Eukaryotische Expressionsvektoren

Invitrogen

pcDNA3.1 Zeo+

pcDNA4/myc-His Zeo

Aufgeführt sind die für die PCR-Ansätze der verschiedenen cDNA-Konstrukte verwendeten Oligonukleotide, jeweilsvom m 5’- zum 3’-Ende, die Klonierungsvektoren und die zur Klonierung benutzten Restriktionsschnittstellen.

Tabelle 1: Oligonukleotide für die PCR

Aufgeführt sind alle im Rahmen dieser Arbeit verwendeten, genetisch veränderten Zelllinien. Angegeben ist der Name der jeweiligen Ursprungszelllinie, alle exogen exprimierten Proteine und die entsprechenden Resistenzen zur Selektion der Einzelzellklone. Für nicht selbst erstellte Zelllinien ist die entsprechende Referenz angegeben.

Name

Zelllinie

überexprimierte Proteine

Resistenz

Zitat

(für nicht selbst

hergestellte Linien)

β APPwt

HEK 293

βAPP₆₉₅wt

G 418

(Haass et al., 1992)

β APPsw

HEK 293

βAPP₆₉₅sw

G 418

(Citron et al., 1992)

BACE-wt

HEK 293/βAPPwt

βAPP₆₉₅wt

BACE

G 418

Zeocin

BACE- Δ C

HEK 293/βAPPwt

βAPP₆₉₅wt

BACE-ΔC

G 418

Zeocin

BACE-L

HEK 293/βAPPwt

βAPP₆₉₅wt

BACE-L

G 418

Zeocin

BACE R45A

HEK 293/βAPPwt

βAPP₆₉₅wt

BACE R45A

G 418

Zeocin

β APP

MDCK

βAPP₆₉₅wt

G418

(Haass et al., 1994)

β APP Δ C

MDCK

βAPP₆₉₅ΔC

G418

(Haass et al., 1995)

β APP BACE

MDCK/βAPPwt

βAPP₆₉₅wt

BACE

G 418

Zeocin

BACE STOP ₄₉₄

MDCK/βAPPwt

βAPP₆₉₅wt

BACE STOP₄₉₄

G 418

Zeocin

β APP Δ C BACE

MDCK/βAPPΔC

βAPP₆₉₅ΔC

BACE

G 418

Zeocin

PS1wt

MDCK/βAPPwt

βAPP₆₉₅wt

PS1wt

G 418

Zeocin

Tabelle 2: Bezeichnung und exogene Proteinexpression der benutzten Zelllinien

Bei den in der Maus hergestellten Antikörpern (AK) handelt es sich ausnahmslos um monoklonale AK. Für die Herstellung der polyklonalen AK gegen BACE wurden synthetische Peptide einer potentiell antigenen Region des Proteins an KLH (keyhole limpet hemocyanin) gekoppelt und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. Die Synthese und Kopplung der Peptide, sowie die Immunisierung der Kaninchen und die Gewinnung der Antiseren wurden von der Firma Eurogentec durchgeführt.

Angegeben ist die Bezeichnung des Antikörpers (AK), das zur Immunisierung eingesetzte Antigen und die benutzten Verdünnungen in der Immunopräzipitation (IP), im Western Blot (WB) und in der Immunofluoreszenz (IF). Wurde der AK bereits in anderen Arbeiten eingesetzt ist das entsprechende Zitat angegeben. Bei kommerziell erworbenen oder von anderen Arbeitsgruppen freundlicherweise zur Verfügung gestellten AK ist die Bezugsquelle angegeben.

Bezeichnung

Antigen (AS)

Wirt

IP

WB

IF

Bezugsquelle

human Giantin

Maus

---

---

1:10000

Dr. H.-P. Hauri, Basel
(Linstedt und Hauri, 1993)

c-myc

(AS 410-419)

Maus

1:500

1:5000

1:500

Hybridomabank, University of Iowa

BACE

(AS 22-45)

Kaninchen

1:200

1:500

1:200

Dr. Gerd Multhaup, Berlin

BACE

(AS 46-60)

Kaninchen

1:300

1:1000

1:300

BACE

(AS 482-501)

Kaninchen

1:300

1:1000

---

βAPP₆₉₅

(AS 676-695)

Kaninchen

1:300

1:600

---

(Capell et al., 2000)

βAPP₆₉₅

(AS 444-592)

Kaninchen

1:300

1:600

---

(Steiner et al., 1999)

βAPP₆₉₅

(AS 595-611)

Kaninchen

1:300

1:600

---

Dr. D.J. Selkoe, USA

(Haass et al., 1992)

Aβ

(AS 1-40)

Kaninchen

1:300

1:1000

---

(Wild-Bode et al., 1997)

PS1

(AS 263-407)

Kaninchen

1:300

1:2000

---

(Capell et al., 1998)

PS1

(AS 2-80)

Maus

---

1:2000

---

Dr. Ralph A. Nixon, USA (Capell et al., 1997)

NCT

(AS693-709)

Kaninchen

1:500

1:5000

---

Sigma

Tabelle 3: Übersicht der Primär-Antikörper

Angegeben sind die Bezeichnungen der AK, die Antigene, gegen die die AK gerichtet sind, die Spezies in denen die AK generiert wurden, die Applikationen und eingesetzten Verdünnungen der AK, sowie die Bezugsquellen.

Bezeichnung

Antigen

Wirt

Applikation

Verdünnung

Firma

anti-Kaninchen-HRP

Kaninchen IgG

Ziege

WB

1:20000

Promega

anti-Maus-

HRP

Maus IgG

Ziege

WB

1:10000

Promega

anti-Kaninchen-

[I]

Kaninchen

IgG

Esel

WB

1:10

Amersham

Alexa Fluor 488 (grün)

Kaninchen IgG

Ziege

IF

1:250

Molecular Probes

Alexa Fluor 594 (rot)

Kaninchen IgG

Ziege

IF

1:500

Molecular Probes

Alexa Fluor 488 (grün)

Maus IgG

Ziege

IF

1:250

Molecular Probes

Alexa Fluor 594 (rot)

Maus IgG

Ziege

IF

1:500

Molecular Probes

Tabelle 4: Übersicht der Sekundär-Antikörper

Einfriermedium:

90 % FKS, 10 % DMSO

Zum Anlegen von Dauerkulturen wurden konfluente Zellmonolayer einer 10 cm Petrischale wie unter 2.4.1 beschrieben pelletiert. Das Zellpellet wurde in 1 ml Einfriermedium (4°C) resuspendiert und in ein Kryoröhrchen überführt. Die Kulturen wurden in Einfrierboxen, die eine langsame, definierte Abkühlung gewährleisten, bei -80°C eingefroren und zur Dauerlagerung nach ca. 1 Woche in den flüssigen Stickstofftank überführt. Die Zellkonzentration im Einfriermedium beträgt ca. 5x10Zellen /ml.

Selektionsmedien:

Die gewünschten Selektionsantibiotika wurden in der angegebenen Konzentration zu dem Grundmedium zugegeben:
G418 (Geneticin) Stocklösung (100 mg/ml), Endkonzentration 400 µg/ml, Zeocin Stocklösung (100 mg/ml), Endkonzentration 200 µg/ml.

Die entsprechenden Zellen wurden in einer 10 cm Schale bis zu einer Konfluenz von ca. 80 % kultiviert und mittels FuGENE gemäß den Anweisungen des Herstellers mit der gewünschten Plasmid-DNA transfiziert. Im Falle einer transienten Transfektion wurden die Zellen 24-48 h nach der Transfektion für das entsprechende Experiment eingesetzt. Zur Selektion stabiler Einzelzellklone wurden die Zellen 24 h nach der Transfektion in verschiedenen Verdünnungen (1:50-1:400) in das entsprechende Selektionsmedium umgesetzt. Je nach Antibiotikum benötigte eine vollständige Selektion 1-3 Wochen. Untransfizerte Zellen waren abgestorben und stabile Einzelzellklone waren zu Zellhaufen herangewachsen. Die Einzelzellklone wurden von der geeigneten Verdünnungsplatte unter Verwendung steriler Klonierungszylinder isoliert, mit Trypsin-EDTA-Lösung abgelöst und in 12-well-Platten transferiert.

Die Zellen wurden anschließend weiter vermehrt, je Zellklon wurden zwei 6 cm Schalen angelegt, die Zellen einer Schale wurden als Dauerkultur eingefroren, die der anderen Schale wurden lysiert, in der SDS-PAGE aufgetrennt (2.5.3.3) und auf Expression des exogenen Proteins im Western Blot analysiert (2.5.3.5).

Poly-L-Lysin (Stocklösung 100fach für Deckgläschen, 1000fach für Kulturschalen):

10 mg/ml Poly-L-Lysin in sterilem dH₂O

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na₂HPO₄ und 1,75 mM KH₂PO₄ in dH₂O, pH 7,4; autoklaviert

Für einige Experimente mussten Zellkulturschalen mit Poly-L-Lysin beschichtet werden, um eine bessere Haftung der HEK 293 Zellen zu erreichen. Hierzu wurden Kulturschalen für 1-2 h bei 37°C mit einer Poly-L-Lysin-Lösung (10 µg/ml) im CO₂-Inkubator inkubiert und anschließend 5-mal mit sterilem dH₂O gewaschen. Sollten die Schalen sofort benutzt werden, wurden sie 1-mal mit sterilem PBS-Puffer gewaschen, andernfalls wurden die Schalen in der Sterilbank getrocknet, steril verpackt und bei 4°C gelagert.

Glasdeckgläschen müssen, um ein Zellwachstum zu ermöglichen, immer beschichtet werden. Deckgläschen wurden über Nacht in 70 % Ethanol sterilisiert oder zur Serilisation autoklaviert (120 °C, 1,2 bar, 20 min). Nach der Sterilisation wurden sie vollständig mit Poly-L-Lysin-Lösung (100 µg/ml) bedeckt und 2 h bei 37°C oder über Nacht bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Deckgläschen 5-mal mit sterilem dH₂O gewaschen und in sterilem dH₂O gelagert.

Die Zellzahl wurde mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer ermittelt.

Selektionsmedien:

Die gewünschten Selektionsantibiotika wurden in der angegebenen Konzentration zu dem Grundmedium zugegeben:
G418 (Geneticin) Stocklösung (100 mg/ml), Endkonzentration 800 µg/ml, Zeocin Stocklösung (100 mg/ml), Endkonzentration 400 µg/ml

Die Kultivierung der MDCK Zellen erfolgte analog zu der von HEK 293 Zellen (2.4.1). Unterschiede ergaben sich nur bei der Transfektion. Da MDCK Zellen sehr schlecht zu transfizieren sind, konnten transiente Transfektionen nicht durchgeführt werden, und um stabile Einzellzellklone zu erhalten, wurden die Zellen 24 h nach Transfektion in einer Verdünnungen von 1:5 in das entsprechende Selektionsmedium umgesetzt. Die Konzentration der Selektionsantibiotika ist bei MDCK Zellen höher als bei HEK 293 Zellen (2.4.1.2). Je nach Antibiotikum benötigte eine vollständige Selektion 3-4 Wochen. Um 1-2 hoch exprimierende Klone zu erhalten, mussten ca. 20 Einzelzellklone isoliert werden.

Medium für auf Filtern wachsende MDCK Zellen:

20 % FKS, 1 % Penicillin/Streptomycin in DMEM (mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

Medium mit Na-Butyrat:

10 mM Na-Butyrat (Stocklösung (100fach): 1 M Na-Butyrat in sterilem dH₂O) in Grundmedium oder in Filtermedium

MDCK Zellen wurden zur Ausbildung eines polarisierten „Monolayers“ auf Transwell-Filter ausgesät und 5-6 Tage bei täglichem Mediumwechsel kultiviert. Die FKS Konzentration des Grundmediums wurde auf 20 % erhöht.

Für biochemische Experimente wurden Filter mit einem Durchmesser von 24 mm eingesetzt, das apikale Medienvolumen betrug 1,5 ml, das basolaterale 2,6 ml. Es wurden ca. 2,5 x 10 Zellen auf einen 24 mm Filter ausgesät.

Für cytochemische Untersuchungen wurden Filter mit einem Durchmesser von 12 mm eingesetzt, das apikale Medienvolumen betrug 0,5 ml, das basolaterale 1,5 ml. Es wurden ca. 6 x 10Zellen auf einen 12 mm Filter ausgesät.

Zur Erhöhung der Expression der exogen exprimierten Proteine wurden die MDCK Zelllinien über Nacht, d.h. 15-18 h, mit 10 mM Na-Butyrat behandelt (Gottlieb et al., 1986).

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na₂HPO₄ und 1,75 mM KH₂PO₄ in dH₂O, pH 7,4; autoklaviert

STEN-Lysepuffer mit BSA:

50 mM Tris pH 7,6; 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % NP-40, 2 mg/ml BSA in dH₂O

STEN-Lysepuffer ohne BSA:

50 mM Tris pH 7,6; 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % NP-40 in dH₂O

Konfluente Monolayer von HEK 293 oder MDCK Zellen wurden auf Eis 2-mal mit eiskaltem PBS-Puffer gewaschen und anschließend in 1 ml PBS-Puffer abgeschabt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (1000 , 5 min) pelletiert, in STEN-Lysepuffer Puffer resuspendiert (800 μl pro 10 cm Schale, 400 μl pro 6 cm Schale) und 15 min auf Eis inkubiert. Die unlöslichen Bestandteile, wie Cytoskelett und Zellkerne, wurden durch Zentrifugation (16000 , 20 min, 4°C) abgetrennt. Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Sollten die Zelllysate direkt in der SDS-PAGE aufgetrennt werden, wurde STEN-Lysepuffer ohne BSA eingesetzt, sollte jedoch das Zelllysat zur Immunopräzipitation eingesetzt werden, wurde STEN-Lysepuffer mit BSA benutzt. Zur Lagerung wurden Lysate bei -20°C eingefroren.

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na₂HPO₄ und 1,75 mM KH₂PO₄ in dH₂O, pH 7,4; autoklaviert

Hypotoner-Puffer:

10 mM Tris pH 7,6; 10 mM KCl, 1,5 mM Mg-Acetat in dH₂O

STEN-Lysepuffer ohne BSA:

50 mM Tris pH 7,6; 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % NP-40 in dH₂O

Konfluente Monolayer einer 10 cm Schale von HEK 293 oder MDCK Zellen wurden auf Eis 2-mal mit eiskaltem PBS-Puffer gewaschen und anschließend in 1 ml PBS-Puffer abgeschabt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (400 , 5 min) pelletiert, in 1 ml kaltem hypotonen Puffer resuspendiert und zum Schwellen 30 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden durch 15-maliges Aufziehen der Suspension mit einer 2 ml Spritze durch eine 0,6 mm Injektionskanüle geöffnet. Zellkerne und Cytoskelett wurden durch Zentrifugation (3000 , 10 min, 4°C) abgetrennt und die Membranen anschließend durch Ultrazentrifugation (100000 , 1 h, 4°C) aus dem Überstand pelletiert. Das Membranpellet wurde entweder direkt in 30-60 µl SDS-Probenpuffer (2.5.3.1) bei 37°C im Schüttelinkubator gelöst, oder in 50-100 µl STEN-Lysepuffer ohne BSA resuspendiert. Unlösliche Bestandteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt (16000 , 20 min, 4°C), aus dem STEN-Membranlysat wurde die Proteinkonzentration ermittelt.

20 % Trichloressigsäure (TCA)

Aceton

SDS-Probenpuffer (2fach):

20 % Glycerin, 4 % (w/v) SDS, 5 % β-Mercaptoethanol, 125 mM Tris pH 6,8; 0,005 % Bromphenol blau

Die Proben wurden mit einem Volumen 20 %iger-TCA-Lösung versetzt, 30 min auf Eis inkubiert und anschließend zentrifugiert (16000 , 30 min, 4°C). Das Proteinpellet wurde 1-mal mit Aceton gewaschen, kurz bei 37°C getrocknet und in Probenpuffer aufgenommen.

STEN-Puffer:

50 mM Tris pH 7,6; 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,2 % NP-40 in dH₂O

STEN-NaCl-Puffer:

50 mM Tris pH 7,6; 500 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,2 % NP-40 in dH₂O

STEN-SDS-Puffer:

50 mM Tris pH 7,6; 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,2 % NP-40, 0,1 % (w/v) SDS in dH₂O

Protein-A-Sepharose Suspension (PAS):

100 mg/ml Protein-A gebunden an Sepharose CL-4B und 2 mg/ml BSA in STEN-Puffer

SDS-Probenpuffer (2fach):

20 % Glycerin, 4 % (w/v) SDS, 5 % β-Mercaptoethanol, 125 mM Tris pH 6,8; 0,005 % Bromphenol blau

Gesamtproteinlysate oder Membranproteinlysate wurden nach der Abzentrifugation unlöslicher Bestandteile (2.5.1.1) zur Vorreinigung mit 25 µl Protein-A Sepharose (PAS) versetzt und 30 min bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Die PAS und unspezifisch gebundene Bestandteile wurden durch Zentrifugation abgetrennt (16000 , 20 min, 4°C). Der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit dem entsprechenden AK in derunter 2.2.4.1 angegebenen Konzentration und 25 µl PAS für 3-4 h bei 4°C auf einem Schüttler inkubiert. Konditionierte Medien wurden nicht vorgereinigt, sondern direkt mit AK und PAS über Nacht inkubiert. Das Immunopräzipitat wurde durch Zentrifugation (4000 , 5 min, 4°C) sedimentiert und der Überstand wurde aspiriert. Nacheinander wurde das Immunopräzipitat je 15 min, mit je 1ml STEN-NaCl-Puffer, STEN-SDS-Puffer und STEN-Puffer gewaschen. Nach jedem Wasch-schritt wurde, wie oben beschrieben, zentrifugiert und die Überstände wurden aspiriert.

Die Pellets wurden anschließend mit 15 µl 2fach SDS-Probenpuffer versetzt, 5 min bei 95 °C erhitzt und mittels SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (2.5.3.3) und Western Blot (2.5.3.5) oder Fluorografie (2.5.3.6) analysiert.

SDS-Polyacrylamid Gele :

Trenngel-Puffer (4fach „lower Tris“):

1,5 M Tris pH 8,8; 0,4 % (w/v) SDS in dH₂O

Sammelgel-Puffer (4fach „upper Tris“):

0,5 M Tris pH 6,8; 0,4 % (w/v) SDS in dH₂O

Acrylamid-Lösung:

40 % (w/v) Acrylamid-BIS-Acrylamid 37,5:1 in dH₂O

Ammoniumpersulfat Lösung (APS):

10 % (w/v) Ammoniumpersulfat in dH₂O

Zusammensetzung der Gel-Lösungen für 2 Minigele (0,75 mm)

8 %-

Trenngel

10 %-

Trenngel

12 %-

Trenngel

Sammelgel

Trenngel-/Sammelgel-Puffer

4,0 ml

4,0 ml

4,0 ml

2,5 ml

Acrylamid-Lsg.

3,2 ml

4,0 ml

4,8 ml

0,9 ml

dH₂O

8,8 ml

8,0 ml

7,2 ml

6,5 ml

10 % APS-Lsg.

30µl

30 µl

30 µl

30 µl

TEMED

30 µl

30 µl

30 µl

30 µl

SDS-Probenpuffer (4fach):

40 % Glycerin, 8 % (w/v) SDS, 10 % β-Mercaptoethanol, 250 mM Tris pH 6,8; 0,01 % Bromphenol blau

SDS-Probenpuffer (2fach):

20 % Glycerin, 4 % (w/v) SDS, 5 % β-Mercaptoethanol, 125 mM Tris pH 6,8; 0,005 % Bromphenol blau

Elektrophoresepuffer ohne SDS (10fach):

250 mM Tris, 1,92 M Glycin in dH₂0

Elektrophoresepuffer (1fach):

25 mM Tris, 0,2 M Glycin und 0,1 % (w/v) SDS in dH₂0

Die eindimensionale Auftrennung von Proteinen erfolgte unter denaturierenden Bedingungen in einem diskontinuierlichen Gelsystem (Laemmli, 1970). Proteine werden entsprechend ihrer apparenten molekularen Masse aufgetrennt.

Zur SDS-PAGE wurde ein Minigelsystem mit einer Sammelgelstrecke von 0,5-1 cm und einer Trenngelstrecke von ca. 7 cm verwendet. SDS-Gele mit 10 Probentaschen und einer Dicke von 0,75 mm oder 15 Probentaschen und einer Dicke von 1,5 mm wurden eingesetzt. Der Anteil des Polyacrylamids ist entscheidend für die Vernetzung der Gele und damit für die Trennfähigkeit. Je höher der Anteil des Acrylamids, angegeben in Prozent, desto kleinere Proteine können aufgetrennt werden; 10 %ige SDS-Gele trennen Proteine bis zu einem Molekulargewicht von 20 kDa. Die Prozentigkeit der SDS-Gele ist bei den jeweiligen Experimenten angegeben.

Die Glasplatten wurden vor der Verwendung mit Seifenlösung und Isopropanol von Proteinen und Gelrückständen befreit, entsprechend der Herstellerbeschreibung zusammengebaut und in Gießständer eingesetzt. Das Trenngel wurde bis zu einer Höhe von ca. 2 cm unterhalb des oberen Glasplattenrandes gegossen und mit Isopropanol überschichtet. Nach dem Polymerisieren wurde das Isopropanol dekantiert und Reste mit Filterpapier entfernt. Das Sammelgel wurde auf das Trenngel gegossen und ein Probentaschenkamm eingefügt. Nach der vollständigen Polymerisierung des Sammelgels wurde der Kamm vorsichtig entfernt und das Gel in die Trennkammer eingesetzt. Elektrophoresepuffer wurde in die Anoden- und Katodenkammer gefüllt. Die Probentaschen wurden vor dem Laden der Proben mit Elektrophoresepuffer gespült.

Die in Probenpuffer aufgenommenen Proben wurden vor dem Einbringen in die Probentaschen 5 min bei 95°C erhitzt. Nicht gelöstes Material wurde durch Zentrifugation (16000 , 2 min) abgetrennt. Als Molekulargewichtsstandard wurden 10 µl „Rainbowmarker“ geladen. Anode und Kathode wurden mit der Spannungsquelle verbunden. Die Elektrophorese erfolgte bei einer konstanten Spannung von 120 V.

Elektrophoresepuffer für Tris-Tricine-Gele mit SDS (10fach):

1 M Tris, 1M Tricine und 1 % (w/v) SDS in dH₂O

Zur Auftrennung von niedermolekularen Proteinen wurde das Tris-Tricine-Gelsystem der Firma Novex/Invitrogen nach Schägger und von Jagow (Schägger und von Jagow, 1987) unter Verwendung von 10-20 %igen Tris-Tricine-Fertiggelen entsprechend der Anweisung des Herstellers eingesetzt.

Als Anoden- und Kathodenpuffer wurde Tris-Tricine-Elektrophoresepuffer eingesetzt, die Proben wurden in SDS-PAGE Probenpuffer (2.5.3.3) aufgenommen und 5 min bei 95°C erhitzt. Als Molekulargewichtsstandard wurden 10 µl „Low-Range Molekulargewichtsmarker“ eingesetzt. Die Elektrophorese wurde wie unter 2.5.3.3 beschrieben durchgeführt.

Transferpuffer (1fach):

25 mM Tris, 0,2 M Glycin in dH₂0

TBST-Puffer:

0,3 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,6; 0,3 % Triton X-100 in dH₂O

Blockierungspuffer:

5 % (w/v) Magermilchpulver in TBST-Puffer oder 50 % Pferdeserum in TBST-Puffer

Nach der Proteinauftrennung im SDS-Gel mittels Elektrophorese wurden die Proteine in einer Transferkammer aus dem Gel auf eine PVDF- oder Nitrozellulose-Membran übertragen.

Transferaufbau:

Anodenplatte

poröser Schwamm in Transferpuffer äquilibriert

zwei Lagen Gel-Transferpapier in Transferpuffer äquilibriert

Membran in Transferpuffer äquilibriert

SDS-Gel

zwei Lagen Gel-Transferpapier in Transferpuffer äquilibriert

poröser Schwamm in Transferpuffer äquilibriert

Kathodenplatte

Der Transfer wurde bei konstantem Stromfluss von 400 mA für 1 h bei 4°C durchgeführt. Nach erfolgtem Transfer wurde die Membran zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen 1 h bei RT in Blockierungspuffer geschüttelt. Die so vorbehandelte Membran wurde anschließend 2 h bei RT oder über Nacht bei 4°C mit primärem AK, verdünnt in Blockierungspuffer (2.2.4.1), auf einem Schüttler inkubiert. Überschüssiger oder unspezifisch gebundener AK wurde durch 4-mal 15 min Waschender Membran mit TBST-Puffer entfernt. Der entsprechende HRP-gekoppelte sekundäre Antikörper (2.2.4.1) wurde ebenfalls in Blockierungspuffer verdünnt und 1 h bei RT mit der Membran inkubiert. Schließlich wurde erneut 4-mal je 15 min mit TBST-Puffer gewaschen und kurz mit dH₂O nachgespült. Die Detektion der mit den Antikörpern gekoppelten Proteine erfolgte mit Hilfe der ECL Technik nach Angaben des Herstellers. Zum Nachweis schwacher Signale wurde der sensitive „ECL-Plus Western Blotting Kit“ verwendet. Die Chemilumineszenzsignale wurden mit Kodak-X-Omat DS Röntgenfilmen detektiert.

Fixierlösung:

25 % Isopropanol und 10 % Essigsäure in dH₂O

Die zur radioaktiven Markierung eingesetzten Isotope [S] und [H] sind niederenergetische Strahler, ein direkter autoradiografischer Nachweis ist kaum möglich, durch Einsatz eines Szintillators können die Signale von [H] 1000fach und die von [S] 10fach erhöht werden.

Radioaktiv markierte, immunopräzipitierte Proteine wurden in der SDS-PAGE oder im Tris-Tricine-Gelsystem aufgetrennt. Die Proteine wurden, durch 30 min Inkubation der Gele in der Fixierlösung, im Gel fixiert. Zur Verstärkung der radioaktiven Signale, durch Umwandlung der radioaktiven Strahlung in Lichtsignale wurden die Gele 30 min in Amplify-Lösung inkubiert und auf Transfer Papier im Geltrockner bei 80°C 1h getrocknet. Der fluorografische Nachweis der radioaktiven Proteine erfolgte mit Hilfe von Röntgenfilmen. Die Röntgenfilme wurden auf die getrockneten Gele aufgelegt und in Filmkassetten bei -80°C inkubiert, nach gewünschter Inkubationszeit wurden die Filme entwickelt. Die Exposition bei -80°C erhöht die Sensitivität des Films für schwache Lichtsignale.

Radioaktiv markierte Proteine wurden nach der SDS-PAGE, der Fixierung im Gel, der Verstärkung der Signale und dem Trocknen des Gels, mit Hilfe des Phosphor-Imagers quantifiziert. Die getrockneten Gele wurden in Phosphor-Imager Kassetten mit einer radioaktivitätssensitiven Folie inkubiert. Auf der Folie wurden die radioaktiven Signale gespeichert und im Phosphor-Imager konnten die Intensitäten der Signale gemessen werden. Die Banden der zu quantifizierenden Proteine wurden markiert und die Intensitäten berechnet. In dieser Arbeit wurden ausschließlich Verhältnisse von verschiedenen Proteinen quantifiziert, so konnte auf eine Normierung auf einen externen Standard verzichtet werden.

Für alle Quantifizierungen wurden 3fach Bestimmungen angesetzt, Mittelwerte und Standardabweichungen wurden angegeben.

Medium für radioaktive Markierungen („pulse“-Medium):

1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

Medium für radioaktive Langzeitmarkierungen:

5 % dialysiertes FKS, 1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyrouat)

Die entsprechenden HEK 293 Zelllinien wurden in 6 cm Schalen bis zu einer Konfluenz von 80-90 % kultiviert. Das Kulturmedium wurde aspiriert und durch 2 ml methioninfreies „pulse“-Medium ersetzt, die Zellen wurden 1 h bei 37°C im CO₂-Inkubator inkubiert. Das „pulse“-Medium wurde anschließend vollständig entfernt und durch 1,5 ml methioninfreies Medium für radioaktive Langzeitmarkierungen, mit 5 % dialysiertem Serum, ersetzt. 20 µl Promix wurden je Kulturschale zugesetzt, damit ergibt sich eine Konzentration von 7 MBq [S]Methionin/Cystein /ml. Nach 4 h Inkubation bei 37°C im CO₂-Inkubator wurde das konditionierte Medium abgenommen und nach Zentrifugation (16000 , 20 min, 4°C) direkt zur Immunopräzipitation (2.5.3.2) eingesetzt oder bei -20°C eingefroren. Bei Bedarf wurden die Zellen mit STEN-Lysepuffer lysiert (2.5.1.1) und die zu untersuchenden Proteine ebenfalls immunopräzipitiert. Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE (2.5.3.3) und Fluorografie des Gels (2.5.3.6).

Medium für radioaktive Markierungen („pulse“-Medium):

1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

Medium für radioaktive Langzeitmarkierungen:

5 % dialysiertes FKS, 1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

Die entsprechenden MDCK Zelllinien wurden in Filterkammern mit 24 mm Durchmesser polarisiert, zur radioaktiven Markierung wurde das Kulturmedium aspiriert und durch methioninfreies „pulse“-Medium ersetzt (apikal 1,5 ml, basolateral 2,6 ml), die Zellen wurden 45 min bei 37°C im CO₂-Inkubator vorinkubiert. Das „pulse“-Medium wurde anschließend vollständig entfernt und apikal durch 1,5 ml methioninfreies Medium für radioaktive Langzeitmarkierungen, mit 5 % dialysiertem Serum, ersetzt. Für das basolaterale Medium wurden 4 MBq [S]Methionin/Cystein /ml zu dem Medium für radioaktive Langzeitmarkierungen zugesetzt und 2,6 ml je Filterkammer eingesetzt. Polarisierte MDCK Zellen nehmen Aminosäuren fast ausschließlich basolateral auf. Nach 4 h Inkubation bei 37°C im CO₂-Inkubator wurde das konditionierte apikale und basolaterale Medium getrennt abgenommen und nach Zentrifugation (16000 , 20 min, 4°C) direkt zur Immunopräzipitation (2.5.3.2) eingesetzt bzw. bei -20°C eingefroren. Für die Amyloid-Bestimmung mussten apikale und basolaterale Medien von 3 Filtern vereinigt werden. Bei Bedarf wurden die Zellen mit STEN-Lysepuffer lysiert (2.5.1.1).

Medium für radioaktive Markierungen („pulse“-Medium):

1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

Medium für radioaktive Markierungen („chase“-Medium):

Grundmedium mit 5fach erhöhter Methioninkonzentration (1 mM)

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na₂HPO₄ und 1,75 mM KH₂PO₄ in dH₂O, pH 7,4; autoklaviert

Die entsprechenden HEK 293 Zelllinien wurden in 6 cm Schalen bis zu einer Konfluenz von 80-90 % kultiviert. Nach Entfernung des Kulturmediums, wurden die Zellen 1 h mit 2 ml „pulse“-Medium bei 37°C im CO₂-Inkubator vorinkubiert. Das „pulse“-Medium wurde durch 7 MBq [S]Methionin/Cystein /ml haltigem „pulse“-Medium ersetzt. Nach 10-15 min Inkubation bei 37°C im CO₂-Inkubator, wurde das radioaktive Medium sofort abgenommen, die Zellen mit 2 ml „chase“-Medium gewaschen und 1,5 ml frisches „chase“-Medium zugegeben. Zu den angegebenen „chase“-Zeitpunkten wurde der Zellrasen sofort mit eiskaltem PBS-Puffer gewaschen und mit STEN-Lysepuffer lysiert (2.5.1.1). Die Lysate wurden direkt für die Immunopräzipitation (2.5.3.2) verwendet und die zu den verschiedenen „chase“-Zeitpunkten gesammelten Medien wurden bei Bedarf ebenfalls immunopräzipitiert. Die Analyse der Proteine erfolgte in der SDS-PAGE (2.5.3.3) und Fluorografie (2.5.3.6).

Medium für radioaktive Markierungen („pulse“-Medium):

1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyrovate)

Medium für radioaktive Markierungen („chase“-Medium):

Grundmedium mit 5fach erhöhter Methioninkonzentration (1 mM)

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na₂HPO₄ und 1,75 mM KH₂PO₄ in dH₂O, pH 7,4; autoklaviert

Die entsprechenden MDCK Zelllinien wurden in Filterkammern mit 24 mm Durchmesser polarisiert, zur radioaktiven Markierung wurde das Kulturmedium aspiriert und durch methioninfreies „pulse“-Medium ersetzt (apikal 1,5 ml, basolateral 2,6 ml). Die Zellen wurden 45 min bei 37°C im CO₂-Inkubator vorinkubiert. Das „pulse“-Medium wurde anschließend vollständig entfernt und die Filter wurden nach kurzer Trocknung auf Filterpapier in eine 10 cm Kulturschale je auf einen 50 µl Tropfen, bestehend aus 20 µl Promix und 30 µl „pulse“-Medium (10,6 MBq [S]Methionin/Cystein), überführt. Apikal wurden 150 µl „pulse“-Medium auf den Zellmonolayer pipettiert, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern. Die Filter wurden 10 min bei 37°C im CO₂-Inkubator inkubiert, nach der „pulse“-Inkubation wurden die Filter in ihre Kulturschale zurückgesetzt und mit „chase“-Medium gewaschen. Für den „chase“-Zeitpunkt „0 min“ wurde der Filter sofort mit eiskaltem PBS-Puffer gewaschen und lysiert. Für jeden gewünschten „chase“-Zeitpunkt wurde ein Filter eingesetzt. Die verschiedenen Ansätze wurden entsprechend der jeweiligen „chase“-Zeit bei 37°C im CO₂-Inkubator inkubiert, anschließend wurde das konditionierte Medium abgenommen, der Zellmonolayer sofort mit eiskaltem PBS-Puffer gewaschen und die Zellen mit STEN-Lysepuffer lysiert. Medien und STEN-Lysate wurden immunopräzipitiert, in der SDS-PAGE (2.5.3.3) und Fluorografie (2.5.3.6) analysiert.

Medium ohne Phenylalanin (2fach Stocklösung):

Die Herstellung erfolgte unter Verwendung des MEM Select-Amine Kit nach den Anweisungen des Herstellers.

Die entsprechende MDCK Zelllinie wurde in Filterkammern mit 24 mm Durchmesser polarisiert, zur radioaktiven Markierung wurde das Kulturmedium aspiriert und durch phenylalaninfreies Medium ersetzt (apikal 1,5 ml, basolateral 2,6 ml), die Zellen wurden 45 min bei 37°C im CO₂-Inkubator vorinkubiert. Das Medium wurde anschließend vollständig entfernt und apikal durch 1,5 ml phenylalaninfreiesMedium mit 5 % dialysiertem Serum ersetzt. Für die basolaterale radioaktive Markierung wurde phenylalaninfreies, 2fach Medium mit 5 % dialysiertem FKS und 1:1 mit [H]Phenylalanin (37 MBq/ml) supplementiert, eingesetzt. Nach 4 h Inkubation bei 37°C im CO₂-Inkubator wurde das konditionierte basolaterale Medium abgenommen und nach Zentrifugation (16000 , 20 min, 4°C) direkt zur Immunopräzipitation mit AK 3926 eingesetzt (2.2.4.1).Das Immunopräzipitat wurde im Tris-Tricine Gel aufgetrennt und auf eine PVDF-Membran transferiert (2.5.3.5). Parallel wurde eine Markierung mit [S]Methionin/Cystein (2.5.4.2) durchgeführt und die [S]-markierten Immunopräzipitate wurden neben der [H]-markierten Probe im Tris-Tricine-Gel geladen, um die [H]-markierten Proteine auf der Membran besser lokalisieren zu können. Zum Nachweis der radioaktiven Proteine wurden sensitive Röntgenfilme (BioMax TMMR)verwendet. Die Exposition erfolgte bei -80°C.

Radiosequenzierung:

Die [H]-markierten Protein-Banden wurden mit einem Skalpell aus der PVDF Membran ausgeschnitten. Die an die Membran gebundenen Proteine wurden einem automatisierten Edman-Abbau (Applied Biosystems, Sequenzierer Model 475) unterzogen. Die erhaltenen Aminosäure-Thiohydantoin wurden mit n-Butylchlorid extrahiert und in 6 ml Szintillationsgefäße überführt. Die Radioaktivitätsmessung erfolgte unter Zusatz von 5 ml Szintillationscocktail im Szintillationszähler. Die Radiosequenzierung wurde von Dr. David Teplow (Harvard Medical School, Brigham and Women`s Hospital, Boston) durchgeführt.

N-Glycosidase F-Puffer:

100 mM Natrium-Phosphat, pH 8,0; 25 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100, 2,5 mM PMSF in dH₂O

„Beads“-Elutionspuffer:

100 mM Tris pH 7,5; 1 % (w/v) SDS, 1 % β-Mercaptoethanol

HEK 293 Zelllinien oder MDCK Zelllinien wurden im „pulse/chase“-Experiment mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert (2.5.4.3 / 2.5.4.4). Die „pulse“ und „chase“ Zeiten sind bei den jeweiligen Experimenten angegeben. Gesamtproteinlysate wurden hergestellt (2.5.1.1) und die zu deglycosylierenden Proteine wurden durch Immunopräzipitation mit dem entsprechenden AK (2.5.3.2) isoliert. Mit 20 µl „beads“-Elutionspuffer bei 10 min Erhitzung auf 95°C wurden die präzipitierten Proteine von der PAS abgetrennt. Die PAS wurde durch Zentrifugation pelletiert (16000 , 5 min), und je 10 µl des Eluats wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zu dem Reaktions- und Kontrollansatz wurden 90 µl N-Glycosidase F-Puffer und zum Reaktionsansatz zusätzlich 1µl N-Glycosidase F (1 U/µl) pipettiert. Reaktions- und Kontrollansätze wurden 16 h bei 37°C, 700 UpM auf einem Thermoschüttler inkubiert, anschließend wurde die Reaktion durch TCA-Fällung gestoppt (2.5.3.1). Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE und Fluorografie (2.5.3.6).

Endoglycosidase H-Puffer:

200 mM Natriumcitrat pH 5,8; 2,5 mM PMSF in dH₂O

„Beads“-Elutionspuffer:

100 mM Tris pH 7,5; 1 % (w/v) SDS, 1 % β-Mercaptoethanol

Die Proteine wurden wie unter 2.5.5.1 beschrieben radioaktiv markiert und isoliert. Je 10 µl des Eluats für den Reaktions- und den Kontrollansatz wurden in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zu beiden Ansätzen wurden 90 µl Endoglycosidase H-Puffer, 1 µl 1M PMSF und zum Reaktionsansatz zusätzlich 1 µl Endoglycosidase H (5 U/ml) pipettiert. Reaktions- und Kontrollansätze wurden 16 h bei 37°C, 700 UpM auf einem Thermoschüttler inkubiert, anschließend wurde die Reaktion durch TCA-Fällung gestoppt (2.5.3.1). Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE und Fluorografie (2.5.3.6).

Tunicamycin (Stocklösung 1000fach):

10 mg/ml in DMSO

HEK 293 Zelllinien wurden im „pulse/chase“-Experiment in Gegenwart von 10 µg/ml Tunicamycin mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert (2.5.4.3). Sowohl die Präinkubation in methioninfreiem Medium, als auch „pulse“ und „chase“ wurden in Gegenwart von Tunicamycin durchgeführt. Zu den angegebenen „chase“-Zeitpunkten wurden Gesamtproteinlysate hergestellt (2.5.1.1) und die fraglichen Proteine wurden immunopräzipitiert (2.5.3.2). Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE (2.5.3.3) und Fluorografie (2.5.3.6).

Brefeldin A (BFA), (Stocklösung 500fach):

5 mg/ml BFA in EtOH

Monensin (Stocklösung 1000fach):

10 mM Monensin in EtOH

HEK 293 Zelllinien wurden im „pulse/chase“-Experiment mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert (2.5.4.3). Während der auf 2 h verlängerten Präinkubation mit methioninfreiem Medium wurden bereits BFA (10 µg/ml) bzw. Monensin (10 µM) zugesetzt. Auch der 15 min „pulse“ und der „chase“ entsprechend der angegebenen „chase“-Zeiten wurde in Gegenwart von BFA bzw. Monensin durchgeführt. Gesamtproteinlysate wurden mit STEN-Lysepuffer hergestellt (2.5.1.1) und die zu untersuchenden Proteine wurden mit den im Experiment angegebenen AK immunopräzipitiert (2.5.3.2). Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE (2.5.3.3) und Fluorografie (2.5.3.6).

Furininhibitor (Stocklösung 200-1000fach):

10 mM Furin-Inhibitor „Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-chloromethylketon“ in MeOH

Calcium-Ionophor A23187 (Stocklösung 1000fach):

5 mM Calcium-Ionophor in DMSO

Calciumfreies Medium:

5 % dialysiertes FKS, 1 % Penicillin/Streptomycin in DMEM (mit Glucose und Na-Pyruvat, ohne L-Glutamin und CaCl₂)

Medium für radioaktive Markierungen („pulse“-Medium):

1 % Penicillin/Streptomycin in MEM (ohne Methionin, mit Glucose, L-Glutamin, ohne Na-Pyruvat)

HEK 293 Zelllinien wurden vor der Durchführung des „pulse/chase“-Experiments für 10 h mit 10 µM und 50 µM Furin-Inhibitor bzw. 5 µM Calcium-Ionophor behandelt. Die Behandlung mit Calcium-Ionophor erfolgte in calciumfreiem Medium. Während der Präinkubation in methioninfreiem Medium, der 15 min „pulse“-Zeit und der „chase“-Zeit wurden die Inhibitoren zugesetzt. Für die Präinkubation in methioninfreiem Medium und für die „pulse“ Markierung konnte in der Calcium-Ionophor Behandlung kein calciumfreies Medium eingesetzt werden, für die „chase“-Inkubation wurde hingegen calciumfreies Medium eingesetzt. Die jeweiligen „chase“-Zeiten sind im Experiment angegeben. Gesamtproteinlysate wurden mit STEN-Lysepuffer hergestellt (2.5.1.1) und die zu untersuchenden Proteine wurden mit den im Experiment angegebenen AK immunopräzipitiert (2.5.3.2). Die Analyse der Proteine erfolgte mittels SDS-PAGE (2.5.3.3 ) und Fluorografie (2.5.3.6).

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na₂HPO₄ und 1,75 mM KH₂PO₄ in dH₂O, pH 7,4; autoklaviert

PBS/Ca/Mg-Puffer:

1mM CaCl₂, 0,5 mM MgCl₂ in PBS-Puffer

Biotin-Lösung:

1 mg/ml sulfo-NHS-LC-biotin in PBS/Ca/Mg-Puffer

BSA-Lösung:

1 % (w/v) BSA in PBS/Ca/Mg-Puffer

Glycin/BSA-Lösung:

10 mM Glycin, 1 % (w/v) BSA in PBS/Ca/Mg-Puffer

Die entsprechenden MDCK Zelllinien wurden in Filterkammern mit 24 mm Durchmesser polarisiert, zur Biotinylierung wurde das Kulturmedium aspiriert und der Zellmonolayer apikal und basolateral 3-mal mit eiskaltem PBS/Ca/Mg-Puffer gewaschen. Der Zellmonolayer wurde anschließend entweder apikal mit 1,5 ml oder basolateral mit 2,6 ml frisch hergestellter Biotin-Lösung 1 h auf Eis inkubiert. Auf die jeweils nicht zu biotinylierende Seite wurde BSA-Lösung gegeben. Nach der Inkubation wurde der Zellmonolayer apikal und basolateral 3-mal mit eiskaltem PBS/Ca/Mg-Puffer gewaschen und dann, zur Absättigung vom ungebundenen Biotin, 30 min mit Glycin/BSA-Lösung inkubiert. Nach zwei weiteren Waschzyklen mit PBS/Ca/Mg-Puffer wurden die Zellen in 1 ml PBS/Ca/Mg-Puffer mechanisch vom Filter abgelöst, pelletiert (1000 , 5 min) und mit STEN-Lysepuffer lysiert (2.5.1.1). Zur Isolierung der biotinylierten Proteine wurde das Zelllysat mit 25 µl Streptavidin-Sepharose für 2 h bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Das Streptavidin-Sepharose Präzipitat wurde durch Zentrifugation (10000 , 5 min, 4°C) abgetrennt und wie unter 2.5.3.2 beschrieben mit den Waschpuffern der Immunopräzipitation gewaschen. Die so erhaltenen Proteine wurden mittels SDS-PAGE (2.5.3.3) getrennt und im Western Blot mit den entsprechenden Antikörpern analysiert (2.5.3.5). Zur Kontrolle der Proteinexpression wurde ein Aliquot des biotinylierten Zelllysats direkt in der SDS-PAGE aufgetrennt.

Apikale oder basolaterale Oberflächenproteine polarisierter MDCK Zellen wurden wie unter 2.5.6.3 beschrieben biotinyliert. Zum Nachweis der Sezernierung nach Reinternalisierung und Recycling zur apikalen oder basolateralen Oberfläche wurde der Zellmonolayer in den Filterkammern nach der Biotinylierung mit vorgewärmtem Medium bei 37°C im CO₂-Inkubator inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 1 h wurden die konditionierten apikalen und basolateralen Medien getrennt gesammelt und mit Hilfe von Streptavidin-Sepharose Präzipitation (2.5.6.3), SDS-PAGE (2.5.3.3) und Western Blot (2.5.3.5) auf sezerniertes, biotinyliertes l-βAPP untersucht.

PBS-Puffer:

140 mM NaCl, 10 mM Na₂HPO₄ und 1,75 mM KH₂PO₄ in dH₂O, pH 7,4; autoklaviert

Waschpuffer:

20 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ pH 6,0 in dH₂O

Elutionspuffer:

250 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 50 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ pH 6,0 in dH₂O

HEK 293 Zellen, die stabil BACE-L(His)₆ exprimieren, wurden in Zellkulturschalen mit 10 cm Durchmesser kultiviert (2.4.1). Bei einer Konfluenz von 60-80% wurde der Zellrasen mit PBS-Puffer gewaschen und mit 4 ml Optimem/Glutamax-1 für 16-24 h bei 37°C im CO₂-Inkubator inkubiert.

Nach der Inkubationszeit wurde das konditionierte Medium abgenommen, Zellbruchteile wurden abzentrifugiert (5000 , 20 min, 4°C) und der Überstand mit Ni-Agarose bei 4°C für 1-2 h im Überkopf-Schüttler inkubiert. Je 10 ml konditionierten Mediums wurden 100 µl Ni-Agarose eingesetzt. Am Ende der Inkubationszeit wurde die Ni-Agarose abzentrifugiert (2500 , 10 min, 4°C) und im „batch“-Verfahren 3-mal gewaschen. BACE-L wurde anschließend eluiert. Dazu wurden 100 µl Elutionspuffer je 10 ml konditionierten Mediums für 15 min bei RT unter Schütteln mit dem Ni-Agarose Pellet inkubiert. Nach Zentrifugation (10000 , 5 min, 4°C) wurde der BACE-L enthaltende Überstand abgenommen und auf Eis gelagert.

Na-Acetat-Puffer:

20 mM Na-Acetat pH 4,5

Konditioniertes Medium von HEK 293 Zellen, die stabil BACE-L(His)₆ exprimieren wurde, wie unter 2.7.1.1 beschrieben, gesammelt. Zellbruchteile wurden abzentrifugiert und der Überstand in einem Dialyseschlauch, mit einer Durchlässigkeit < 10 kDa gegen ein 200faches Volumen Na-Acetat-Puffer für 16 h dialysiert.

Konditioniertes Medium von HEK 293 Zellen, die stabil BACE-L(His)₆ exprimieren, wurde, wie unter 2.7.1.1 beschrieben, gesammelt. Zellbruchteile wurden abzentrifugiert und der Überstand in einem Centricon-Konzentrator, mit einer Durchlässigkeit < 10 kDa, ca. 4fach konzentriert.

MES-Puffer:

1 %Triton X-100, 20 mM MES pH 6,0; incl. Protease-Inhibitor Mix

Membranen wurden wie unter 2.5.1.2 beschrieben hergestellt, das Membranpellet, wurde mit MES-Puffer extrahiert. 2 µl des Membranextrakts wurden für einen Assayansatz eingesetzt.

Eine Größe für die Messung der inhibitorischen Wirkung eines Stoffes ist der so genannte IC₅₀-Wert. Dieser Wert gibt die Hemmstoffkonzentration an, bei der die ursprüngliche Enzymaktivität auf 50 % reduziert ist. Für die folgenden Peptidinhibitoren wurden im Assay die IC₅₀-Werte ermittelt.

Name

Peptidsequenz

MW

Reinheit

Stocklösung in DMSO

GL189

H-EVNstatinVAEF-NH_{2 x TFA}

1077,1

83 %

50 mM

GL190

H-EEISEVNstatinVAEF-NH_{2 x TFA}

1535,6

85 %

50 mM

Tabelle 7: Peptidinhibitoren für BACE

Als Kontrolle für die Spezifität der Inhibitoren wurde folgender Proteaseinhibitor-Mix (PI-Mix) eingesetzt, angegeben ist die Endkonzentration im Assay:

Aprotinin

0,5 µM

Bestatin

100 µM

E 64

5 µM

EDTA

500 µM

Leupeptin

5 µM

Pepstatin A

5 µM

Phospoamidon

100 µM

PMSF

1 mM