4 Diskussion

4.1  Charakterisierung von BACE im Zellkultursystem

↓197

In dieser Arbeit werden die Maturierung und der intrazelluläre Transport der Aspatyl-Protease BACE untersucht. Post-translationale Modifikationen werden in Hinblick auf die Enzymaktivität und auf die subzelluläre Lokalisierung analysiert. Ferner wird der Transport von BACE im Vergleich zum Transport von βAPP in polarisierten Zellen untersucht (1.6). Es wird geklärt inwieweit die Amyloid-Entstehung durch den Transport von βAPP und der prozessierenden Sekretase BACE beeinflusst werden kann.

4.1.1 Expression von BACE in HEK 293 und MDCK Zellen

Zur Charakterisierung von BACE wurden HEK 293 und MDCK Zellen eingesetzt (3.1.1). HEK 293 Zellen stellen bei der Untersuchung der βAPP-Prozessierung ein weit verbreitetes Modellsystem dar. Es konnte bereits 1992 von Haass und Kollegen gezeigt werden, dass in HEK 293 Zellen, wie auch in anderen eukaryotischen Zellen, neben der α-Prozessierung von βAPP auch β-Prozessierung stattfindet und das Aβ-Peptid aus dem Vorläuferprotein freigesetzt werden kann (Haass et al., 1992). Damit wurde der indirekte Nachweis erbracht, dass neben der α-Sekretase auch β-Sekretase und γ-Sekretase endogen in HEK 293 Zellen vorhanden sind. Später konnten die Komponenten des γ-Sekretase-Komplex (Capell et al., 1998;Shirotani et al., 2004;Steiner et al., 2002;Yu et al., 1998;Yu et al., 2000) und die α-Sekretase ADAM10 (Lammich et al., 1999) in HEK 293 Zellen nachgewiesen werden. BACE wurde unter anderem in HEK 293 Zellen kloniert (Vassar et al., 1999), und erste Untersuchungen an transfiziertem BACE wurden ebenfalls in HEK 293 Zellen durchgeführt (Lin et al., 2000;Sinha et al., 1999;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999).

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Die endogene BACE-Expression in peripheren Zellen, so auch in HEK 293 Zellen, ist niedrig. Durch eine untranslatierte 5’-RNA-Region wird die Expression von BACE reguliert (Christensen et al., 2004;Ge et al., 2004;Lammich et al., 2004;Sambamurti et al., 2004). In Northern Blots konnte eine hohe mRNA-Expression in verschiedenen Hirnregionen, wie Hippocampus, Cortex, Cerebellum sowie in Pankreas und eine niedrige Expression im peripheren Gewebe nachweisen (Lin et al., 2000;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999). Entsprechend konnte eine hohe BACE-Aktivität in neuronalen Kulturen und eine niedrige Aktivität in anderen Zelllinien gezeigt werden (Busciglio et al., 1993;Haass et al., 1992;Sinha et al., 1999;Sinha und Lieberburg, 1999).

In dieser Arbeit konnte im Western Blot mit keinem der drei verwendeten AK endogenes BACE nachgewiesen werden (Abbildung 17). Um BACE und den Einfluss von BACE auf die βAPP-Prozessierung untersuchen zu können, wurde die Protease BACE und das Substrat βAPP695 exogen exprimiert. Alle Untersuchungen wurden an stabil transfizierten Zelllinien durchgeführt und um klonale Effekte ausschließen zu können wurden alle Ergebnisse, an verschiedenen Einzelzellklonen verifiziert. Morphologische Veränderungen der Zellen und verändertes Zellwachstum wurden nicht beobachtet.

4.1.2 Maturierung und Stabilität von BACE

Aufgrund der Aminosäuresequenz wurde für BACE eine Membranverankerung postuliert, und erste Arbeiten konnten zeigen, dass BACE membrangebunden (Vassar et al., 1999) und BACE-Aktivität membranassoziiert ist (Sinha et al., 1999). Entsprechend wurde in dieser Arbeit transfiziertes BACE in Gesamtzelllysaten und in Membranproteinlysaten nachgewiesen (Abbildung 17 / Abbildung 18). BACE migriert im SDS-Gel als Doppelbande bei einem Molekulargewicht von ca. 65 und 70 kDa, wobei die kleinere Form präferentiell von dem gegen das Propeptid gerichteten Antikörper erkannt wird (Abbildung 18). Bisherige Arbeiten hatten BACE als 70 kDa Protein beschrieben und vermutet, dass die Differenz des kalkulierten Molekulargewichts von 51 kDa zu dem im SDS-Gel beobachteten Migrationsverhalten bei 70 kDa durch N-Glycosylierung hervorgerufen wird (Lin et al., 2000;Sinha et al., 1999;Vassar et al., 1999).

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Der Antikörper gegen den C-Terminus von BACE erkennt zusätzlich kleinere, BACE spezifische Fragmente, mit einer prominenten Bande bei ca. 28 kDa (Abbildung 17). Diese Bande wurde auch in der Arbeit von Vassar und Kollegen beschrieben (Vassar et al., 1999). Es könnte sich um Abbauprodukte handeln, die Überexpression könnte zu einer Akkumulation von Degradationsprodukten führen. Eine andere Möglichkeit für die Entstehung der C-terminalen Fragmente wäre die beschriebene Ektodomänen-Abspaltung von BACE an der Zelloberfläche (Benjannet et al., 2001;Hussain et al., 2003). Da nur sehr geringe Mengen der BACE-Ektodomäne sezerniert werden (Benjannet et al., 2001;Hussain et al., 2003), und ein Zusammenhang der Sezernierung und der Entstehung der C-terminalen Fragmente nicht gezeigt werden konnte, ist es unwahrscheinlich, dass die C-terminalen Fragmente aus der Ektodomänen-Abspaltung resultieren. Endogen konnte bisher keine Sezernierung von BACE gezeigt werden.

Die in dieser Arbeit benutzten Antikörper, gerichtet gegen das Propeptid, die Ektodomäne und die cytoplasmatische Domäne, erkennen alle die 65 kDa und die 70 kDa BACE-Form, wenn auch mit sehr unterschiedlicher Affinität (Abbildung 18). Dies ist ein Beleg dafür, dass die kleinere 65 kDa BACE-Form nicht durch Proteolyse entsteht. Damit und aufgrund der vier N-Glycosylierungsmotive in BACE ist es wahrscheinlich, dass die Molekulargewichtsdifferenz von 5 kDa auf der Umwandlung mannosereicher Zucker in Zucker des komplexen Typs beruht, was auch in der vorliegenden Arbeit erstmalig gezeigt werden konnte (4.1.3) (Capell et al., 2000).

Zunächst wurde mit Hilfe von „pulse/chase“-Experimenten belegt, dass die 65 kDa BACE-Form ein Vorläufer der 70 kDa Form ist. Die 65 kDa Form nimmt mit der „chase“-Zeit ab und die 70 kDa Form zu. Nach 60 min „chase“-Zeit ist die 70 kDa Form erstmals zu detektieren und bei 120 min migriert der überwiegende Teil von BACE bei 70 kDa. Diese Maturierung von BACE ist im Prinzip unabhängig von der cytoplasmatischen Domäne und der Membranverankerung von BACE (Abbildung 20). Die lösliche Form von BACE (BACE-L) maturiert effizient und nur matures BACE-L wird sezerniert. Nach 60 min „chase“-Zeit wurden schon fast 50 % von BACE-L sezerniert. Die Deletion der cytoplasmatischen Domäne führt zu einer deutlich verlangsamten und ineffizienteren Maturierung im Vergleich zu BACE-wt, aber ebenso zu einem verlangsamten Abbau (Abbildung 20 / Abbildung 21). Dies war ein erster Hinweis darauf, dass der C-Terminus den Transport von membrangebundenem BACE reguliert und dadurch die Maturierung und Degradation beeinflusst werden kann. Dass die Deletion des BACE C-Terminus Missfaltung induziert und dadurch eine langsamere Maturierung verursacht wird, ist weitestgehend auszuschließen, da die lösliche Form BACE-L effizient maturiert.

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Spätere Arbeiten bestätigen die, in dieser Arbeit erstmalig gezeigte, Maturierung von BACE mit einer Molekulargewichtszunahme von ca. 5 kDa (Capell et al., 2000). Die Molekulargewichtsangaben variieren, immatures BACE wird mit 58 kDa (Huse et al., 2000), 60 kDa (Hussain et al., 1999) oder 66 kDa (Benjannet et al., 2001) und matures BACE mit 65 kDa (Hussain et al., 1999), 66 kDa (Huse et al., 2000) oder 72 kDa (Benjannet et al., 2001) angegeben. Die Differenzen sind möglicherweise auf unterschiedliche Gelsysteme oder Molekulargewichtsmarker zurückzuführen, ferner weisen verschiedene Zelllinien unterschiedliche Glycosylierungsmuster auf (Albach et al., 2001;Ohl et al., 2003).

Die relativ langsame Maturierung von BACE, im „pulse/chase- Experiment liegt BACE erst nach 120 min „chase“ überwiegend als mature Form vor, wurde bestätigt (Benjannet et al., 2001;Huse et al., 2000). Allerdings weist BACE mit einer Halbwertzeit von 16 h (Huse et al., 2000) eine deutlich größere Stabilität auf, als in dieser Arbeit gezeigt werden konnte. Matures BACE-wt ist nach 3,5 h zur Hälfte degradiert (Abbildung 21). Die Ursache für die erheblichen Differenzen in der Stabilität von BACE könnte in der deutlich unterschiedlichen experimentellen Durchführung begründet liegen. Huse und Kollegen transfizierten BACE-wt, konjugiert mit einem Hämagglution-Sequenzabschnitt (HA-tag), transient und markierten BACE radioaktiv während einer 30-minütigen „pulse“-Zeit (Huse et al., 2000). In der vorliegenden Arbeit wurden myc-His-konjugierte BACE-Konstrukte eingesetzt, Zelllinien mit stabiler Expression generiert, und die radioaktive Markierung erfolgte in einem 10-minütigen „pulse“. Die unterschiedlichen BACE-Konjugate könnten die Degradation beeinflussen, ebenso könnte die hohe Expression aufgrund der transienten Transfektion die Abbaumaschinerie der Zelle beeinträchtigen bzw. absättigen, wodurch es zu einer längeren Halbwertzeit von BACE kommen würde. In der langen „pulse“-Zeit von 30 min wird eine größere Population markiert als im 10-minütigen „pulse“, die Abbauzeit müsste entsprechend länger sein.

Die Vermutung, dass der C-Terminus von BACE den Transport von BACE regulieren könnte (Capell et al., 2000), wurde durch weitere Arbeiten bestätigt (Huse et al., 2000;Pastorino et al., 2002;Walter et al., 2001). Es konnte gezeigt werden, dass BACE nach dem Transport zur Plasmamembran reinternalisiert wird und ein Di-Leucin-Motiv in der C-terminalen Domäne von BACE den Transport zu endosomalen Kompartimenten reguliert (Huse et al., 2000;Pastorino et al., 2002;Walter et al., 2001). Die Phosphorylierung am dem Di-Leucin-Motiv benachbarten Serin an AS-Position 498 reguliert den Transport von frühen Endosomen über späte Endosomen zurück zum TGN (Walter et al., 2001).

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Die Deletion des Di-Leucin-Motivs und damit auch die Deletion des gesamten BACE C-Terminus beeinträchtigt die Reinternalisierung (Pastorino et al., 2002). BACE akkumuliert an der Plasmamembran und kann nicht mehr dem lysosomalen Abbau zugeführt werden, dadurch kommt es vermutlich zu der in dieser Arbeit beobachteten erhöhten Stabilität von BACE-ΔC. Für Di-Leucin-Motive konnte generell gezeigt werden, dass sie mit der VHS-Domäne von Clathrin bindenden Adaptorproteinen interagieren, die für den endosomalen Transport und den Edosomen/TGN-Transport eine wichtige Rolle spielen (Maxfield und McGraw, 2004). Für BACE konnte eine Interaktion mit den Adaptorproteinen GGA1 (Golgi-localizing, γ-adaptin ear homology domain, ARF-interacting) (He et al., 2002;Shiba et al., 2004) und GGA2 (He et al., 2002) gezeigt werden. Die Phosphorylierung des Ser498 verstärkt die Interaktion mit GGA1 (Shiba et al., 2004;von Arnim et al., 2004). Eine Regulation des Di-Leucin-Motivs durch die Phosphorylierung eines benachbarten Serins konnte ebenfalls für andere Proteine gezeigt werden (Bonifacino, 2004).

Ferner wurde gezeigt, dass der BACE C-Terminus eine Konsensussequenz für Palmitoylierung enthält und die Palmitoylierung von BACE förderlich für den Transport von BACE aus dem ER ist (Benjannet et al., 2001). Die Deletion des BACE C-Terminus würde damit den BACE Transport aus dem ER inhibieren und damit die in dieser Arbeit beobachtete verlangsamte Maturierung von BACE-ΔC erklären.

4.1.3 Die Glycosylierung von BACE

Die Vermutung, dass die Differenz des berechneten und des tatsächlichen Molekulargewichts von BACE auf Glycosylierung zurückzuführen ist (Hussain et al., 1999;Sinha et al., 1999;Vassar et al., 1999) konnte in dieser Arbeit erstmalig experimentell bestätigt werden (Capell et al., 2000). Deglycosylierung von BACE mit N-Glycosidase F zeigte, dass die mature und die immature Form von BACE N-glycosyliert sind. Beide Formen migrieren nach N-Glycosidase F Behandlung im SDS-Gel bei einem Molekulargewicht von ca. 50 kDa (Abbildung 22), dies ist auch ein Hinweis darauf, dass das unterschiedliche Migrationsverhalten der immaturen und der maturen Form auf differentiellen Zuckeraufbau zurückzuführen ist. Wird die N-Glycosylierung durch Behandlung mit dem Antibiotikum Tunicamycin unterbunden (3.2.2), migriert BACE wie nach der Deglycosylierung ebenfalls bei einem Molekulargewicht von ca. 50 kDa (Abbildung 23). Eine Behandlung mit der Endoglycosidase H zeigte, dass die mature Form von BACE Endo H Resistenz erreicht und damit komplex glycosyliert sein muss (Abbildung 24). Endo H spaltet ausschließlich mannosereiche und keine komplexen N-glycosylierten Zuckerketten. In der Zelle findet der Umbau von mannosereichen in komplexe Zucker im späten Golgi-Apparat statt (Helenius und Aebi, 2001;Roth, 2002), dass heißt matures BACE hat auf dem sekretorischen Transportweg auf jeden Fall den späten Golgi-Apparat erreicht (Abbildung 59) (Capell et al., 2000).

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Andere Gruppen konnten diese Ergebnisse bestätigen (Benjannet et al., 2001;Charlwood et al., 2001;Creemers et al., 2001;Haniu et al., 2000;Huse et al., 2000;Pinnix et al., 2001). Darüber hinaus zeigen Huse und Kollegen durch sequenzielle Zuckerabspaltung, dass BACE an drei der vier möglichen N-Glycosylierungsstellen glycosyliert ist (Huse et al., 2000). Ferner konnten sie zeigen, dass aufgrund eines C-terminal konjugierten ER-Retentionssignals (-KKXX) im ER zurückgehaltenes BACE keine Endo H Resistenz erreicht (Huse et al., 2000). Kontrovers zu den Ergebnissen von Huse et al. zeigen Charlwood et al. eine N-Glycosylierung von BACE an allen vier möglichen Glycosylierungsstellen (Asn 153, Asn 172, Asn 223, Asn 354) (Charlwood et al., 2001). In eukaryotischen Zellen werden alle Zucker in den Komplex-Typ mit zwei bis drei Verzweigungsgraden modifiziert (Charlwood et al., 2001).

Die Glycosylierung von BACE beeinflusst die proteolytische BACE-Aktivität. Mutation der N-Glycosylierungsstellen oder Expression von BACE in einem nicht eukaryotischen Zellsystem, in dem keine komplexe Glycosylierung stattfinden kann, reduzieren die BACE-Aktivität um 40-50 % (Charlwood et al., 2001). Ursache für die verminderte Enzymaktivität ist wahrscheinlich eine veränderte Faltung von BACE (Charlwood et al., 2001).

Die Ergebnisse der N-Glycosidase F und der Tunicamycin Behandlung dieser Arbeit lassen vermuten, dass keine O-Glycosylierung von BACE stattfindet. Die Deglycosylierung und die Verhinderung der N-Glycosylierung von BACE resultieren in einer BACE-Spezies von ca. 50 kDa. Da die Blockierung der N-Glycosylierung auch den Transport von BACE aus dem ER verhindert (4.1.4), wird auch eine mögliche O-Glycosylierung im Golgi-Apparat unterbunden. Die Abspaltung der N-glycosidisch gebundenen Zucker führt somit zum gleichen Molekulargewicht, wie die Verhinderung der N- und O-Glycosylierung. Damit ist anzunehmen, dass BACE nicht O-glycosyliert wird. Eine andere Arbeitsgruppe konnte ebenfalls keine O-Glycosylierung von BACE detektieren (Haniu et al., 2000).

4.1.4 Die Prozessierung des BACE-Propeptids

↓203

BACE enthält entsprechend von Sequenzanalysen eine Propeptiddomäne von AS 22-45 (Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999) und mit dem Sequenzmotiv -RLPR- wird die minimale Anforderung für die Konsensussequenz von Furin oder furinähnlichen Propeptidkonvertasen (PK) erfüllt (3.2.3). Furin und furinähnliche PK erkennen die Konsensussequenz -RXXR-, der Schnitt erfolgt C-terminal der Konsensussequenz, an Position P2 ist eine basische AS ausreichend.

Für BACE konnte bereits bei Beginn dieser Arbeit gezeigt werden, dass aufgereinigtes Enzym zu 90 % mit der AS an Position 46 beginnt und nur zu 10 % mit AS 22 (Sinha et al., 1999), d.h. bei dem überwiegenden Anteil von BACE erfolgte die Propeptidabtrennung, und bei einem geringen Anteil wurde nur das Signalpeptid abgetrennt. Proteinsequenzierungen bestätigten diese Angaben (Bennett et al., 2000).

In der vorliegenden Arbeit konnte mit Hilfe eines Antikörpers (AK), der spezifisch das Propeptid erkennt, erstmalig gezeigt werden, dass fast nur immatures BACE das Propeptid enthält (Abbildung 25). Matures, komplex glycosyliertes BACE wird kaum von dem gegen das Propeptid gerichteten AK erkannt. Die intrazelluläre Lokalisierung bestätigt, dass Propeptid enthaltendes BACE (Pro-BACE) nicht im Golgi-Apparat sondern überwiegend an der Zellkernhülle sowie im ER lokalisiert ist. Ein AK, der alle BACE-Spezies detektiert, zeigt hingegen deutliche BACE-Lokalisation im Golgi-Apparat. Bei dieser Spezies muss bereits das Propeptid abgespalten sein.

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Inhibition von zellulären Transportvorgängen durch BFA oder Monensin verhindert die Abspaltung des Propeptids (Abbildung 26). BFA blockiert den Vorwärtstransport vom ER zum Golgi-Apparat (Dinter und Berger, 1998;Klausner et al., 1992) und führt vermutlich zur Verschmelzung von ER- und Golgi-Kompartimenten (Alberts et al., 2002;Lippincott-Schwartz et al., 1991). Bei BFA-Behandlung kommt es zu einer geringen Reduktion des Molekulargewichts von BACE, die möglicherweise auf den Umbau der Zuckerketten im ER zurückzuführen ist (Helenius und Aebi, 2001;Roth, 2002). Bei fehlgefalteten Proteinen werden zunächst einzelne Mannosereste vom Oligosaccharid entfernt, bleibt das Protein falsch gefaltet kann es der ER-assoziierten Degradation (ERAD) zugeführt werden (Molinari et al., 2003;Tsai et al., 2002). So ist auch die im Molekulargewicht reduzierte BACE-Form nicht stabil und nach 120 min „chase“-Zeit vollständig abgebaut (Abbildung 26). Andere Gruppen konnten bestätigen, dass BFA die Maturierung und die Abspaltung des Propeptids von BACE verhindern (Benjannet et al., 2001;Bennett et al., 2000;Haniu et al., 2000), ebenso wurde eine Reduzierung im Molekulargewicht von Pro-BACE nach BFA-Behandlung beobachtet (Benjannet et al., 2001).

Monensin blockiert den Transport von cis- und medialen-Golgi-Zisternen zum trans-Golgi-Apparat und TGN (Dinter und Berger, 1998) und verhindert die Propeptidabspaltung und Maturierung von BACE. Eine Veränderung des Molekulargewichts wird nicht beobachtet und die immature Form von BACE, vermutlich lokalisiert in frühen Golgi-Kompartimenten, scheint stabil zu sein. Bennet et al. bestätigten die Inhibition der Propeptidabspaltung und der komplexen Glycosylierung von BACE bei Monensin Behandlung (Bennett et al., 2000). Wird durch Tunicamycin die N-Glycosylierung von BACE verhindert, kommt es ebenfalls nicht zur Abspaltung des Propeptids (Abbildung 23), vermutlich wird BACE aufgrund der falschen Faltung im ER zurückgehalten.

Die Untersuchungen dieser Arbeit zeigen, dass das Propeptid von BACE nicht im ER oder in frühen Golgi-Kompartimenten abgespalten wird, aber dass die Propeptidabspaltung vor der Maturierung stattfindet (3.2.3.1) (Capell et al., 2000). Da die Maturierung, d.h. der Aufbau von komplexen Zuckern im trans-Golgi-Apparat (Helenius und Aebi, 2001;Roth, 2002) lokalisiert ist, muss die Abspaltung des Propeptids unmittelbar vor dem trans-Golgi-Apparat oder im trans-Golgi-Apparat direkt vor dem Umbau der Zucker stattfinden (Abbildung 59).

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Abbildung 59: Modell des BACE Transports und Lokalisierung der posttranslationalen Modifikationen

Dargestellt ist die Prozessierung von BACE durch die Kompartimente des sekretorischen Transportwegs zur Zelloberfläche und die Reinternalisierug von BACE. Die parallel stattfindenden sekundären Modifikationen sind gekennzeichnet. Die Angriffspunkte der zur Untersuchung der BACE Prozessierung eingesetzten Transport-Inhibitoren bzw. Glycosylierungs-Inhibitoren sind angegeben.

Die BACE schneidende PK wurde in der vorliegenden Arbeit weiter charakterisiert. Wird das Arginin an Position P1 der PK-Konsensussequenz zu Alanin mutiert, kann die Sequenz nicht mehr von der PK erkannt werden (Krysan et al., 1999;Molloy et al., 1992). Wird in BACE die Mutation R45A eingefügt, kommt es nicht mehr zur Propeptidabspaltung und Maturierung von BACE (Abbildung 28). Dies ist ein deutlicher Hinweis darauf, dass es sich bei der PK von BACE um Furin oder eine furinähnliche PK handelt. Im Gegensatz zu den hier gezeigten Daten konnten andere Gruppen bei Einführung der Mutation R45A bzw. der Mutation R42A in BACE keinen veränderten Transport von BACE detektieren (Benjannet et al., 2001;Creemers et al., 2001). Es kam zur komplexen Glycosylierung von BACE R45A, allerdings enthielt komplex glycosyliertes BACE zum Teil noch das Propeptid (s. unten). Möglicherweise ist in der vorliegenden Arbeit die Expression von BACE R45A zu niedrig, um komplex glycosyliertes BACE detektieren zu können. Es war jedoch nicht möglich Einzelzellklone zu finden deren BACE-Expression der der anderen Konstrukte entsprach.

Ein weiterer Hinweis auf Furin oder eine furinähnliche PK als BACE-PK ist die Calciumabhängigkeit der Propeptidabspaltung. Die Aktivierung von Pro-Furin ist calciumabhängig (Vey et al., 1994). Wird Calcium-Ionophor A23187 parallel mit calciumfreien Medium eingesetzt, kommt es zur reduzierten intrazellulären Calciumkonzentration (3.4). Eine Calcium-Depletion blockiert die Propeptidabspaltung und die Maturierung von BACE (Abbildung 35). Die erhebliche Reduktion der intrazellulären Calciumkonzentration blockiert nicht den Transport vom ER zum Golgi-Apparat und die Maturierung der Zucker von Glycoproteinen sollte nicht beeinträchtigt sein(Klenk et al., 1984;Oda, 1992). Die Retention von Pro-BACE im ER oder frühen Golgi-Apparat ist damit nicht direkt auf die Calcium-Depletion zurückzuführen, sondern andere Retentionsmechanismen, z.B. Qualitätskontrollmechanismen scheinen den Transport und die Maturierung von Pro-BACE zu verhinden.

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Eine andere Arbeitsgruppe hat als Folge der intrazellulären Calcium-Depletion ebenfalls eine Inhibition der Propeptidabspaltung festgestellt, im Gegensatz zu den hier gezeigten Ergebnissen kommt es jedoch zur komplexen Glycosylierung von BACE, und der Transport wird nicht behindert (Bennett et al., 2000). Es gab jedoch erhebliche Unterschiede in der Versuchsdurchführung. In der in dieser Arbeit beschriebenen Calcium-Ionophor Behandlung wurden die Zellen für 10 h in calciumfreien Medium vorinkubiert und die Calcium-Ionophor-Behandlung wurde ebenfalls in calciumfreien Medium durchgeführt. Bennet et al. beschreiben nicht, dass sie calciumfreies Medium eingesetzt haben, und setzen Calcium-Ionophor ausschließlich währen der 5 h „chase“-Zeit ein (Bennett et al., 2000). Die Calciumreduktion war möglicherweise nicht vollständig.

Furin und furinähnliche PK können durch, der Konsensussequenz homologen Peptide, wie dem Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-chloromethylketon inhibiert werden (3.4) (Garten et al., 1994;Hallenberger et al., 1992;Jean et al., 1995). Der Einsatz des Inhibitors verhindert nicht die BACE-Maturierung, es entsteht jedoch matures BACE, dass noch das Propeptid enthält. Damit wurde gezeigt, dass die Abspaltung des Propeptids nicht Bedingung für eine komplexe Glycosylierung und für den Transport zum TGN ist. Der Peptidinhibitor ist nicht furinspezifisch, sondern inhibiert auch furinähnliche PK mit nanomolaren Ki-Werten. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit kann festgestellt werden, dass Furin oder furinähnliche PK das BACE Propeptid abspalten.

Auch die Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen können nicht eindeutig klären, ob es sich bei der BACE-PK um Furin oder eine furinähnliche PK handelt (Baek et al., 2002;Benjannet et al., 2001;Bennett et al., 2000;Creemers et al., 2001;Pinnix et al., 2001). Transiente Transfektion von cDNAs verschiedener PK Inhibitoren, wie z.B. α1-PDX (α1-Anti-trypsin Portland) ein relativ spezifischer Furin-Inhibitor (Jean et al., 1998), den Prosegmenten verschiedener PK (Pro-Furin, -PC7, -PC5, -SKL-1), die als Inhibitoren der jeweiligen PK fungieren und α2-M (α2-Macroglobulin) sowie der Furin inhibierenden Mutante (α2-M-F) gaben weitere Hinweise über die BACE-PK. Eine Inhibition der Propeptidabspaltung wurden bei Furin- und PC5-Inhibitoren (α1-PDX, Pro-Furin, Pro-PC5, α2-M-F) beobachtet nicht jedoch bei PC7 und SKL-1 Inhibitoren (Pro-PC7, Pro-SKL-1) (Benjannet et al., 2001;Bennett et al., 2000). Eine Inhibition der Propeptidabspaltung verhindert nicht die komplexe Glycosylierung von BACE (Benjannet et al., 2001;Bennett et al., 2000). Dieses Phänomen wurde auch in der vorliegenden Arbeit bei dem Einsatz des Peptidinhibitors beobachtet. Eine humane Kolon-Karzinom-Zelllinie (LoVo), die kein funktionelles Furin exprimiert zeigt keine Propeptidabspaltung von BACE, jedoch eine komplexe Glycosylierung von Pro-BACE (Bennett et al., 2000).

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Eine furindefiziente CHO (Chinese hamster ovary) Zelllinie zeigt ebenfalls eine stark reduzierte Abspaltung des BACE-Propeptids und eine komplexe Glycosylierung von Pro-BACE (Creemers et al., 2001;Pinnix et al., 2001). Durch Transfektion der Furin cDNA, aber auch durch Transfektion anderer PK cDNA (PACE4, PC4/6, PC7), kann die Propeptidabspaltung von BACE in der furindefizienten CHO Zelllinie wieder eingeleitet werden (Creemers et al., 2001;Pinnix et al., 2001). Ferner kann in der furindefizienten CHO Zelllinie durch Einsatz eines PK Peptidinhibitors eine weitere Reduktion der Propeptidabspaltung erreicht werden (s. oben) (Pinnix et al., 2001). Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass Furin nicht die einzige BACE-PK ist, sondern andere furinähnliche PK bei der Konvertierung von Pro-BACE zu BACE eine Rolle spielen.

Assays hingegen ergaben, dass Furin besonders effizient Pro-BACE spalten kann (Benjannet et al., 2001;Bennett et al., 2000).

Zusammenfassend kann aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit und den Daten anderer Gruppen festgestellt werden, dass BACE als Proenzym exprimiert wird. Die Abspaltung des Propeptids erfolgt nicht autokatalytisch (Benjannet et al., 2001;Bennett et al., 2000;Creemers et al., 2001). Furin und furinähnliche PK erkennen die BACE-Konsensussequenz -RLPR- und können das Propeptid von BACE schneiden (Benjannet et al., 2001;Bennett et al., 2000;Capell et al., 2000;Pinnix et al., 2001). In Vertebraten umfasst die PK-Familie der calciumabhängigen Serin-Proteasen sieben Mitglieder: Furin, PC1/PC3, PC2, PC4, PACE4, PC5/PC6 und PC7 (Thomas, 2002). Furin und PC7 sind wie BACE ubiquitär exprimiert und im sekretorischen sowie endocytotischen Transportweg lokalisiert und aktiv (Molloy et al., 1999;Seidah und Chretien, 1997). Das Expressionsprofil, Experimente mit Furin-Inhibitoren und in furindefizienten Zelllinien weisen auf Furin als Hauptkandidat der BACE-PK hin (Benjannet et al., 2001;Bennett et al., 2000;Creemers et al., 2001;Shi et al., 2001). Es gibt jedoch auch Arbeiten, die die Bedeutung furinähnlicher PK für die Konvertierung von Pro-BACE betonen (Ermolieff et al., 2000;Pinnix et al., 2001). Abschließend kann nicht eindeutig geklärt werden welche PK Pro-BACE prozessiert, möglicherweise sind auch verschiedene Furin und furinähnliche PK an der Propeptidabspaltung von BACE beteiligt.

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Eine typische Funktion der N-terminalen Prodomäne in Aspartylproteasen ist die Regulation der katalytischen Enzymaktivität (Tang und Wong, 1987). Prodomänen haben oft zymogen-ähnliche Eigenschaften und inhibieren die Aktivität des Proenzyms. Die Prodomäne von BACE inhibiert jedoch nur geringfügig die Aktivität von BACE (Ermolieff et al., 2000;Shi et al., 2001). Pro-BACE und auch im ER zurückgehaltenes BACE ist enzymatisch aktiv (Benjannet et al., 2001;Creemers et al., 2001). Die Prodomäne von BACE spielt aber eine Rolle für die Faltung von BACE (Chou und Howe, 2002;Shi et al., 2001) und möglicherweise auch für den intrazellulären Transport (Benjannet et al., 2001;Creemers et al., 2001). Es bleibt zu untersuchen ob die Prodomäne von BACE zymogene Eigenschaften für andere Substrate als βAPP zeigt. Die Inhibition des Propeptidschnitts von BACE hat daher als therapeutisches Ziel für die Alzheimer Krankheit keine Relevanz.

4.1.5  Die βAPP-Prozessierung durch BACE und BACE-Varianten

BACE erfüllt nicht nur alle für eine β-Sekretase geforderten Kriterien (vgl. Einleitung), sondern scheint auch die einzige Aβ generierende Sekretase im Hirn zu sein, zeigen doch BACE defiziente Mäuse keine Aβ-Bildung (Cai et al., 2001;Luo et al., 2001;Roberds et al., 2001).

Aufgrund der in peripheren Zellen niedrigen endogenen BACE-Expression wird βAPP überwiegend durch die α-Sekretasen prozessiert(Haass et al., 1993).

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αSekretasen und BACE konkurrieren um das gleiche Substrat βAPP(Haass et al., 1993;Hung et al., 1993;Lin et al., 2000;Sinha und Lieberburg, 1999;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999). Eine Überexpression von BACE führt in βAPPsw oder βAPPwt exprimierenden Zelllinien zu einer erhöhten β-Sekretase und einer verminderten α-Sekretase Prozessierung von βAPP. Die Aβ-Sezernierung wird verdoppelt (Huse et al., 2000;Vassar et al., 1999) und es entstehen AβSpezies, die an den Positionen Asp1 und Glu11 der Aβ-Sequenz beginnen (Vassar et al., 1999).

In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass BACE-wt und die Varianten BACE-ΔC sowie BACE-L enzymatisch aktiv sind. In HEK 293 Zellen stabil transfiziert mit BACE-wt, BACE-ΔC oder BACE-L ist die α-Sekretase Prozessierung von βAPPwt ist stark reduziert und die Prozessierung durch BACE entsprechend erhöht (Abbildung 31). Ein offensichtlicher Unterschied in der enzymatischen Aktivität der BACE-Varianten besteht nicht. Die C-terminale Domäne oder eine Membranverankerung von BACE ist für die Aktivität nicht notwendig. Eine genauere Betrachtung der entstehenden Aβ-Spezies zeigt, dass alle BACE-Varianten sowohl AβAsp1 als auch AβGlu11 generieren. Allerdings zeigt die BACE-L exprimierende Zelllinie am wenigsten der AβGlu11-Spezies und die BACE-ΔC exprimierende Zelllinie am meisten (Abbildung 30 / Abbildung 32). Da sowohl BACE-L als auch BACE-ΔC nicht endocytiert werden können, kann die Amyloid-Entstehung in Recycling-Kompartimenten keine Rolle für die unterschiedlichen Verhältnisse von AβGlu11 und AβAsp1 spielen. In „pulse/chase“-Experimenten war aufgefallen, dass BACE-L schneller und BACE-ΔC langsamer als BACE-wt maturiert (Abbildung 20). Es scheint ein Zusammenhang zwischen der Maturierungsgeschwindigkeit und der Entstehung der AβGlu11-Spezies zu bestehen: Je langsamer die Maturierung, desto mehr AβGlu11 entsteht. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass AβGlu11 in frühen und AβAsp1 in späten Kompartimenten des sekretorischen Transportweges entsteht.

Andere Arbeitsgruppen bestätigen, dass lösliche BACE-Varianten enzymatisch aktiv sind, schnell maturieren bzw. schnell in Plasmamembran nahe Kompartimente transportiert werden und überwiegend die AβAsp1-Spezies generieren (Benjannet et al., 2001;Creemers et al., 2001;Vassar et al., 1999). Ferner wurde festgestellt, dass AβGlu11 in Abhängigkeit von der BACE-Expression entsteht (Creemers et al., 2001;Liu et al., 2002;Vassar et al., 1999). Eine hohe BACE-wt Expression führt neben der AβGlu11-Bildung auch zur Akkumulation von BACE prozessierten βAPP-CTF (Benjannet et al., 2001). Bei einer Überexpression schneidet BACE verstärkt in frühen zellulären Kompartimenten wie dem ER (Benjannet et al., 2001;Creemers et al., 2001). Da in diesen Kompartimenten γ-Sekretase nicht aktiv ist (Annaert und De Strooper, 1999;Annaert et al., 1999;Cupers et al., 2001;Herreman et al., 2003), kommt es zur Akkumulation von βAPP-CTF (Benjannet et al., 2001). Zunächst entstehen βAPP-CTF durch den Asp1-Schnitt, diese Fragmente können an der Glu11-Position nachgeschnitten werden (Creemers et al., 2001;Fluhrer et al., 2002;Liu et al., 2002). Möglicherweise sind die mit Glu11 beginnenden βAPP-CTF der direkte Vorläufer für AβGlu11

↓210

Wird BACE aber durch ein ER-Retentionssignal (-KKXX) oder durch Transportinhibitoren (BFA, Monensin) im ER oder in frühen sekretorischen Kompartimenten zurückgehalten, kommt es überwiegend zum Asp1 Schnitt des βAPP (Fluhrer et al., 2002;Huse et al., 2002). Im ER wird AβGlu11 demnach nicht generiert. Eine BACE-Chimäre, bei der der C-Terminus von BACE durch den C-Terminus von Furin ersetzt wurde, wodurch überwiegend eine TGN Lokalisierung erreicht wurde (Huse et al., 2002), führt zu einer Erhöhung des Glu11 Schnitts von βAPP (Huse et al., 2002). Wurde hingegen das Reinternalisierungssignal von BACE deletiert, entstehen geringere Mengen von AβGlu11(Huse et al., 2002). Da die BACE-Furin-Chimäre zwischen Endosomen und TGN recycelt (Jones et al., 1995;Molloy et al., 1998), wäre es auch möglich, dass AβGlu11 nicht nur im TGN, sondern auch im endocytotischen Transportweg entstehen kann. Ein Einfluss des pH-Wertes oder der Glycosylierung von BACE auf die Entstehung von AβAsp1 und AβGlu11 konnte nicht festgestellt werden (Huse et al., 2002).

Die Ursache dafür, dass lösliche BACE-Varianten kaum AβGlu11 produzieren, bleibt unklar, da BACE-L schnell in späte Kompartimente transportiert wird und in diesen überwiegend der Glu11-Schnitt erfolgen soll (Fluhrer et al., 2002;Huse et al., 2002). Der Asp1-Schnitt kann wahrscheinlich im gesamten sekretorischen Transportweg stattfinden, wie die Prozessierung von βAPPsw im sekretorischen Transportweg zeigt (Citron et al., 1995;Haass et al., 1995;Haass et al., 1995;Steinhilb et al., 2002). Hingegen findet der Glu11-Schnitt erst in späteren Kompartimenten statt, wenn die Bedingungen für die BACE-Aktivität besser sind, weil ein niedriger pH-Wert als im ER vorliegt (Alberts et al., 2002;Machen et al., 2003) und die sekundären Modifikationen des Proteins, wie die Abspaltung der Prodomäne und die Glycosylierung abgeschlossen sind. Entsteht jedoch AβGlu11, liegen auch immer akkumulierte βAPP-CTF vor, d.h. in dem Kompartiment der BACE Prozessierung ist die γ-Sekretase in diesem Fall nicht aktiv. Bei der Überexpression von BACE-L kommt es nicht zur Akkumulation von βAPP-CTF. Möglicherweise ist die spezifische Aktivität von BACE-L geringer als die anderer BACE-Varianten, oder aber aufgrund seinen schnellen Transports zur Plasmamembran schneidet es sein Substrat in späteren Kompartimenten des sekretorischen Transportwegs, in denen auch die γ-Sekretase aktiv ist. Dadurch generieren BACE-L exprimierende Zellen mehr Aβ als Zellen, die andere BACE-Varianten exprimieren. Möglich wäre auch, dass BACE-L nicht in der Lage ist den Glu11-Schnitt zu katalysieren, da diese Schnittstelle näher an der Membran liegt und evtl. für die lösliche BACE-Form nicht zugänglich ist (Vassar et al., 1999).

Vermutlich hat die Asp1-Schnittstelle die größere Affinität zu BACE. In HEK 293 Zellen entsteht AβGlu11 erst nach exogener Expression von BACE. Ist jedoch aufgrund einer veränderten ASSequenz die Affinität dieser Schnittstelle zu BACE verschlechtert, wie z.B. in der Maus- bzw. Ratten-Sequenz (De Strooper et al., 1995) findet die βAPP-Prozessierung durch BACE überwiegend an der Glu11-Schnittstelle statt. Die Maus und Ratten Glu11-Schnittstelle entspricht den Anforderungen von BACE mit Phenylalanin, einer polaren AS mit sterisch großem Rest, an Position P1 und Glutamat, eine AS mit kleinen, negativ geladenen Seitenketten, an Position P1’ (Lin et al., 2000;Sauder et al., 2000). Folglich ist die AβGlu11-Spezies die dominante Amyloid-Form in neuronalen Primärkulturen der Ratte und der Maus (Cai et al., 2001;Gouras et al., 1998;Wang et al., 1996). In humanen neuronalen Zellen entstehen sowohl endogen als auch nach Überexpression von BACE die AβAsp1- und die AβGlu11-Spezies (Lee et al., 2003). Ferner konnte AβGlu11 in Amyloid-Ablagerungen im Gehirn nachgewiesen werden (Huse et al., 2002;Masters et al., 1985;Naslund et al., 1994;Wang et al., 1999). konnte eine stärkere Fibrillenbildung und eine größere Neurotoxizität für die N-terminal verkürzte Spezies festgestellt werden (Pike et al., 1995). Einige FAD-Mutationen in βAPP erhöhen im Zellkulturmodell ebenfalls die Bildung der AβGlu11-Spezies (Haass et al., 1994;Nilsberth et al., 2001).

4.1.6 Polarisierter Transport von BACE

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Zunächst konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass BACE auch in einer polarisierten Epithel-Zelllinie, der MDCK Zelllinie, durch Propeptid Abspaltung und dem Aufbau Endo H resistenter komplexer Zucker maturiert (Abbildung 36 / Abbildung 37) (Capell et al., 2002). Die Maturierung von BACE in MDCK Zellen unterscheidet sich damit nicht von der Maturierung in anderen Zellen (3.2) (Capell et al., 2000;Creemers et al., 2001;Haniu et al., 2000;Huse et al., 2000). Im Vergleich zu HEK 293 Zellen maturiert BACE in MDCK Zellen schneller, schon nach 30 min „chase“-Zeit liegt überwiegend und nach 60 min ausschließlich die mature Spezies vor (Abbildung 36). In HEK 293 Zellen überwiegt die mature Form erst nach 120 min (Abbildung 20). Ferner konnte im Assay gezeigt werden, dass stabil in MDCK Zellen exprimiertes BACE enzymatisch aktiv ist (Abbildung 38) (Capell et al., 2002). Damit waren die Grundvoraussetzungen für die Analyse des Transports von BACE in einer polarisierten Zelllinie gegeben. In der Immunofluoreszenz konnte BACE mit Hilfe eines konfokalen Laser-Mikroskops sowohl an der apikalen als auch an der basolateralen Plasmamembran nachgewiesen werden (Abbildung 39). Durch Oberflächenbiotinylierung wurde die Verteilung von BACE an der apikalen und basolateralen Plasmamembran quantifiziert (3.5.3.2). Es zeigte sich, dass BACE überwiegend apikal lokalisiert ist. In Klonen mit hoher BACE-Expression war 60-70 % des an der Oberfläche befindlichen BACE apikal lokalisiert, in Klonen mit niedriger Expression konnten über 80 % an der apikalen Plasmamembran nachgewiesen werden () Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.) (Capell et al., 2002). Dass niedrig exprimierende Klone eine akkuratere Sortierung zeigen als hoch exprimierende Klone, wird häufig beobachtet, da die Sortierungsmaschinerie durch die Überexpression abgesättigt werden kann. Darüber hinaus sind apikale Sortierungssignale selten stringent, so dass eine basolaterale Fehlsortierung von 20-30 % im üblichen Rahmen liegt.

Im Gegensatz zu basolateralen Transportsignalen, oft bestehend aus hydrophoben cytoplasmatischen Sequenzmotiven, sind Signale für die apikale Sortierung meistens N- oder O-Glycosylierungen und GPI-Anke (Rodriguez-Boulan und Gonzalez, 1999). GPI-verankerte Proteine sind oft „lipid raft“ assoziiert und „lipid rafts“ werden überwiegend apikal transportiert (Benting et al., 1999;Brown und London, 1998;Simons und Ikonen, 2000). Bei „lipid rafts“ handelt es sich um Mikrodomänen der Membran, in denen bestimmte Lipide, wie Phospholipide, Sphingolipide und Cholesterin, angereichert vorliegen. Ferner sind „lipid rafts“ durch eine Unlöslichkeit in Nicht-Ionischen-Detergenzien bei 4°C gekennzeichnet (Simons und Toomre, 2000). Selten sind luminale oder Membran assoziierte Sequenzmotive die Ursache für eine apikale Proteinsortierung (Benting et al., 1999;Mostov et al., 2003). Es ist wahrscheinlich, dass die N-Glycosylierung von BACE für die apikale Sortierung verantwortlich ist. BACE kann an vier Stellen N-glycosyliert werden. Auf Deletion der Glycosylierungsstellen wurde jedoch verzichtet, da eine Inhibition der Glycosylierung durch Tunicamycin den Transport von BACE blockiert (Abbildung 23). Eine Verhinderung der Glycosylierung kann die Gesamtstruktur der Ektodomäne derart verändern, dass der Transport und die Stabilität des Proteins erheblich beeinflusst werden (Helenius, 1994;Helenius und Aebi, 2001;Roth, 2002). In MDCK Zellen können apikal sortierte Proteine sowohl direkt als auch über Transcytose zur apikalen Plasmamembran transportiert werden. Bei der Transcytose erfolgt zunächst ein Transport zur basolateralen Membran, meist in eine laterale Membranregion unterhalb der „tight junctions“, dort werden die Proteine über Endocytose aufgenommen und zur apikalen Plasmamembran transportiert (Mostov et al., 2003;Polishchuk et al., 2004). Da für den apikalen Sortierungsmechanismus der Transcytose eine Proteinaufnahme von der lateralen Plasmamembran erfolgen muss, wurde untersucht, ob das Di-Leucin-Motiv im BACE C-Terminus eine Rolle bei dem apikalen Transport von BACE spielt (4.1). Eine BACE-Variante (BACE STOP494), bei der die letzten acht AS inklusive des Di-Leucin-Motivs deletiert sind, wird immer noch apikal transportiert (Abbildung 41). Damit ist gezeigt, dass das Di-Leucin-Motiv keine Rolle für den apikalen Transport von BACE spielt.

Andere Gruppen konnten eine Anreicherung von BACE in „lipid rafts“ nachweisen (Ehehalt et al., 2003;Marlow et al., 2003;Riddell et al., 2001), so könnte der apikale Transport von BACE seine Ursache auch in der „lipid raft“-Assoziation von BACE haben.

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Wichtig für die Beurteilung der Relevanz der in MDCK Zellen erzielten Ergebnisse für die Alzheimer Krankheit wäre eine Verifizierung in Neuronen. Die apikale Lokalisierung von BACE in MDCK Zellen würde einer axonalen Lokalisierung in Neuronen entsprechen (Dotti und Simons, 1990). Die Sortierungsmechanismen in MDCK Zellen und Neuronen sind ähnlich. Es wurden zunehmend aber auch Ausnahmen gefunden, bei denen eine apikale Sortierung in MDCK Zellen keiner axonalen Sortierung in Neuronen entsprach (Winckler und Mellman, 1999). Für BACE konnte in Übereinstimmung mit der apikalen Lokalisierung in MDCK Zellen eine axonale Lokalisierung in neuronalen Primärkulturen (Capell et al., 2002) und im Hirn (Sheng et al., 2003) gezeigt werden.

4.1.6.1  Auswirkungen des polarisierten Transports von BACE auf die βAPP-Prozessierung

Das Holoprotein βAPP wird in MDCK Zellen zu >80 % basolateral sortiert und die Prozessierungsprodukte Aβ-, p3-Peptid und l-βAPP werden basolateral sezerniert (De Strooper et al., 1995;Haass et al., 1994;Lo et al., 1994). Das basolaterale Sortierungssignal wurde in der cytoplasmatischen Domäne identifiziert (1.5.2) (Haass et al., 1995).

Zur Untersuchung des Einflusses von BACE auf die Prozessierung von βAPP wurde eine stabil BACE und βAPP exogen exprimierendeMDCK Zelllinie generiert. Die BACE-Überexpression führt zu einer Akkumulation von BACE geschnittenem βAPP-CTF und einer Reduktion der intrazellulären, maturen βAPP-Spezies, wohingegen die immature βAPP-Spezies nicht beeinflusst wird (Abbildung 42). Die Reduktion der maturen βAPP-Form ist vermutlich auf eine verstärkte Prozessierung durch BACE und damit verbunden auf eine erhöhte Sezernierung von l-βAPPβ zurückzuführen. Die Abnahme der maturen βAPP-Spezies wurde auch in anderen BACE transfizierten Zelllinien beobachtet (Creemers et al., 2001;Yan et al., 1999).

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Die Untersuchung der polarisierten Sezernierung von l-βAPP in BACE transfizierten MDCK Zellen zeigt, dass fast ausschließlich l-βAPPβ entsteht. α-Prozessierung von βAPP findet kaum noch statt (Abbildung 43A). Da kein epitopspezifischer AK für die Detektion von l-βAPPβ zur Verfügung stand, wurde die von BACE generierte l-βAPPβ-Spezies aus der Differenz der l-βAPPtotal-Spezies und der durch α-Sekretase generierten l-βAPPα-Spezies berechnet. Diese Berechnung kann Anhaltspunkte liefern, jedoch keine absoluten Werte, da zwei verschiedene AK mit unterschiedlichen Affinitäten zu ihren Antigenen eingesetzt wurden. So ist die Kalkulation für l-βAPPβ nur als Abschätzung zu verstehen. Trotzdem kann festgestellt werden, das l-βAPPβ gleichmäßig apikal und basolateral sezerniert wird (Abbildung 43B), obwohl das BACE-Substrat βAPP fast vollständig basolateral transportiert wird. Auch eine Deletion des βAPP Sortierungssignals (βAPPΔC) (1.5.2) und damit verbunden eine gleichmäßige apikale und basolaterale Oberflächenlokalisation von βAPPΔC ändert die Sezernierung von l-βAPPβ nicht (Abbildung 49). Das bedeutet, dass in BACE transfizierten Zellen die Sortierung von βAPP keine Rolle für die Prozessierung spielt. Aufgrund der Überexpression von BACE wird βAPP fast ausschließlich durch BACE prozessiert und wie bereits für andere Zelllinien beobachtet wurde (Benjannet et al., 2001;Creemers et al., 2001;Vassar et al., 1999), ist exogen exprimiertes BACE bereits in frühen Kompartimenten des sekretorischen Transportweges aktiv. Dadurch schneidet BACE sein Substrat βAPP bevor es zur Trennung des apikalen und basolateralen Transports kommt.

Aufgrund der hohen BACE-Expression wird ausschließlich die verkürzte AβGlu11-Spezies generiert (Abbildung 45, 4.1.5) und AβGlu11 wird weiterhin basolateral sezerniert. Für die basolaterale Sezernierung von AβGlu11 gibt es mehrere mögliche Erklärungen, so könnte die Aβ C-terminal generierende γ-Sekretase nur basolateral aktiv sein (4.1.6.2), oder aber das direkte Substrat für den γ-Sekretase-Schnitt wird basolateral sortiert. Die in Folge der BACE-Prozessierung von βAPP entstehenden βAPP-CTFβ enthalten noch das cytoplasmatische Sortierungssignal für den basolateralen Transport von βAPP (Haass et al., 1995). Es konnte βAPP-CTF an der basolateralen Plasmamembran nachgewiesen werden (Abbildung 47). Dieser Nachweis konnte nur in βAPP transfizierten und nicht in zusätzlich mit BACE transfizierten Zellen erbracht werden. In BACE transfizierten Zellen kommt es aufgrund der hohen BACE-Aktivität in frühen sekretorischen Kompartimenten zu einer βAPP-Prozessierung und zu einer Akkumulation von βAPP-CTFβ. Aufgrund der Akkumulation der βAPP-CTFβ wird vermutlich der Transport zur Oberfläche behindert, so konnte für βAPPsw und BACE exprimierende Zellen eine Akkumulation von βAPP-CTFβ und im Vergleich zu βAPPwt exprimierende Zellen eine niedrigere Sezernierung von Aβ nachgewiesen werden (Sinha et al., 1999;Sinha und Lieberburg, 1999;Vassar et al., 1999)

Da die Überexpression von BACE eine frühe Prozessierung von βAPP verursacht, wurde die Prozessierung von βAPP nochmals mit endogener BACE-Expression unter Berücksichtigung des apikalen BACE Transports analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass l-APPα fast ausschließlich basolateral sezerniert wird (Abbildung 43). Auch, wenn das basolaterale Sortierungssignal von βAPP deletiert ist (βAPPΔC) und das Volllängenprotein gleichmäßig apikal und basolateral sortiert wird (Haass et al., 1995), konnte l-βAPPα nur basolateral nachgewiesen werden (Abbildung 49). Eine basolaterale Sezernierung von l-βAPPα wurde bereits von anderen Arbeitgruppen gezeigt (De Strooper et al., 1995;Haass et al., 1994;Lo et al., 1994).Für βAPPΔC wurde seiner Zeit nur die Sezernierung der l-βAPPα-Spezies untersucht (Haass et al., 1995) und die weiterhin basolaterale Sezernierung ließ vermuten, dass sich in der Ektodomäne von βAPP ein weiteres basolaterales Sortierungssignal befindet (De Strooper et al., 1995). Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen jedoch daraufhin, dass auch die αSekretase Aktivität basolateral lokalisiert ist. Basolateral transportiertes βAPP-Holoprotein wird fast ausschließlich von der α-Sekretase prozessiert und die Prozessierungsprodukte lβAPPα und das p3-Peptid werden basolateral sezerniert. Apikal transportiertes βAPPΔC oder fehlsortiertes βAPP wird von BACE prozessiert und l-βAPPβ wird apikal sezerniert (Abbildung 43 / Abbildung 49). Zur Verdeutlichung wird nochmals die Prozessierung von βAPP und βAPPΔC vergleichend dargestellt (Abbildung 60).

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Abbildung 60: Sezernierung von l-βAPPα und l-βAPPtotal in βAPP und βAPPΔC transfizierten MDCK Zellen

Zusammenfassung der Ergebnisse aus Abbildung 43 und Abbildung 49. l-βAPPα wird basolateral sezerniert. Bei der apikal sezernierten Spezies, detektiert mit dem AK 5313 gerichtet gegen l-βAPPtotal, muss es sich um l-βAPPβ handeln. Diese l-βAPPβ-Spezies ist deutlich erhöht, wenn βAPP, wie die βAPPΔC Variante, auch apikal sortiert wird.

Die aus dem apikalen Fehltransport von βAPP resultierenden βAPP-CTFβ werden vermutlich reinternalisiert und aufgrund des Sortierungsignals in basolaterale Kompartimente transportiert, dort durch die γ-Sekretase prozessiert und das Aβ-Peptid wird basolateral sezerniert (Abbildung 45). Die hier postulierte Transcytose für βAPP-CTFβ konnte für das βAPP-Holoprotein gezeigt werden. L-βAPP, resultierend aus apikal markiertem Holoprotein, konnte im basolateral konditionierten Medium nachgewiesen werden (Abbildung 48). Es konnte jedoch nicht geklärt werden, ob neben l-βAPPα auch l-βAPPβ auf dem Transportweg der Transcytose entsteht. Andere Gruppen konnten nach Reinternalisierung ausschließlich die Entstehung von l-βAPPα zeigen (Haass et al., 1994;Lo et al., 1994).

Ist das C-terminale Sortierungssignal jedoch deletiert, wie im Falle von βAPPΔC, wird eine verkürzte Aβ-Spezies auch apikal sezerniert (Abbildung 50) (Haass et al., 1995). Eine andere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass die verkürzte, apikal sezernierte Aβ-Spezies in Abhängikeit von Cholesterin entsteht und eine Cholesterin Depletion führt zu einer „normalen“ apikal sezernierten Aβ-Spezies (Mizuno et al., 1998). Da apikale Membranen einen höheren Cholesteringehalt aufweisen als basolaterale, wäre es möglich, dass die Membranzusammensetzung einen Einfluss auf den BACE-Schnitt von βAPP hat.

4.1.6.2 βAPP prozessierende Sekretase Aktivitäten in MDCK Zellen

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Die Produkte der γ-Sekretase Prozessierung von βAPP-CTF werden überwiegend im basolateralen Medium nachgewiesen (Abbildung 45). Wird das Volllängenprotein jedoch auch apikal sortiert wie βAPPΔC, kann Aβ auch im apikalen Medium nachgewiesen werden (Abbildung 50). Neben den apikalen und basolateralen Aktivitäten konnten auch zwei Komponenten (Presenilin 1 und Nicastrin) des γ-Sekretase Komplex apikal und basolateral nachgewiesen werden (Abbildung 51). Im Gegensatz zeigte jedoch eine andere Gruppe eine ausschließliche basolaterale Lokalisierung von Presenilin in MDCK Zellen (Georgakopoulos et al., 1999). Eine basolaterale Lokalisierung von Presenilin kann aber nicht die Möglichkeit der apikalen Aβ-Sezernierung erklären. Es ist auch unwahrscheinlich, dass die Vielzahl der γ-Sekretase Substrate basolateral sortiert werden. Ferner wurde eine „lipid raft“ Assoziation (Vetrivel et al., 2004)und in Neuronen ein axonaler Transport von Presenilin 1 beschrieben (Sheng et al., 2003). Axone würden dem apikalen Kompartiment von MDCK Zellen entsprechen. Mit apikal lokalisierter BACE-Aktivität und α-Sekretase Aktivität im basolateralen Kompartiment ergibt sich für βAPP die in Abbildung 61 dargestellte Prozessierung in polarisierten MDCK Zellen.

Abbildung 61: Polarisierte Sortierung von βAPP und den prozessierenden Proteasen

Dargestellt ist die Oberflächenverteilung von βAPP und βAPPΔC (schwarz), BACE (blau), α-Sekretase Aktivität (rot) und γ-Sektetase (grau). Die resultierenden Prozessierungsprodukte sind in den Farben der prozessierenden Protease dargestellt.

4.2 Charakterisierung von BACE - in vitro

Es wurde im Rahmen dieser Arbeit ein spezifischer, sensitiver BACE-Assay entwickelt, der zur Identifikation von BACE-Inhibitoren im „high-throughput“ System eingesetzt werden kann. Anderen Gruppen haben für die Analyse von BACE-Inhibitoren ähnliche Assays entwickelt und bestätigen die Funktionalität des in dieser Arbeit beschriebenen quenchenden Fluoreszenzassays (Andrau et al., 2003;Marcinkeviciene et al., 2001;Toulokhonova et al., 2003).

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Wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt wird (3.3.2) (Capell et al., 2000) und andere Arbeiten gezeigt haben, sind lösliche BACE-Varianten aktiv (Benjannet et al., 2001;Creemers et al., 2001;Vassar et al., 1999), und Peptidsubstrate, die die βAPPwt- oder die βAPPsw-Sequenz enthalten, werden von BACE prozessiert (Lin et al., 2000;Sinha et al., 1999;Vassar et al., 1999). Da die Affinität von BACE zur βAPPsw-Sequenz deutlich größer ist als zur βAPPwt-Sequenz (Lin et al., 2000;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999), wurden für die Untersuchungen Peptide mit der βAPPsw-Sequenz als Substrat eingesetzt. Für den Fluoreszenz Assay wurden Peptide unterschiedlicher Länge, konjugiert mit einer fluoreszierenden und einer quenchenden Gruppe, eingesetzt (2.7.2).Das kürzeste Peptid mit der P5-P4’ Sequenz der BACE-Schnittstelle war für den Fluoreszenz Assay das am besten geeignete Substrat. Andere Gruppen haben unterschiedlich lange Peptidsubstrate eingesetzt: P3-P3’ (Andrau et al., 2003), P4-P4’ (Lin et al., 2000), P5-P5’ (Yan et al., 1999), P21-P9’ (Vassar et al., 1999). Als Kontrolle der BACE-Spezifität des Peptidumsatzes wurde ein Substratpeptid mit einer AS-Substitution von Leucin zu Valin an Position P1 generiert. Dieser AS-Austausch verhindert die Prozessierung durch BACE-L nahezu vollständig (Abbildung 53) (Citron et al., 1995;Vassar et al., 1999). Ferner wird die Spezifität des Assays nochmals dadurch bestätigt, dass Inhibitoren gegen bekannte Proteasegruppen, wie Serin-, Cystein-, Metallo- und andere Aspartyl-Proteasen, die BACE-Aktivität nicht inhibieren (Abbildung 58) (Mallender et al., 2001;Sinha et al., 1999).

Als Enzymquelle wurde konditioniertes Medium von BACE-L exprimierenden HEK 293 Zellen eingesetzt. BACE-L-Aktivität konnte direkt im konditionierten Medium nachgewiesen werden, durch Konzentration des Mediums konnte die BACE-L-Aktivität entsprechend verstärkt werden (Abbildung 54). Sezerniertes BACE-L ist komplex glycosyliert, enthält jedoch vermutlich zum Großteil noch das Propeptid (Abbildung 52A) (Bennett et al., 2000;Haniu et al., 2000). Da der Nachweis der Propeptid enthaltenden BACE-L-Form mit einem anderen AK erfolgte als der der Gesamtpopulation, ist aufgrund der unterschiedlichen AK-Affinitäten ein direkter quantitativer Vergleich nicht möglich. Eine Ursache für die ineffiziente Abspaltung des Propeptids von BACE-L könnte der schnelle Transport zur Plasmamembran sein. Im Assay wird demzufolge ein Gemisch aus BACE-L mit und ohne Propeptid eingesetzt. Obwohl gezeigt wurde, dass das Propeptid nur geringen Einfluss auf die BACE-Aktivität hat (Benjannet et al., 2001;Creemers et al., 2001;Ermolieff et al., 2000;Shi et al., 2001), muss bei der Beurteilung der Ergebnisse berücksichtigt werden, dass eine heterogene BACE-L-Spezies eingesetzt wurde. Hat das Propeptid Einfluss auf die Faltung von BACE, wie vermutet wird (Shi et al., 2001), so könnte auch ein Einfluss auf die Eigenschaften des Enzyms bestehen.

BACE-L konnte über das konjugierte sechsfache Histidin mit Hilfe von Nickel-Agarose aufgereinigt werden (Abbildung 52B). Die aufgereinigte, in der Silberfärbung ausschließlich BACE-L enthaltende, Fraktion war enzymatisch aktiv (Abbildung 54). Konditioniertes Kontrollmedium zeigte keine enzymatische Aktivität. Da die Prozessierung des Substratpeptids spezifisch war (s. oben) und die Aktivität des konzentrierten, konditionierten BACE-L Mediums ausreichend war, wurde dieses Medium für die weiteren Experimente eingesetzt. Eine Optimierung der Aufreinigung von BACE-L war für die Ziele dieser Arbeit nicht notwendig.

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BACE-L hat im Assay bei einem pH-Wert von 4,4 die maximale Aktivität, die Aktivität nimmt außerhalb des engen pH-Bereichs von 4,2-4,8 schnell ab, bei einem pH-Wert von 5,0 liegen nur noch 20 % der maximalen Aktivität vor (3.6.2.1). Andere Arbeitsgruppen haben für BACE ebenfalls eine maximale Aktivität im sauren Milieu mit pH-Werten von 4,0-4,5 festgestellt (Andrau et al., 2003;Gruninger-Leitch et al., 2002;Lin et al., 2000;Vassar et al., 1999). Das pH-Maximun der BACE-Aktivität ist unabhängig vom Substrat (Gruninger-Leitch et al., 2002;Lin et al., 2000).

Überraschend ist, dass BACE , d.h. in Zellkultur, eine deutlich größere pH-Wert Toleranz aufweist. So ist BACE zwar überwiegend in leicht sauren Kompartimenten (Haass und Selkoe, 1993;Knops et al., 1995) wie dem Golgi-Apparat, dem TGN (Haass et al., 1995;Haass et al., 1995;Hussain et al., 1999;Steinhilb et al., 2002;Vassar et al., 1999) und dem endosomalen/lysosomalen System (Huse et al., 2002;Huse et al., 2000;Koo und Squazzo, 1994;Perez et al., 1999;Thinakaran et al., 1996;Vassar et al., 1999;Walter et al., 2001;Yan et al., 2001) lokalisiert und aktiv. Es wurde jedoch auch BACE-Aktivität im ER (Benjannet et al., 2001;Chyung et al., 1997;Cook et al., 1997;Haniu et al., 2000;Hartmann et al., 1997;Huse et al., 2000;Wild-Bode et al., 1997) und an der Zelloberfläche (Chyung und Selkoe, 2003;Kinoshita et al., 2003) gezeigt. Die BACE-Aktivität und die Entstehung von Aβ ist damit nicht auf ein zelluläres Kompartiment begrenzt, Aβ kann an verschiedenen Orten in der Zelle entstehen. Entweder ermöglichen lokale saure pH-Werte auch in nicht sauren Kompartimenten die BACE-Aktivität, oder ist BACE in einem breiteren pH-Bereich aktiv und außerhalb des pH-Optimums ist die BACE-Aktivität reduziert.

Erste Untersuchungen der Enzymkinetik zeigen, dass keine hyperbole Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration besteht, sondern eine fast sigmoidale Beziehung vorliegt (Abbildung 57). Bei der Substraterhöhung im Bereich niedriger Substratkonzentrationen (< 400 nM) steigt die Reaktionsgeschwindigkeit nur sehr langsam an, geschwindigkeitsbegrenzende Enzymumfaltungen oder die Entstehung von Enzym-Substrat-Intermediaten könnten eine mögliche Ursache sein. Sehr häufig bestehen Enzyme mit einer sigmoidalen Kinetik aus mehreren Untereinheiten, die verschiedene Konformationen mit unterschiedlicher Fähigkeit zur Substratbindung und Enzymkatalyse eingehen können. Bei Erhöhung der Substratkonzentration kommt es zu einer Stabilisierung der enzymatisch aktiveren Form (Löffler und Petrides, 2003). Für BACE konnten zwei kinetische Phasen in der Substratumsetzung festgestellt werden, möglicherweise verursacht durch einen zwei-stufigen Substrat-Bindungsmechanismus. Durch die strukturelle Änderung, vermutlich in der „flap“-Region, entsteht ein Enzym-Substrat-Komplex, der die Katalyse erhöht, die enzymatische Reaktion zeigt dann eine hyperbole Abhängigkeit von der Substratkonzentration (Marcinkeviciene et al., 2001;Toulokhonova et al., 2003).

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Der Einsatz von Inhibitoren zeigt, dass der Enzymassay geeignet ist, BACE-Inhibitoren aus pharmakologischen Komponenten-Banken zu detektieren. Es wurden zwei auf der βAPPsw-Sequenz basierende Peptidinhibitoren GL189 P4-P4’ und GL190 P8-P4’generiert. Bei beiden Inhibitoren ersetzt Statin die AS an Position P1 (Leucin), und die AS an Position P1’ (Aspartat) wurde durch Valin substituiert (2.7.3.1). Beide Inhibitoren zeigen ein ähnliches BACE-Inhibitionsprofil mit einem IC50-Wert von ca. 100 nM. Die N-terminale Verlängerung von GL190 hat keinen Einfluss auf die Inhibition der BACE-Aktivität (Abbildung 58).

Andere Arbeitsgruppen haben für substratanaloge Peptidinhibitoren, die auf Statin-Substitution basieren, IC50-Werte von 30 nM bis 40 µM ermittelt (Andrau et al., 2003;Gruninger-Leitch et al., 2002;Mallender et al., 2001;Sinha et al., 1999). Für einen Inhibitor P10-P4’, der den Substitutionen von GL189 und GL190 entspricht wurden IC50-Werte von 30 nM (Sinha et al., 1999) und 200 nM (Gruninger-Leitch et al., 2002) ermittelt. Eine Inhibitorklasse, die auch bei der Kristallisation von BACE eingesetzt wurde (Hong et al., 2000), zeigt deutlich niedrigere IC50-Werte im Bereich von 1 nM (Ermolieff et al., 2000;Ghosh et al., 2001). Bei den OM-99 Inhibitoren wurden die AS der Schnittstelle P1-P1’ durch ein Hydroxylethylen-Dipeptid-Isoster ersetzt und das Aspartat an Position P1’ durch Alanin ersetzt. Aufgrund der genauen Strukturkenntnis von BACE war es möglich, Inhibitoren mit einer größeren Affinität zu generieren. Genaue Bindungsanalysen ergaben, dass nur P1-P4 sowie P1’-P2’ an der Enzymbindung beteiligt sind (Ghosh et al., 2001;Hong et al., 2000). Damit ist erklärt warum eine N-terminale Verlängerung des Inhibitors keinen Einfluss auf die Inhibition hat (s. oben). Genaue Sequenzanalysen von BACE-Inhibitoren und -Substraten ergaben, dass BACE sehr niedrige Kinetik-Konstanten zum Substrat βAPP hat (Gruninger-Leitch et al., 2002;Lin et al., 2000), und bei weitem nicht so sequenzspezifischist wie vermutet wurde (Ghosh et al., 2001;Hong et al., 2002).

4.3 Relevanz der Ergebnisse bezüglich der Alzheimer Krankheit

Die Behandlung der Alzheimer Krankheit ist aufgrund der weiten Verbreitung, des langen Krankheitsverlaufs und der gesellschaftlichen Belastung ein herausragendes Ziel der neurologischen Forschung (1.1). Bisher werden ausschließlich die Symptome der Alzheimer Krankheit behandelt, wodurch der Krankheitsverlauf verlangsamt und die Symptome zeitweilig vermindert werden (Citron, 2004). Ziel der Erforschung der Alzheimer Krankheit ist es die Entstehungsmechanismen aufzudecken und mögliche therapeutische Angriffspunkte zur Ursachenbekämpfung offen zu legen. Eine Schlüsselrolle in der Entstehung der Alzheimer Krankheit spielt die Entstehung und Akkumulation des Aβ-Peptids, insbesondere der um zwei AS verlängerten Aβ42-Spezies (1.3). Es konnte gezeigt werden, dass durch die Reduktion von Aβ im Hirn transgener Alzheimer Mäuse deren kognitive Funktion verbessert wurde (Dodart et al., 2002;Morgan et al., 2000)

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BACE schneidet βAPP N-terminal der Aβ-Sequenz und durch den folgenden C-terminalen γSekretase-Schnitt wird Aβ freigesetzt (1.3.2). Die Inhibition von BACE würde zu einer Verminderung der Amyloid-Produktion führen.Da BACE „knock-out“ Mäuse keinen bzw. nur einen minimalen Phänotyp zeigen (Cai et al., 2001;Luo et al., 2001;Roberds et al., 2001) ist die BACE-Inhibition vermutlich unproblematisch. Im Gegensatz dazu sind „knock-out“ Mäuse einzelner γ-Sekretase Komplex Komponenten pränatal letal(De Strooper et al., 1998;Herreman et al., 1999;Shen et al., 1997;Wong et al., 1997). Die Ursache hierfür liegt in der Vielzahl der γ-Sekretase Substrate begründet(1.3.2.3)(Kopan und Ilagan, 2004;Xia und Wolfe, 2003),so spielt z.B. die γ-Sekretase Prozessierung von Notch eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung(De Strooper et al., 1999;Mumm et al., 2000;Selkoe und Kopan, 2003). Damit ist die BACE-Inhibition der primäre Ansatzpunkt um die Entstehung von Amyloid zu reduzieren (Citron, 2004;Dingwall, 2001;Dodart et al., 2002;Ghosh et al., 2002;Hong et al., 2002). Eine Inhibition von BACE führt nicht zur Akkumulation von toxischen βAPP-Fragmenten sondern zu einer erhöhten nicht amyloidogenen Prozessierung durch die α-Sekretase. Die Inhibition von BACE würde den initialen Schritt in der Entstehung der Alzheimer Krankheit unterbinden. Kürzlich konnte im Mausmodell gezeigt werden, dass BACE-Inhibitoren, kovalent an einen Peptidcarrier gebunden, die Blut-Hirn-Schranke passieren und zur reduzierten Aβ-Produktion führen (Chang et al., 2004). Durch diese Ergebnisse wird der Therapieansatz der BACE-Inhibition weiter unterstützt.

In dieser Arbeit wurde ein sensitiver Assay aufgebaut, mit dessen Hilfe BACE-Inhibitoren analysiert werden können.

Um neben der BACE-Inhibition weitere mögliche Eingriffspunkte für die Modulation der BACE-Aktivität aufzudecken, wurden die Maturierung und der Transport von BACE analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass BACE auch in frühen Kompartimenten des sekretorischen Transportwegs aktiv sein kann und dass die BACE-Aktivität unabhängig von der cytoplasmatischen Domäne und der Transmembrandomäne ist. Die Experimente in MDCK Zellen zeigen jedoch, dass der Transport von BACE erheblichen Einfluss auf die Aβ-Entstehung hat. In MDCK Zellen werden BACE und βAPP differenziell transportiert, BACE apikal und βAPP basolateral, dadurch wird die α-Sekretase Prozessierung von βAPP begünstigt. Wird jedoch βAPP, durch Deletion des basolateralen Sortierungssignals, in apikale Kompartimente transportiert findet verstärkt BACE-Prozessierung von βAPP statt. Damit ist eindeutig gezeigt das der Transport des βAPP bzw. der βAPP prozessierenden Proteasen die Amyloid-Entstehung beeinflusst. Es wäre also möglich, dass geringe, evtl. altersabhängige, Änderungen in Transportmechanismen die Entstehung der Alzheimer Krankheit begünstigen könnten. Andere Gruppen konnten ebenfalls den Transport bzw. die Lokalisierung von βAPP und BACE als den, die Aβ-Entstehung begrenzenden Faktor ausmachen. BACE wurde überwiegend in „lipid rafts“ lokalisiert (Marlow et al., 2003;Riddell et al., 2001) und eine Erhöhung der βAPP-Fraktion (Marlow et al., 2003) oder der BACE- und βAPP-Fraktion (Ehehalt et al., 2003) in „lipid rafts“ verstärkt die amyloidogene Prozessierung von βAPP.


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04.07.2006