemäß den Anweisungen des Herstellers mit der gewünschten Plasmid-DNA transfiziert. Im Falle einer transienten Transfektion wurden die Zellen 24-48 h nach der Transfektion für das entsprechende Experiment eingesetzt. Zur Selektion stabiler Einzelzellklone wurden die Zellen 24 h nach der Transfektion in verschiedenen Verdünnungen (1:50-1:400) in das entsprechende Selektionsmedium umgesetzt. Je nach Antibiotikum benötigte eine vollständige Selektion 1-3 Wochen. Untransfizerte Zellen waren abgestorben und stabile Einzelzellklone waren zu Zellhaufen herangewachsen. Die Einzelzellklone wurden von der geeigneten Verdünnungsplatte unter Verwendung steriler Klonierungszylinder isoliert, mit Trypsin-EDTA-Lösung abgelöst und in 12-well-Platten transferiert.

↓57

Die Zellen wurden anschließend weiter vermehrt, je Zellklon wurden zwei 6 cm Schalen angelegt, die Zellen einer Schale wurden als Dauerkultur eingefroren, die der anderen Schale wurden lysiert, in der SDS-PAGE aufgetrennt (2.5.3.3) und auf Expression des exogenen Proteins im Western Blot analysiert (2.5.3.5).

2.4.1.3  Beschichtung von Kulturschalen und Deckgläschen mit Poly L-Lysin

Poly-L-Lysin (Stocklösung 100fach für Deckgläschen, 1000fach für Kulturschalen):

10 mg/ml Poly-L-Lysin in sterilem dH2O

↓58

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,75 mM KH2PO4 in dH2O, pH 7,4; autoklaviert

Für einige Experimente mussten Zellkulturschalen mit Poly-L-Lysin beschichtet werden, um eine bessere Haftung der HEK 293 Zellen zu erreichen. Hierzu wurden Kulturschalen für 1-2 h bei 37°C mit einer Poly-L-Lysin-Lösung (10 µg/ml) im CO2-Inkubator inkubiert und anschließend 5-mal mit sterilem dH2O gewaschen. Sollten die Schalen sofort benutzt werden, wurden sie 1-mal mit sterilem PBS-Puffer gewaschen, andernfalls wurden die Schalen in der Sterilbank getrocknet, steril verpackt und bei 4°C gelagert.

↓59

Glasdeckgläschen müssen, um ein Zellwachstum zu ermöglichen, immer beschichtet werden. Deckgläschen wurden über Nacht in 70 % Ethanol sterilisiert oder zur Serilisation autoklaviert (120 °C, 1,2 bar, 20 min). Nach der Sterilisation wurden sie vollständig mit Poly-L-Lysin-Lösung (100 µg/ml) bedeckt und 2 h bei 37°C oder über Nacht bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Deckgläschen 5-mal mit sterilem dH2O gewaschen und in sterilem dH2O gelagert.

2.4.1.4 Zählen von Zellen

Die Zellzahl wurde mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer ermittelt.

2.4.2 Kultivierung der MDCK Zellen

2.4.2.1 Verdünnung, Kryokulturen und Transfektion

Selektionsmedien:

↓60

Die gewünschten Selektionsantibiotika wurden in der angegebenen Konzentration zu dem Grundmedium zugegeben:
G418 (Geneticin) Stocklösung (100 mg/ml), Endkonzentration 800 µg/ml, Zeocin Stocklösung (100 mg/ml), Endkonzentration 400 µg/ml

Die Kultivierung der MDCK Zellen erfolgte analog zu der von HEK 293 Zellen (2.4.1). Unterschiede ergaben sich nur bei der Transfektion. Da MDCK Zellen sehr schlecht zu transfizieren sind, konnten transiente Transfektionen nicht durchgeführt werden, und um stabile Einzellzellklone zu erhalten, wurden die Zellen 24 h nach Transfektion in einer Verdünnungen von 1:5 in das entsprechende Selektionsmedium umgesetzt. Die Konzentration der Selektionsantibiotika ist bei MDCK Zellen höher als bei HEK 293 Zellen (2.4.1.2). Je nach Antibiotikum benötigte eine vollständige Selektion 3-4 Wochen. Um 1-2 hoch exprimierende Klone zu erhalten, mussten ca. 20 Einzelzellklone isoliert werden.

2.4.2.2 Wachstum von MDCK Zellen in Filterkammern

Medium für auf Filtern wachsende MDCK Zellen:

↓61

20 % FKS, 1 % Penicillin/Streptomycin in DMEM (mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

Medium mit Na-Butyrat:

10 mM Na-Butyrat (Stocklösung (100fach): 1 M Na-Butyrat in sterilem dH2O) in Grundmedium oder in Filtermedium

↓62

MDCK Zellen wurden zur Ausbildung eines polarisierten „Monolayers“ auf Transwell-Filter ausgesät und 5-6 Tage bei täglichem Mediumwechsel kultiviert. Die FKS Konzentration des Grundmediums wurde auf 20 % erhöht.

Für biochemische Experimente wurden Filter mit einem Durchmesser von 24 mm eingesetzt, das apikale Medienvolumen betrug 1,5 ml, das basolaterale 2,6 ml. Es wurden ca. 2,5 x 10 Zellen auf einen 24 mm Filter ausgesät.

Für cytochemische Untersuchungen wurden Filter mit einem Durchmesser von 12 mm eingesetzt, das apikale Medienvolumen betrug 0,5 ml, das basolaterale 1,5 ml. Es wurden ca. 6 x 10Zellen auf einen 12 mm Filter ausgesät.

↓63

Zur Erhöhung der Expression der exogen exprimierten Proteine wurden die MDCK Zelllinien über Nacht, d.h. 15-18 h, mit 10 mM Na-Butyrat behandelt (Gottlieb et al., 1986).

2.5 Proteinbiochemische Methoden

2.5.1 Herstellung von Zelllysaten

2.5.1.1  Gesamtproteinlysat

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,75 mM KH2PO4 in dH2O, pH 7,4; autoklaviert

↓64

STEN-Lysepuffer mit BSA:

50 mM Tris pH 7,6; 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % NP-40, 2 mg/ml BSA in dH2O

STEN-Lysepuffer ohne BSA:

↓65

50 mM Tris pH 7,6; 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % NP-40 in dH2O

Konfluente Monolayer von HEK 293 oder MDCK Zellen wurden auf Eis 2-mal mit eiskaltem PBS-Puffer gewaschen und anschließend in 1 ml PBS-Puffer abgeschabt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (1000 , 5 min) pelletiert, in STEN-Lysepuffer Puffer resuspendiert (800 μl pro 10 cm Schale, 400 μl pro 6 cm Schale) und 15 min auf Eis inkubiert. Die unlöslichen Bestandteile, wie Cytoskelett und Zellkerne, wurden durch Zentrifugation (16000 , 20 min, 4°C) abgetrennt. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Sollten die Zelllysate direkt in der SDS-PAGE aufgetrennt werden, wurde STEN-Lysepuffer ohne BSA eingesetzt, sollte jedoch das Zelllysat zur Immunopräzipitation eingesetzt werden, wurde STEN-Lysepuffer mit BSA benutzt. Zur Lagerung wurden Lysate bei -20°C eingefroren.

2.5.1.2  Membranproteinlysat

PBS-Puffer:

↓66

140 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,75 mM KH2PO4 in dH2O, pH 7,4; autoklaviert

Hypotoner-Puffer:

10 mM Tris pH 7,6; 10 mM KCl, 1,5 mM Mg-Acetat in dH2O

↓67

STEN-Lysepuffer ohne BSA:

50 mM Tris pH 7,6; 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % NP-40 in dH2O

Konfluente Monolayer einer 10 cm Schale von HEK 293 oder MDCK Zellen wurden auf Eis 2-mal mit eiskaltem PBS-Puffer gewaschen und anschließend in 1 ml PBS-Puffer abgeschabt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (400 , 5 min) pelletiert, in 1 ml kaltem hypotonen Puffer resuspendiert und zum Schwellen 30 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden durch 15-maliges Aufziehen der Suspension mit einer 2 ml Spritze durch eine 0,6 mm Injektionskanüle geöffnet. Zellkerne und Cytoskelett wurden durch Zentrifugation (3000 , 10 min, 4°C) abgetrennt und die Membranen anschließend durch Ultrazentrifugation (100000 , 1 h, 4°C) aus dem Überstand pelletiert. Das Membranpellet wurde entweder direkt in 30-60 µl SDS-Probenpuffer (2.5.3.1) bei 37°C im Schüttelinkubator gelöst, oder in 50-100 µl STEN-Lysepuffer ohne BSA resuspendiert. Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt (16000 , 20 min, 4°C), aus dem STEN-Membranlysat wurde die Proteinkonzentration ermittelt.

2.5.2 Proteinbestimmung

↓68

BSA-Standard Lösung:

2 2 mg/ml BSA

Die Bestimmung der Proteinkonzentration von Gesamt- oder Membranproteinlysaten erfolgte mit Hilfe des Bio-Rad Protein Assay Kit und basiert auf der Methode nach Bradford (Bradford, 1976).

↓69

1-2 µl der zu messenden Probe wurden in einer 1 cm Einwegküvette vorgelegt, mit 1 ml der 1:5 verdünnten Bio-Rad Protein Assay Reagenzlösung versetzt, nach mindestens 5 min Inkubation bei RT wurde die Extinktion bei einer Wellenlänge von 595 nm fotometrisch ermittelt. Parallel wurde eine Kalibrierkurve mit 2-10 µg BSA angesetzt. Alle Proben und die Kalibierstandards wurden als 3fache Bestimmung angesetzt. Die Funktion der Kalibrierkurve wurde durch lineare Regression ermittelt, und aus der Funktion der Kalibrierkurve wurde die Proteinkonzentration der Proben berechnet.

2.5.3 Nachweis von Proteinen

2.5.3.1  TCA-Fällung von Proteinen

20 % Trichloressigsäure (TCA)

Aceton

↓70

SDS-Probenpuffer (2fach):

20 % Glycerin, 4 % (w/v) SDS, 5 % β-Mercaptoethanol, 125 mM Tris pH 6,8; 0,005 % Bromphenol blau

Die Proben wurden mit einem Volumen 20 %iger-TCA-Lösung versetzt, 30 min auf Eis inkubiert und anschließend zentrifugiert (16000 , 30 min, 4°C). Das Proteinpellet wurde 1-mal mit Aceton gewaschen, kurz bei 37°C getrocknet und in Probenpuffer aufgenommen.

2.5.3.2 Immunopräzipitation von Proteinen

↓71

STEN-Puffer:

50 mM Tris pH 7,6; 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,2 % NP-40 in dH2O

STEN-NaCl-Puffer:

↓72

50 mM Tris pH 7,6; 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,2 % NP-40 in dH2O

STEN-SDS-Puffer:

50 mM Tris pH 7,6; 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,2 % NP-40, 0,1 % (w/v) SDS in dH2O

↓73

Protein-A-Sepharose Suspension (PAS):

100 mg/ml Protein-A gebunden an Sepharose CL-4B und 2 mg/ml BSA in STEN-Puffer

SDS-Probenpuffer (2fach):

↓74

20 % Glycerin, 4 % (w/v) SDS, 5 % β-Mercaptoethanol, 125 mM Tris pH 6,8; 0,005 % Bromphenol blau

Gesamtproteinlysate oder Membranproteinlysate wurden nach der Abzentrifugation unlöslicher Bestandteile (2.5.1.1) zur Vorreinigung mit 25 µl Protein-A Sepharose (PAS) versetzt und 30 min bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Die PAS und unspezifisch gebundene Bestandteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt (16000 , 20 min, 4°C). Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit dem entsprechenden AK in derunter 2.2.4.1 angegebenen Konzentration und 25 µl PAS für 3-4 h bei 4°C auf einem Schüttler inkubiert. Konditionierte Medien wurden nicht vorgereinigt, sondern direkt mit AK und PAS über Nacht inkubiert. Das Immunopräzipitat wurde durch Zentrifugation (4000 , 5 min, 4°C) sedimentiert und der Überstand wurde aspiriert. Nacheinander wurde das Immunopräzipitat je 15 min, mit je 1ml STEN-NaCl-Puffer, STEN-SDS-Puffer und STEN-Puffer gewaschen. Nach jedem Wasch-schritt wurde, wie oben beschrieben, zentrifugiert und die Überstände wurden aspiriert.

Die Pellets wurden anschließend mit 15 µl 2fach SDS-Probenpuffer versetzt, 5 min bei 95 °C erhitzt und mittels SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (2.5.3.3) und Western Blot (2.5.3.5) oder Fluorografie (2.5.3.6) analysiert.

2.5.3.3  SDS-Polyacrylamid Gelektrophorese (SDS-PAGE)

↓75

SDS-Polyacrylamid Gele :

Trenngel-Puffer (4fach „lower Tris“):

1,5 M Tris pH 8,8; 0,4 % (w/v) SDS in dH2O

↓76

Sammelgel-Puffer (4fach „upper Tris“):

0,5 M Tris pH 6,8; 0,4 % (w/v) SDS in dH2O

Acrylamid-Lösung:

↓77

40 % (w/v) Acrylamid-BIS-Acrylamid 37,5:1 in dH2O

Ammoniumpersulfat Lösung (APS):

10 % (w/v) Ammoniumpersulfat in dH2O

↓78

Zusammensetzung der Gel-Lösungen für 2 Minigele (0,75 mm)

 

8 %-

Trenngel

10 %-

Trenngel

12 %-

Trenngel

Sammelgel

Trenngel-/Sammelgel-Puffer

4,0 ml

4,0 ml

4,0 ml

2,5 ml

Acrylamid-Lsg.

3,2 ml

4,0 ml

4,8 ml

0,9 ml

dH2O

8,8 ml

8,0 ml

7,2 ml

6,5 ml

10 % APS-Lsg.

30µl

30 µl

30 µl

30 µl

TEMED

30 µl

30 µl

30 µl

30 µl

SDS-Probenpuffer (4fach):

↓79

40 % Glycerin, 8 % (w/v) SDS, 10 % β-Mercaptoethanol, 250 mM Tris pH 6,8; 0,01 % Bromphenol blau

SDS-Probenpuffer (2fach):

20 % Glycerin, 4 % (w/v) SDS, 5 % β-Mercaptoethanol, 125 mM Tris pH 6,8; 0,005 % Bromphenol blau

↓80

Elektrophoresepuffer ohne SDS (10fach):

250 mM Tris, 1,92 M Glycin in dH20

Elektrophoresepuffer (1fach):

↓81

25 mM Tris, 0,2 M Glycin und 0,1 % (w/v) SDS in dH20

Die eindimensionale Auftrennung von Proteinen erfolgte unter denaturierenden Bedingungen in einem diskontinuierlichen Gelsystem (Laemmli, 1970). Proteine werden entsprechend ihrer apparenten molekularen Masse aufgetrennt.

Zur SDS-PAGE wurde ein Minigelsystem mit einer Sammelgelstrecke von 0,5-1 cm und einer Trenngelstrecke von ca. 7 cm verwendet. SDS-Gele mit 10 Probentaschen und einer Dicke von 0,75 mm oder 15 Probentaschen und einer Dicke von 1,5 mm wurden eingesetzt. Der Anteil des Polyacrylamids ist entscheidend für die Vernetzung der Gele und damit für die Trennfähigkeit. Je höher der Anteil des Acrylamids, angegeben in Prozent, desto kleinere Proteine können aufgetrennt werden; 10 %ige SDS-Gele trennen Proteine bis zu einem Molekulargewicht von 20 kDa. Die Prozentigkeit der SDS-Gele ist bei den jeweiligen Experimenten angegeben.

↓82

Die Glasplatten wurden vor der Verwendung mit Seifenlösung und Isopropanol von Proteinen und Gelrückständen befreit, entsprechend der Herstellerbeschreibung zusammengebaut und in Gießständer eingesetzt. Das Trenngel wurde bis zu einer Höhe von ca. 2 cm unterhalb des oberen Glasplattenrandes gegossen und mit Isopropanol überschichtet. Nach dem Polymerisieren wurde das Isopropanol dekantiert und Reste mit Filterpapier entfernt. Das Sammelgel wurde auf das Trenngel gegossen und ein Probentaschenkamm eingefügt. Nach der vollständigen Polymerisierung des Sammelgels wurde der Kamm vorsichtig entfernt und das Gel in die Trennkammer eingesetzt. Elektrophoresepuffer wurde in die Anoden- und Katodenkammer gefüllt. Die Probentaschen wurden vor dem Laden der Proben mit Elektrophoresepuffer gespült.

Die in Probenpuffer aufgenommenen Proben wurden vor dem Einbringen in die Probentaschen 5 min bei 95°C erhitzt. Nicht gelöstes Material wurde durch Zentrifugation (16000 , 2 min) abgetrennt. Als Molekulargewichtsstandard wurden 10 µl „Rainbowmarker“ geladen. Anode und Kathode wurden mit der Spannungsquelle verbunden. Die Elektrophorese erfolgte bei einer konstanten Spannung von 120 V.

2.5.3.4 Tris-Tricine-Gelelektrophorese

Elektrophoresepuffer für Tris-Tricine-Gele mit SDS (10fach):

↓83

1 M Tris, 1M Tricine und 1 % (w/v) SDS in dH2O

Zur Auftrennung von niedermolekularen Proteinen wurde das Tris-Tricine-Gelsystem der Firma Novex/Invitrogen nach Schägger und von Jagow (Schägger und von Jagow, 1987) unter Verwendung von 10-20 %igen Tris-Tricine-Fertiggelen entsprechend der Anweisung des Herstellers eingesetzt.

Als Anoden- und Kathodenpuffer wurde Tris-Tricine-Elektrophoresepuffer eingesetzt, die Proben wurden in SDS-PAGE Probenpuffer (2.5.3.3) aufgenommen und 5 min bei 95°C erhitzt. Als Molekulargewichtsstandard wurden 10 µl „Low-Range Molekulargewichtsmarker“ eingesetzt. Die Elektrophorese wurde wie unter 2.5.3.3 beschrieben durchgeführt.

2.5.3.5 Western Blot Analyse

↓84

Transferpuffer (1fach):

25 mM Tris, 0,2 M Glycin in dH20

TBST-Puffer:

↓85

0,3 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,6; 0,3 % Triton X-100 in dH2O

Blockierungspuffer:

5 % (w/v) Magermilchpulver in TBST-Puffer oder 50 % Pferdeserum in TBST-Puffer

↓86

Nach der Proteinauftrennung im SDS-Gel mittels Elektrophorese wurden die Proteine in einer Transferkammer aus dem Gel auf eine PVDF- oder Nitrozellulose-Membran übertragen.

Transferaufbau:

Anodenplatte

↓87

poröser Schwamm in Transferpuffer äquilibriert

zwei Lagen Gel-Transferpapier in Transferpuffer äquilibriert

Membran in Transferpuffer äquilibriert

↓88

SDS-Gel

zwei Lagen Gel-Transferpapier in Transferpuffer äquilibriert

poröser Schwamm in Transferpuffer äquilibriert

↓89

Kathodenplatte

Der Transfer wurde bei konstantem Stromfluss von 400 mA für 1 h bei 4°C durchgeführt. Nach erfolgtem Transfer wurde die Membran zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen 1 h bei RT in Blockierungspuffer geschüttelt. Die so vorbehandelte Membran wurde anschließend 2 h bei RT oder über Nacht bei 4°C mit primärem AK, verdünnt in Blockierungspuffer (2.2.4.1), auf einem Schüttler inkubiert. Überschüssiger oder unspezifisch gebundener AK wurde durch 4-mal 15 min Waschender Membran mit TBST-Puffer entfernt. Der entsprechende HRP-gekoppelte sekundäre Antikörper (2.2.4.1) wurde ebenfalls in Blockierungspuffer verdünnt und 1 h bei RT mit der Membran inkubiert. Schließlich wurde erneut 4-mal je 15 min mit TBST-Puffer gewaschen und kurz mit dH2O nachgespült. Die Detektion der mit den Antikörpern gekoppelten Proteine erfolgte mit Hilfe der ECL Technik nach Angaben des Herstellers. Zum Nachweis schwacher Signale wurde der sensitive „ECL-Plus Western Blotting Kit“ verwendet. Die Chemilumineszenzsignale wurden mit Kodak-X-Omat DS Röntgenfilmen detektiert.

2.5.3.6 Fluorografische Analyse radioaktiv markierter Proteine

Fixierlösung:

↓90

25 % Isopropanol und 10 % Essigsäure in dH2O

Die zur radioaktiven Markierung eingesetzten Isotope [S] und [H] sind niederenergetische Strahler, ein direkter autoradiografischer Nachweis ist kaum möglich, durch Einsatz eines Szintillators können die Signale von [H] 1000fach und die von [S] 10fach erhöht werden.

Radioaktiv markierte, immunopräzipitierte Proteine wurden in der SDS-PAGE oder im Tris-Tricine-Gelsystem aufgetrennt. Die Proteine wurden, durch 30 min Inkubation der Gele in der Fixierlösung, im Gel fixiert. Zur Verstärkung der radioaktiven Signale, durch Umwandlung der radioaktiven Strahlung in Lichtsignale wurden die Gele 30 min in Amplify-Lösung inkubiert und auf Transfer Papier im Geltrockner bei 80°C 1h getrocknet. Der fluorografische Nachweis der radioaktiven Proteine erfolgte mit Hilfe von Röntgenfilmen. Die Röntgenfilme wurden auf die getrockneten Gele aufgelegt und in Filmkassetten bei -80°C inkubiert, nach gewünschter Inkubationszeit wurden die Filme entwickelt. Die Exposition bei -80°C erhöht die Sensitivität des Films für schwache Lichtsignale.

2.5.3.7 Quantifizierung radioaktiv markierter Proteine

↓91

Radioaktiv markierte Proteine wurden nach der SDS-PAGE, der Fixierung im Gel, der Verstärkung der Signale und dem Trocknen des Gels, mit Hilfe des Phosphor-Imagers quantifiziert. Die getrockneten Gele wurden in Phosphor-Imager Kassetten mit einer radioaktivitätssensitiven Folie inkubiert. Auf der Folie wurden die radioaktiven Signale gespeichert und im Phosphor-Imager konnten die Intensitäten der Signale gemessen werden. Die Banden der zu quantifizierenden Proteine wurden markiert und die Intensitäten berechnet. In dieser Arbeit wurden ausschließlich Verhältnisse von verschiedenen Proteinen quantifiziert, so konnte auf eine Normierung auf einen externen Standard verzichtet werden.

Für alle Quantifizierungen wurden 3fach Bestimmungen angesetzt, Mittelwerte und Standardabweichungen wurden angegeben.

2.5.4 Metabolische radioaktive Markierung von Proteinen

2.5.4.1 Langzeitmarkierung von HEK 293 Zellen mit [S]Methionin/ Cystein

Medium für radioaktive Markierungen („pulse“-Medium):

↓92

1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

Medium für radioaktive Langzeitmarkierungen:

5 % dialysiertes FKS, 1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyrouat)

↓93

Die entsprechenden HEK 293 Zelllinien wurden in 6 cm Schalen bis zu einer Konfluenz von 80-90 % kultiviert. Das Kulturmedium wurde aspiriert und durch 2 ml methioninfreies „pulse“-Medium ersetzt, die Zellen wurden 1 h bei 37°C im CO2-Inkubator inkubiert. Das „pulse“-Medium wurde anschließend vollständig entfernt und durch 1,5 ml methioninfreies Medium für radioaktive Langzeitmarkierungen, mit 5 % dialysiertem Serum, ersetzt. 20 µl Promix wurden je Kulturschale zugesetzt, damit ergibt sich eine Konzentration von 7 MBq [S]Methionin/Cystein /ml. Nach 4 h Inkubation bei 37°C im CO2-Inkubator wurde das konditionierte Medium abgenommen und nach Zentrifugation (16000 , 20 min, 4°C) direkt zur Immunopräzipitation (2.5.3.2) eingesetzt oder bei -20°C eingefroren. Bei Bedarf wurden die Zellen mit STEN-Lysepuffer lysiert (2.5.1.1) und die zu untersuchenden Proteine ebenfalls immunopräzipitiert. Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE (2.5.3.3) und Fluorografie des Gels (2.5.3.6).

2.5.4.2  Langzeitmarkierung von MDCK Zellen mit [S]Methionin/ Cystein

Medium für radioaktive Markierungen („pulse“-Medium):

1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

↓94

Medium für radioaktive Langzeitmarkierungen:

5 % dialysiertes FKS, 1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

Die entsprechenden MDCK Zelllinien wurden in Filterkammern mit 24 mm Durchmesser polarisiert, zur radioaktiven Markierung wurde das Kulturmedium aspiriert und durch methioninfreies „pulse“-Medium ersetzt (apikal 1,5 ml, basolateral 2,6 ml), die Zellen wurden 45 min bei 37°C im CO2-Inkubator vorinkubiert. Das „pulse“-Medium wurde anschließend vollständig entfernt und apikal durch 1,5 ml methioninfreies Medium für radioaktive Langzeitmarkierungen, mit 5 % dialysiertem Serum, ersetzt. Für das basolaterale Medium wurden 4 MBq [S]Methionin/Cystein /ml zu dem Medium für radioaktive Langzeitmarkierungen zugesetzt und 2,6 ml je Filterkammer eingesetzt. Polarisierte MDCK Zellen nehmen Aminosäuren fast ausschließlich basolateral auf. Nach 4 h Inkubation bei 37°C im CO2-Inkubator wurde das konditionierte apikale und basolaterale Medium getrennt abgenommen und nach Zentrifugation (16000 , 20 min, 4°C) direkt zur Immunopräzipitation (2.5.3.2) eingesetzt bzw. bei -20°C eingefroren. Für die Amyloid-Bestimmung mussten apikale und basolaterale Medien von 3 Filtern vereinigt werden. Bei Bedarf wurden die Zellen mit STEN-Lysepuffer lysiert (2.5.1.1).

2.5.4.3 „Pulse/chase“-Markierung von HEK 293 Zellen

↓95

Medium für radioaktive Markierungen („pulse“-Medium):

1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

Medium für radioaktive Markierungen („chase“-Medium):

↓96

Grundmedium mit 5fach erhöhter Methioninkonzentration (1 mM)

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,75 mM KH2PO4 in dH2O, pH 7,4; autoklaviert

↓97

Die entsprechenden HEK 293 Zelllinien wurden in 6 cm Schalen bis zu einer Konfluenz von 80-90 % kultiviert. Nach Entfernung des Kulturmediums, wurden die Zellen 1 h mit 2 ml „pulse“-Medium bei 37°C im CO2-Inkubator vorinkubiert. Das „pulse“-Medium wurde durch 7 MBq [S]Methionin/Cystein /ml haltigem „pulse“-Medium ersetzt. Nach 10-15 min Inkubation bei 37°C im CO2-Inkubator, wurde das radioaktive Medium sofort abgenommen, die Zellen mit 2 ml „chase“-Medium gewaschen und 1,5 ml frisches „chase“-Medium zugegeben. Zu den angegebenen „chase“-Zeitpunkten wurde der Zellrasen sofort mit eiskaltem PBS-Puffer gewaschen und mit STEN-Lysepuffer lysiert (2.5.1.1). Die Lysate wurden direkt für die Immunopräzipitation (2.5.3.2) verwendet und die zu den verschiedenen „chase“-Zeitpunkten gesammelten Medien wurden bei Bedarf ebenfalls immunopräzipitiert. Die Analyse der Proteine erfolgte in der SDS-PAGE (2.5.3.3) und Fluorografie (2.5.3.6).

2.5.4.4 „Pulse/chase“-Markierung von MDCK Zellen

Medium für radioaktive Markierungen („pulse“-Medium):

1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyrovate)

↓98

Medium für radioaktive Markierungen („chase“-Medium):

Grundmedium mit 5fach erhöhter Methioninkonzentration (1 mM)

PBS-Puffer:

↓99

140 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,75 mM KH2PO4 in dH2O, pH 7,4; autoklaviert

Die entsprechenden MDCK Zelllinien wurden in Filterkammern mit 24 mm Durchmesser polarisiert, zur radioaktiven Markierung wurde das Kulturmedium aspiriert und durch methioninfreies „pulse“-Medium ersetzt (apikal 1,5 ml, basolateral 2,6 ml). Die Zellen wurden 45 min bei 37°C im CO2-Inkubator vorinkubiert. Das „pulse“-Medium wurde anschließend vollständig entfernt und die Filter wurden nach kurzer Trocknung auf Filterpapier in eine 10 cm Kulturschale je auf einen 50 µl Tropfen, bestehend aus 20 µl Promix und 30 µl „pulse“-Medium (10,6 MBq [S]Methionin/Cystein), überführt. Apikal wurden 150 µl „pulse“-Medium auf den Zellmonolayer pipettiert, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern. Die Filter wurden 10 min bei 37°C im CO2-Inkubator inkubiert, nach der „pulse“-Inkubation wurden die Filter in ihre Kulturschale zurückgesetzt und mit „chase“-Medium gewaschen. Für den „chase“-Zeitpunkt „0 min“ wurde der Filter sofort mit eiskaltem PBS-Puffer gewaschen und lysiert. Für jeden gewünschten „chase“-Zeitpunkt wurde ein Filter eingesetzt. Die verschiedenen Ansätze wurden entsprechend der jeweiligen „chase“-Zeit bei 37°C im CO2-Inkubator inkubiert, anschließend wurde das konditionierte Medium abgenommen, der Zellmonolayer sofort mit eiskaltem PBS-Puffer gewaschen und die Zellen mit STEN-Lysepuffer lysiert. Medien und STEN-Lysate wurden immunopräzipitiert, in der SDS-PAGE (2.5.3.3) und Fluorografie (2.5.3.6) analysiert.

2.5.4.5 Markierung von MDCK Zellen mit [H]Phenylalanin und Radiosequenzierung

Medium ohne Phenylalanin (2fach Stocklösung):

↓100

Die Herstellung erfolgte unter Verwendung des MEM Select-Amine Kit nach den Anweisungen des Herstellers.

Die entsprechende MDCK Zelllinie wurde in Filterkammern mit 24 mm Durchmesser polarisiert, zur radioaktiven Markierung wurde das Kulturmedium aspiriert und durch phenylalaninfreies Medium ersetzt (apikal 1,5 ml, basolateral 2,6 ml), die Zellen wurden 45 min bei 37°C im CO2-Inkubator vorinkubiert. Das Medium wurde anschließend vollständig entfernt und apikal durch 1,5 ml phenylalaninfreiesMedium mit 5 % dialysiertem Serum ersetzt. Für die basolaterale radioaktive Markierung wurde phenylalaninfreies, 2fach Medium mit 5 % dialysiertem FKS und 1:1 mit [H]Phenylalanin (37 MBq/ml) supplementiert, eingesetzt. Nach 4 h Inkubation bei 37°C im CO2-Inkubator wurde das konditionierte basolaterale Medium abgenommen und nach Zentrifugation (16000 , 20 min, 4°C) direkt zur Immunopräzipitation mit AK 3926 eingesetzt (2.2.4.1).Das Immunopräzipitat wurde im Tris-Tricine Gel aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert (2.5.3.5). Parallel wurde eine Markierung mit [S]Methionin/Cystein (2.5.4.2) durchgeführt und die [S]-markierten Immunopräzipitate wurden neben der [H]-markierten Probe im Tris-Tricine-Gel geladen, um die [H]-markierten Proteine auf der Membran besser lokalisieren zu können. Zum Nachweis der radioaktiven Proteine wurden sensitive Röntgenfilme (BioMax TMMR)verwendet. Die Exposition erfolgte bei -80°C.

Radiosequenzierung:

↓101

Die [H]-markierten Protein-Banden wurden mit einem Skalpell aus der PVDF Membran ausgeschnitten. Die an die Membran gebundenen Proteine wurden einem automatisierten Edman-Abbau (Applied Biosystems, Sequenzierer Model 475) unterzogen. Die erhaltenen Aminosäure-Thiohydantoin wurden mit n-Butylchlorid extrahiert und in 6 ml Szintillationsgefäße überführt. Die Radioaktivitätsmessung erfolgte unter Zusatz von 5 ml Szintillationscocktail im Szintillationszähler. Die Radiosequenzierung wurde von Dr. David Teplow (Harvard Medical School, Brigham and Women`s Hospital, Boston) durchgeführt.

2.5.5 Analyse der Protein-Glycosylierung

2.5.5.1  N-Glycosidase F Behandlung

N-Glycosidase F-Puffer:

100 mM Natrium-Phosphat, pH 8,0; 25 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 2,5 mM PMSF in dH2O

↓102

„Beads“-Elutionspuffer:

100 mM Tris pH 7,5; 1 % (w/v) SDS, 1 % β-Mercaptoethanol

HEK 293 Zelllinien oder MDCK Zelllinien wurden im „pulse/chase“-Experiment mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert (2.5.4.3 / 2.5.4.4). Die „pulse“ und „chase“ Zeiten sind bei den jeweiligen Experimenten angegeben. Gesamtproteinlysate wurden hergestellt (2.5.1.1) und die zu deglycosylierenden Proteine wurden durch Immunopräzipitation mit dem entsprechenden AK (2.5.3.2) isoliert. Mit 20 µl „beads“-Elutionspuffer bei 10 min Erhitzung auf 95°C wurden die präzipitierten Proteine von der PAS abgetrennt. Die PAS wurde durch Zentrifugation pelletiert (16000 , 5 min), und je 10 µl des Eluats wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zu dem Reaktions- und Kontrollansatz wurden 90 µl N-Glycosidase F-Puffer und zum Reaktionsansatz zusätzlich 1µl N-Glycosidase F (1 U/µl) pipettiert. Reaktions- und Kontrollansätze wurden 16 h bei 37°C, 700 UpM auf einem Thermoschüttler inkubiert, anschließend wurde die Reaktion durch TCA-Fällung gestoppt (2.5.3.1). Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE und Fluorografie (2.5.3.6).

2.5.5.2 Endoglycosidase H Behandlung

↓103

Endoglycosidase H-Puffer:

200 mM Natriumcitrat pH 5,8; 2,5 mM PMSF in dH2O

„Beads“-Elutionspuffer:

↓104

100 mM Tris pH 7,5; 1 % (w/v) SDS, 1 % β-Mercaptoethanol

Die Proteine wurden wie unter 2.5.5.1 beschrieben radioaktiv markiert und isoliert. Je 10 µl des Eluats für den Reaktions- und den Kontrollansatz wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zu beiden Ansätzen wurden 90 µl Endoglycosidase H-Puffer, 1 µl 1M PMSF und zum Reaktionsansatz zusätzlich 1 µl Endoglycosidase H (5 U/ml) pipettiert. Reaktions- und Kontrollansätze wurden 16 h bei 37°C, 700 UpM auf einem Thermoschüttler inkubiert, anschließend wurde die Reaktion durch TCA-Fällung gestoppt (2.5.3.1). Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE und Fluorografie (2.5.3.6).

2.5.5.3 Tunicamycin Behandlung

Tunicamycin (Stocklösung 1000fach):

↓105

10 mg/ml in DMSO

HEK 293 Zelllinien wurden im „pulse/chase“-Experiment in Gegenwart von 10 µg/ml Tunicamycin mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert (2.5.4.3). Sowohl die Präinkubation in methioninfreiem Medium, als auch „pulse“ und „chase“ wurden in Gegenwart von Tunicamycin durchgeführt. Zu den angegebenen „chase“-Zeitpunkten wurden Gesamtproteinlysate hergestellt (2.5.1.1) und die fraglichen Proteine wurden immunopräzipitiert (2.5.3.2). Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE (2.5.3.3) und Fluorografie (2.5.3.6).

2.5.6 Analyse zellulärer Transport Mechanismen

2.5.6.1 Behandlung von HEK 293 Zellen mit Brefeldin A und Monensin

Brefeldin A (BFA), (Stocklösung 500fach):

↓106

5 mg/ml BFA in EtOH

Monensin (Stocklösung 1000fach):

10 mM Monensin in EtOH

↓107

HEK 293 Zelllinien wurden im „pulse/chase“-Experiment mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert (2.5.4.3). Während der auf 2 h verlängerten Präinkubation mit methioninfreiem Medium wurden bereits BFA (10 µg/ml) bzw. Monensin (10 µM) zugesetzt. Auch der 15 min „pulse“ und der „chase“ entsprechend der angegebenen „chase“-Zeiten wurde in Gegenwart von BFA bzw. Monensin durchgeführt. Gesamtproteinlysate wurden mit STEN-Lysepuffer hergestellt (2.5.1.1) und die zu untersuchenden Proteine wurden mit den im Experiment angegebenen AK immunopräzipitiert (2.5.3.2). Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE (2.5.3.3) und Fluorografie (2.5.3.6).

2.5.6.2 Behandlung von HEK 293 mit Furininhibitor und Calcium-Ionophor

Furininhibitor (Stocklösung 200-1000fach):

10 mM Furin-Inhibitor „Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-chloromethylketon“ in MeOH

↓108

Calcium-Ionophor A23187 (Stocklösung 1000fach):

5 mM Calcium-Ionophor in DMSO

Calciumfreies Medium:

↓109

5 % dialysiertes FKS, 1 % Penicillin/Streptomycin in DMEM (mit Glucose und Na-Pyruvat, ohne L-Glutamin und CaCl2)

Medium für radioaktive Markierungen („pulse“-Medium):

1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

↓110

HEK 293 Zelllinien wurden vor der Durchführung des „pulse/chase“-Experiments für 10 h mit 10 µM und 50 µM Furin-Inhibitor bzw. 5 µM Calcium-Ionophor behandelt. Die Behandlung mit Calcium-Ionophor erfolgte in calciumfreiem Medium. Während der Präinkubation in methioninfreiem Medium, der 15 min „pulse“-Zeit und der „chase“-Zeit wurden die Inhibitoren zugesetzt. Für die Präinkubation in methioninfreiem Medium und für die „pulse“ Markierung konnte in der Calcium-Ionophor Behandlung kein calciumfreies Medium eingesetzt werden, für die „chase“-Inkubation wurde hingegen calciumfreies Medium eingesetzt. Die jeweiligen „chase“-Zeiten sind im Experiment angegeben. Gesamtproteinlysate wurden mit STEN-Lysepuffer hergestellt (2.5.1.1) und die zu untersuchenden Proteine wurden mit den im Experiment angegebenen AK immunopräzipitiert (2.5.3.2). Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE (2.5.3.3 ) und Fluorografie (2.5.3.6).

2.5.6.3 Biotinylierung von apikalen und basolateralen Oberflächenproteinen polarisierter MDCK Zellen.

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,75 mM KH2PO4 in dH2O, pH 7,4; autoklaviert

↓111

PBS/Ca/Mg-Puffer:

1mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2 in PBS-Puffer

Biotin-Lösung:

↓112

1 mg/ml sulfo-NHS-LC-biotin in PBS/Ca/Mg-Puffer

BSA-Lösung:

1 % (w/v) BSA in PBS/Ca/Mg-Puffer

↓113

Glycin/BSA-Lösung:

10 mM Glycin, 1 % (w/v) BSA in PBS/Ca/Mg-Puffer

Die entsprechenden MDCK Zelllinien wurden in Filterkammern mit 24 mm Durchmesser polarisiert, zur Biotinylierung wurde das Kulturmedium aspiriert und der Zellmonolayer apikal und basolateral 3-mal mit eiskaltem PBS/Ca/Mg-Puffer gewaschen. Der Zellmonolayer wurde anschließend entweder apikal mit 1,5 ml oder basolateral mit 2,6 ml frisch hergestellter Biotin-Lösung 1 h auf Eis inkubiert. Auf die jeweils nicht zu biotinylierende Seite wurde BSA-Lösung gegeben. Nach der Inkubation wurde der Zellmonolayer apikal und basolateral 3-mal mit eiskaltem PBS/Ca/Mg-Puffer gewaschen und dann, zur Absättigung vom ungebundenen Biotin, 30 min mit Glycin/BSA-Lösung inkubiert. Nach zwei weiteren Waschzyklen mit PBS/Ca/Mg-Puffer wurden die Zellen in 1 ml PBS/Ca/Mg-Puffer mechanisch vom Filter abgelöst, pelletiert (1000 , 5 min) und mit STEN-Lysepuffer lysiert (2.5.1.1). Zur Isolierung der biotinylierten Proteine wurde das Zelllysat mit 25 µl Streptavidin-Sepharose für 2 h bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Das Streptavidin-Sepharose Präzipitat wurde durch Zentrifugation (10000 , 5 min, 4°C) abgetrennt und wie unter 2.5.3.2 beschrieben mit den Waschpuffern der Immunopräzipitation gewaschen. Die so erhaltenen Proteine wurden mittels SDS-PAGE (2.5.3.3) getrennt und im Western Blot mit den entsprechenden Antikörpern analysiert (2.5.3.5). Zur Kontrolle der Proteinexpression wurde ein Aliquot des biotinylierten Zelllysats direkt in der SDS-PAGE aufgetrennt.

2.5.6.4 Untersuchung der Endocytose und Transcytose in polarisierten MDCK Zellen

↓114

Apikale oder basolaterale Oberflächenproteine polarisierter MDCK Zellen wurden wie unter 2.5.6.3 beschrieben biotinyliert. Zum Nachweis der Sezernierung nach Reinternalisierung und Recycling zur apikalen oder basolateralen Oberfläche wurde der Zellmonolayer in den Filterkammern nach der Biotinylierung mit vorgewärmtem Medium bei 37°C im CO2-Inkubator inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 1 h wurden die konditionierten apikalen und basolateralen Medien getrennt gesammelt und mit Hilfe von Streptavidin-Sepharose Präzipitation (2.5.6.3), SDS-PAGE (2.5.3.3) und Western Blot (2.5.3.5) auf sezerniertes, biotinyliertes l-βAPP untersucht.

2.6 Immunocytochemische Methoden

2.6.1  Immunofluoreszenz von transfizierten, auf Deckgläschen gewachsenen HEK 293 Zellen

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,75 mM KH2PO4 in dH2O, pH 7,4; autoklaviert

↓115

Fixierlösung:

4 % Paraformaldehyd in PBS

NH 4 Cl-Lösung:

↓116

50 mM NH4Cl in PBS, mit/ohne 0,2 % Triton X-100

Blocklösung:

5 % (w/v) BSA in PBS

↓117

AK-Verdünnungslösung:

1 % (w/v) BSA in PBS

Eindeckellösung:

↓118

15 % (w/v) Mowiol, 50 mg/ml DABCO in PBS

Die entsprechenden HEK 293 Zellen wurden in einer Verdünnung von 1:4 auf Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläschen (2.4.1.3) ausgesät und nach 24-48 h fixiert. Zur Fixierung wurde das Medium abgenommen, der Zellrasen 2-mal mit PBS-Puffer gewaschen und mit Fixierlösung für 20 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde der Zellrasen 3-mal mit PBS-Puffer gewaschen und für 10 min mit NH4Cl-Lösung inkubiert. Zum Öffnen der Zellen wurde NH4Cl-Lösung mit 0,2 % Triton X-100 eingesetzt. Der Zellrasen wurde erneut 2-mal mit PBS-Puffer gewaschen und 1 h mit Blocklösung bei RT inkubiert. Die Deckgläschen wurden dann auf Parafilm in eine so genannte Feuchtkammer (s.u.) überführt und mit 100 µl der primären AK-Lösung in entsprechender Verdünnung (2.2.4.1) für 1-3 h bei RT inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation mit dem primären AK wurden die Deckgläschen 5-mal mit PBS-Puffer gewaschen und 1 h bei RT mit der sekundären AK-Lösung inkubiert (2.2.4.1). Der sekundäre AK ist gegen die IgG-Spezies des primären AK gerichtet und mit einem Fluorochrom konjugiert. Vor dem Eindeckeln wurden die Deckgläschen erneut 3-mal mit PBS-Puffer und 1-mal mit dH2O gewaschen, um dann schließlich mit dem Zellrasen nach unten, mit einem Tropfen Eindeckellösung, auf einen Objektträger montiert zu werden.

Bei der Feuchtkammer handelt es sich um eine Petrischale mit 15 cm Durchmesser, die mit Aluminiumfolie abgedunkelt und mit Filterpapier ausgelegt wurde. Vor der Benutzung wird das Filterpapier mit dH2O befeuchtet und ein ausreichendes Areal für die Inkubation der Deckgläschen mit Parafilm abgedeckt.

↓119

Die Fluoreszenzpräparate wurden nach dem Aushärten im Leica DMRB Fluoreszenzmikroskop mit einem 100/1.3 Immersionöl-Objektiv analysiert. Aufnahmen wurden mit einer digitalen Kamera unter Benutzung der MetaView Imaging Software gemacht.

2.6.2 Oberflächenimmunofluoreszenz von transfizierten, in Filter- kammern polarisierten MDCK Zellen

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,75 mM KH2PO4 in dH2O, pH 7,4; autoklaviert

↓120

PBS/Ca/Mg-Puffer:

1mM CaCl2, 0,5 mM MgCl2 in PBS-Puffer

BSA-Lösung:

↓121

0,2 % (w/v) BSA in PBS/Ca/Mg-Puffer

Fixierlösung:

4 % Paraformaldehyd in PBS/Ca/Mg-Puffer

↓122

NH 4 Cl-Lösung:

50 mM NH4Cl in PBS/Ca/Mg-Puffer

Eindeckellösung:

↓123

15 % (w/v) Mowiol, 50 mg/ml DABCO in PBS

Die entsprechenden MDCK Zelllinien wurden in Filterkammern mit 12 mm Durchmesser polarisiert. Zur Oberflächenmarkierung wurde der Zellmonolayer 2-mal mit kaltem PBS/Ca/Mg-Puffer gewaschen und apikal oder basolateral bei 4°C, 30 min mit dem gewünschten AK inkubiert. Der zu benutzende AK wurde entsprechend den Angaben in 2.2.4.1 verdünnt. Zur basolateralen Markierung wurden je Filter 50 µl AK-Lösung auf den Parafilm in der Feuchtkammer pipettiert und der Filter auf den AK-Tropfen gesetzt, apikal wurden 150 µl BSA-Lösung auf den Zellmonolayer pipettiert. Zur apikalen Markierung wurde der Filter auf BSA-Lösung gesetzt und apikal wurde die AK-Lösung auf die Zellen pipettiert. Nach der Inkubation mit den primären AK wurden die Filter zurück in die Kulturschale gesetzt, extensiv mit PBS/Ca/Mg-Puffer gewaschen und 30 min bei RT mit Fixierlösung behandelt (apikal 0,25 ml, basolateral 0,75 ml). Anschließend wurden die Filter 2-mal mit PBS/Ca/Mg-Puffer gewaschen, 10 min in NH4Cl-Lösung inkubiert, erneut 2-mal mit PBS/Ca/Mg-Puffer gewaschen, und 1 h mit BSA-Lösung blockiert. Die Inkubation mit dem sekundären AK erfolgte wie oben beschrieben (2.6.1) in der Feuchtkammer für 45 min bei 37°C. Zum anschließenden Waschen wurden die Filter zurück in die Kulturschale gesetzt und 3-mal mit PBS/Ca/Mg-Puffer gewaschen, danach wurden die Filter mit einem Skalpell aus den Filterkammern herausgeschnitten, kurz in dH2O gespült, auf Papier getrocknet und mit dem Zellrasen nach oben auf einen Objektträger gebracht. Zum Eindeckeln wurden 2 Tropfen Eindeckellösung auf den Zellmonolayer gegeben, der mit einem Deckgläschen (18 x 18 mm) abgedeckt wurde.

Aufnahmen wurden mit dem Leica TCS SP Konfokal Laser Mikroskop unter Benutzung eines Plan-Apochromat 100/1.4 Immersionöl-Objektivs gemacht. Für das Fluorochrom Alexa 488 wurden ein Argon Laser mit einer Excitationswellenlänge von 488 nm und ein Emissionsfilter von 490-530 nm eingesetzt. Aufnahmen mit einer Auflösung von 512 x 512 Pixel wurden mit dem Bildberarbeitungsprogramm Photoshop Version 5.5 weiter prozessiert.

2.7 BACE in vitro Assay

2.7.1 Enzympräparationen

2.7.1.1  Aufreinigung von BACE-L(His)6 über Nickel-Agarose

↓124

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4 und 1,75 mM KH2PO4 in dH2O, pH 7,4; autoklaviert

Waschpuffer:

↓125

20 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 6,0 in dH2O

Elutionspuffer:

250 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM Na2HPO4/NaH2PO4 pH 6,0 in dH2O

↓126

HEK 293 Zellen, die stabil BACE-L(His)6 exprimieren, wurden in Zellkulturschalen mit 10 cm Durchmesser kultiviert (2.4.1). Bei einer Konfluenz von 60-80% wurde der Zellrasen mit PBS-Puffer gewaschen und mit 4 ml Optimem/Glutamax-1 für 16-24 h bei 37°C im CO2-Inkubator inkubiert.

Nach der Inkubationszeit wurde das konditionierte Medium abgenommen, Zellbruchteile wurden abzentrifugiert (5000 , 20 min, 4°C) und der Überstand mit Ni-Agarose bei 4°C für 1-2 h im Überkopf-Schüttler inkubiert. Je 10 ml konditionierten Mediums wurden 100 µl Ni-Agarose eingesetzt. Am Ende der Inkubationszeit wurde die Ni-Agarose abzentrifugiert (2500 , 10 min, 4°C) und im „batch“-Verfahren 3-mal gewaschen. BACE-L wurde anschließend eluiert. Dazu wurden 100 µl Elutionspuffer je 10 ml konditionierten Mediums für 15 min bei RT unter Schütteln mit dem Ni-Agarose Pellet inkubiert. Nach Zentrifugation (10000 , 5 min, 4°C) wurde der BACE-L enthaltende Überstand abgenommen und auf Eis gelagert.

2.7.1.2 Dialyse von konditioniertem Medium

Na-Acetat-Puffer:

↓127

20 mM Na-Acetat pH 4,5

Konditioniertes Medium von HEK 293 Zellen, die stabil BACE-L(His)6 exprimieren wurde, wie unter 2.7.1.1 beschrieben, gesammelt. Zellbruchteile wurden abzentrifugiert und der Überstand in einem Dialyseschlauch, mit einer Durchlässigkeit < 10 kDa gegen ein 200faches Volumen Na-Acetat-Puffer für 16 h dialysiert.

2.7.1.3 Konzentration von konditioniertem Medium

Konditioniertes Medium von HEK 293 Zellen, die stabil BACE-L(His)6 exprimieren, wurde, wie unter 2.7.1.1 beschrieben, gesammelt. Zellbruchteile wurden abzentrifugiert und der Überstand in einem Centricon-Konzentrator, mit einer Durchlässigkeit < 10 kDa, ca. 4fach konzentriert.

2.7.1.4  Membranpräparation

↓128

MES-Puffer:

1 %Triton X-100, 20 mM MES pH 6,0; incl. Protease-Inhibitor Mix

Membranen wurden wie unter 2.5.1.2 beschrieben hergestellt, das Membranpellet, wurde mit MES-Puffer extrahiert. 2 µl des Membranextrakts wurden für einen Assayansatz eingesetzt.

2.7.2 BACE-L -Substate

↓129

Es wurde bereits gezeigt, dass BACE in der Lage ist Peptidsubstrate zu schneiden (Sinha et al., 1999;Vassar et al., 1999). Da die Affinität von BACE zu βAPPsw größer istals zu βAPPwt (Citron et al., 1995;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999) wurde als Substrat ein Peptid mit der βAPPsw Sequenz gewählt, das die AS von P5-P4` enthält. Das Substrat wurde mit einer fluoreszierenden Cy3- und einer quenchenden Cy5Q-Gruppe konjugiert. Die quenchende Gruppe hat ein Absorptionsspektrum, das überlappt mit dem Emissionsmaximum der fluoreszierenden Gruppe. Liegen die beiden Gruppen nahe beieinander (< 10 Å), z.B. in einem Molekül oder an den beiden Enden eines Substratpeptids, so wird die Fluoreszenz gequenched. Durch Hydrolyse des Peptides wird die fluoreszierende Gruppe von der quenchenden getrennt und die Fluoreszenz wird messbar.

Abbildung 14: Schematische Darstellung der Entstehung des Fluoreszenzsignals durch Protease Aktivität

Abbildung teilweise entnommen aus dem Amersham Biosciences Poster „Homogeneous Imaging Assay for Measuring Aspartic Proteinase Activity“

Das CyDye Donor-Akzeptor-System hat sich bei Enzym Aktivität-Aassays und high-throughput Assays bewährt, die Fluorochrome sind bei pH-Werten von 3-10 stabil, wasserlöslich und DMSO tolerant (Osborn, 2002).

↓130

Tabelle 5: Eigenschaften der eingesetzten Fluorochrome

Fluorochrom

Absorption [nm]

Emission [nm]

Extinktionskoeffizient [Mcm

MW

Cy3 (Akzeptor)

550

570

150000

765,9

Cy5Q (Donor)

644

---

---

907

Die folgenden Peptide mit gleicher βAPPsw AS Sequenz aber unterschiedlicher Kettenlänge wurden von der Fa. Amersham generiert. Ferner wurde ein nicht durch BACE schneidbares Peptid (Citron et al., 1995;Vassar et al., 1999) mit einem AS Austausch an Position P1 von Leu zu Val als Kontrollpeptid, für die Spezifität der Reaktion generiert.

Tabelle 6: CyDye-Peptid-Substrate für den BACE Assay

Name

Peptidsequenz

MW

Reinheit

Stocklösung in DMSO

Cy3

Cy3--K(Cy5Q)-NH2

2556

93,9 %

1mg/ml 367,4 µM

Cy3 R

Cy3-R-K(Cy5Q)-R-OH

2911

99,7 %

1mg/ml 342,5 µM

Cy3 RR

Cy3--R-K(Cy5Q)-R-R-OH

3025

99,1 %

1mg/ml 327,6 µM

Cy3Kontr.

Cy3--K(Cy5Q)-NH2

2556

99,5 %

1mg/ml 389,3 µM

Die βAPP-Sequenz ist blau, die βAPPsw-Sequenz grün und der AS-Austausch zum nicht schneidbaren Kontrollpeptid rot dargestellt.

↓131

Abbildung 15: Schema der BACE-CyDye-Substrate

Abbildung teilweise entnommen aus dem Amersham Biosciences Poster „Improving MMP Protease Assay using a CyDye Peptide Substrate”.

2.7.3 Durchführung des BACE-Assay

Der Assay wurde in schwarzen 96-well Mikrotiterplatten angesetzt, und im Fluorometer wurde mit einer Exitation von 530 nm, die Emission bei 570 nm gemessen.

Reaktionsansatz (je „well“):

↓132

Enzym: 2,5-10 µl

Substrat: 100-400 nM

Puffer: 20 mM Na-Acetat, pH 4,5

↓133

Messbedingungen:

Methode: Fluorometrie

Typ: Kinetik

↓134

Integrationszeit: 20 ms

Messintervall: 30 s (bis 60 min) dann 1 min (bis 120 min)

Messzeit: 30 min, 60 min, 120 min

↓135

Filtersatz: Exitation 530 nm, Emission: 570 nm

Die genauen Enzym- und Substratkonzentrationen wurden bei den jeweiligen Experimenten im Ergebnisteil angegeben.

Alle Messreihen wurden im Triplikat angesetzt, in den Auswertungen wurden jeweils die Mittelwerte angegeben. Wahlweise wurden alle Messpunkte (30 s bzw. 60 s Intervall) ohne Standardabweichung oder jeder fünfte Messpunkt (2,5 min bzw. 5 min Intervall) mit Standardabweichung dargestellt.

2.7.3.1  Bestimmung der IC50-Werte von BACE-Inhibitoren

↓136

Eine Größe für die Messung der inhibitorischen Wirkung eines Stoffes ist der so genannte IC50-Wert. Dieser Wert gibt die Hemmstoffkonzentration an, bei der die ursprüngliche Enzymaktivität auf 50 % reduziert ist. Für die folgenden Peptidinhibitoren wurden im Assay die IC50-Werte ermittelt.

Tabelle 7: Peptidinhibitoren für BACE

Name

Peptidsequenz

MW

Reinheit

Stocklösung in DMSO

GL189

H-EVNstatinVAEF-NH2 x TFA

1077,1

83 %

50 mM

GL190

H-EEISEVNstatinVAEF-NH2 x TFA

1535,6

85 %

50 mM

Als Kontrolle für die Spezifität der Inhibitoren wurde folgender Proteaseinhibitor-Mix (PI-Mix) eingesetzt, angegeben ist die Endkonzentration im Assay:

↓137

Aprotinin

0,5 µM

Bestatin

100 µM

E 64

5 µM

EDTA

500 µM

Leupeptin

5 µM

Pepstatin A

5 µM

Phospoamidon

100 µM

PMSF

1 mM


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04.07.2006