Einleitung

Epidemiologie der Alzheimer Krankheit

Von einer Altersdemenz sind in Europa ca. 6,4 % der über 65 jährigen (Lobo et al., 2000) und 16,9 % bis 34,8 % (Prencipe et al., 1996;Riedel-Heller et al., 2001) der über 85 jährigen betroffen. Mit einer im Durchschnitt älter werdenden Bevölkerung steigt die Anzahl der von einer Demenz betroffenen Menschen, damit stellt die Altersdemenz nicht nur ein persönliches Schicksal dar, sondern ist von zunehmender gesellschaftspolitischer und wirtschaftlicher Bedeutung. Die medizinische und soziale Versorgung wird zukünftig eine Herausforderung für die Gesellschaft werden (Ankri und Poupard, 2003).

Die Alzheimer Krankheit ist heute weltweit die häufigste Form von Demenz (Selkoe, 2001); die Verbreitung ist weitgehend unabhängig von ethnischer Zugehörigkeit (Selkoe, 1999), auch wenn neuere, umfangreiche Studien populationsabhängige Unterschiede in der Häufigkeit des Auftretens der Alzheimer Krankheit und der Wahrscheinlichkeit, die Alzheimer Krankheit zu bekommen, feststellen (Chandra et al., 2001;Hendrie et al., 2001;Tang et al., 2001). Zusammenhänge sowohl zwischen ethnischer Zugehörigkeit, in den USA sind „African Americans“ und „Caribean Hispanics“ gefährdeter als „Caucasians“ (Tang et al., 2001), als auch gesellschaftsstruktureller Entwicklung, in Industrienationen ist die Gefährdung, an Alzheimer zu erkranken größer, als in Entwicklungsländern (Chandra et al., 2001;Hendrie et al., 2001), konnten festgestellt werden. Weitere umfangreiche epidemiologische Studien könnten Hinweise auf Risikofaktoren geben, die die Entstehung der Alzheimer Krankheit begünstigen. Zurzeit leiden weltweit mehr als 12 Millionen Menschen an der Alzheimer Krankheit (Citron, 2004).

Den größten Anteil an der Alzheimer Krankheit machen „sporadisch“ auftretende Fälle aus, nur 5-10 % sind auf genetische Risikofaktoren, wie das ε4 Allel des Apolipoproteingens E (Apo E), oder auf genetisch autosomal-dominant vererbte Fälle zurückzuführen (Selkoe, 1996;Selkoe, 2001). Es gibt drei verschiedene Apo E Allele, ε2, ε3 und ε4, in der Gesamtpopulation überwiegend ist das ε3 Allel vertreten, während ε2 und ε4 weniger häufig sind. Apo E spielt eine regulierende Rolle in dem Lipidmetabolismus und der Cholesterinaufnahme und intrazellulären Freisetzung. Strittmatter und Kollegen (Saunders et al., 1993;Strittmatter et al., 1993) konnten zeigen, dass das ε4 Allel bei „late-onset“ Patienten der Alzheimer Krankheit überrepräsentiert ist und zu erhöhter Amyloid-Ablagerung im cerebralen Cortex führt (Rebeck et al., 1993;Schmechel et al., 1993). Für das ε2 Allel von Apo E konnte eine schützende Funktion festgestellt werden (Corder et al., 1994).

Mutationen in drei Genen können zur autosomal-dominanten „early-onset“ Form (Patienten < 60 Jahre), der familiären Alzheimer Krankheit (FAD, familial Alzheimer`s disease), führen (Hardy, 1997;Tilley et al., 1998). Die Pathologie der FAD-Form unterscheidet sich nicht von der sporadischen „late-onset“ Form der Alzheimer Krankheit (Selkoe, 1999). Mutationen im Gen auf Chromosom 21, kodierend für das β-Amyloid Vorläuferprotein (βAPP, β-amyloid precursor protein), (Goate et al., 1991) sind nur für 2-3 % der Fälle der familiären Alzheimer Krankheit verantwortlich. Dagegen decken Mutationen auf den Genen für Presenilin 1 (PS1) auf Chromosom 14 (Sherrington et al., 1995)70-80 %, und Presenilin 2 (PS2) auf Chromosom 1 (Levy-Lahad et al., 1995;Levy-Lahad et al., 1995;Li et al., 1995;Rogaev et al., 1995) 20 % der familiären Fälle der Alzheimer Krankheit ab (Hyman und Tanzi, 1995). Die bisher bekannten FAD-Mutationen sind auf der „homepage“ http://molgen-www.uia.ac.be/ADMutations aufgeführt.

Die ersten Symptome der Alzheimer Krankheit sind Störungen im Kurzzeitgedächtnis und im Orientierungsvermögen. Später treten Verluste des Langzeitgedächtnisses, der Urteilsfähigkeit, des logischen Denkens und des Sprachvermögens aufIm Endstadium sind die Patienten bettlägerig, incontinent und auf permanente Hilfe angewiesen. Der Tod tritt im Mittel neun Jahre nach der Diagnose ein (Samuels und Davis, 1998).

Der klinische Verdacht stützt sich auf neuropsychologische Tests und bildgebende Verfahren wie Computer-Tomografie, Magnetresonanz-Tomografie, Positronen-Emissions-Tomografie und Photonen-Emissions-Tomografie (DeKosky und Marek, 2003;Demetriades, 2002;Fox et al., 2001).Ferner beruht die Diagnose der Alzheimer Krankheit auf dem Ausschluss anderer Demenzen(McKhann et al., 1984). Biomarker für eine frühe biochemische Diagnose, als Voraussetzung für eine frühe Behandlung, wären wünschenswert, befinden sich aber erst in der Testphase (Blennow und Hampel, 2003;Hampel et al., 2004).Es werden Möglichkeiten untersucht die für die Alzheimer Krankheit relevanten Proteine, Tau, phosphoryliertes Tau und die 42 Aminosäuren (AS) lange Form des β-Amyloid Peptids (Aβ₄₂) im Liquor cerebrospinalis nachzuweisen (Andreasen et al., 2003). Eine definitive Diagnose kann erst post-mortem anhand der Hirnpathologie gestellt werden (Hendriks und Van Broeckhoven, 1996).

Das histopathologische Krankheitsbild

Alois Alzheimer brachte 1907 erstmalig die klinischen Symptome der Krankheit mit der neurofibrillären Pathologie im Gehirn seiner 51-jährig verstorbenen Patientin Auguste D. in Verbindung (Alzheimer, 1907)

Abbildung 1: Dokumentation der neurofibrillären Pathologie nach Alois Alzheimer A: Fotografie der „ersten“ Alzheimer Patientin, Auguste D. B: Neurofibrilläre Bündel, gezeichnet von Alois Alzheimer nach lichtmikroskopischer Untersuchung [Quelle: (Maurer und Maurer, 1998)].

Die beiden charakteristischen neuropathologischen Merkmale der Alzheimer Krankheit - Amyloid-Ablagerungen und neurofibrilläre Bündel - bilden auch heute noch die Grundlage für die endgültige post-mortemDiagnose der Krankheit, (Thorsett und Latimer, 2000).Amyloid-Ablagerungen und neurofibrilläre Bündel sind vorwiegend in den Gehirnregionen Neocortex und Hippocampus sowie im Limbischen System nachweisbar (Braak et al., 1996).

Abbildung 2: Histopathologische Charakteristika der Alzheimer Krankheit A: Hochauflösende mikroskopische Aufnahme eines Amyloid-Plaques (Pfeil), umgeben von dystrophen Neuriten (Pfeilkopf). B: Elektronenmikroskopische Aufnahme neurofibrillärer Bündel, die aus gepaarten helikalen Filamenten (Pfeil) bestehen [Quelle: (Sisodia und St George-Hyslop, 2002)].

Neurofibrilläre Bündel (Abbildung 2B), oder „tangles“, entstehen ausschließlich intrazellulär in Neuronen im somato-dendritischen, aber auch im axonalen Kompartiment durch Aggregation von gepaarten helikalen Filamenten (Terry et al., 1964).Diese Filamente bestehen überwiegend aus hyperphosphorylierten Formen des Mikrotubuli assozierten Proteins Tau(Goedert et al., 1996;Grundke-Iqbal et al., 1986),das unter physiologischen Bedingungen für die Stabilisierung der axonalen Mikrotubuli verantwortlich ist(Friedhoff et al., 2000). Die nicht physiologische Hyperphosphorylierung von Tau ist auf die Störung des Gleichgewichtes bestimmter Kinasen und Phosphatasen zurückzuführen, dessen Ursache bisher nicht vollständig erklärt werden kann (Mandelkow und Mandelkow, 1998).Die durch die „tangle“ Bildung angegriffenen Axone und Dendriten werden als „dystrophe Neuriten“ bezeichnet(Crowther und Goedert, 2000). Nach dem Absterben der betroffenen Neuronen erscheinen die neurofibrillären Bündel auch als extrazelluläre Ablagerungen (Bondareff et al., 1994).Neurofibrilläre Bündel treten auch im Zusammenhang mit anderen neurodegenerativen Erkrankungen, wie z.B. Frontallappen-Demenz, auf (Joachim und Selkoe, 1992;Lee und Trojanowski, 1999;Morris et al., 2001)und sind damit nicht spezifisch für die Alzheimer Krankheit.

Das zweite charakteristische, pathologische Merkmal der Alzheimer Krankheit, die Amyloid-Ablagerungen (Abbildung 2A), oder Amoyloid-Plaques, sind ausschließlich im extrazellulären Raum des Gehirns sowie im zerebralen Blutgefäßsystem nachweisbar (Selkoe, 1999). Mikroskopisch unterscheidet man zwei Subklassen von Amyloid-Plaques, die neuritischen und die diffusen Plaques. Die neuritischen Plaques sind gekennzeichnet durch einen dichten Amyloidkern, dem „amyloid-core“, der von „dystrophen Neuriten“ (Braak et al., 1996) sowie aktivierten Microgliazellen und Astrocyten umgeben ist (Pike et al., 1994).Diese kompakten neuritischen Amyloid-Plaques sind spezifisch für die Alzheimer Krankheit, während die diffusen Amyloid-Plaques auch in Gehirnen nicht dementer, alter Menschen nachweisbar sind (Hardy und Selkoe, 2002).Diffuse Amyloid-Plaques sind hauptsächlich im Cerebellum nachweisbar und bedingen in der Regel keine bis wenige zelluläre Veränderungen (Yamaguchi et al., 1989).

Molekulare und genetische Grundlagen der Alzheimer Krankheit

Die Hyperphosphorylierung von Tau und die Entstehung neurofibrillärer Bündel sind nicht spezifisch für die Alzheimer Krankheit (Joachim und Selkoe, 1992;Morris et al., 2001). Mutationen im Tau kodierenden Gen führen nicht zur Alzheimer Krankheit, sondern zu parkinson-ähnlichen Erkrankungen(Hutton et al., 1998) oder zur Frontallappen-Demenz (Lee und Trojanowski, 1999;Morris et al., 1999). Tau Ablagerungen und Bildungneurofibrillärer Bündel bewirken eine Neurodegeneration, aber keine Entstehung von Amyloid-Plaques (Hardy et al., 1998;Lewis et al., 2000). Amyloid-Ablagerungen treten vor der Tau-Pathologie auf (Oddo et al., 2003) und können die Entstehung neurofibrillärer Bündel einleiten (Gotz et al., 2001).

Obwohl der direkte Zusammenhang zwischen den Amyloid-Plaques, der Pathologie der Alzheimer Krankheit und der neuronalen Degeneration im Zentralnervensystem bisher nicht definitiv geklärt werden konnte, nimmt die Bildung der Amyloid-Plaques eine Schlüsselposition in der Entstehung der Alzheimer Krankheit ein (Hardy und Selkoe, 2002;Huse und Doms, 2001;Selkoe, 1999). Die Hauptkomponente der Amyloid-Plaques ist ein kurzes, amphipatisches Peptid, das Aβ-Peptid (Amyloid β-Peptid). Zunächst konnte das Aβ-Peptid aus zerebralen Ablagerungen an Blutgefäßen (Glenner und Wong, 1984) und später aus Amyloid-Plaques (Masters et al., 1985) isoliert werden. Weitere Komponenten der Plaques sind Apo E und J, α1-Antichymotrypsin und Proteoglycane (Dickson, 1997). Das Aβ-Peptid entsteht durch post-translationale Proteolyse aus einem Vorläuferprotein, demβAPP (Kang et al., 1987). Die das Aβ-Peptid freisetzenden Proteasen werden aufgrund der durch die Proteolyse entstehenden Sezernierungsprodukte (1.3.2) auch Sekretasen genannt. Da die Sekretasen eine Variabilität in ihrer Schnittstelle zeigen, weist das entstehende Aβ-Peptid eine N- und C-terminale Heterogenität auf (Masters et al., 1985;Masters et al., 1985;Wang et al., 1996). Es haben sich jedoch zwei Aβ-Spezies als Hauptkomponenten der Amyloid-Plaques herauskristallisiert, deren N-Termini beginnen mit Aspartat der AS an Position 597, bezogen auf die 695 AS lange βAPP-Spleißform (βAPP₆₉₅), der C-Terminus endet entweder mit V636 oder mit A638, ebenfalls bezogen auf βAPP₆₉₅. Die Nomenklatur der Aβ-Peptide bezieht sich unabhängig von der βAPP-Spleißform auf die Länge des Aβ-Peptids selbst. Damit wird die kürzere Variante beginnend mit Asparaginsäure an Position 1 des Aβ-Peptids als Aβ_1-40 und die zwei AS längere Variante als Aβ_1-42 bezeichnet. Die längere Variante Aβ_1-42 weist eine höhere Tendenz zur Aggregation auf (Barrow und Zagorski, 1991;Jarrett et al., 1993), dadurch wird eine größere Neurotoxizität hervorgerufen (Yankner, 1996). Außerdem ist Aβ_1-42 gegenüber Degradation resistenter als Aβ_1-40(Glabe, 2001), wodurch die Ablagerung im Hirn verstärkt wird (Iwatsubo et al., 1994;Selkoe, 1999). Die Entstehung und die spezifische Ablagerung von Aβ₁ ₄₂ im Hirn scheint der erste pathologische Schritt für die Entstehung der Alzheimer Krankheit zu sein (Citron, 2004;Hardy und Selkoe, 2002;Huse und Doms, 2001;Selkoe, 1999).

Einen entscheidenden Hinweis auf die Schlüsselrolle der Amyloid-Ablagerungen für die Entstehung der Alzheimer Krankheit liefern die bereits unter 1.1 erwähnten autsomal-dominanten FAD-Fälle. Es führen alle bisher bekannten FAD-Mutationen in den Genen kodierend für βAPP, PS1 und PS2 entweder zu einer verstärkten Sezernierung aller Aβ-Peptid Formen oder, wie in den meisten Fällen, zu einer spezifischen Erhöhung der besonders amyloidogenen Aβ₄₂-Spezies (Borchelt et al., 1996;Cai et al., 1993;Chartier-Harlin et al., 1991;Citron et al., 1992;Citron et al., 1997;Duff et al., 1996;Goate et al., 1991;Haass und Steiner, 2002;Murrell et al., 1991;Scheuner et al., 1996;Suzuki et al., 1994;Younkin, 1998)(Borchelt et al., 1996;Cai et al., 1993;Chartier-Harlin et al., 1991;Citron et al., 1992;Citron et al., 1997;Duff et al., 1996;Goate et al., 1991;Haass und Steiner, 2002;Murrell et al., 1991;Scheuner et al., 1996;Suzuki et al., 1994;Younkin, 1998).

Tiermodelle für die Alzheimer Krankheit belegen ebenfalls die Bedeutung der Amyloid-Ablagerungen. Wird in Mäusen mit Amyloid-Plaques durch Immunisierung, z.B. mit Aβ-Peptid oder Antikörpern gerichtet gegen das Aβ-Peptid (Bard et al., 2000;Janus et al., 2000;Morgan et al., 2000;Schenk et al., 1999), der Abbau der Plaques eingeleitet oder wird die weitere Amyloid Entstehung verhindert, z.B. durch Injektion von Proteaseinhibitoren (Chang et al., 2004;Oddo et al., 2004), kommt es zur Reduktion der Plaques und die Lernfähigkeit der Mäuse nimmt zu.

Der neurotoxische Wirkmechanismus und die Entstehung der Läsionen in der Alzheimer Krankheit sind nicht vollständig geklärt. Derzeit wird davon ausgegangen, das die frühe Fehlfunktion der Synapsen (Masliah et al., 2001;Mucke et al., 2000;Small et al., 2001;Sze et al., 2000;Yao, 2004) durch lösliche, neurotoxische, oligomere Aβ₄₂-Formen ausgelöst werden kann (Kamenetz et al., 2003;Selkoe, 2002;Walsh et al., 2002). Dafür spricht auch, dass lösliches Aβ-Peptid besser mit dem Krankheitsverlauf korreliert, als die Anzahl histologisch bestimmter Amyloid-Plaques (Naslund et al., 2000;Wang et al., 1999). Einwandernde Microgliazellen und Astrocyten beschleunigen die neuronale Degeneration (Lemere et al., 1996). Die zunehmende Schädigung der Neuronen bedingt eine Änderung des intrazellulären Milieus, die dabei veränderten Kinase- und Phosphataseaktivitäten führen unter anderem zur Entstehung von gepaarten helikalen Tau Filamenten und somit zum weiteren Funktionsverlust und Tod von Neuronen. Das Absterben der Neuronen wird als die unmittelbare Ursache für die Demenz angesehen (Hardy und Selkoe, 2002;Selkoe, 2001;Sisodia und St George-Hyslop, 2002).

Ein verändertes Gleichgewicht in der Aβ-Peptid Entstehung, der extrazellulären Aggregation und der Aβ-Degradation, ausgelöst durch verschiedenste Faktoren, steht mit großer Wahrscheinlichkeit am Anfang einer Kaskade, die letztlich zum Tod der Neuronen führt (Abbildung 3) (Hardy und Selkoe, 2002).

Abbildung 3: Vereinfachte schematische Darstellung der Amyloid-Kaskade Die Abfolge pathologischer Ereignisse führt zur Alzheimer Krankheit. Das auslösende Phänomen ist die erhöhte Entstehung von Aβ₄₂. In der FAD-Form ist die pathogene Mutation auslösender Faktor für die erhöhte Aβ₄₂-Bildung. In der sporadisch auftretenden Alzheimer Krankheit könnten verschiedenste Faktoren eine Rolle für die erhöhte Aβ₄₂-Produktion spielen. [Quellen: (Citron, 2004;Hardy und Allsop, 1991;Hardy und Selkoe, 2002)].

Struktur und Funktion des β-Amyloid Vorläuferproteins (βAPP)

Die Erkenntnis, dass das Aβ-Peptid aus einem Vorläuferprotein, dem βAPP (Kang et al., 1987), entsteht leitete, neben der Untersuchung der Aβ-Peptid Entstehungsmechanismen auch eine extensive Charakterisierung des βAPP ein.

Abbildung 4: Schematische Darstellung von βAPP₇₇₀ Die luminale Domäne von βAPP enthält ein Signalpeptid (Sp, schwarze Box). Die KPI-Domäne der Spleißformen βAPP_770/751 ist blau, die Ox-2 Antigen-Domäne der Spleißform βAPP₇₇₀ ist hellblau, die Aβ-Domäne ist rot und die zelluläre Membran grau dargestellt. Die ungefähren Schnittstellen der βAPP prozessierenden Sekretasen und die zwei Glycosylierungsstellen sind gekennzeichnet.

βAPP ist ein glycosyliertes Typ I Transmembranprotein, mit einer großen N-terminalen Ektodomäne, einer Transmembrandomäne und einer kurzen C-terminalen, cytoplasmatischen Domäne (Abbildung 4). N-terminal befindet sich ein 17 AS langes Signalpeptid, das für die Translation ins Endoplasmatische Retikulum (ER) benötigt wird (Kang et al., 1987;Tanzi et al., 1987).

βAPP wird nach seiner Synthese ko-/post-translational modifiziert und von Sekretasen proteolytisch prozessiert (1.3.2). Nach der Translokation ins ER wird βAPP zunächst im ER N-glycosyliert, dann auf dem sekretorischen Transportweg zur Zelloberfläche transportiert, dabei im Golgi-Apparat O-glycosyliert, sulfatiert und phosphoryliert (Hung und Selkoe, 1994;Oltersdorf et al., 1990;Walter et al., 1997;Weidemann et al., 1989).

An der Zelloberfläche können matures βAPP, oder auch membrangebundene C-terminale Prozessierungsprodukte durch Clathrin-umhüllte-Vesikel endocytiert werden (Lai et al., 1995) und entweder über Endosomen und Lysosomen dem Abbau zugeführt werden (Golde et al., 1992;Haass et al., 1992) oder ein endosomales Recycling durchlaufen (Koo und Squazzo, 1994;Koo et al., 1996;Perez et al., 1999;Yamazaki et al., 1996).

βAPP wird in nahezu allen Zelltypen und Geweben exprimiert (Selkoe et al., 1988). Es werden hauptsächlich drei Isoformen des Proteins, die aus 695, 751 oder 770 AS bestehen, unterschieden (Abbildung 4). Die Isoformen entstehen durch alternatives Spleißen der mRNA (Sandbrink et al., 1994;Selkoe, 1994). Die kürzeste Form, βAPP₆₉₅ wird fast ausschließlich in Neuronen exprimiert, während βAPP₇₅₁ die häufigste Isoform in nicht neuronalen Zellen ist (Wertkin et al., 1993). Die beiden langen Formen, βAPP₇₅₁ und βAPP₇₇₀, enthalten ein Insert in der Ektodomäne, das eine Homologie zum Kunitz-Protease-Inhibitor aufweist (Kitaguchi et al., 1988;Ponte et al., 1988;Tanzi et al., 1988). Alle βAPP-Isoformen haben eine Cu-, Fe- sowie eineZn-Bindungsstelle in der Ektodomäne (Bush et al., 1993). Die Zn-Bindung beeinflusst das Aggregationsverhalten des Aβ-Peptids und (Bush et al., 1994;Lee et al., 2002). Für Zn- und Cu-Chelatbildner wurde eine Reduktion der Amyloid-Aggregation und Plaque-Bildung gezeigt (Cherny et al., 2001).

Die physiologische Funktion von βAPP ist nicht abschließend geklärt, auch wenn zahlreiche mögliche Funktionen in verschiedensten physiologischen Prozessen impliziert wurden (Selkoe, 1994;Selkoe, 1999). Für die längeren Isoformen βAPP₇₅₁ und βAPP₇₇₀ wurde für die lösliche, sezernierte Form (1.3.2), aufgrund der Kunitz-Protease-Inhibitor Domäne, eine Inhibition von Serinproteasen festgestellt. Da Serinproteasen unter anderem eine Rolle bei der Blutgerinnung spielenwurde für βAPP₇₅₁ und βAPP₇₇₀ eine gerinnungshemmende Funktion angenommen (Mahdi et al., 1995;Schmaier et al., 1993).

Ferner werden Funktionen in der Zelladhäsion, der Zell-Zell Interaktion, der Signaltransduktion und dem Zellwachstum, insbesondere dem Auswachsen von Neuriten, diskutiert (Koo, 2002;Milward et al., 1992;Nishimoto et al., 1993). Es konnte eine Kolokalisierung von βAPP mit Integrinen (Yamazaki et al., 1997) und fokalen Komplexen(Storey et al., 1996)gezeigt werden. βAPP konnte mit den cytoplasmatischen Bindungspartnern Fe65 und Mena in Lamellipodien nachgewiesen werden (Sabo et al., 2001).Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne von βAPP über Fe65 mit einem Proteinnetzwerk interagiert, das durch Transmembran-Signaltransduktion die corticale neuronale Migration reguliert und das Auswachsen von Axonen beeinflussen kann(Bothwell und Giniger, 2000;De Strooper und Annaert, 2000).

βAPP „knock-out“ Mäuse, d.h. Mäuse, in denen beide βAPP-Allele eliminiert sind, zeigten keinen ausgeprägten Phänotyp und gaben damit keine weiteren Hinweise auf die Funktion (Yankner, 1996;Zheng et al., 1995). Eine mögliche Erklärung lieferten die zwei zu βAPP homologen Proteine APLP (amyloid precursor-like protein)-1 und APLP-2 (Sprecher et al., 1993;Wasco et al., 1992;Wasco et al., 1993). βAPP/APLP-2 oder APLP-1/APLP-2 doppel-„knock-out“ Mäuse sind pränatal letal, ohne histologische Abnormalitäten in der Hirnentwicklung zu zeigen. βAPP/APLP-1 „knock-out“ Mäuse weisen hingegen keinen auffälligen Phänotyp auf, wie auch die APLP-1 oder APLP-2 „knock-out“ Mäuse (Heber et al., 2000;Müller et al., 1998;von Koch et al., 1997). Mäuse, die defizient in allen drei APP-Genen sind, wurden generiert. Wie erwartet sind auch diese Mäuse letal, zeigen aber Abnormalitäten in der Hirnentwicklung und neuronale Migrationsdefekte (Muller und Kins, 2002). Damit scheinen die Proteine der βAPP-Familie essentiell und partiell redundant zu sein. Diese Ergebnisse bestätigen die Rolle von βAPP und APLP in der Adhäsion und Signaltransduktion, die die neuronale Migration und das Neuritenwachstum reguliert (Koo, 2002).

Darüber hinaus gibt es Anhaltspunkte, dass βAPP als Cargo-Rezeptor für Kinesin-1 fungiert und somit am vesikulären Transport beteiligt ist (Kamal et al., 2001;Matsuda et al., 2001).βAPP wird in Neuronen über den schnellen anterograden Transportmechanismus zur axonalen Oberfläche transportiert (Buxbaum et al., 1998;Kaether et al., 2000;Koo et al., 1990;Sisodia et al., 1993) und lokalisiert in Adhäsionssegmenten und synaptischen Kompartimenten, jedoch nicht in synaptischen Vesikeln (Ikin et al., 1996).Der anterograde Transport von βAPP benötigt Kinesin-1 und der C-Terminus von βAPP bindet an der Kinesin-1 Untereinheit(Kamal et al., 2000).

Die Prozessierungsprodukte (1.3.2) von βAPP könnten ebenfalls eine physiologische Rolle spielen. Das Aβ-Peptid kann während der gesamten Lebensspanne in Körperflüssigkeiten, wie Liquor und Plasma, von Gesunden nachgewiesen werden (Haass et al., 1992;Seubert et al., 1992;Shoji et al., 1992). Aβ-Peptid wird von aktiven, gesunden Neuronen sezerniert und eine erhöhte synaptische Aktivität führt zu einem Anstieg der Aβ-Sezernierung (Nitsch et al., 1993). Sezerniertes Aβ-Peptid hingegen reduziert die synaptische Aktivität (Kamenetz et al., 2003). Dieser vom Aβ-Peptid ausgelöste negative „feedback-loop“ könnte eine Rolle in der generellen Regulation der neuronalen Aktivität spielen (Esteban, 2004). Ferner wurde gezeigt, dass ein frühes Merkmal der Alzheimer Krankheit der Verlust an Synapsen und synaptischer Aktivität ist (Selkoe, 2002), und dass lösliche Aβ-Peptid Oligomere die Inhibition der „long-term potentiation“ (LTP) bewirken (Walsh et al., 2002;Wang et al., 2004). LTP spielt eine kritische Rolle bei bestimmten Lern- und Erinnerungsmechanismen (Morris, 2003), damit könnte auch das Aβ-Peptid hier eine physiologische Rolle spielen (Esteban, 2004).

Die bei der βAPP-Prozessierung (1.3.2) entstehenden C-terminalen Fragmente sind toxisch(McPhie et al., 2001;Sopher et al., 1994).βAPP kann C-terminal an Position 664 von Caspasen geschnitten werden, das freiwerdende 31 AS lange Peptid leitet möglicherweise den apoptotischen Zelltod ein (Gervais et al., 1999;Lu et al., 2000). Es bleibt jedoch zu zeigen in wieweit diese apoptotischen Mechanismen eine Rolle für die Neurodegeneration in der Alzheimer Krankheit spielen (Koo, 2002).

Parallelen bei der Prozessierung der Notch-Rezeptoren und βAPP durch die gleichen Sekretasen (De Strooper et al., 1999) ließen auf eine ähnliche Funktion schließen. Die entwicklungsbiologisch hoch konservierten Notch-Rezeptoren spielen eine wichtige Rolle in der Zelldifferenzierung während der Entwicklung und im adulten Gewebe(Mumm und Kopan, 2000).Nach Ligandenbindung, wird Notch durch α- und γ-Sekretase prozessiert, dabei wird ein C-terminales Fragment frei, die so genannte Notch intrazelluläre Domäne (Notch intracellular domain, NICD). NICD wird in den Zellkern transportiert, interagiert dort mit dem transkriptions-aktivierenden Komplex CSL (C-promotor-binding factor / recombination signal-sequence binding protein JK / suppressor of Hairless / Lag1) und löst die Aktivierung verschiedener Gene aus (Kopan und Goate, 2000;Kopan und Ilagan, 2004). In Analogie zur Notch-Prozessierung entsteht auch aus dem βAPP ein intrazelluläres Fragment (βAPP intracellular domain, AICD). AICD ist instabil (Edbauer et al., 2002),kann aber durch Bindung an Fe65 stabilisiert werden, was zu einer Akkumulation im Zellkern und Cytoplasma führt (Kimberly et al., 2001;Minopoli et al., 2001).Binden AICD und Fe65 an einem dritten Protein, dem Transkriptionsfaktor Tip60, entsteht ein Transkription regulierender Komplex (Cao und Südhof, 2001;Kimberly et al., 2001). Der genaue Mechanismus bleibt unklar, ein Kerntransport von AICD scheint für die Transkriptionsaktivität nicht erforderlichzu sein (Cao und Sudhof, 2004).

βAPP und seine Prozessierungsprodukte sind an verschiedensten physiologischen Prozessen beteiligt, es bleibt zu untersuchen, in wieweit die physiologischen Funktionen von βAPP eine Rolle für die Entstehung der Alzheimer Krankheit spielen (Koo, 2002).

Die proteolytische Prozessierung von βAPP und die Entstehung des Aβ-Peptids

βAPP kann auf seinem sekretorischen Transportweg durch verschiedene Proteasen, der α-, β- und γ-Sekretase proteolytisch gespalten werden (Abbildung 5) (Haass, 2004).

Abbildung 5: Proteolytische Prozessierung von βAPP durch α-, β- und γ-Sekretase Dargestellt ist βAPP (grau) mit der Aβ-Domäne (rote Box) und dem Bereich der γ-Sekretase-Schnittstellen (blaue Box). Die Prozessierung durch α-/γ-Sekretase bzw. β-/γ-Sekretase ist dargestellt und die entstehenden Prozessierungsprodukte sind angegeben. Die blau-weiß karierte Box stellt den Teil der βAPP-Sequenz dar, der weder am C-Terminus von Aβ/p3 noch am N-Terminus von AICD nachzuweisen ist. Die zelluläre Membran ist hellgrau dargestellt [Quelle: (Haass und Selkoe, 1993)].

Der größte Anteil von βAPP wird zunächst durch die α-Sekretase prozessiert. Hierbei wird die Ektodomäne als lösliches Molekül sezerniert (l-βAPPα). Der in der Membran verbleibende, 83 AS lange C-terminale Rest (βAPP-CTFα) wird anschließend durch die γ-Sekretase gespalten, wobei eine intrazelluläre Domäne (AICD, βAPP-intracellular domain) (Sastre et al., 2001) und ein lösliches 3 kDa großes Peptid (p3) freigesetzt werden (Haass et al., 1993).

Wird βAPP hingegen zuerst durch die β-Sekretase und anschließend durch die γ-Sekretase geschnitten, so entsteht eine kürzere lösliche Ektodomäne als nach dem α-Sekretase-Schnitt (l-βAPPβ). Aus dem zunächst generierten 99 AS langen C-terminalen Rest (βAPP-CTFβ) entstehen das Aβ-Peptid (Haass et al., 1992;Shoji et al., 1992) und AICD (Abbildung 5) (Haass und Steiner, 2002;Sastre et al., 2001).

Die Prozessierung von βAPP durch die α-Sekretase innerhalb der Aβ-Domäne verhindert die Entstehung des amyloidogenen Aβ-Peptids. Die α- und β-Sekretase konkurrieren im sekretorischen Transportweg um dasselbe Substrat βAPP (Buxbaum et al., 1998;Haass et al., 1995;Skovronsky et al., 2000;Thinakaran et al., 1996). Damit beeinflussen die Aktivitäten der Sekretasen, die Affinitäten zum Substrat und die Zugänglichkeiten zum Substrat die Menge des gebildeten Aβ-Peptids.

Interessanterweise liegen alle bisher bekannten FAD-Mutationen des βAPP-Gens in der Nähe der Schnittstellen der α-, β- oder γ-Sekretase (Abbildung 6)

Abbildung 6: Übersicht über die FAD-Mutationen im βAPP-Gen βAPP ist schematisch dargestellt. Die Aβ-Domäne (rot) mit Angabe der AS-Sequenz, inklusiv angrenzender AS, ist zusätzlich vergrößert dargestellt. Die jeweiligen durch die FAD-Mutationen bedingten Aminosäuresubstitutionen sind unterhalb der Sequenz angegeben.

Die angegebenen Mutationen bedingen entweder eine Erhöhung der Gesamtsezernierung des Aβ-Peptids oder erhöhen spezifisch die Produktion des Aβ₄₂(Selkoe, 1996). Besonders erwähnt sei in diesem Zusammenhang die „schwedische“ Doppelmutation K595N/M596L, die in einer schwedischen Familie mit FAD nachgewiesen wurde (Mullan et al., 1992). Die schwedische Mutation in βAPP (βAPPsw) erhöht die Affinität der β-Sekretase zu ihrem Substrat und es entsteht vermehrt Aβ-Peptid (Cai et al., 1993;Citron et al., 1992;Vassar et al., 1999). Mutationen im Bereich der α-Sekretase-Schnittstelle verändern vermutlich die Tertiärstruktur und reduzieren die Prozessierung durch die α-Sekretase(Hendriks et al., 1992;Levy et al., 1990), dadurch kommt es zu einer verstärkten Prozessierung durch β-Sekretase und es entstehen erhöhte Mengen des Aβ-Peptids (Vassar, 2002).

Der α-Sekretase-Schnitt

α-Sekretasen schneiden βAPP innerhalb der Aβ-Domäne zwischen AS-Position 16 und 17 des Aβ-Peptids und verhindern so die Bildung von Aβ-Peptid (Esch et al., 1990;Sisodia, 1992). Die Prozessierung von βAPP durch die α-Sekretase findet im sekretorischen Transportweg vom trans-Golgi-Netzwerk (TGN) zur oder an der Plasmamembran statt (Chyung und Selkoe, 2003;Haass et al., 1992;Sisodia, 1992). α-Sekretasen sind in der Regel konstitutiv aktiv, der αSekretase Prozessierungsweg wird aber unter anderem durch Phorbolester (PDBu, TPA), cholinerge Agonisten und andere Neurotransmitter sowie epidermale und muscarine Wachstumsfaktoren stimuliert (Buxbaum et al., 1992;Nitsch et al., 1992). Die Stimulierung der α-Sekretase erfolgt über Proteinkinase C (PKC), Tyrosinkinasen, mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPKs) und signal-induzierte Kinasen (Mills und Reiner, 1999). Eine verstärkte α-Sekretase Prozessierung des βAPP erfolgt zu Lasten des β-Sekretase Prozessierungswegs und führt deshalb zu einer verminderten Aβ-Peptid Produktion (Buxbaum et al., 1993;Gandy et al., 1993;Hung et al., 1993;Postina et al., 2004).

α-Sekretasen katalysieren die Spaltung ihrer Substrate offenbar unabhängig von einer AS-Konsensussequenz, sie spalten vielmehr in Distanz von 12-13 AS zur Membran. Eine weitere Voraussetzung für die Spaltung eines Substrates durch α-Sekretasen ist eine α-helikale Konformation des Substrates im Bereich der Spaltstelle (De Strooper et al., 1993;Sisodia, 1992).

Bisher identifizierte Enzyme, die die charakteristischen Eigenschaften einer α-Sekretase aufweisen, sind Vertreter der ADAM (a disintegrin and metalloprotease)-Familie. Es handelt sich hierbei um Typ I Membranproteine mit einer multi-Domänen Struktur, die zumeist N-terminal ein Signalpeptid und ein Propeptid enthalten; die folgende katalytische Domäne enthält ein Zink-Bindungsmotiv, es folgen eine Cystein-reiche-, eine Disintegrin-, eine EGF-ähnliche-Domäne, dann die Transmembrandomäne und eine kurze cytoplasmatische Domäne. Für zwei Enzyme der ADAM-Familie, ADAM10 (Lammich et al., 1999) und ADAM17 (auch TACE - tumor necrosis factor-α (TNFα)-converting enzyme) (Buxbaum et al., 1998), konnte und eine α-Sekretase Aktivität nachgewiesen werden. Auch für eine weitere Metalloprotease, ADAM9, wurde α-Sekretase Aktivität gezeigt (Koike et al., 1999), allerdings schneidet ADAM9 zwischen AS-Position 14 und 15 des Aβ-Peptids. In neuronalen Primärkulturen wurden l-βAPP-Spezies, deren C-Terminus mit der ADAM9 Schnittstelle übereinstimmt, nachgewiesen (Simons et al., 1996).

TACE (ADAM17) wurde als Protease identifiziert, die TNFα vom membrangebundenen Vorläuferprotein freisetzt (Black et al., 1997;Moss et al., 1997). Die Inhibition oder der „Knock-out“ von TACE bewirken eine verminderte α-Sekretase Prozessierung von βAPP, die nicht mehr durch Phorbolester stimulierbar ist (Buxbaum et al., 1998). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass ein spezifischer TACE-Inhibitor die stimulierbare, aber nicht die konstitutive αSekretase Aktivität in Neuronen blockiert (Blacker et al., 2002). Kinetische Untersuchungen für TACE ergaben eine deutlich höhere Substrataffinität zu TNFα als zu βAPP (Mohan et al., 2002). Obwohl TACE in Neuronen des Hippocampus und Cortex exprimiert wird (Skovronsky et al., 2001), kann während der Mausentwicklung keine Überlappung der βAPP- und TACE-Expression nachgewiesen werden (Marcinkiewicz und Seidah, 2000). TACE „knock-out“ Mäuse sterben aufgrund gestörter Signalkaskaden zwischen Tag 17,5 des embryonalen Stadiums und Tag 17 nach der Geburt (Peschon et al., 1998).

ADAM10 wurde zunächst als Myelin degradierendes Enzym detektiert (Chantry et al., 1989), später konnte eine Rolle in der neuronalen Differenzierung, u. a. durch Prozessierung des Notch-Rezeptors, gezeigt werden (Allinson et al., 2003), bis Lammich und Kollegen eine αSekretase Aktivität für ADAM10 nachweisen konnten (Lammich et al., 1999). Überexpression von ADAM10 erhöht die basale und die Phorbolester induzierbare α-Sekretase Aktivität (Lammich et al., 1999;Lopez-Perez et al., 2001), damit unterscheiden sich TACE und ADAM10 in ihrem Einfluss auf die basale Aktivität, aber nicht in ihrer Induzierbarkeit. Im Gegensatz zu TACE zeigen Hybridisationen für ADAM10- und βAPP-Koexpression während der Mausentwicklung (Marcinkiewicz und Seidah, 2000). Mäuse, die ADAM10 defizient sind, sterben pränatal aufgrund gestörter Notch-Signaltransduktion (Hartmann et al., 2002). Isolierte Fibroblasten dieser Mäuse zeigen α-Sekretase Prozessierung von βAPP, jedoch mit erheblichen, klonalen Unterschieden (Hartmann et al., 2002). Damit ist gezeigt, dass ADAM10 nicht die einzige α-Sekretase ist. Vermutlich verhalten sich die drei ADAM-Proteasen bezüglich der α-Prozessierung von βAPP redundant (Allinson et al., 2003). Die Überexpression von ADAM10 in Mäusen führt zu einer erhöhten α-Sekretase Prozessierung von βAPP (Postina et al., 2004). Wird diese Maus mit einer βAPP transgenen Maus (Alzheimer-Maus) gekreuzt, kommt es kaum noch zur Entstehung von Amyloid-Plaques (Postina et al., 2004).

Aufgrund dieses Zusammenhangs wird die Stimulierung der α-Sekretase Aktivität als möglicher therapeutischer Ansatz für die Behandlung der Alzheimer Krankheit betrachtet (Lichtenthaler und Haass, 2004). Die geringen Substratspezifitäten der α-Sekretasen könnten sich jedoch als problematisch herausstellen (Allinson et al., 2003). So katalysieren ADAM9, ADAM10 und TACE auch die Ektodomänenabspaltung anderer Typ I Transmembranproteine, wie z.B. TNFα, Notch-Rezeptoren, p75 TNFα-Rezeptor, L-Selectin usw. (Seals und Courtneidge, 2003).

Der β-Sekretase-Schnitt

Die β-Sekretase BACE (β-site APP cleaving enzyme), auch als Asp-2 oder Memapsin2 bezeichnet, wurde zeitgleich durch verschiedene Arbeitsgruppen mit Hilfe von Datenbankanalyse, Expressionsklonierung oder durch Enzymaufreinigung und Sequenzierung identifiziert (Hussain et al., 1999;Lin et al., 2000;Sinha et al., 1999;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999). BACE ist ein Typ I Transmembranprotein mit großer Ektodomäne, die ein Signalpeptid (AS 1-21) und ein Propeptid (AS 22-45) enthält, und einer kurzen cytoplasmatischen Domäne (Abbildung 7) (Hussain et al., 1999;Lin et al., 2000;Sinha et al., 1999;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999). Die Ektodomäne enthält zwei charakteristische Amiosäuremotive, DTGS (AS 93-96) und DSGT (AS 289–292), die dem katalytischen Zentrum einer Aspartylprotease entsprechen (Abbildung 7) (Hussain et al., 1999;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999). Die Mutation eines dieser beiden in der Evolution hoch konservierten Motive verhindert die Proteaseaktivität vollständig (Bennett et al., 2000;Hussain et al., 1999). BACE ist damit die erste bekannte Aspartylprotease, die dem Pepsin ähnlich ist und über eine Transmembrandomäne verfügt (1.4). Des Weitern finden sich in der Ektodomäne von BACE vier mögliche N-Glycosylierungsstellen sowie sechs Cysteinreste, die drei intramolekulare Disulfidbrücken ausbilden können (Sinha et al., 1999;Vassar et al., 1999).

Abbildung 7: Schema der BACE-Protease Dargestellt ist eine Schemazeichnung der BACE-Protease. Die zelluläre Membran wird durch einen grauen Kasten symbolisiert und die potentielle Lage der BACE-Membrandomäne ist angegeben. Gekennzeichnet sind das Signalpeptid (Sp, schwarz), das potenielle Propeptid (Pp, weiß) und die beiden kritischen Aspartylmotive.

BACE besitzt alle Eigenschaften der β-Sekretase, die bereits vor der Klonierung anhand der Proteolyseprodukte und der Proteolysebedingungen des βAPP gut untersucht waren. βSekretase Aktivität konnte in allen Zell- und Gewebetypen nachgewiesen werden (Haass et al., 1992;Seubert et al., 1993;Shoji et al., 1992). Die höchste Aktivität ist jedoch in neuronalen Zellen und Geweben nachweisbar (Haass et al., 1992;Seubert et al., 1993). BACE ist ubiquitär exprimiert, mit einer besonders hohen Expression im Hirn (Lin et al., 2000;Vassar et al., 1999). β-Sekretase Aktivität konnte in leicht sauren Kompartimenten der Zelle, wie in TGN und Endosomen nachgewiesen werden (Haass et al., 1995;Haass et al., 1992;Knops et al., 1995;Koo und Squazzo, 1994;Perez et al., 1999;Thinakaran et al., 1996). BACE ist genau in diesen Kompartimenten, dem TGN und dem endosomalen System lokalisiert worden (Huse et al., 2000;Hussain et al., 1999;Vassar et al., 1999). Im Gegensatz zur α-Sekretase ist die βSekretase durch eine Sequenzspezifität gekennzeichnet (Citron et al., 1995). Die Substitution von Met, an Position P1 der β-Sekretase-Schnittstelle, zu einer AS mit großem hydrophoben Rest, wie z.B. Leu (vgl. schwedischen Mutante) erhöht die Affinität der β-Sekretase zu ihrem Substrat dem βAPP. Umgekehrt bedingt die Einführung kleiner hydrophober Reste, wie z.B. Val, eine Verringerung der Affinität bzw. eine Inhibition der Spaltung (Citron et al., 1995). Aufgrund des AS-Austauschs an den Positionen P1 und P2 der Schnittstelle (KM♢NL) schneidet aufgereinigtes BACE synthetisches Peptidsubstrat mit der βAPPsw-Sequenz mit einer deutlich höheren Affinität als Substrat mit der βAPPwt-Sequenz. (Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999). Neben der Aβ-Spezies beginnend mit Asp1 wird auch die Entstehung einer weiteren dominanten Aβ-Spezies, beginnend mit Glu11 (Gouras et al., 1998;Haass et al., 1992), durch BACE katalysiert (Vassar et al., 1999).

BACE „knock-out“ Mäuse, zeigen in Gegenwartvon humanem βAPP keine nachweisbare Synthese von Aβ in Neuronen (Cai et al., 2001;Luo et al., 2001;Roberds et al., 2001). Es muss deshalb davon ausgegangen werden, dass BACE wahrscheinlich die einzige β-Sekretase in Neuronen ist (Vassar, 2002). Die Relevanz von BACE für die Alzheimer Krankheit wird dadurch bestätigt, dass bei „late-onset“ Patienten die BACE Aktivität im Hirn signifikant erhöht ist (Fukumoto et al., 2002;Holsinger et al., 2002;Yang et al., 2003). Über die physiologische Funktion von BACE ist wenig bekannt, die BACE „knock-out“ Maus zeigt keinen offensichtlichen Phänotyp (Cai et al., 2001;Luo et al., 2001;Roberds et al., 2001). Bisher sind vier weitere Substrate, die Sialyl-Transferase ST6Gal1 (Kitazume et al., 2001) und der P-Selectin Glycoprotein Ligand-1 (Lichtenthaler et al., 2003) und die APP homologen APLP-1 und APLP2 (Li und Sudhof, 2004;Pastorino et al., 2004) bekannt.

Neben BACE ist eine zweite membrangebundene Aspartylprotease, BACE2, identifiziert worden (Lin et al., 2000;Saunders et al., 1999;Solans et al., 2000;Yan et al., 1999;Yang et al., 1998). Die AS-Sequenzen von BACE und BACE2 sind zu 64 % homolog und die beschriebenen strukturellen Eigenschaften sind identisch (Vassar, 2002). BACE2 wird im Gegensatz zu BACE verstärkt in peripherem Gewebe exprimiert und kaum in neuronalem Gewebe (Bennett et al., 2000;Vassar et al., 1999). BACE2 zeigt keine β-Sekretase Aktivität, sondern prozessiert βAPP an alternativen Schnittstellen (Farzan et al., 2000;Fluhrer et al., 2002;Yan et al., 2001).

Die beiden Homologe BACE und BACE2 definieren aufgrund ihrer Membranverankerung und der geringen Homologie zu anderen Aspartylproteasen der Pepsin-Familie eine völlig neue Klasse von Aspartylproteasen (1.4), die nicht durch bekannte Inhibitoren der Aspartylproteasen gehemmt wird (Citron et al., 1996).

Der γ-Sekretase-Schnitt

Die γ-Sekretase prozessiert die proteolytische Spaltung der durch die α- und β-Sekretase entstehenden βAPP-CTF (1.3.2). Damit ist der γ-Sekretase-Schnitt der zweite notwendige Schnitt für die Entstehung von Aβ-Peptid. γ-Sekretase kann an verschiedenen Positionen schneiden, so dass Aβ-Peptide unterschiedlicher Länge gebildet werden. Die häufigste Spezies endet mit der 40igsten AS von Aβ (Aβ₄₀), die um 2 AS verlängerten Aβ₄₂-Spezies entsteht nur zu 5-10 %. Trotz der niedrigen Produktion scheint Aβ₄₂ die pathogene, amyloidogene Spezies zu sein, es ist die Hauptkomponente der Amyloid-Plaques und die in genetisch bedingten, „early-onset“ FAD-Fällen erhöht produzierte Spezies (1.1 / 1.3) (Selkoe, 1999). Auffällig ist, dass die Spaltung von βAPP durch die γ-Sekretase, nicht wie für Proteasen üblich, in wässriger Umgebung erfolgt, sondern innerhalb der Transmembrandomäne des Substrats (Wolfe et al., 1999). Die Einführung von Mutationen hat gezeigt, dass der γ-Sekretase-Schnitt nicht sequenzspezifisch ist, sondern eine Vielzahl von Typ I Transmembranproteinen mit kurzer Ektodomäne von der γ-Sekretase prozessiert werden können (Struhl und Adachi, 2000). Für die Position des γ-Sekretase-Schnitts sind dabei offenbar Länge und Struktur der Transmembrandomäne entscheidender als die genaue Aminosäuresequenz (Esler und Wolfe, 2001;Lichtenthaler et al., 2002). So konnten, wie erwartet, weitere Substrate der γ-Sekretase identifiziert werden. Hierzu gehören die βAPP homologen APLP (Walsh et al., 2003), die Notch-Rezeptoren 1-4 (De Strooper et al., 1999;Saxena et al., 2001) und die Notch-Liganden Delta und Jagged (LaVoie und Selkoe, 2003;Six et al., 2003), die Rezeptor-Tyrosin-Kinase ErbB-4 (Lee et al., 2002;Ni et al., 2001), E- und N-Cadherin (Marambaud et al., 2002;Marambaud et al., 2003), der LDL-Rezeptor (May et al., 2002), CD44 (Lammich et al., 2002;Okamoto et al., 2002) und Nectin1α (Kim et al., 2002;Kopan und Ilagan, 2004).

Durch die γ-Sekretase Spaltung der βAPP-CTF entsteht, neben der Aβ- bzw. p3-Spezies, auch ein lösliches cytosolisches Fragment des βAPP, das AICD (1.3.2 und Abbildung 5). Interessanterweise korrespondiert der N-Terminus des AICD nicht mit dem C-Terminus des p3/Aβ-Peptids, sondern beginnt ca. 10 AS C-terminaler in der βAPP-Sequenz, womit ein weiterer γ-Sekretase-Schnitt im C-terminalen Bereich der βAPP-Transmembrandomäne vorliegen muss (Sastre et al., 2001;Weidemann et al., 2002;Yu et al., 2001), der die Freisetzung des AICD bewirkt. Dieses Phänomen des doppelten γ-Sekretase-Schnitts konnte auch für andere Substrate gezeigt werden (Okochi et al., 2002). Ferner wurde für einige Substrate der γSekretase, wie für Notch (Selkoe und Kopan, 2003) und N-Cadherin (Marambaud et al., 2003), nachgewiesen, dass die freigesetzte intrazelluläre Domäne eine Funktion in der nuklearen Signaltransduktion hat und die Transkription von Zielgenen reguliert (Haass, 2004;Kopan und Ilagan, 2004). Der Notch-Signaltransduktionsweg ist im Laufe der Evolution hoch konserviert geblieben und spielt unter anderem in der Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle bei der Zelldifferenzierung (Mumm und Kopan, 2000). Aber auch im erwachsenen Menschen erfüllt die Notch-Signaltransduktion noch wichtige Funktionen, z.B. bei der Differenzierung der T-Lymphozyten (Hadland et al., 2001).

Bei der katalytisch aktiven γ-Sekretase handelt es sich nicht um ein einziges Protein, sondern um einen hochmolekularen Proteinkomplex, bestehend aus einer katalytischen Untereinheit und drei weiteren Kofaktoren, Nicastrin (Edbauer et al., 2002;Kopan und Goate, 2002;Lai, 2002;Yu et al., 2000), PEN-2 (presenilin enhancer protein 2) (Francis et al., 2002;Luo et al., 2003;Steiner et al., 2002) und APH-1 (anterior pharynx defective 1) (Francis et al., 2002;Goutte et al., 2002;Lee et al., 2002;Luo et al., 2003).

Die katalytische Untereinheit der γ-Sekretase ist das Presenilin 1 (PS1) oder das Presenilin 2 (PS2). PS1 und PS2 wurden aufgrund von genetischen Untersuchungen mit der Alzheimer Krankheit in Verbindung gebracht, da zahlreiche FAD-Mutationen auf dem PS1 Gen (Abbildung 8) und zu einem geringeren Anteil auf dem PS2 Gen lokalisiert wurden (1.1) (Levy-Lahad et al., 1995;Levy-Lahad et al., 1995;Rogaev et al., 1995;Sherrington et al., 1995). Alle untersuchten FAD-Mutationen innerhalb der PS-Gene erhöhen die Bildung des Aβ₄₂-Peptids (1.3)(Haass und Steiner, 2002;Hardy, 1997).

Abbildung 8: Struktur von PS1 und Lokalisation der FAD-Mutationen Die Abbildung veranschaulicht die Struktur der PS. Gezeigt ist das gängigste Topologiemodell, mit 8 Transmembrandomänen. Die Pfeile kennzeichnen Bereiche gehäufter FAD-Mutationen. Einige der FAD-assoziierten Mutationen sind angegeben. TM: Transmembrandomäne; HL: Hydrophiler Loop. [Quelle: http://molgen-www.uia.ac.be/ADMutations]

PS1 und PS2 sind homologe, polytope Transmembranproteine (Levy-Lahad et al., 1995;Sherrington et al., 1995). Die meisten Strukturmodelle favorisieren ein acht Transmembrandomänen Modell mit cytoplasmatischer Orientierung von N- und C-Terminus (De Strooper et al., 1997;Doan et al., 1996;Haass, 2004;Li und Greenwald, 1998). Zwischen Transmembrandomäne 6 und 7 ist ein relativ großer, cytoplasmatisch orientierter AS-Loop, innerhalb dieses Loops wird das Holoprotein endoproteolytisch gespalten. Die daraus resultierenden N- und C-terminalen Fragmente assoziieren zu einem Heterodimer und stellen die in der Zelle stabilisierte Form der PS dar (Capell et al., 1998;Ratovitski et al., 1997;Thinakaran et al., 1996;Thinakaran et al., 1997). Die PS-Heterodimere konnten in hochmolekularen Komplexen nachgewiesen werden (Capell et al., 1998;Yu et al., 1998). Die Integration von PS in einem Proteinkomplex erklärt, dass eine Überexpression von PS alleine nicht zu einer Erhöhung der Heterodimere, sondern nur zur Akkumulation des instabilen Holoproteins führt, und gleichzeitig zu einer Verdrängung des endogenen PS, einem Phänomen, das als „Replacement“ bezeichnet wird. Es konnte auch kein Anstieg an γ-Sekretase Aktivität durch Überexpression von PS beobachtet werden. (Capell et al., 1998;Thinakaran et al., 1997). Erst die Überexpression aller Komplexkomponenten führt zur gesteigerten Formierung aktiver γ-Sekretase Komplexe(Kimberly et al., 2003;Takasugi et al., 2003).

Es gab zahlreiche Hinweise auf die Beteiligung von PS an der γ-Sekretase Aktivität. Neuronen von PS1 „knock-out“ Mäusen zeigten eine stark reduzierte Aβ-Produktion und eine Akkumulation von βAPP-CTF (De Strooper et al., 1998;Naruse et al., 1998). In Zellen von PS1 und PS2 defizienten Mäusen war keine Aβ-Produktion nachweisbar (Herreman et al., 2000;Zhang et al., 2000). Ferner führte die Mutagenese einer der beiden hoch konservierten Aspartylreste in Transmembrandomäne 6 und 7 zu einer stark reduzierten Aβ-Bildung und der Akkumulation der βAPP-CTF (Kimberly et al., 2000;Steiner et al., 1999;Wolfe et al., 1999). Auffällig war, dass auch die Endoproteolyse von PS blockiert war und es zur Akkumulation des Holoproteins kam (1.4) (Kimberly et al., 2000Li, 2000 ;Wolfe et al., 1999). Darüber hinaus zeigten Immunopräzipitate von PS, unter Komplex erhaltenden Bedingungen, γ-Sekretase Aktivität (Li et al., 2000;Xia et al., 2000) und es konnten spezifische Inhibitoren, gerichtet gegen das aktive Zentrum der γ-Sekretase, an PS-Heterodimere binden (Esler et al., 2000;Li et al., 2000;Shearman et al., 2000).

Der Aspartylrest in Transmembrandomäne 7 von PS1/2 liegt innerhalb eines im Laufe der Evolution hoch konservierten Motivs, dem GXGD-Motiv (Haass und Steiner, 2002), das für eine klassische Aspartylprotease zwar untypisch ist, aber in anderen polytopen Aspartylproteasen, wie z.B. den Typ 4 Prepilin-Peptidasen (TFPPs) in Prokaryonten (LaPointe und Taylor, 2000), oder den Signalpeptid Peptidasen (SPPs) und den signalpeptid-ähnlichen Peptidasen (SPPL, signal peptide peptidases like) in höheren Lebewesen (Ponting et al., 2002;Weihofen et al., 2002), hoch konserviert ist. Damit wurde, wie bei der β-Sekretase (1.3.2.2) auch mit der γSekretase eine besondere Form von Aspartylproteasen identifiziert. Zeitgleich zu dieser Aspartylprotease-Familie wurden andere Proteasefamilien, die Metalloprotease S2P- und die Rhomboid-Familie, identifiziert, die ebenfalls zur regulierten Intermembran-Proteolyse (RIP) in der Lage sind (Kopan und Ilagan, 2004;Weihofen und Martoglio, 2003). Die RIP kann durch Freisetzung cytoplasmatischer Fragmente eine generelle Rolle in der Signal Transduktion spielen oder einfach dem Abbau von Transmembrandomänen dienen (Ebinu und Yankner, 2002;Weihofen und Martoglio, 2003;Xia und Wolfe, 2003).

Für γ-Sekretase Aktivität sind neben dem PS als katalytische Untereinheit drei weitere Komponenten notwendig (Francis et al., 2002) und ausreichend (Edbauer et al., 2003;Fraering et al., 2004;Hayashi et al., 2004;Kimberly et al., 2003;Periz und Fortini, 2004). Eine weitere γ-Sekretase Komponente, Nicastrin, wurde durch biochemische Aufreinigung des Komplexes identifiziert. Nicastrin ist ein glycosyliertes Typ I Transmembranprotein (Yu et al., 2000). Die zwei Komponenten APH-1 und PEN-2 wurden in genetischen Analysen gefunden, bei diesen beiden Proteinen handelt es sich um polytopische Transmembranproteine (De Strooper, 2003;Francis et al., 2002;Goutte, 2002). Die einzelnen Komplexkomponenten beeinflussen sich gegenseitig in ihrer zellulären Expression, überexprimierte Einzelkomponenten sind nicht stabil (PEN-2, PS) oder maturieren nicht, wie im Falle von Nicastrin (De Strooper, 2003). Die Komplexbildung und die Funktionen der einzelnen Komponenten sind noch weitgehend ungeklärt. Es konnte ein Präkomplex, bestehend aus AHP-1 und Nicastrin gezeigt werden, die vermutlich über die Nicastrin Transmembrandomäne interagieren (Capell et al., 2003;LaVoie et al., 2003;Morais et al., 2003). PEN-2 spielt möglicherweise eine Rolle für die Endoproteolyse von PS, da die Abwesenheit von PEN-2 das PS-Holoprotein stabilisiert (Hu und Fortini, 2003;Laemmli, 1970;Luo et al., 2003;Prokop et al., 2004;Takasugi et al., 2003).

Wahrscheinlich sind mit den vier beschriebenen Komponenten alle Bestandteile des γSekretase Komplexes identifiziert, und die PS bilden das proteolytische Zentrum der γSekretase (Haass, 2004).

Abbildung 9: Schematische Darstellung des γ-Sekretase Komplexes Gezeigt sind die Modellzeichnungen der einzelnen Proteine des γ-Sekretase Komplexes und ihre Orientierung in der zellulären Membran (grauer Kasten). Die Position der Aspartate im vermuteten katalytischen Zentrum der γ-Sekretase sind angegeben (D). [Quelle: (Haass und Steiner, 2002)].

Aspartylproteasen

Aspartylproteasen spielen im Rahmen der Alzheimer Krankheit für die Aβ-Peptid Entstehung eine entscheidende Rolle. Deshalb werden im Folgenden die wichtigsten Charakteristika dieser Proteaseklasse beschrieben. Die Aspartylproteasen sind eine weit verbreitete Proteaseklasse, die in einer Vielzahl von Organismen, wie Säugetieren, Fischen, Retroviren, Pflanzen, Pilzen und Protozoen vorkommt. Wird die Sequenzabfolge -DT/(S)G- als Bedingung für Aspartylproteasen definiert, so unterscheidet man 8 Aspartylprotease-Familien, von denen die pepsin-ähnlichen mit 282 Mitgliedern und die retroviralen Proteasen mit 93 Mitgliedern die größten Familien darstellen (Dunn, 2002).

Zur Gruppe der retroviralen Proteasen gehören die HIV-Proteasen. Die virale Protease HIV-1 ist für die Replikation des menschlichen Immunschwächevirus (HIV, human immunodeficency virus) verantwortlich. Die HIV-1 Protease ist mit 11 kDa im Vergleich zu eukaryotischen Proteasen sehr klein und wird autokatalytisch aus einem Vorläuferprotein freigesetzt, das zusätzlich zur Protease weitere virale Proteine enthält. Strukturell ist auch die HIV-1 Protease, besonders in der Umgebung des aktiven Zentrums, dem Pepsin sehr ähnlich (Lapatto et al., 1989;Mager, 2001;Seelmeier et al., 1988). Eine detaillierte Klassifizierung der Aspartylprotease ist auf der „homepage“ zu finden. zu finden.

BACE und BACE2 gehören zu den pepsin-ähnlichen Proteasen, der am besten charakterisierten Familie (Abbildung 10) (Hong et al., 2000). Alle Vertreter dieser Familie, wie auch BACE, besitzen im katalytisch aktiven Zentrum zwei hoch konservierte Aspartylmotive der Sequenz -DT/SG- und schneiden vorzugsweise zwischen hydrophoben AS. BACE und BACE2 unterscheiden sich durch ihre Membranverankerung von den anderen pepsin-ähnlichen Proteasen. Auch das Disulfidbrückenmuster von BACE und BACE2 ist untypisch für pepsin-ähnliche Proteasen. Normalerweise werden in pepsin-ähnlichen Proteasen Disulfidbrücken zwischen benachbarten Cysteinen ausgebildet, bei BACE liegen bis zu 200 AS zwischen den Disulfidbrücken ausbildenden Cysteinen (C216-C420, C278-C443, C330-C380).

Abbildung 10: Evolutionäre Verwandtschaft von BACE zu anderen Aspartylproteasen BACE und BACE2 bilden eine neue Familie membrangebundener Aspartylproteasen, mit größter Homologie zu der Pepsin Familie und entfernter Verwandtschaft zu den retroviralen Aspartylproteasen [Quelle: (Citron, 2004)]

Proteasen, auch pepsin-ähnliche Aspartylproteasen werden in der Regel in Form einer proteolytisch inaktiven Vorstufe, dem sog. Zymogen oder Proenzym, synthetisiert. Die Aktivierung des Enzyms erfolgt meist durch Abspaltung eines Propeptids am N-Terminus des Enzyms. Diese erfolgt entweder durch intra- oder intermolekulare Autokatalyse oder aber mittels proteolytischer Spaltung durch andere Proteasen.

Pepsinogen, die inaktive Vorstufe des Pepsins, wird beispielsweise bei niedrigem pH-Wert durch intramolekulare Abspaltung des Propeptids aktiviert. Das Propeptid selbst, dessen Sekundärstruktur aus einem β-Faltblatt und drei α-Helizes besteht, interagiert im Falle des Pepsinogens direkt mit dem katalytisch aktiven Zentrum und verhindert somit die Ausbildung eines Enzym-Substrat-Komplexes (Koelsch et al., 1994;Sielecki et al., 1990).

Neben der Regulation der Enzymaktivität erfüllen Propeptide häufig wichtige Funktionen im Zusammenhang mit der korrekten Faltung des Proteins und mit dem Transport in entsprechende Zielkompartimente (Baxter et al., 1991;Harrison et al., 1989;Norman et al., 1992). Für BACE wurde die mögliche Existenz eines kurzen Propeptids postuliert (Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999).

Die räumliche Struktur der pepsin-ähnlichen Proteasen besteht aus einer wechselnden Abfolge von α-Helizes und β-Faltblattstrukturen, die innerhalb der Familien unterschiedlich stark konserviert ist und die endgültige Gesamtstruktur des Proteins bestimmt. N- und C-terminale Domäne verhalten sich dabei meist spiegelbildlich (Dunn, 2002).

In unmittelbarer Nachbarschaft zum aktiven Zentrum befindet sich die Deckelregion („flap-region“), eine nahezu ausschließlich aus β-Faltblattstrukturen bestehenden Domäne, die meist von Glycinresten umrahmt wird und somit beweglich ist. Die „flap-region“ schließt nach Substratbindung und öffnet sich nach erfolgter Katalyse. Das Substrat selbst interagiert dabei häufig über Wasserstoffbrückenbindungen mit der Deckelregion. Wird die Bewegungsfreiheit der „flap-region“ durch bindende Komponenten eingeengt, kommt es in der Regel zur Inhibition der Enzymaktivität (Andreeva et al., 1995;Okoniewska et al., 1999;Okoniewska et al., 2000).

Für die katalytische Aktivität der Aspartylproteasen muss eine der beiden Carboxylgruppen in undissoziierter Form und die andere in ionisierter Form vorliegen. Nachfolgend ist der für die Katalyse postulierte Mechanismus beschrieben.

Abbildung 11: Mechanismus der Peptidspaltung durch Aspartylproteasen Zunächst bindet das freie Enzym an sein Substrat (1). Es entsteht ein Enzym-Substrat-Komplex (ES). (2) Durch Schließen der Deckelregion wird der ES-Komplex neu arrangiert (E`S). (3) Die Katalyse beginnt mit der Entfernung eines Protons vom gebundenen H₂O und der Stimulierung des Carbonylrestes (F`T). (4) Es folgt ein Proton-Transfer zum Stickstoff der Peptidbindung (G`Z). (5) Die Peptidbindung wird getrennt, (6) die Deckelregion öffnet sich (FPQ) und (7) die Produkte werden freigesetzt (F). (8) Ein Proton wird abgegeben (G) und (9) eine neue Wasserstoffbrückenbindung zum H₂O ausgebildet (E). [Quelle: (Dunn, 2002)]

Die beiden Aspartylreste im aktiven Zentrum der Protease aktivieren einerseits das für die Spaltung der Peptidbindung nötige Wassermolekül und agieren zum anderen als Protonenakzeptoren und -donatoren. Auf diese Weise wird die für den Ablauf der chemischen Reaktion benötigte Aktivierungsenergie herabgesetzt und der energiereiche Übergangszustand stabilisiert.

Fast alle Aspartylproteasen werden durch Pepstatin, ein Peptidgemisch aus verschiedenen Streptomyceten, sehr effizient gehemmt. Pepstatin fungiert dabei aufgrund einer tetraedrischen Hydroxymethylengruppe als Übergangszustandsanalogon (Bott et al., 1982;James et al., 1982;Rich et al., 1985). Darüber hinaus sind zahlreiche weitere Protein- und Peptidinhibitoren bekannt, die bestimmte Aspartylproteasen teilweise hochspezifisch inhibieren. Die Inhibition erfolgt in diesem Fall beispielsweise durch die Ausbildung charakteristischer Sekundärstrukturen, die das aktive Zentrum räumlich blockieren (Fraser et al., 1992;Li et al., 2000;Phylip et al., 2001), oder durch zum substratähnliche Peptide, die an das katalytische Zentrum binden, aber durch Einführung von Statinen nicht gespalten werden können (Bursavich et al., 2001). Durch Wechselwirkung des Inhibitors mit Domänen, die dem aktiven Zentrum benachbart sind, die aber innerhalb der Familien weniger gut konserviert sind, wird die Spezifität weiter erhöht (Ng et al., 2000). So wird die Kreuzreaktivität mit anderen homologen Proteasen reduziert.

Neben BACE handelt sich auch bei PS, der anderen an der Aβ-Peptid Freisetzung beteiligten Protease im weiteren Sinne um eine Aspartyprotease. PS besitzen nicht die typische Sequenz -DT/(S)G- und auch nicht die charakteristische Struktur von Aspartylproteasen. Trotzdem bilden vermutlich zwei Aspartylreste in hoch konservierten Membranstrukturen, von denen ein Aspartylrest in das Sequenzmotiv -GXGD- eingebettet ist, das katalytische Zentrum; X steht hierbei für eine beliebige, vorzugsweise hydrophobe Aminosäure, (1.3.2.3) (Steiner et al., 2000;Wolfe et al., 1999).

Damit wird eine völlig neuartige Gruppe polytopischer transmembrangebundener Aspartylproteasen durch Presenilin und presenilin-ähnliche Enzyme definiert. Die beiden kritischen Aspartylreste befinden sich innerhalb oder am Rande zweier unabhängiger Transmembrandomänen und katalysieren die Spaltung membrangebundener Proteine innerhalb ihrer Transmembrandomäne (1.3.2.3) (Weihofen und Martoglio, 2003). Die beiden wichtigsten Vertreter dieser Gruppe sind die Preseniline (Haass und Steiner, 2002) und die Signalpeptid Peptidasen (Weihofen et al., 2002).

Die Rolle des intrazellulären Transports in der Alzheimer Krankheit

In der Alzheimer Krankheit kommt es ausschließlich in dem an polarisierten Zellen angrenzenden extrazellulären Raum zur Bildung von Amyloid-Plaques. Aβ-Peptid Ablagerungen entstehen an Neuriten und zerebralen Blutgefäßen, damit an polarisierten Neuronen oder Endothelzellen. Dies und die Tatsache, dass βAPP polarisiert transportiert wird (De Strooper et al., 1995;Haass et al., 1995;Haass et al., 1994;Lo et al., 1994;Tienari et al., 1996;Yamazaki et al., 1996;Yamazaki et al., 1995), könnte ein Hinweis darauf sein, dass polarisierte Transportmechanismen eine Rolle in der Produktion und Ablagerung von Aβ-Peptid spielen.

Polarisierter Transport in MDCK Zellen

Ein Modelsystem zur Untersuchung von polarisierten Transportmechanismen sind die Madin- Darby canine Nierenzellen (MDCK). MDCK Zellen sind Epithelzellen, die ein vollständig polarisiertes Epithel ausbilden, wenn sie in Filterkammern wachsen und dadurch apikal und basal Zugang zu Nährmedium haben. Polarisierung bedeutet für die MDCK Zelle, dass sich die apikale Membran von der basolateralen Membran in ihrer Funktion und Zusammensetzung unterscheidet. Membranproteine, sekretorische Proteine und Lipide werden gerichtet zur jeweiligen Membran transportiert und die verschiedenen Membransysteme sind voneinander getrennt. In MDCK Zellen trennen „tight junctions“ die apikale, zum Lumen gerichtete Oberfläche von der basolateralen, zu anderen Zellen und zur extrazellulären Matrix Kontakt herstellenden Membran (Abbildung 12).

Abbildung 12: MDCK Zellmonolayer in einer Transwell-Filterkammer

Die polarisierte Verteilung von apikalen und basolateralen Komponenten ist das Ergebnis von drei verschiedenen Mechanismen. Erstens, neu synthetisierte Proteine werden in das raue ER transloziert und über den Golgi-Apparat zum TGN transportiert. Im TGN werden sie durch spezifische Transportvesikel zur apikalen oder basolateralen Membran transportiert (Jacob und Naim, 2001;Kreitzer et al., 2003) Zweitens, Proteine werden spezifisch an einer Membran zurückgehalten und stabilisiert, dadurch bildet sich eine differenzielle Verteilung aus (Harris und Lim, 2001). Drittens, Proteine, die die Plasmamembran erreichen, werden direkt wieder aufgenommen, zu frühen Endosomen transportiert, von dort können sie zurück zur Oberfläche, zu späten Endosomen oder zur anderen, „gegenüber liegenden“ Oberfläche transportiert werden. Dieser Vorgang wird Transcytose genannt und spielt eine erhebliche Rolle für die polarisierte Verteilung von Proteinen. So können MDCK Zellen 50 % ihrer Zelloberfläche in einer Stunde endocytieren (Mostov et al., 2003).

Für den spezifischen polarisierten Transport von Proteinen sind Erkennungsmerkmale erforderlich. Basolateral sortierte Proteine haben meist als Signal ein kurzes Sequenzmotiv in ihrer cytoplasmatischen Domäne. Die Deletion dieses Motivs führt zu einer apikalen Fehlsortierung oder zur gleichmäßigen apikalen und basolateralen Sortierung. Die Adaptor-Proteine AP-1B und AP-4 binden an basolaterale Signale und regulieren den basolateralen Transport (Gan et al., 2002;Simmen et al., 2002).

Die apikalen Transportmechanismen sind weniger gut verstanden. Apikaler Transport kann durch Membransegmente bestimmter Lipidzusammensetzung, den „lipid rafts“, katalysiert werden (Fullekrug und Simons, 2004;Schuck und Simons, 2004;Verkade et al., 2000). „Lipid rafts“ entstehen im Golgi-Apparat und Vesikel, die einen hohen Anteil an „lipid rafts“ enthalten, werden apikal transportiert. Proteine, die aufgrund ihrer Transmembrandomäne oder eines Glycosylphosphatidylinositol-Lipidankers „raft“-assoziiert sind, werden überwiegend apikal transportiert. Es gibt jedoch auch „raft“-unabhängigen, apikalen Transport, der durch apikale Sortierungssignale reguliert wird. Die Glycosylierung ist häufig als apikales Signal beschrieben (Benting et al., 1999;Potter et al., 2004), aber auch in cytoplasmatischen und luminalen Domänen sind Signale für den apikalen Transport detektiert worden (Nelson und Yeaman, 2001).

Die Maschinerie für den polarisierten Transport ist von der Hefe bis zum Menschen konserviert (Mostov et al., 2003).

Polarisierter Transport von βAPP in MDCK Zellen

In MDCK Zellen wurde bereits der polarisierte Transport von βAPP untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das βAPP-Holoprotein basolateral transportiert wird (De Strooper et al., 1995;Haass et al., 1994;Lo et al., 1994). Das Sortierungssignal mit Tyr653 in der cytoplasmatischen Domäne von βAPP wurde identifiziert (Haass et al., 1995). Auch die Prozessierungsprodukte von βAPP, l-βAPP, p3- und Aβ-Peptid werden basolateral sezerniert (Abbildung 13) (Haass et al., 1995;Haass et al., 1994). Die Deletion des basolateralen Sortierungssignals (βAPPΔC) führt zu einer gleichmäßig apikalen und basolateralen Oberflächenverteilung des βAPP-Holoproteins und zu einem Anstieg der apikalen Sezernierung des Aβ-Peptids. Die durch die α-Sekretase geschnittene, lösliche Form l-βAAPα, wird jedoch weiterhin ausschließlich basolateral sezerniert (Abbildung 13) (Haass et al., 1994). Dieses Paradox, dass das Vorläuferprotein βAPPΔC nicht polarisiert transportiert wird, die Prozessierungsprodukte jedoch weiterhin polarisiert sezerniert werden, hat seinerzeit zu der Annahme geführt, dass in der l-βAPP-Domäne ein weiteres basolaterales Sortierungssignal lokalisiert ist (De Strooper et al., 1995;Haass et al., 1994;Lo et al., 1994). Wird βAPPsw, eine FAD-Mutante, die die Prozessierung von βAPP durch BACE erhöht (1.3.2), in MDCK Zellen exprimiert, kann eine apikale Sezernierung von l-βAPPβ festgestellt werden. Der überwiegende Anteil von l-βAPP und das Aβ-Peptid werden jedoch weiterhin basolateral sezerniert (De Strooper et al., 1995;Lo et al., 1994). Für βAPPsw konnte keine BACE-Prozessierung an der Zelloberfläche nachgewiesen werden (Lo et al., 1994), stattdessen konnte gezeigt werden, dass βAPPsw auf dem sekretorischen Transportweg von BACE geschnitten wird (Haass et al., 1995).

Abbildung 13: Polarisierte Sortierung von βAPP Die Oberflächenverteilung von βAPP (rot), βAPPsw (grün) und βAPPΔC (blau) und die Verteilung der entsprechenden Prozessierungsprodukte sind dargestellt.

Zielsetzung

Zu Beginn dieser Arbeit war die β-Sekretase, BACE, kloniert (Hussain et al., 1999;Sinha et al., 1999;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999). Aufgrund der Sequenzanalyse wurde angenommen, dass BACE ein Typ I Transmembranprotein mit Signalsequenz und Propeptid ist. BACE-Aktivität konnte in Membranpräparationen nachgewiesen werden (Sinha et al., 1999). Ferner ergab die AS-Sequenzanalyse für BACE vier potentielle N-Glycosylierungsstellen und sechs luminale Cysteinreste, die drei Disulfidbrücken ausbilden könnten (1.3.2.2).

In dieser Arbeit soll BACE zunächst hinsichtlich post-translationaler Modifizierungen und endoproteolytischer Maturierung experimentell charakterisiert werden. Ferner soll die subzelluläre Lokalisierung und der zelluläre Transport von BACE in Zusammenhang mit der Maturierung und der proteolytischen Aktivität untersucht werden. Es soll geklärt werden in welchen Zellkompartimenten die Protease BACE und das Substrat βAPP zusammen treffen. BACE stellt zusammen mit BACE2 eine völlig neuartige Gruppe von membrangebundenen Aspartylproteasen dar (1.3.2.2 / 1.4). Es soll daher untersucht werden inwieweit die Membrandomäne und die cytoplasmatische Domäne eine Bedeutung für die katalytische Aktivität sowie den zellulären Transport und die Lokalisierung von BACE haben. Damit wird die Relevanz dieser Domänen für die Aβ-Entstehung analysiert.

Darüber hinaus wird der Einfluss des Transports von BACE auf die Prozessierung von βAPP in einem polarisierten Zellsystem, den MDCK Zellen, untersucht. Da ADAM-Proteasen und BACE um das gleiche Substrat βAPP konkurrieren, soll untersucht werden, ob der Transport der Proteasen den Zugang zum Substrat und damit die Prozessierung des Substrats beeinflusst. Für βAPP wurde ein polarisierter, basolateraler Transport beschrieben (1.5.2) (Haass et al., 1994), ob aber die βAPP prozessierenden Proteasen polarisiert transportiert werden, ist unbekannt.

Zur weiteren Charakterisierung von BACE außerhalb des zellulären Systems soll ein Assay entwickelt werden. Dieser Assay kann auch zur Untersuchung von verschiedenen BACE-Konstrukten auf enzymatische Aktivität und zur Identifizierung von BACE-Inhibitoren eingesetzt werden. Dazu soll der Assay auch im „high-throughput“ Verfahren einsetzbar sein und industriell genutzt werden können. Eine Inhibition von BACE wird als viel versprechender, therapeutischer Ansatz für die Alzheimer Krankheit diskutiert (Citron, 2004;Vassar, 2002). Eine Inhibition von BACE würde genauso wie eine Inhibition der γ-Sekretase die Entstehung des Amyloid-Peptids, auch der Aβ₄₂-Spezies, verhindern. Im Gegensatz zur γ-Sekretase, für die eine Vielzahl von Substraten identifiziert wurde und die multiple, essentielle Funktionen in der Zelldifferenzierung, der embryonalen Entwicklung, der Signaltransduktion (1.3.2.3) (Haass, 2004) und dem Erinnerungsvermögen (Saura et al., 2004) übernimmt, konnten für BACE bisher keine essentiellen Funktionen nachgewiesen werden. BACE defiziente Maus sind fertil und zeigen keinen offensichtlichen Phänotyp (Cai et al., 2001;Luo et al., 2001;Roberds et al., 2001), damit lässt die Inhibition von BACE weniger Nebenwirkungen erwarten als die Inhibition der γ-Sekretase.