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Expression und Nachweis von BACE Expression von BACE in HEK 293 Zellen und MDCK Zellen

Für die Charakterisierung der Aspartylprotease BACE, durch die Analyse der sekundären Modifikationen im Hinblick auf Aktivität, subzelluläre Lokalisierung und intrazellulären Transport, musste ein geeignetes Modellsystem für die Expression von BACE ausgewählt werden. In zahlreichen vorangegangenen Arbeiten konnte für das Substrat von BACE, βAPP, gezeigt werden, dass in Zellkulturen die Prozessierung sehr ähnlich mit der Prozessierung ist. Dies ist unabhängig davon ob βAPP endogen vorliegt oder exogen überexprimiert wird (Busciglio et al., 1993;Haass et al., 1992;Koo und Squazzo, 1994;Shoji et al., 1992). Ebenso ist die prinzipielle Prozessierung von βAPP in Zellen unterschiedlicher Gewebe identisch (Haass et al., 1992).

Für viele Studien wurden und werden humane, embryonale Nierenzellen (HEK 293, human embryonic kidney) zur Untersuchung der proteolytischen Prozessierung von βAPP eingesetzt (Citron et al., 1992;Haass et al., 1992;Seubert et al., 1993;Shoji et al., 1992;Vassar et al., 1999) So wurden die α-, β-Sekretase und der γ-Sekretase-Komplex in HEK 293 Zellen charakterisiert (Capell et al., 1998;Citron et al., 1992;Citron et al., 1995;Haass et al., 1995;Lammich et al., 1999;Steiner et al., 2002), und BACE wurde unter anderem mit Hilfe dieses Zellsystems kloniert (Vassar et al., 1999).

Damit wird die HEK 293 Zelllinie hier als geeignetes Modellsystem zur Charakterisierung von BACE eingesetzt. BACE ist in HEK 293 Zellen endogen nur sehr schwach exprimiert (Lin et al., 2000;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999) und mit den üblichen proteinbiochemischen Methoden schwer nachweisbar, deshalb wurde BACE cDNA und die in der folgenden Arbeit genannten BACE cDNA-Konstrukte stabil transfiziert.

Um die Analyse der βAPP-Prozessierung zu erleichtern, wurden die BACE cDNA-Konstrukte in eine HEK 293 Zelllinie transfiziert, die bereits stabil die neuronale Isoform βAPP₆₉₅ überexprimiert (1.3.1)(Haass et al., 1992). Durch die Überproduktion des exogenen βAPP₆₉₅ ist der Nachweis der βAPP-Prozessierungsprodukte und damit die Überprüfung der Aktivität der BACE-Varianten erleichtert. Ferner lässt sich die exogene Isoform βAPP₆₉₅, aufgrund des unterschiedlichen Molekulargewichts, leicht von der endogenen Hauptspleißvariante βAPP₇₅₁ unterscheiden.

Für die Untersuchung des polarisierten Transports von BACE wurde auf ein bewährtes, einfaches Modellsystem zurückgegriffen, die in Filterkammern gewachsenen, polarisierten MDCK Zellen (1.5.1). Auch dieses Modellsystem wurde bereits für die Untersuchung des polarsierten βAPP-Transports eingesetzt (De Strooper et al., 1995;Haass et al., 1995;Haass et al., 1994;Lo et al., 1994). BACE wurde stabil in MDCK Zellen exprimiert, die bereits mit βAPP₆₉₅ oder βAPP₆₉₅ΔC (der C-Terminus von βAPP ist deletiert) cDNA stabil transfiziert waren (Haass et al., 1995;Haass et al., 1994), um den Einfluss von BACE auf die Prozessierung von βAPP besser analysieren zu können. Zusätzlich konnte der Einfluss des βAPP Transports auf die Prozessierung durch BACE untersucht werden.

Der Vorteil des MDCK Modellsystems gegenüber polarisierten, primären, neuronalen Kulturen besteht darin, dass stabile mit gewünschten cDNA-Konstrukten transfizierte Zelllinien hergestellt werden können. Stabile Zelllinien mit moderater Expression des gewünschten Proteins gewährleisten, dass die Sortierungsmaschinerie der Zelle kein limitierender Faktor für den gerichteten Transport wird. Ein weiterer Vorteil ist die räumliche Trennung der polarisierten Plasmamembranen in apikale und basolaterale Plasmamembran und die daraus resultierende Trennung der extrazellulären Räume. Aufgrund dessen ist neben einer immunocytochemischen Analyse des BACE-Transports, wie sie auch in Neuronen möglich wäre, zusätzlich eine biochemische Analyse möglich. Außerdem kann aufgrund der getrennten extrazellulären Räume die polarisierte βAPP-Prozessierung genau untersucht werden, die apikalen und basolateralen Kulturüberstände können auf sezernierte βAPP-Prozessierungsprodukte analysiert werden. Nachteile des MDCK Modellsystems sind, dass die Sortierungsmechanismen der Epithelzellen denen der neuronalen Zellen ähnlich (Dotti und Simons, 1990) aber nicht mit ihnen identisch sind (Winckler und Mellman, 1999) und dass die relevanten Zellen für die Entstehung der Alzheimer Krankheit Neuronen sind.

Antikörper zum Nachweis von BACE

In der folgenden Arbeit wurden unter anderem BACE cDNA-Konstrukte eingesetzt, die mit einer bekannten für den C-Terminus des Myc-Proteins kodierenden Sequenz und der Sequenz für sechs Histidine konjugiert sind. BACE wurde mit dem Myc-Epitop konjugiert, um kommerziell erhältliche Anti-myc-Anitköper, wie den monoklonalen AK 9E10, gegen das Fusionsprotein einsetzten zu können (2.2.4.1). Die 6 Histidine wurden zur Aufreinigung des löslichen BACE (BACE-L) über Nickel-Säulenmaterial benötigt (2.7.1.1 / 3.6.1.1). Für die Transfektion von MDCK Zellen werden nicht konjugierte BACE cDNA-Konstrukte eingesetzt, um mögliche Interferenzen des Myc-His-Konjugats mit dem BACE-Transport auszuschließen.

Für den Nachweis des unkonjugierten BACE wurden drei polyklonale Antikörper eingesetzt (Abbildung 16 / 2.2.4.1). AK GM190 gegen das Propeptid (AS_22-45), AK 7523 gegen den Bereich der Ektodomäne, der unmittelbar an das Propeptid angrenzt (AS_46-60), und AK 7520 gegen die cytoplasmatische Domäne (AS_482-501).

Abbildung 16: Schematische Darstellung von BACE mit Angabe der Antikörper Die große luminale Domäne von BACE enthält ein Signalpeptid (Sp, schwarze Box), ein Propeptid (Pp, weiße Box) und die katalytischen Zentren (DTGS, DSGT). Die zelluläre Membran ist dunkelgrau dargestellt. Die cytoplasmatisch konjugierten Epitope „myc“ (gestreifte Box) und „His“ (schwarze Box) sind gekennzeichnet. Die Antikörper und die AS der als Antigen eingesetzten Peptide sind angegeben und durch schwarze Balken gekennzeichnet.

Spezifität der Antiseren und Nachweis von BACE im Western Blot und in der Immunopräzipitation

Um die Spezifität der Antiseren zu überprüfen, wurden Membranlysate von stabil mit BACE transfizierten HEK 293 Zellen, analysiert. Als Kontrolle wurden Membranlysate untransfizierter Zellen eingesetzt.

Abbildung 17: Nachweis von BACE im Western Blot

Im Western Blot detektiert, der gegen das Propeptid gerichtete AK GM190 eine prominente Bande bei ca. 65 kDa in Lysaten transfizierter Zellen, AK 7523 und AK 7520 erkennen in Membranlysate transfizierter Zellen jeweils eine geringfügig größere, prominente Bande bei ca.70 kDa und eine schwächere Bande bei 65 kDa. In Lysaten untransfizierter HEK 293 Kontrollzellen erkennt kein AK endogenes BACE, es sind aber auch keine nennenswerten Kreuzreaktionen sind zu beobachten (Abbildung 17).

Die Antikörper wurden zusätzlich in der Immunopräzipitation von BACE aus Zelllysaten transfizierter und nicht transfizierter HEK 293 Zellen getestet. Zur Detektion im Western Blot wurde der monoklonale AK 9E10 eingesetzt.

Abbildung 18: Nachweis von BACE in der Immunopräzipitation Zelllysate von untransfizierten (-) und BACE-wt (myc-His) transfizierten (+) HEK 293 Zellen wurden mit dem jeweils angegebenen AK immunopräzipitiert und für AK 7523 wurde zusätzlich das Präimmunserum eingesetzt (prä). Die Präzipitate wurden in der SDS-PAGE getrennt und der BACE-Nachweis erfolgte im Western Blot mit AK 9E10. Der Pfeil kennzeichnet die 70 kDa Bande, der Pfeilkopf die 65 kDa Bande.

Auch in der Immunopräzipitation reagiert der AK GM190 fast ausschließlich mit der kleineren BACE-Form, während der AK 7523 präferentiell mit der größeren 70 kDa BACE-Form reagiert. Der AK 7520 präzipitiert beide Formen gleich gut (Abbildung 18).

Berechnet ist für BACE ein theoretisches Molekulargewicht von 50 kDa. Die Migration in der SDS-PAGE bei 65 kDa und 70 kDa deutet auf eine sekundäre Modifikation hin. Die Möglichkeit einer Molekulargewichtszunahme durch Konjugation und Maturierung von Zuckern wird später untersucht (3.2.2).

Auffallend ist, dass die kleine Form präferentiell von dem gegen das Propeptid gerichtet AK GM190 erkannt wird, dieses Propeptid scheint in der größeren Form nicht mehr oder kaum noch vorhanden zu sein. AK 7523 gegen die an das Propeptid angrenzende N-terminale Domäne, erkennt besonders gut die größere BACE-Form, das AK Epitop scheint ohne Propeptid besser zugänglich zu sein.

Die Entstehung der größeren BACE-Form und die Differenz aus berechnetem und tatsächlichem Molekulargewicht weisen auf mögliche sekundäre Modifikationen hin.

Maturierung von BACE durch post-translationale Modifikationen Kinetik der Maturierung von BACE

Es wurde zunächst untersucht, ob zwischen der Entstehung der BACE-Migrationsformen bei 65 kDa und 70 kDa eine zeitliche Abfolge besteht. Ein Übergang der 65 kDa Form in die 70 kDa Form wäre ein Hinweis auf eine post-translationale Modifikation von BACE. Um die Funktion der BACE-Domänen bezüglich ihrer Rolle für den Transport und evtl. der transportabhängigen Enzymaktivität zu analysieren, wurde ferner untersucht, ob die cytoplasmatischen Domäne bzw. die Membranverankerung von BACE für die mögliche Maturierung benötigt werden. Dazu wurden die cDNA-Konstrukte BACE-wt, BACE-ΔC und BACE-L (Abbildung 19) stabil in HEK 293/βAPPwt transfiziert.

Abbildung 19: Darstellung der eingesetzten BACE-Konstrukte Alle Konstrukte sind mit der Sequenz für „myc“ und „His“ konjugiert. BACE-ΔC enthält die Transmembrandomäne, nicht aber die cytoplasmatische Domäne von BACE, die BACE-Sequenz endet mit V477. BACE-L enthält weder die Transmembrandomäne, noch die cytoplasmatische Domäne und endet kurz vor der potentiellen Transmembrandomäne mit T454. Signalpeptid, Propeptid und die aktiven Zentren sind gekennzeichnet.

Die Maturierung von BACE wurde in „pulse/chase“-Experimenten analysiert (Abbildung 20 / 2.5.4.3). Eine kleine Population von neu synthetisiertem BACE wurde radioaktiv markiert (pulse) und diese Population wurde zeitlich in ihrer Maturierung verfolgt (chase). Zu den angegebenen „chase“-Zeitpunkten wurden Zelllysate hergestellt und mit AK 9E10 immunopräzipitiert. Zusätzlich wurde das konditionierte Medium von der BACE-L exprimierenden Zelllinie gesammelt und ebenfalls immunopräzipitiert, da erwartet werden konnte, dass die lösliche Variante von BACE in das Medium sezerniert wurde.

Abbildung 20: Maturierung von BACE-wt, BACE-ΔC und BACE-L analysiert im „pulse/chase“-Experiment

Das zum „chase“-Zeitpunkt „0 min“ hergestellte Zelllysat zeigt für alle BACE-Varianten ausschließlich eine Bande bei ca. 65 kDa, es handelt sich hierbei um die Ausgangspopulation, die während des „pulse“ radioaktiv markiert wurde. Beim „chase“-Zeitpunkt „60 min“ ist für BACE-wt und BACE-L eine zweite, mature Bande bei ca. 70 kDa zu erkennen. Zusätzlich ist für BACE-L die mature Form deutlich im Medium detektierbar und nach 120 min ist fast die gesamte radioaktiv markierte BACE-L-Population sezerniert. Die mature Form ist für BACE-ΔC erst zum nach 120 min erkennbar. Die Quantifizierung der Maturierung von BACE-wt, BACE-ΔC und BACE-L zeigt, dass die lösliche Form effizient und am schnellsten maturiert, während BACE-ΔC am langsamsten maturiert (Abbildung 21A). Wird hingegen die Stabilität der maturen Form betrachtet, so ist matures BACE-ΔC am stabilsten und matures BACE-wt wird am schnellsten abgebaut (Abbildung 21B). Da matures BACE-L sezerniert wird kommt es nach 60 min „chase“ zur dramatischen Abnahme von maturem BACE-L im Zelllysat. Auch im Medium wird sezerniertes BACE-L abgebaut, der Abbau ist jedoch langsamer als der von BACE-wt im Lysat.

Abbildung 21: Quantifizierung der Maturierung und des Abbaus von BACE-wt, BACE-ΔC und BACE-L

Zusammenfassend ist festzustellen, dass BACE eine zeitabhängige Vergrößerung seines Molekulargewichts erfährt. Für diese Maturierung sind die cytoplasmatische Domäne und die Membranverankerung nicht erforderlich. Für membrangebundenesBACE erhöht die cytoplasmatische Domäne die Effizienz der Maturierung, allerdings auch die Degradation.

N-Glycosylierung von BACE

Viele der im ER synthetisierten Proteine werden durch kovalente Bindung von Zuckern am Amidstickstoff des Asparagin glycosyliert. Die Übertragung der Oligosaccharide erfolgt im ER direkt während der Peptidsynthese durch eine membrangebundene Glycosyltransferase. Die Glycosyltransferase erkennt die Konsensus-Sequenz -N(X)[S/T]-, wobei X jede beliebige Aminosäure außer Prolin sein kann. BACE enthält vier mögliche N-Glycosylierungsstellen.

Die im ER auf das Protein übertragenen „core“-Oligosaccharide sind Pentasaccharide, bestehend aus zwei β-glycosidisch verknüpften N-Acetyl-Glucosamineinheiten verbunden mit einer β-glycosidisch gebundenen Mannose, mit der wiederum zwei α-glycosidisch verbundene Mannoseeinhheiten verknüpft sind. Zunächst werden die „core“-Oligosaccharide im ER getrimmt, um dann im Golgi-Apparat zu komplexen, proteinspezifischen Zuckerresten aufgebaut zu werden.

Neben der N-Glycosylierung an Asparagin können auch Oligosaccharide kovalent an das Sauerstoffatom des Serins oder Threonins gebunden werden, diese häufig vorkommende Bindung wird als O-Glycosylierung bezeichnet und erfolgt ausschließlich im Golgi-Apparat.

Zucker abspaltende Enzyme, Glycosidasen, spalten spezifisch bestimmte Zuckerverbindungen und können zur Analyse der Glycosylierung von Proteinen eingesetzt werden. Alle N-glycosylierten Zuckerreste können durch N-Glycosidase F abgespalten werden, O-glycosylierte Zucker werden nicht abgespalten (Tarentino et al., 1985). Endoglycosidase H (Endo H) spaltet mannosereiche und keine komplexen N-glycosylierten Zuckerketten. Da Komplex-Zucker erst im Golgi-Apparat aufgebaut werden, weist eine Endo H Stabilität der Zucker auf eine Lokalisierung im Golgi-Apparat oder späteren Zellkompartimenten hin (Tarentino und Maley, 1974).

Um zu untersuchen, ob BACE N-glycosyliert wird, wurden BACE exprimierende Zellen im „pulse/chase“-Experiment radioaktiv markiert und nach einer „chase“-Zeit von 120 Minuten lysiert. Zu diesem „chase“-Zeitpunkt liegen ungefähr gleiche Mengen immatures und matures BACE vor (Abbildung 20). Zelllysate wurden mit AK 9E10 immunopräzipitiert und mit N-Glycosidase F oder mit dem entsprechenden Puffer inkubiert. Nach Auftrennung der Proben in der SDS-PAGE wurde BACE in der Autoradiografie detektiert (Abbildung 22). In der unbehandelten Kontrollspur kann immatures und matures BACE bei ca. 65 und 70 kDa nachgewiesen werden. In der behandelten Spur ist im Wesentlichen eine Bande bei einem Molekulargewicht von ca. 50 kDa nachweisbar. Hierbei handelt es sich um die vollständig deglycosylierte Form des Proteins. Das Molekulargewicht von 50 kDa entspricht der kalkulierten Masse von BACE.

Abbildung 22: N-Glycosidase F Behandlung von BACE BACE-wt transfizierte HEK 293 Zellen wurden im „pulse/chase“-Experiment radioaktiv markiert, zum „chase“-Zeitpunkt „120“ min wurden Zelllysate hergestellt und mit AK 9E10 immunopräzipitiert. Ein Immunopräzipitat wurde mit N-Glycosidase F inkubiert (+), ein weiteres zur Kontrolle nur mit dem Inkubationspuffer (-). Die Proben wurden im 8%-SDS-Gel getrennt. Abgebildet ist eine Autoradiografie des Gels.

Ein weiterer Nachweis für eine N-Glycosylierung von BACE wurde durch eine Behandlung mit dem Antibiotikum Tunicamycin erbracht. Tunicamycin kann aufgrund seiner Analogie zum UDPN-Acteylglucosamin die Bildung des „core“-Oligosaccharids verhindern. Dadurch werden NGlycosylierungen vollständig unterbunden (Leavitt et al., 1977;McDowell und Schwarz, 1988).

BACE exprimierende Zellen wurden mit Tunicamycin vorbehandelt und in Anwesenheit von Tunicamycin wurde ein „pulse/chase“-Experiment durchgeführt. Zelllysate zum „chase“-Zeitpunkt „0“ und „120“ Minuten wurden mit AK GM190 und AK 9E10 immunopräzipitiert (Abbildung 23).

Abbildung 23: Tunicamycin Behandlung BACE exprimierender Zellen BACE-wt transfizierte HEK 293 Zellen wurden nach Tunicamycin Vorbehandlung, in Anwesenheit von Tunicamycin im „pulse/chase“-Experimeniment radioaktiv markiert. Zu den „chase“-Zeitpunkten „0 min“ und „120 min“ wurden Zelllysate hergestellt und mit AK GM190 und AK 9E10 immunopräzipitiert. Die Proben wurden im 8%-SDS-Gel getrennt. Abgebildet ist eine Autoradiografie des Gels.

In Gegenwart von Tunicamycin erhält man ausschließlich eine Bande von 50 kDa, entsprechend dem Molekulargewicht von deglycosyliertem BACE (Abbildung 22). Auch beim „chase“-Zeitpunkt „120 min“ ist keine Glycosylierung von BACE nachweisbar. Die Behandlung mit Tunicamycin verhindert nicht nur die Glycosylierung von BACE, sondern vermutlich auch die Abspaltung des Propeptides. Der AK GM190 präzipitiert zum „chase“-Zeitpunkt „120 min“ unvermindert die unglycosylierte BACE-Form (Abbildung 23). In „pulse/chase“-Experimenten, ohne Tunicamycin Behandlung wird zu diesem Zeitpunkt mit dem AK GM190 kaum noch radioaktiv markiertes BACE präzipitiert (Abbildung 25).

Um zu klären, ob die mature Form von BACE den Golgi-Apparat und das TGN erreicht, wurde untersucht, inwieweit die mature Form komplex glycosyliert und damit Endo H resistent ist.

Abbildung 24: Endoglycosidase H Behandlung von BACE BACE-wt transfizierte HEK 293 Zellen wurden im „pulse/chase“-Experimeniment radioaktiv markiert. Zum „chase“-Zeitpunkt „120 min“ wurden Zelllysate hergestellt und mit AK 9E10 immunopräzipitiert. Ein Immunopräzipitat wurde mit Endo H inkubiert (+), ein weiteres zur Kontrolle mit dem Inkubationspuffer (-). Die Proben wurden im 8%-SDS-Gel getrennt. Abgebildet ist eine Autoradiografie des Gels.

Durch Endo H Behandlung ändert die mature Form von BACE ihr Migrationsverhalten in der SDS-PAGE nicht, sie ist Endo H stabil und muss daher komplex glycosyliert sein (Abbildung 24). Immatures BACE wird durch Endo H deglycosyliert und migriert im SDS-Gel bei 50 kDa (Abbildung 24), dem Molekulargewicht des nicht glycosylierten BACE.

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass BACE im ER N-glycosyliert wird. Beim Transport vom ER über den Golgi-Apparat zum TGN werden die Zucker zu einer Endo H resistenten, komplexen Form modifiziert, dadurch kommt es zu einer Zunahme des Molekulargewichts um ca. 5 kDa, von 65 kDa zu 70 kDa.

Analyse der Propeptidprozessierung von BACE

Propeptidkonvertasen (PK) oder auch Propeptidpeptidasen genannt, hydrolysieren die Abspaltung eines Propetides vom Proprotein, dadurch entsteht ein aktiviertes, matures Protein (Nakayama, 1997;Thomas, 2002). Dieser Mechanismus spielt eine große Rolle in der Aktivierung von Proteinen, Enzymen und Hormonen im sekretorischen Transportweg (Nakayama, 1997;Thomas, 2002). PK sind in Vertebraten und vielen Invertebraten ubiquitiär exprimiert. Sie gehören zur Subtilisin Proteinfamilie. Ihr katalytisches Zentrum, bestehend aus den Aminosäuren Asp, His, Ser, ist homolog zu dem bakterieller Serin-Endoproteasen und zu dem der Hefe-Endoprotease Kex2p. In Säugern wurden bisher sieben PK mit einer 50-70 % identischen katalytischen Domäne identifiziert. Furin ist die am besten analysierte PK, mit einem breiten pH-Wert Optimum von pH 5-8 und einer strikten Calciumabhängigkeit, für maximale Aktivität wird eine 1 mM Calciumkonzentration benötigt. Furin-Aktivität konnte in verschiedenen Zellkompartimenten nachgewiesen werden (Bresnahan et al., 1990;Hatsuzawa et al., 1992;Molloy et al., 1992). Die Konsensussequenz von Furin ist -RX(K/R)R- (Hosaka et al., 1991), an Position P2 ist eine basische Aminosäure ausreichend (Krysan et al., 1999;Molloy et al., 1992). Der Schnitt findet hinter dem C-terminalen Argenin statt. Eine entsprechende minimale Konsensussequenz mit -RLPR- ist auch in BACE vorhanden.

Zelluläre Lokalisierung der BACE-Propeptidabspaltung

Wie in anderen Arbeiten postuliert wurde (Lin et al., 2000;Sinha et al., 1999;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999), wird BACE als Proenzym, mit einem relativ kurzen Propeptid von 24 AS, exprimiert. Die Propeptidabspaltung von BACE wurde in „pulse/chase“-Experimenten untersucht und die subzelluläre Lokalisierung von Propeptid enthaltendem BACE (Pro-BACE) wurde in Immunofluoreszenzen analysiert (Abbildung 25).

Abbildung 25: Propeptidabspaltung von BACE, analysiert im „pulse/chase“-Experiment und in der Immunofluoreszenz A: HEK 293 Zellen mit stabiler Überexpression von BACE-wt wurden 10 min mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert, gefolgt von einer Inkubation mit nicht radioaktivem Medium. Zu den angegebenen „chase“-Zeitpunkten wurden Zelllysate hergestellt. Lysate wurden mit AK 7520 und AK GM190 immunopräzipitiert. Die Präzipitate wurden im 10%-SDS-Gel aufgetrennt, gezeigt sind die Autoradiografien der Gele. Matures und immatures BACE sind gekennzeichnet. B: Auf Deckgläschen gewachsene HEK 293 Zellen mit stabiler Überexpression von BACE-wt wurden fixiert und mit Triton X-100 permeabilisiert. BACE und Pro-BACE wurden mit AK 9E10, AK GM190 und fluoreszierendem 2. AK nachgewiesen. Pfeile weisen auf die typischen Fluoreszenzsignale hin.

Im „pulse/chase“-Experiment ist zu erkennen, dass Pro-BACE nicht maturiert. Der gegen das Propeptid gerichtete AK GM190 immunopräzipitiert ausschließlich immatures BACE. Immatures BACE und Pro-BACE nehmen während der „chase“-Zeit vergleichbar ab, parallel kommt es zur Zunahme von maturem BACE (Abbildung 25A). Die Propeptidabspaltung scheint unmittelbar vor der komplexen Glycosylierung von BACE stattzufinden und damit vor dem Erreichen des TGN. Die Immunofluoreszenzen bestätigen eine unterschiedliche Lokalisierung von Pro-BACE und BACE. Pro-BACE ist überwiegend in der Kernhülle und in ER-ähnlichen Strukturen lokalisiert, kann aber kaum im Golgi-Apparat nachgewiesen werden (Abbildung 25B). Dahingegen zeigt AK 9E10, der Pro-BACE und BACE erkennt, eine starke Fluoreszenz in Strukturen, die an einer Seite des Zellkerns lokalisiert sind und wahrscheinlich dem Golgi-Apparat entsprechen (Abbildung 25).

Die „pulse/chase“-Experimente und die subzelluläre Lokalisierung von BACE weisen daraufhin, dass die Propeptidabspaltung auf dem zellulären Transportweg vom ER zum Golgi-Apparat, im ER, „intermediate“ Kompartiment oder cis-Golgi-Apparat, stattfindet.

Durch die gezielte Blockierung zellulärer Transportvorgänge können bestimmte Mechanismen oder enzymatische Aktivitäten subzellulären Kompartimenten zugeordnet werden. Brefeldin A (BFA) inhibiert den Vorwärtstransport vom ER zum Golgi-Apparat (Dinter und Berger, 1998;Klausner et al., 1992). Da der Rücktransport nicht blockiert wird, kommt es vermutlich zur Fusion des ER und Golgi-Apparats (Alberts et al., 2002;Haass und Selkoe, 1993). Der Transportweg von cis- und medialen-Golgi-Zisternen zum TGN kann durch Monensin blockiert werden, wobei ER und Golgi-Apparat nicht verschmelzen (Rosa et al., 1992;Wild-Bode et al., 1997).

Zur weiteren Untersuchung der subzellulären Lokalisation der Propeptidabspaltung von BACE wurden „pulse/chase“-Experimente in Anwesenheit von BFA oder Monensin durchgeführt. Zelllysate wurden mit AK GM190 gegen das Propeptid und zur Kontrolle mit AK 7520 oder AK 9E10 immunopräzipitiert.

Abbildung 26: BFA- und Monensin Behandlung BACE exprimierender Zellen

In Zelllysaten BFA oder Monensin behandelter Zellen ist nur die immature BACE-Variante nachzuweisen, der Umbau der N-glycosylierten Zucker zu komplexen Strukturen findet nicht mehr statt (Abbildung 26).

Bei BFA Behandlung kommt es zu einer leichten Reduktion des Molekulargewichts, wahrscheinlich aufgrund des Trimmens der Zucker. Die immature BACE-Form ist instabil und zum „chase“-Zeitpunkt „60 min“ ist im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle und zur Monensin Behandlung eine deutliche Reduktion zu beobachten (Abbildung 26, vgl. Abbildung 20). In der Immunopräzipitation von BACE mit AK GM190 und AK 9E10 ist kein wesentlicher Unterschied zu erkennen. Dies weist daraufhin, dass das Propeptid bei BFA-Behandlung nicht abgespalten wird.

Monensin erhöht die Stabilität von BACE (Abbildung 26). Bei der Präzipitation von BACE mit AK GM190 ist beim „chase“-Zeitpunkt „120 min“ kaum eine Reduktion des immaturen BACE festzustellen, dies zeigt, dass auch bei Monensin Behandlung das Propeptid nicht abgespalten wird (Abbildung 26, vgl. Abbildung 25).

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Propeptidabspaltung von BACE nicht im ER stattfindet, sondern später im sekretorischen Transportweg, jedoch bevor es zum Aufbau von komplexen Zuckern kommt. BFA und Monensin blockieren den Transport von BACE vom ER zum Golgi-Apparat bzw. vom Golgi-Apparat zum TGN, und damit ist auch die Propeptidabspaltung und die Maturierung von BACE blockiert.

Bestimmung der Schnittstelle der BACE-Propeptidkonvertase

Aufgrund der in BACE vorhandenen PK-Konsensussequenz wird angenommen, dass die BACE prozessierende PK nach der minimalen Furin Konsensussequenz -RLPR- schneidet. Um diese Hypothese zu überprüfen wurde die Konsensussequenz durch eine Mutation von Arg zu Ala an Position 45 in -RLPA- verändert, sodass sie nicht mehr von Furin oder einer furinähnlichen PK erkannt werden konnte (Krysan et al., 1999;Molloy et al., 1992).

Abbildung 27: Darstellung des BACE R45A Konstruktes Das BACE R45A Konstrukt ist mit der Sequenz für „myc“ und „His“ konjugiert und entspricht, abgesehen von dem AS Austausch Arg ♢ Ala an Position 45, der Sequenz von BACE-wt.

BACE mit der Mutation R45A wurde stabil in HEK 293/βAPPwt Zellen exprimiert. In „pulse/chase“-Experimenten wurde die Maturierung dieser BACE-Mutante und der Einfluss der Mutation auf die Propeptidabspaltung untersucht.

Abbildung 28: BACE R45A analysiert im „pulse/chase“-Experiment HEK 293 Zellen mit stabiler Überexpression von BACE R45A wurden 10 min mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert, gefolgt von einer Inkubation mit nicht radioaktivem Medium. Zu den angegebenen „chase“-Zeitpunkten wurden Zelllysate hergestellt. Die Lysate wurden mit AK 9E10 und AK GM190 immunopräzipitiert und im 10%-SDS-Gel aufgetrennt. Immatures BACE ist gekennzeichnet.

Zelllysate der entsprechenden „chase“-Zeitpunkte wurden zur Untersuchung der Maturierung mit AK 9E10 immunopräzipitiert. Obwohl AK 9E10 die immature und mature Form von BACE mit gleicher Affinität immunopräzipitiert, ist eine Maturierung von BACE R45A nicht zu detektieren (Abbildung 28). Für BACE-wt ist die mature Form nach 60 min nachweisbar und nach 120 min liegt überwiegend matures BACE vor (Abbildung 20 / Abbildung 25). Die immature BACE R45A Form ist stabil und wird während des „chase“-Zeitraums von 240 Minuten kaum abgebaut (Abbildung 28). Im Gegensatz dazu ist für BACE-wt nach 240 min kein immatures BACE zu detektieren (Abbildung 25). Die Immunopräzipitation der Zelllysate mit AK GM190 zeigt, dass das Propeptid während der „chase“-Periode nicht abgespalten wird. Die Vermutung, dass es sich bei der Sequenzabfolge -RLPR- um die Erkennungssequenz der BACE schneidenden PK handelt, hat sich bestätigt.

Einfluss von BACE auf die βAPP-Prozessierung

BACE schneidet βAPP N-terminal des Aβ-Peptids und leitet damit die Freisetzung von Aβ ein.

Nachdem die Maturierung und von BACE in Abhängigkeit von der cytoplasmatischen Domäne und der Transmembrandomäne untersucht wurde, wurde der Einfluss dieser Domänen auf die Aktivität untersucht. Es wurde ferner anhand der BACE R45A Mutante untersucht, ob eine Propeptidabspaltung und Maturierung von BACE für die enzymatische Aktivität, d.h. für die Freisetzung von Aβ notwendig ist.

Antikörper zum Nachweis des βAPP und der βAPP-Prozessierungsprodukte

βAPP gehört zur Gruppe der N- und O-glycosylierten Transmembranproteine vom Typ I. Während des Transports auf dem sekretorischen Weg vom ER über den Golgi-Apparat zur Zelloberfläche und der folgenden Reinternalisierung kann βAPP, zunächst von α- oder β-Sekretase, dann von der γ-Sekretase, proteolytisch prozessiert werden (1.3.2). Die zum Nachweis von βAPP und seinen proteolytischen Fragmenten benutzten Antikörper sind in Abbildung 29 dargestellt. Der Ektodomänen AK 5313 (Steiner et al., 1999;Steiner et al., 1999;Walter et al., 2000) detektiert alle lösliche Formen von βAPP (l-βAPP) sowie das Holoprotein, während AK 6687 das Holoprotein und alle membrangebundenen, C-terminalen Fragmente erkennt (Capell et al., 2000). Zum Nachweis von l-βAPPα wurde der neoepitopspezifische AK 1736 eingesetzt, der ausschließlich mit der an der α-Schnittstelle endenden βAPP-Spezies reagiert (Haass et al., 1992). Zur Aβ-Präzipitation wurde der alle Aβ-Spezies erkennende AK 3926 (Wild-Bode et al., 1997) eingesetzt.

Abbildung 29: Schematische Darstellung von βAPP₆₉₅ mit Angabe der Antikörper Die luminale Domäne von βAPP enthält ein Signalpeptid (Sp, schwarze Box), die zelluläre Membran ist grau dargestellt. Die Aβ Domäne (rote Box) ist zusätzlich vergrößert, unter Angabe der AS-Sequenz im Einbuchstabencode dargestellt. Die potentiellen Schnittstellen der α-, β-, und γ-Sekretase sind durch Pfeile gekennzeichnet. Die Antikörper und die AS der als Antigen eingesetzten Peptide sind angegeben und durch schwarze Balken gekennzeichnet.

Prozessierung von βAPP durch BACE und die BACE-Varianten: ΔC, L, R45A

Die BACE-Konstrukte wurden stabil in HEK 293 Zellen transfiziert, die bereits βAPPwt exogen exprimieren. Alle Zelllinien exprimieren ähnliche Mengen βAPPwt, da die gleiche Ausgangszelllinie zur Transfektion der BACE-Konstrukte benutzt wurde. Die BACE-Expression ist ebenfalls vergleichbar, nur die Zelllinie BACE R45A hat eine niedrigere Expression (Abbildung 28). Für diese Zelllinie konnten keine hoch exprimierenden Klone gefunden werden. Zur Analyse der βAPP-Prozessierung wurden die Zelllinien BACE-wt, BACE-ΔC, BACE-L, BACE R45A, und zur Kontrolle die βAPPwt und βAPPsw exprimierenden Zelllinien, 4 h mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert. Die sezernierten Prozessierungsprodukte l-βAPPα, lβAPP_totalsowie die Aβ- und p3-Spezies wurden aus den konditionierten Medien immunopräzipitiert (Abbildung 30).

Abbildung 30: βAPP-Prozessierung in Abhängigkeit von BACE und BACE-Varianten Die angegebenen Zelllinien wurden 4 h mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert, konditionierte Medien wurden gesammelt und Aliquote zur Immunopräzipitation von l-βAPPα (10 %), l-βAPP_total(10 %) und Aβ (80 %), mit den AK 1736, AK 5313 und AK 3926 eingesetzt. Die Immunopräzipitate von l-βAPP wurden im 8%-SDS-Gel aufgetrennt, die von Aβ im Tris-Tricine-Gel. Abgebildet sind Autoradiografien der getrockneten Gele.

Zur Beurteilung der BACE-Aktivität ist es notwendig, die Sezernierung von l-βAPPα im Verhältnis zur Sezernierung von l-βAPP_total zu betrachten, da die Gesamtsezernierung der verschiedenen Zelllinien unterschiedlich ist. Die Autoradiografie der Aβ- und p3-Spezies gibt jedoch einen direkten Hinweis auf die BACE-Aktivität. Die Zelllinien BACE-wt, BACE-ΔC und BACE-L zeigen im Vergleich zur Kontrollzelllinie βAPPwt eine erhöhte Aβ- und deutlich verminderte p3-Produktion. Es entsteht neben der Aβ-Spezies, deren N-Terminus mit Asp1 beginnt (Aβ_(1-40/42) oder Aβ_Asp1) eine weitere mit Glu11 beginnende Aβ-Spezies (Aβ_(11-40/42), Aβ_Glu11) (1.3.2.2). BACE schneidet βAPP mit größter Affinität zwischen M595 und D596, aber katalysiert auch den Schnitt zwischen Y605 und E606 (1.3.2.2) (Vassar et al., 1999). Die Positionsangaben sind bezogen auf die Spleißform βAPP₆₉₅. Die Zelllinie BACE R45A zeigt keine erhöhte Aβ-Produktion. βAPPsw wird, wie aufgrund der erhöhten Affinität von BACE zum βAPPsw-Substrat zu erwarten war, hauptsächlich von BACE geschnitten und es entsteht überwiegend Aβ_(1-40/42) (1.3.2.2) (Citron et al., 1992;Lin et al., 2000;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999).

Die Quantifizierung von drei unabhängigen Experimenten bestätigt für die Zelllinien BACE-wt, BACE-ΔC und BACE-L eine reduzierte α-Sekretase Prozessierung von βAPP. Die l-βAPPα- und p3-Sezernierung sind deutlich vermindert. Hingegen zeigt BACE R45A keine Veränderung der Aβ-Sezernierung im Vergleich zur Kontrollzelllinie βAPPwt (Abbildung 31A/B).

Abbildung 31: Quantitative Auswertung der l-βAPP- und Aβ-Sezernierung Quantifizierung der radioaktiven Immunopräzipitate von l-βAPPα, l-βAPP_total und Aβ bzw. p3 mittels Phosphor-Imager, Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Experimenten. Der Anteil der α-Sekretase Prozessierung an der Gesamtprozessierung von βAPP wird im Verhältnis der Sezernierung von l-βAPPα zu l-βAPP_total (A), oder im Verhältnis von p3 zu Aβ_Asp1 (B) ausgedrückt.

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass BACE-wt, BACE-ΔC und BACE-L βSekretase Aktivität zeigen und in transfizierten Zellen kaum Unterschiede in der Aktivität zu erkennen sind. Damit wäre BACE-L eine mögliche Enzymquelle für ein Assay System.

Eine genaue Betrachtung der entstehenden Aβ-Spezies für BACE-wt, BACE-ΔC und BACE-L lässt Unterschiede im Aβ_Glu11 und Aβ_Asp1 Verhältnis erkennen (Abbildung 30). Eine Quantifizierung der Aβ-Spezies aus drei unabhängigen Experimenten bestätigt diesen Eindruck (Abbildung 32).

Abbildung 32: Sezernierung von Aβ_Asp1 und Aβ_Glu11 in Abhängigkeit von der BACE-Variante Quantifizierung der radioaktiven Immunopräzipitate Aβ_Asp1und Aβ_Glu11 mittels Phosphor-Imager. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Experimenten. Der Anteil der Aβ_Glu11-Spezies zu der Aβ_Asp1-Spezies ist dargestellt.

BACE-ΔC transfizierte Zellen produzieren die größte Menge der Aβ_Glu11-Spezies, BACE-L transfizierte Zellen die geringste. Möglicherweise liegt eine Korrelation zwischen Geschwindigkeit der Maturierung und der Entstehung der Aβ_Glu11-Spezies vor, BACE-ΔC maturiert am langsamsten und BACE-L am schnellsten (Abbildung 20 / Abbildung 21). Dieser Zusammenhang könnte daraufhin deuten, dass der Ort der Entstehung von Aβ_Asp1 und Aβ_Glu11 in der Zelle ein anderer ist.

Identifizierung der Propeptidkonvertase von BACE

Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Aminosäureabfolge -RLPR- die Konsensussequenz für die BACE prozessierende PK ist und eine Mutation an dieser Schnittstelle sowohl die Maturierung (Abbildung 28), als auch die Aktivierung von BACE (Abbildung 30 / Abbildung 31) verhindert, wurde die BACE schneidende PK und die Bedeutung der BACE-Prodomäne auf die enzymatische Aktivität weiter untersucht. Es ist notwendig von der BACE-Mutation unabhängige Methoden zur Untersuchung der BACE-PK einzusetzen, da es auch möglich wäre, dass die blockierte Maturierung von BACE R45A nicht direkt durch die verhinderte Propeptidabspaltung bedingt ist, sondern die Mutation eine falsche Faltung induziert. Daraufhin könnte BACE R45A kaum das ER verlassen, sondern würde verstärkt dem proteasomalen Abbau falsch gefalteter Proteine zugeführt werden (Bonifacino und Lippincott-Schwartz, 1991;Tsai et al., 2002). Ein verstärkter Abbau von BACE R45A könnte auch die niedrige Expression erklären, und ein verminderter Export aus dem ER könnte die Ursache für die Blockierung der Maturierung und der Aktivität sein. Die Effekte der Mutation R45A auf BACE-Maturierung und -Aktivität wären unspezifisch auf die falsche Faltung zurückzuführen. Zur weiteren Klärung der Rolle des BACE-Propeptids wurde die endoproteolytische Spaltung von BACE spezifisch inhibiert.

Die bekannten Bedingungen des Furin-Schnitts wurden genutzt, um funktionelle Peptidinhibitoren zu generieren. Ein solcher Inhibitor ist das Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-chloromethylketon (Garten et al., 1994;Hallenberger et al., 1992;Jean et al., 1995). Im Folgenden wurde der Einfluss des Inhibitors auf den Propeptidschnitt und die Maturierung von BACE untersucht, dazu wurden „pulse/chase“-Experimente in Anwesenheit des Inhibitors durchgeführt (2.5.6.2).

Abbildung 33: Einfluss eines Furin-Inhibitors auf BACE-wt Maturierung, analysiert im „pulse/chase“-Experiment BACE-wt transfizierte HEK 293 Zellen wurden nach Inhibitor bzw. Lösungsmittel Vorbehandlung, in Anwesenheit von Inhibitor/Lösungsmittel 10 min mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert, gefolgt von einer Inkubation mit nicht radioaktivem Medium. Zu den angegebenen „chase“-Zeitpunkten wurden Zelllysate hergestellt und die Lysate wurden mit AK GM190 und AK 9E10 immunopräzipitiert. Die Präzipitate wurden im 10%-SDS-Gel aufgetrennt. Gezeigt sind die Autoradiografien der Gele. Matures und immatures BACE sind gekennzeichnet.

Die Anwesenheit des Inhibitors verhindert nicht die Maturierung von BACE (Abbildung 33, IP: AK 9E10). Auffallend ist jedoch, dass das Propeptid in Anwesenheit des Inhibitors nicht mehr effizient abgetrennt wird, so entsteht eine komplex-glycosylierte Form von BACE die das Propeptid enthält (Abbildung 33, IP: AK GM190). In dem Kontrollexperiment, ohne Einsatz von Inhibitor, entsteht ausschließlich matures BACE, dass kein Propeptid enthält. Das Propeptid wird vollständig vor der Maturierung von BACE abgetrennt. Trotzdem ist die Abtrennung des Propeptids nicht Vorraussetzung für die komplexe Glycosylierung von BACE, wie der Einsatz des Inhibitors zeigt.

Inwieweit in Anwesenheit des Inhibitors die Propeptidabspaltung vor der komplexen Glycosylierung stattfindet, ist schwer abzuschätzen, da Immunopräzipitationen mit verschiedenen AK miteinander verglichen werden müssen. Bei einer Inhibitorkonzentration von 10 µM musste für die Autoradiografie der Immunopräzipitation mit dem AK GM190 eine lange Expositionszeit gewählt werden, um die geringe Menge von komplex-glycosyliertem, Propeptid enthaltendem BACE zu detektieren („chase“-Zeitpunkt „120 min“), im Vergleich ist die radioaktiv markierte Ausgangsmenge von immaturem BACE sehr hoch („chase“-Zeitpunkt „0 min“). Die Immunopräzipitation mit AK 9E10 zeigt im Vergleich zum Ausgangsmaterial („chase“-Zeitpunkt „0 min“) größere Mengen von maturem BACE („chase“-Zeitpunkt „120 min“). Ähnlich sind die Verhältnisse bei einer Inhibitorkonzentration von 50 µM. Der AK 9E10 präzipitiert, bei gleichen Mengen von immaturem BACE zum „chase“-Zeitpunkt „0 min“, größere Mengen von maturem BACE als der AK GM190 („chase“-Zeitpunkt „120 min“). Es ist damit davon auszugehen, dass auch bei einer Inhibitorkonzentration von 50 µM eine Propeptidabspaltung noch teilweise stattfindet und matures BACE mit und ohne Propeptid vorliegt.

Obwohl nur ein geringer Effekt des Peptidinhibitors auf die BACE-Maturierung festgestellt werden konnte, wurde ein möglicher Einfluss auf die BACE-Aktivität untersucht (Abbildung 34). BACE-wt und βAPPwt koexprimierende HEK 293 Zellen wurden in Anwesenheit des Inhibitors 4 h mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert. Die sezernierten Prozessierungsprodukte Aβ und p3 wurden aus den konditionierten Medien immunopräzipitiert.

Abbildung 34: Einfluss des Furin-Inhibitors auf die BACE-Prozessierung von βAPP BACE-wt transfizierte HEK 293 Zellen wurden nach Inhibitor (10, 50 µM) bzw. Lösungsmittel (-) Vorbehandlung, in Anwesenheit von Inhibitor (10, 50 µM)/Lösungsmittel (-) 4 h mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert, konditionierte Medien wurden gesammelt, mit AK 3926 immunopräzipitiert und in der Tris-Tricine-PAGE aufgetrennt. Abgebildet ist die Autoradiografie (A). Eine Quantifizierung von Aβ- im Verhältnis zur p3-Sezernierung ist in (B) dargestellt.

Die Autoradiografie zeigt abhängig von der Inhibitorkonzentration eine schwächere Aβ-Bande und einen Anstieg der p3-Bande. Im Vergleich zeigt die unbehandelte Kontrolle kaum p3, sondern fast ausschließlich die beiden Aβ-Spezies (Aβ_1-40/42; Aβ_11-40/42) (Abbildung 34A). Die Quantifizierung bestätigt den Eindruck, die Aβ-Produktion geht mit steigender Inhibitorkonzentration zugunsten der p3-Produktion zurück (Abbildung 34B). Die Effekte des Inhibitors auf die Aβ-Produktion sind deutlich und nur geringfügig abhängig von der Inhibitorkonzentration. Aufgrund des geringen Einflusses des Inhibitors auf die Propeptidabspaltung und Maturierung von BACE waren so offensichtliche Einflüsse auf die Aβ-Produktion nicht zu erwarten.

Einen weiteren Hinweis auf Furin oder einer furinähnlichen PK als BACE schneidende PK könnte die Untersuchung der Calciumabhängigkeit des Propeptidschnitts geben, da für Furin und furinähnliche Endoproteasen eine Calciumabhängigkeit bekannt ist(Bresnahan et al., 1990;Hatsuzawa et al., 1992;Molloy et al., 1992). Die Endoprotease Furin wird zunächst als Pro-Furin exprimiert und die Aktivierung durch Abspaltung des Propeptids ist calciumabhängig (Vey et al., 1994). Die Calcium Homeostase einer Zelle kann durch Calcium-Ionophor A23187 Behandlung beeinflusst werden. Durch Calcium-Ionophor werden die Calciumkanäle der Plasmamembran geöffnet, dadurch kann Calcium ungehindert in die Zelle hinein- oder herausströmen. Des Weiteren wird Calcium aus intrazellulären Speichern freigesetzt. Parallel zur Calcium-Ionophor Behandlung eingesetztes calciumfreies Medium führt zu einer Calciumreduktion innerhalb der Zelle.

Im „pulse/chase“-Experiment wurde der Calcium Einfluss auf die Maturierung und den Propeptidschnitt von BACE untersucht (2.5.6.2).

Abbildung 35: Einfluss von Calcium-Ionophor A23187 auf BACE-wt Maturierung, analysiert im „pulse/chase“-Experiment BACE-wt transfizierte HEK 293 Zellen wurden nach Calcium-Ionophor Vorbehandlung in Ca-freiem Medium (10 h), in Anwesenheit von Calcium-Ionophor 10 min mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert, gefolgt von einer Inkubation mit nicht radioaktivem Medium. Zu den angegebenen „chase“-Zeitpunkten wurden Zelllysate hergestellt und mit AK GM190 und AK 9E10 immunopräzipitiert. Die Präzipitate wurden im 10%-SDS-Gel aufgetrennt, gezeigt sind die Autoradiografien der Gele. Immatures BACE ist gekennzeichnet. Kontrollexperiment mit unbehandelten Zellen s. Abbildung 33.

Eine Calcium Depletion durch 5 µM Calcium-Ionophor Behandlung in calciumfreiem Medium blockiert den Propeptidschnitt und die Maturierung von BACE vollständig (Abbildung 35).

Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass das Propeptid von BACE durch Furin oder einer furinähnlichen Propeptidkonvertase abgespalten wird. Da Decanoyl-Arg-Val-Lys-Arg-chloromethylketon auch alle furinähnlichen Proteinkonvertasen mit niedrigen, nanomolaren K_iWerten inhibiert ist eine Differenzierung zwischen Furin und furinähnlichen Proteinkonvertasen ist nicht möglich (Jean et al., 1998). Parallel zu dieser Arbeit identifizierten andere Arbeitsgruppen Furin und furinähnliche Propeptidkonvertasen als BACE konvertierende Proteasen (4.1.4) (Bennett et al., 2000;Creemers et al., 2001).

Die Behandlung mit dem Furin-Inhibitor zeigt, dass BACE auch mit dem Propeptid komplex-glycosyliert werden kann. Die Propeptidabspaltung ist nicht Bedingung für eine komplexe Glycosylierung und für den Transport auf dem sekretorischen Weg. Dass das Propeptid die BACE-Aktivität deutlich inhibiert, zeigt die verminderte Aβ-Produktion nach Inkubation mit dem Furin-Inhibitor. Ob Pro-BACE inaktiv ist kann nicht eindeutig geklärt werden, da die Propeptidabspaltung nicht vollständig blockiert werden kann und für die verbleibende BACE-Aktivität entweder Pro-BACE oder die reduzierte Menge an vollständig prozessiertem BACE verantwortlich ist.

Die Nicht-Maturierung der Mutante BACE R45A kann nicht alleine auf die blockierte Abspaltung des Propeptids zurückgeführt werden, da Pro-BACE, wie die Experimente mit dem Furin-Inhibitor zeigen im geringen Maße komplex-glycosyliert werden kann. Die niedrige Expression von BACE R45A und die fehlende Maturierung sind Hinweise auf eine verstärkte Degradation.

Polarisierter Transport von BACE

Im Folgenden wurde untersucht, ob BACE polar transportiert wird und ob der Transport von BACE die βAPP-Prozessierung beeinflusst. Als Modellsystem wurden MDCK Zellen gewählt, die bereits für die Untersuchungen des gerichteten Transports von βAPP eingesetzt wurden (1.5.2 / 3.1.1) (De Strooper et al., 1995;Haass et al., 1995;Haass et al., 1994;Lo et al., 1994).

BACE-Prozessierung in MDCK Zellen

In MDCK Zellen, wie auch in HEK 293 Zellen (Vassar et al., 1999), ist die endogene BACE-Expression sehr niedrig. Zum besseren Nachweis wurden MDCK Zellen, die bereits βAPP₆₉₅wt stabil exprimieren (Haass et al., 1994), mit einer BACE-cDNA stabil cotransfiziert. BACE war nicht mit dem Myc-Epitop konjugiert, damit wurde von vornherein ein möglicher Einfluss des Myc-Epitopes auf den Transport ausgeschlossen.

Es wurde zunächst überprüft, ob die Maturierung von BACE in MDCK Zellen mit der in HEK 293 Zellen identisch ist. In „pulse/chase“-Experimenten wurde die Maturierung von BACE analysiert (2.5.4.4).Wie in HEK 293 Zellen kommt es zu einer Maturierung von BACE in MDCK Zellen (Abbildung 36 vgl. Abbildung 20).

Abbildung 36: Maturierung von BACE in MDCK Zellen analysiert im „pulse/chase“-Experiment Auf Filtern gewachsene MDCK Zellen mit stabiler Überexpression von BACE-wt, wurden basolateral 10 min mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert, gefolgt von einer Inkubation mit nicht radioaktivem Medium. Zu den angegebenen „chase“-Zeitpunkten wurden Zelllysate hergestellt. Die Lysate wurden mit AK 7523 und AK GM190 immunopräzipitiert. Die Präzipitate wurden in der 10%-SDS-PAGE aufgetrennt, gezeigt sind die Autoradiografien der Gele. Matures und immatures BACE sind gekennzeichnet.

Bei der Immunopräzipitation der zu den verschiedenen Zeitpunkten hergestellten Zelllysaten mit AK 7523 ist ein Molekulargewichtsanstieg von ca. 65 kDa auf 70 kDa bei dem „chase“-Zeitpunkt „30 min“ detektierbar. Zu beachten ist, dass der AK 7523 präferentiell matures BACE erkennt (Abbildung 36 / Abbildung 18), dadurch wird der Eindruck erweckt, dass mehr matures BACE entsteht als immatures BACE zu den „chase“-Zeitpunkten „0 min“ und „15 min“ vorlag. Parallel zum Molekulargewichtsanstieg findet eine Abspaltung des Propeptids statt, wie die Immunopräzipitation mit AK GM190 zeigt. Bei dem „chase“-Zeitpunkt „60 min“ liegt kaum immatures BACE mehr vor, und das Propeptid wurde fast vollständig abgespalten (Abbildung 36). Die Maturierung von BACE in MDCK Zellen ist effizienter und schneller als in HEK 293 Zellen, wo erst bei dem „chase“-Zeitpunkt „120 min“ das Propeptid fast vollständig abgespalten ist und kaum immatures BACE mehr zu detektieren ist (Abbildung 20 / Abbildung 25). Die langsamere Maturierung von BACE in HEK 293 Zellen muss nicht in der Zelllinie begründet liegen sondern könnte seine Ursache auch in dem in HEK 293 Zellen eingesetzten, konjugierten BACE-myc-His Konstrukt haben.

Um zu zeigen, dass der Molekuargewichtsanstieg während der „chase“-Zeit durch komplexe Glycosylierung der Zucker hervorgerufen wird und dass matures BACE in MDCK Zellen Endo H resistent ist, wie auch in HEK 293 Zellen (Abbildung 24), wurden Deglycosylierungsexperimente durchgeführt. Radioaktiv markiertes BACE wurde zu den „chase“-Zeitpunkten „0 min“ und „120 min“ aus den Zelllysaten mit AK 7523 immunopräzipitiert und mit N-Glycosidase F und Endo H behandelt (Abbildung 37).

Abbildung 37: Analyse der Glycosylierung von BACE in MDCK Zellen BACE-wt transfizierte MDCK Zellen wurden im „pulse/chase“-Experimeniment radioaktiv markiert. Zu den „chase“-Zeitpunkten „0 min“ und „120“ min wurden Zelllysate hergestellt und mit AK 7523 immunopräzipitiert. Die Immunopräzipitate wurden von der Matrix eluiert und aufgeteilt für die N-Glycosidase F und Endo H Behandlung (+). Für jede Inkubation wurde eine Kontrolle (-), im entsprechenden Puffer, ohne Enzym angesetzt. Die Proben wurden im 8%-SDS-Gel getrennt. Abgebildet ist eine Autoradiografie des Gels.

Die immature und auch die mature Form von BACE sind durch N-Glycosidase F Behandlung in die deglycosylierte Form mit einem Molekulargewicht von 50 kDa überführbar (Abbildung 37). Wie die Endo H Behandlung zeigt, ist die mature Form von BACE komplex glycosyliert und vollständig Endo H resistent (Abbildung 37). Damit konnte gezeigt werden, dass die Maturierung von BACE in MDCK Zellen mit der in HEK 293 Zellen vergleichbar ist (Abbildung 24).

BACE-Aktivität in MDCK Zellen

Nachdem gezeigt werden konnte, dass BACE in MDCK Zellen normal maturiert, wurde nun untersucht, ob exogen exprimiertes BACE in MDCK Zellen enzymatische Aktivität besitzt (Abbildung 38). Hierzu wurde der unter Kapitel 3.6 beschriebene, für BACE-L entwickelte Fluoreszenz Assay eingesetzt. In MDCK Zellen wurde membrangebundenes BACE-wt und nicht die lösliche Variante BACE-L exprimiert. Somit konnte als Enzymquelle nicht, wie für die Entwicklung des Assays, konditioniertes Medium eingesetzt werden (3.6.1.1), sondern BACE-wt musste aus Membranen isoliert werden. Dazu wurden von stabil mit BACE-wt transfizierten und zur Kontrolle von untransfizierten MDCK Zellen, Membranen präpariert. Die Membranen wurden mit 1 % Triton X-100 in MES Puffer extrahiert, und die lösliche Fraktion wurde im Assay eingesetzt (2.7.1.4). Als weitere Kontrollen wurden Membranextrakte von BACE transfizierten MDCK Zellen unter Zusatz des spezifischen BACE-Inhibitors GL189 mit dem Substratpeptid (Abbildung 58) oder mit einem nicht schneidbaren Kontrollpeptid inkubiert (2.7.2 / Abbildung 53) (Citron et al., 1995;Vassar et al., 1999).

Abbildung 38: Enzymatische Aktivität von BACE, exprimiert in MDCK Zellen Je Reaktion wurden 2 µl eines Membranextraktes (Proteinkonzentration: 4 µg/µl) von BACE transfizierten und untransfizierten MDCK Zellen im Assay bei einer Substratkonzentration von 400 nM eingesetzt. Extrakte von BACE transfizierten Membranen wurden zusätzlich, als Kontrolle für die Spezifität der Reaktion mit dem Inhibitor GL189 in einer Konzentration von 5 µM oder einem nicht von BACE schneidbaren Substrat inkubiert. Dargestellt sind die Mittelwerte aller Messpunkte aus drei Ansätzen, gemessen wurde die Fluoreszenzzunahme in Abhängigkeit von der Zeit.

Membranextrakte von MDCK Zellen die nur endogenes BACE exprimieren zeigen im Assay kaum Aktivität, wohingegen Membranextrakte von BACE transfizierten MDCK Zellen eine deutliche BACE-Aktivität im Assay zeigen. Dass diese Aktivität BACE spezifisch ist wird durch den Einsatz des BACE-Inhibitors GL189 demonstriert, der den Schnitt des Substratpeptids komplett verhindert. Ebenso wird das Kontrollpeptid nicht durch Membranextrakte von BACE transfizierten Zellen prozessiert (Abbildung 38).

Damit konnte gezeigt werden, dass zum einen auch Membranextrakte im Assay eingesetzt werden können, ohne dass es zu unspezifischen Aktivitäten kommt und zum anderen dass exogenes BACE in MDCK Zellen aktiv ist.

Zelloberflächenverteilung von BACE in MDCK Zellen

Für BACE konnte in HEK 293 Zellen ein Transport über den sekretorischen Prozessierungsweg zur Zelloberfläche (3.2) und ein Recycling über endosomale Kompartimente gezeigt werden (Huse et al., 2000;Walter et al., 2001). In polarisierten Zellen ist ein gerichteter sekretorischer Transport von BACE wahrscheinlich, da auch das BACE-Substrat βAPP polarisiert transportiert wird. Die Oberflächenlokalisierung von BACE in MDCK Zellen gibt Aufschluss darüber, welchen Sortierungsweg BACE im TGN einschlägt, den der apikalen oder den der basolateralen Sortierungsvesikel. Der Transport von BACE gibt Hinweise darauf, wo es zur Interaktion von BACE und βAPP kommen könnte. Ferner könnte die Prozessierung von βAPP durch BACE auch direkt an der Zelloberfläche stattfinden, wie bereits für die α-Sekretase Prozessierung von βAPP gezeigt wurde (De Strooper et al., 1993;Haass et al., 1992;Sisodia, 1992).

Zur Untersuchung des polarisierten Transports von BACE werden MDCK Zellen eingesetzt, die auf einer permeablen Membran in Filterkammern wachsen, Unter diesen Wachstumsbedingungen bilden MDCK Zellen ein polarisiertes Epithel aus, mit räumlich und funktionell getrennten, apikalen und basolateralen Plasmamembranen (1.5.1).

Immunocytochemische Detektion von BACE an der Plasma- membran

BACE überexprimierende, in Filterkammern polarisierte MDCK Zellen wurden apikal oder basolateral bei 4°C mit AK 7523 gegen die BACE-Ektodomäne inkubiert und nach intensivem Waschen fixiert. An den AK 7523 gebundener fluoreszierender Anti-Kaninchen AK wurde mit geeigneten Filtern im konfokalen Mikroskop detektiert (2.6.2).

Abbildung 39: Immunofluoreszenz von BACE an der Zelloberfläche von polarisierten MDCK Zellen Auf Filtern gewachsene, polarisierte, BACE-wt transfizierte MDCK Zellen wurden bei 4°C mit AK 7523 auf der apikalen oder basolateralen Oberfläche inkubiert, gebundener AK 7523 wurde nach Fixierung des Monolayers, mit fluoreszierendem 2. Antikörper (α-Kaninchen IgG Alexa488) detektiert. Dargestellt sind die apikale und basolaterale Oberfläche in der Aufsicht (x-y-Ebene) und im Querschnitt (z-Ebene). Die Pfeilspitzen weisen auf die apikale bzw. basale Plasmamembran hin.

BACE kann sowohl an der apikalen als auch an der basolateralen Oberfläche von MDCK Zellen nachgewiesen werden, dies wird auch in der Fluoreszenz des Querschnitts des Epithels bestätigt (Abbildung 39). Es ist die Fluoreszenz von BACE an der relativ ebenen apikalen Membran erkennbar und die typische, becherförmige Fluoreszenz an der lateralen und basalen Membran.

Biochemische Detektion von BACE an der Plasmamembran

Eine weitere Methode zum Nachweis der Oberflächenlokalisierung von Proteinen ist die Biotinylierung aller Oberflächenproteine, gefolgt von einem spezifischen, immunobiologischen Nachweis des zu untersuchenden Proteins. Dabei wird ein nicht zellgängiges Biotinderivat mittels einer N-hydroxysulfosuccinimidester-Gruppe kovalent an freie Aminogruppen der Oberflächenproteine gebunden (Green et al., 1971). Die spezifische Bindung von Biotin an Stepavidin wird zur Präzipitation der biotinylierten Proteine mit Strepavidin konjugierter Sepharose genutzt (Chaiet und Wolf, 1964;Wilcheck M. und Bayer E.A., 1990).

Drei MDCK Zellklone mit verschieden starker BACE-Expression, zwei hoch exprimierende Klone (8, 41), ein niedrig exprimierender Klon (14), wurden zur apikalen und basolateralen Oberflächenbiotinylierung eingesetzt. Die apikale und basolaterale Oberflächenexpression von BACE wurde für jeden Klon in drei unabhängigen Experimenten quantifiziert.

Abbildung 40: Biotinylierung von BACE an der Zelloberfläche vonpolarisierten MDCK Zellen A: BACE-Expression der Klone 14, 8 und 41. Zelllysate (40 µg Protein/Spur) wurden in der 8%-SDS-PAGE aufgetrennt und BACE wurde im Western Blot mit AK 7523 detektiert. B: Die MDCK Klone mit unterschiedlicher BACE-Expression wurden auf Filtern polarisiert und die Oberfläche des Zellmonolayers wurde entweder apikal (ap) oder basolateral (bl) biotinyliert. Zelllysate wurden hergestellt, biotinylierte Proteine mit Strepavidin-Sepharose präzipitiert und in der SDS-PAGE aufgetrennt. BACE wurde mit AK 7523 im Western Blot nachgewiesen. C: Für die Quantifizierung mittels Phosphor-Imgagers wurde zur Detektion im Western Blot ein jodierter 2. Antikörper eingesetzt. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus 3 unabhängigen Experimenten. Die prozentualen apikalen bzw. basolateralen Verteilungen im Verhältnis zur Gesamtoberflächenexpression sind angegeben.

Im Western Blot von BACE aus MDCK Zelllysaten und in der Oberflächenbiotinylierung kann ausschließlich matures BACE nachgewiesen werden (A/B). Die Oberflächenbiotinylierung zeigt ferner, dass BACE verstärkt an der apikalen Membran lokalisiert ist, besonders der niedrig exprimierende Klon 14 zeigt eine stark ausgeprägte apikale Lokalisierung von BACE ( Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.A/B). Die Oberflächenbiotinylierung zeigt ferner, dass BACE verstärkt an der apikalen Membran lokalisiert ist, besonders der niedrig exprimierende Klon 14 zeigt eine stark ausgeprägte apikale Lokalisierung von BACE (B/C). Die Nivellierung der apikalen Lokalisierung bei den beiden hoch exprimierenden Klonen mag seine Ursache in einer möglichen Sättigung der Sortierungsmaschinerie haben. Die Quantifizierung bestätigt diesen Eindruck, der niedrig exprimierende Klon 14 zeigt über 80 % von BACE an der apikalen Membran, während die hoch exprimierenden Klone 8 und 41 nur 60-70 % BACE apikal zeigen. Fehler! Verweisquelle konnte nicht gefunden werden.B/C). Die Nivellierung der apikalen Lokalisierung bei den beiden hoch exprimierenden Klonen mag seine Ursache in einer möglichen Sättigung der Sortierungsmaschinerie haben. Die Quantifizierung bestätigt diesen Eindruck, der niedrig exprimierende Klon 14 zeigt über 80 % von BACE an der apikalen Membran, während die hoch exprimierenden Klone 8 und 41 nur 60-70 % BACE apikal zeigen.

Interessant ist, dass BACE damit in MDCK Zellen überwiegend entgegengesetzt zu seinem basolateral sortierten Substrat βAPP transportiert wird (1.5.2) (De Strooper et al., 1995;Haass et al., 1994;Lo et al., 1994).

Neben wenigen von der Sequenz abhängigen apikalen Sortierungssignalen (Mostov et al., 2003) sind überwiegend N-Glycosylierungen oder GPI-Anker für die apikale Sortierung verantwortlich (1.5.1). Da in der cytoplasmatischen Domäne von BACE, an Position 498-500 mit der Sequenzabfolge -SLL-, ein Transportsignal für den Rücktransport aus frühen Endosomen in späte Endosomen und ins TGN nachgewiesen werden konnte (Huse et al., 2000;Pastorino et al., 2002;Walter et al., 2001), wurde untersucht, ob dieses Signal auch eine Rolle für die apikale Sortierung von BACE in MDCK Zellen spielt.

Es wurde eine stabile MDCK Zelllinie generiert, die ein BACE-Stoppkonstrukt, das mit AS 494 endet, exprimiert (BACE-STOP₄₉₄). Die Oberflächenlokalisierung der BACE-STOP₄₉₄ Mutante wurde durch Biotinylierung ermittelt.

Abbildung 41: Biotinylierung von BACE-STOP₄₉₄ an der Zelloberfläche von polarisierten MDCK Zellen A: Schematische Darstellung der BACE-STOP₄₉₄Mutante und Kennzeichnung des Sortierungsmotivs. B: Biotinylierung von BACE-STOP₄₉₄ exprimierenden, auf Filtern polarisierten MDCK Zellen. Die Oberfläche des Zellmonolayers wurde entweder apikal oder basolateral biotinyliert. Zelllysate wurden hergestellt und biotinylierte Proteine mit Strepavidin-Sepharose präzipitiert und in der SDS-PAGE aufgetrennt. BACE wurde mit AK 7523 im Western Blot nachgewiesen.

BACE-STOP₄₉₄ist überwiegend an der apikalen Zelloberfläche lokalisiert und zeigt damit keinen generellen Unterschied zur Verteilung von BACE-wt (Abbildung 41). Das SLLK-Motiv spielt somit keine Rolle für den gerichteten Transport zur apikalen Plasmamembran.

Einfluss der BACE-Sortierung auf die Prozessierung von βAPP

Bei den bisherigen Untersuchungen der βAPP-Prozessierung in MDCK Zellen wurden nur teilweise die unterschiedlichen l-βAPP-Spezies, l-βAPPβ generiert durch BACE und l-βAPPα generiert durch die α-Sekretase, berücksichtigt (De Strooper et al., 1995;Haass et al., 1995;Haass et al., 1994;Lo et al., 1994). Es konnte gezeigt werden, dass das Holoprotein βAPP zur basolateralen Plasmamembran transportiert wird und die löslichen Prozessierungsprodukte l-βAPP, Aβ und p3 basolateral sezerniert werden (De Strooper et al., 1995;Haass et al., 1995;Haass et al., 1994;Lo et al., 1994). Es blieben jedoch einige Unklarheiten bestehen. So hatte eine Deletion des cytoplasmatischen Sortierungssignals von βAPP zwar zu einer gleichmäßigen apikalen und basolateralen Oberflächenverteilung von βAPP geführt, jedoch die Sezernierung von Aβ und l-βAPP nicht wesentlich verändert (Haass et al., 1995). Die Expression der schwedischen Mutante von βAPP (βAPPsw), die die BACE-Prozessierung von βAPP erhöht (Haass et al., 1995;Thinakaran et al., 1996), führt in MDCK Zellen unerklärlicher Weise zu einer erhöhten apikalen Sezernierung von l-βAPP (1.5.2) (De Strooper et al., 1995;Lo et al., 1994).

Unter Berücksichtigung der Kenntnis der apikalen Lokalisierung von BACE wurden daher erneut die Prozessierung von βAPP und die Sezernierung seiner proteolytischen Prozessierungsprodukte in MDCK Zellen analysiert. Es wurde geklärt inwieweit der gerichtete Transport von BACE die Prozessierung von βAPP beeinflussen kann.

Polarisierte Sezernierung von l-βAPPα und l-βAPPβ

Zunächst wurde der Einfluss der BACE-Expression in polarisierten Zellen auf intrazelluläres βAPP-Holoprotein und βAPP-CTF Generierung analysiert. Dazu wurden stabil nur mit βAPP oder mit βAPP und BACE transfizierte MDCK Zellen auf Filtern polarisiert und mit [S]Methionin/Cystein metabolisch markiert. Zelllysate wurden hergestellt und mit AK 6687 gerichtet gegen den C-Terminus von βAPP immunopräzipitiert.

Abbildung 42: Einfluss von BACE auf βAPP-Prozessierung in MDCK Zellen βAPP transfizierte oder BACE und βAPP transfizierte MDCK Zellen wurden in Filterkammern polarisiert und 4 h mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert. Die Zelllysate wurden mit AK 6687 immunopräzipitiert und die Immunopräzipitate in der 12%-SDS-PAGE aufgetrennt. Abgebildet ist eine Autoradiografie des getrockneten Gels.

In der zusätzlich mit BACE transfizierten Zelllinie ist weniger von der N- und O-glycosylierten, maturen βAPP-Form zu erkennen. Der Anteil der immaturen βAPP-Spezies ändert sich kaum durch die BACE-Expression (Abbildung 42). Dies deutet daraufhin, dass die Expression von βAPP in beiden Zelllinien ähnlich ist, jedoch durch die exogene BACE-Expression die Prozessierung von maturem βAPP verstärkt wird. Durch eine erhöhte Prozessierung von βAPP durch BACE wäre eine erhöhte Sezernierung von l-βAPPβ zu erwarten.

Die durch α-Sekretase oder BACE generierten, membrangebundenen βAPP-CTF verändern ihr Migrationsverhalten im SDS-Gel in BACE transfizierten Zellen. βAPP wird in MDCK überwiegend durch α-Sekretase prozessiert, und es entstehen fast ausschließlich βAPP-CTFα (Haass et al., 1994). Durch exogene BACE-Expression entstehen βAPP-CTF, die im SDS-Gel bei einem höheren Molekulargewicht migrieren (Abbildung 42), es handelt sich hierbei um BACE generierte βAPP-CTFβ (1.3.2). α-Sekretase Prozessierung von βAPP ist nicht mehr nachweisbar.

Die Sezernierung von l-βAPP wurde in βAPP und BACE transfizierten oder in nur βAPP transfizierten MDCK Zellen analysiert. Auf Filtern gewachsene, polarisierte MDCK Zellen wurden mit [S]Methionin/Cystein metabolisch markiert. Apikal und basolateral konditioniertes Medium wurde getrennt gesammelt und Aliquote der Medien wurden mit dem l-βAPPα epitopspezifischen AK 1736 oder mit AK 5313, der alle l-βAPP-Spezies erkennt, immunopräzipitiert.

Abbildung 43: Sezernierung der l-βAPPα- und l-βAPPβ-Spezies in BACE und βAPP transfizierten MDCK Zellen βAPP transfizierte oder BACE und βAPP transfizierte MDCK Zellen wurden in Filterkammern polarisiert und 4 h mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert. Konditionierte Medien wurden apikal und basolateral getrennt gesammelt und zur Immunopräzipitation von l-βAPPα (50 %) mit AK 1736 (A) und von l-βAPP_total(50%) mit AK 5313 (B) aufgeteilt. Zur Verdeutlichung des unterschiedlichen Migrationsverhaltens von l-βAPPβ und l-βAPPα wurde zur Kontrolle, neben den Immunopräzipitaten mit AK 5313, zusätzlich l-βAPPα aufgetragen. Die Immunopräzipitate von l-βAPP wurden in der 8%-SDS-PAGE aufgetrennt, abgebildet sind Autoradiografien der getrockneten Gele. Unterhalb der Autoradiografie ist die Quantifizierung mittels Phosphor-Imagers dargestellt. Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen von 3 unabhängigen Experimenten. C: Quantifizierung von apikal und basolateral sezerniertem l-βAPPβ, berechnet aus der Differenz von l-βAPP_total und l-βAPPα.

Wie bereits in früheren Arbeiten gezeigt wurde (Haass et al., 1994), entsteht in MDCK Zellen, die nur βAPP exogen exprimieren, überwiegend α-Sekretase generiertes l-βAPP (l-βAPPα). l-βAPPα wird fast ausschließlich basolateral sezerniert (Abbildung 43A, Spur 4), wohingegen die Immunopräzipitation mit AK 5313 eine geringe aber deutliche apikale Sezernierung von l-βAPP_total zeigt (Abbildung 43B, Spur 4), auch wenn die Majorität von l-βAPP_total basolateral sezerniert wird. Bei den ca. 20 % von l-βAPP_total, die apikal sezerniert werden (Abbildung 43B, Quantifizierung), muß es sich um l-βAPPβ handeln, da l-βAPPα nicht apikal sezerniert wird (Abbildung 43A, Quantifizierung). Im SDS-Gel ist ein geringfügig unterschiedliches Migrationsverhalten von l-βAPPβ und l-βAPPα erkennbar, l-βAPPβ migriert bei einem niedrigern Molekulargewicht. Das Migrationsverhalten der mit AK 5313 präzipitierten, apikalen Fraktion unterstützt die Vermutung, dass es sich um l-βAPPβ handelt (Abbildung 43B, Spur 4 / vgl. Spur 3). Eine Quantifizierung von l-βAPPβ ist schwierig, da die Immunopräzipitation von l-βAPPα und l-βAPP_total mit unterschiedlichen AK durchgeführt wurde und das Präzipitationsverhalten AK-spezifisch ist. Trotz der Bedenken wurde versucht die sezernierte Menge von l-βAPPβ aus der Differenz von l-βAPP_total und l-βAPPα zu berechnen. Die Kalkulation ergibt eine identische apikale und basolaterale Sezernierung von l-βAPPβ (Abbildung 43C). Dass l-βAPPβ gleichmäßig apikal und basolateral sezerniert wird, wurde bisher nicht erkannt, da die BACE prozessierte l-βAPPβ Menge gering ist und von dem Hauptsezernierungsprodukt l-βAPPα überdeckt wird.

Die apikale Sezernierung von l-βAPPβ ließe sich durch apikale Fehlsortierung des βAPP-Holoproteins erklären, diese apikale βAPP-Population wird ausschließlich von BACE prozessiert und nicht von der α-Sekretase, die resultierende l-βAPPβ Menge wird apikal sezerniert. Die basolaterale Menge von l-βAPPβ entsteht aufgrund der 20-30 % basolateral sortiertem BACE, das in diesem Kompartiment mit der α-Sekretase konkurriert (4.1.6.1). Die polarisierte Sezernierung von l-βAPP ist zusammenfassend in Abbildung 44 dargestellt.

Abbildung 44: Polarisierte Sezernierung l-βAPPα und l-βAPPβ Dargestellt ist sind Oberflächenverteilungen von βAPP (schwarz), BACE (blau) und die vermutete Verteilung der α-Sekretase Aktivität (rot). Die resultierenden l-βAPP Prozessierungsprodukte sind in den Farben der prozessierenden Protease dargestellt. Die Prozentangaben beziehen sich jeweils auf die Gesamtmenge von βAPP bzw. BACE.

Eine zusätzliche BACE-Transfektion der βAPP exprimierenden MDCK Zelllinie verhindert fast vollständig die α-Sekretase Prozessierung von βAPP. Nur geringe, basale Mengen von l-βAPPα werden apikal und basolateral sezerniert (Abbildung 43A, Spur 1 / 2). Da α-Prozessierung kaum stattfindet entspricht l-βAPP_total, in diesem Fall der l-βAPPβ-Spezies. L-βAPPβ wird gleichmäßig apikal und basolateral sezerniert (Abbildung 43B, Spur 2 / 3). Da das βAPP-Holoprotein basolateral sortiert wird, überrascht die ausschließliche Prozessierung durch überwiegend apikal sortiertes BACE. Es wäre möglich, dass aufgrund der Übertransfektion BACE nicht im endocytotischen Transportweg (Haass und Selkoe, 1993;Koo und Squazzo, 1994), sondern bereits in frühen sekretorischen Kompartimenten sein Substrat βAPP schneidet, bevor es zu einer Trennung des apikalen und basolateralen Transportweges kommt. Auch in anderen Zelllinien wurde beobachtet, dass eine Überexpression von BACE zu einer Prozessierung von βAPP in frühen sekretorischen Kompartimenten führt (Creemers et al., 2001;Vassar et al., 1999).

Polarisierte Sezernierung von Aβ und p3

Aus den bisherigen Ergebnissen ergibt sich, dass die nicht amyloidogene Prozessierung von βAPP durch die α-Sekretase und die amyloidogene Prozessierung durch BACE in getrennten Transportwegen stattfindet. Zur Entstehung von Aβ oder p3 müssen die durch BACE oder α-Sekretase generierten, membrangebundenen C-terminalen Fragmente βAPP-CTFβ oder βAPP-CTFα von dem γ-Sekretase-Komplex geschnitten werden (1.3.2) (Haass, 2004). Es entstehen Aβ oder p3, die sezerniert werden, und ein instabiles, verkürztes C-terminales Fragment (βAPP-CTFγ, auch AICD) (Sastre et al., 2001).

Die Sezernierung von Aβ und p3 wurde, wie auch die Sezernierung von l-βAPPβ und l-βAPPα in βAPP und BACE transfizierten oder in nur βAPP transfizierten MDCK Zellen analysiert. Auf Filtern gewachsene, polarisierte MDCK Zellen wurden mit [S]Methionin/Cystein metabolisch markiert, apikal und basolateral konditioniertes Medium wurde getrennt gesammelt. Die Medien wurden mit dem AK 3926 immunopräzipitiert (Abbildung 45).

Abbildung 45: Sezernierung von Aβ und p3 in BACE und βAPP transfizierten MDCK Zellen A: βAPP transfizierte oder BACE und βAPP transfizierte MDCK Zellen wurden in Filterkammern polarisiert und 4 h mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert. Konditionierte Medien wurden apikal und basolateral getrennt gesammelt, Aβ und p3 wurden mit AK 3926 immunopräzipitiert. Die Immunopräzipitate wurden im Tris-Tricine Gel aufgetrennt, abgebildet ist die Autoradiografie des getrockneten Gels. B: Zur Radiosequenzierung der Aβ Bande in BACE und βAPP transfizierten MDCK Zellen, wurden diese in Filterkammern polarisiert und 4 h mit [H]Phenylalanin radioaktiv markiert. Konditioniertes Medium wurde basolateral gesammelt und mit AK 3926 immunopräzipitiert. Das Immunopräzipitat wurde im Tris-Tricine-Gel aufgetrennt, auf PVDF-Membran transferiert und die Aβ-Bande wurde in der Autoradiografie lokalisiert (entspricht der in A rot markierten Bande). Die Bande wurde aus der Membran ausgeschnitten und radiosequenziert. Die gemessene Radioaktivität pro Zyklus ist angegeben, die entsprechende Proteinsequenz ist im Einbuchstabencode dargestellt.

In βAPP transfizierten MDCK Zellen werden sowohl Aβ als auch p3 basolateral sezerniert (Abbildung 45A) (De Strooper et al., 1995;Haass et al., 1994;Lo et al., 1994), dies entspricht dem Transport des βAPP-Holoproteins zur basolateralen Plasmamembran. Überraschend ist, dass kein Aβ apikal detektiert wird, obwohl die zugehörige l-βAPPβ Spezies apikal und basolateral detektiert wird (Abbildung 43).

In βAPP und BACE transfizierten MDCK Zellen entsteht ausschließlich eine Peptidspezies, die bei einem Molekulargewicht zwischen dem von Aβ und p3 im Tris-Tricine-Gel migriert und basolateral sezerniert wird (Abbildung 45A). Wie die Radiosequenzierung des Peptids ergab (2.5.4.5), handelt es sich um eine N-teminal verkürzte Aβ_Glu11-Spezies (Abbildung 45B). Dieses an Position Glu11 beginnende Peptid wurde bereits nachgewiesen, bevor BACE kloniert war (Gouras et al., 1998;Haass et al., 1992;Wang et al., 1996). Später konnte gezeigt werden, dass BACE auch diesen Schnitt katalysiert (Benjannet et al., 2001;Cai et al., 2001;Creemers et al., 2001;Farzan et al., 2000;Vassar et al., 1999). Die basolaterale Sezernierung der Aβ-Spezies korrespondiert nicht mit der Sezernierung von l-βAPPβ in BACE transfizierten Zellen (Abbildung 43). Eine mögliche Ursache wäre, dass der γ-Sekretase-Komplex nicht an der apikalen Plasmamembran lokalisiert bzw. aktiv ist und damit apikal kein Aβ entstehen kann. Eine weitere Erklärungsmöglichkeit wäre, dass das direkte Vorläuferprotein für die Aβ-Bildung, βAPP-CTFβ, welches sein C-terminales, basolaterales Sortierungssignal noch enthält (1.5.2)(Haass et al., 1994), zur basolateralen Plasmamembran transportiert wird und im basolateralen Kompartiment von der γ-Sekretase geschnitten wird. Die letztere Möglichkeit ist in der Abbildung 46 dargestellt.

Abbildung 46: Polarisierte Sezernierung von l-βAPPβ und Aβ in BACE transfizierten MDCK Zellen Durch die hohe BACE Expression (Sternenbanner) findet fast ausschließlich BACE-Prozessierung von βAPP (blau) statt.

Polarisierte Verteilung von βAPP-CTF an der Plasma- membran

Um zu untersuchen, ob βAPP-CTF polarisiert transportiert werden, wurden βAPP exprimierende MDCK Zellen auf Filtern polarisiert und zur apikalen und basolateralen Oberflächenbiotinylierung eingesetzt. Es wurden keine zusätzlich BACE exprimierenden MDCK Zellen eingesetzt, da eine Überexpression von BACE zu einer Prozessierung von βAPP in frühen sekretorischen Kompartimenten führt (3.5.4.1).

Abbildung 47: Biotinylierung von βAPP-CTF an der Zelloberfläche von polarisierten MDCK Zellen βAPP exprimierende MDCK Zellen wurden auf Filtern polarisiert, die Oberfläche des Zellmonolayers wurde entweder apikal oder basolateral biotinyliert. Zelllysate wurden hergestellt und biotinylierte Proteine mit Strepavidin-Sepharose präzipitiert, in der SDS-PAGE aufgetrennt, und βAPP-CTF wurde mit AK 6687 im Western Blot nachgewiesen. Als Kontrolle wurde Zelllysat direkt mit AK 6687 immunopräzipitiert.

βAPP-CTF kann nur an der basolateralen Plasmamembran, nicht apikal, detektiert werden (Abbildung 47). Es können nur geringe Mengen βAPP-CTF an der Oberfläche nachgewiesen werden, vermutlich handelt es sich um βAPP-CTFα, da βAPP in MDCK Zellen überwiegend von der α-Sekretase prozessiert wird (Abbildung 42). Es ist anzunehmen, dass βAPP-CTFβ ebenfalls basolateral sortiert wird, da es das gleiche basolaterale Sortierungssignal enthält, wie βAPP-CTFα. Aufgrund der geringen BACE-Prozessierung von βAPP ist βAPP-CTFβ nicht nachweisbar.

Der basolaterale Transport von βAPP-CTF, des unmittelbaren Substrats der γ-Sekretase und des direkten Aβ- und p3-Vorläufers, erklärt die ausschließlich basolaterale Sezernierung von Aβ, auch in BACE überexprimierenden Zellen.

Reinternalisierung und Transcytose von βAPP

Das unterschiedliche Sezernierungsverhalten von Aβ und dem korrespondierenden l-βAPPβ in BACE transfizierten, aber auch in nur βAPP transfizierten MDCK Zellen, könnte durch Reinternalisierung von βAPP-CTFβ und einen Rücktransport zum basolateralen Kompartiment folgendermaßen erklärt werden. Zunächst würde ein Teil des βAPP-Holoproteins zur apikalen Plasmamembran transportiert werden, wo Prozessierung durch BACE stattfindet. L-βAPPβ wird apikal sezerniert und die entstehenden βAPP-CTFβ würden reinternalisiert, zur basolateralen Plasmamembran transportiert bzw. transcytiert und dort von der γ-Sekretase geschnitten werden, so könnte Aβ basolateral sezerniert werden.

Die Oberflächenexpression von βAPP-CTFβ konnte nicht nachgewiesen werden und die Oberflächenexpression von βAPP-CTFα ist zu niedrig um eine mögliche Transcytose zu untersuchen. Die Reinternalisierung konnte nur am βAPP-Holoprotein und den aus der Reinternalisierung folgenden Sezernierungsprodukten, l-βAPPα und l-βAPPβ untersucht werden.

Abbildung 48: Reinternalisierung vom βAPP-Holoprotein Auf Filtern gewachsene, βAPP überexpremierende MDCK Zellen wurden apikal oder basolateral zunächst bei 4°C biotinyliert und dann mit Medium 1 h bei 37°C im CO₂-Inkubatior inkubiert. Die konditionierten Medien wurden apikal und basolateral getrennt gesammelt, mit Strepavidin-Sepharose präzipitierte Proteine wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt, und l-βAPP wurde mit AK 1736 (A) und AK 5313 (B) im Western Blot nachgewiesen.

Apikal fehl-sortiertes βAPP-Holoprotein wurde an der apikalen Plasmamembran biotinyliert, die resultierende, biotinylierte l-βAPP-Spezies wird basolateral sezerniert (Abbildung 48A / B, Spur 2). Diese l-βAPP-Spezies enthält l-βAPPα (Abbildung 48A, Spur 2). Da die Differenz zwischen detektiertem l-βAPP_total und l-βAPPα gering ist kann nicht beurteilt werden inwieweit diese Spezies auch l-βAPPβ beinhaltet. Von dem basolateral biotinylierten βAPP-Holoproteins werden nur geringe Mengen l-βAPP sezerniert (Abbildung 48A / B, Spur 3 / 4). Die Transcytose des fehl-sortierten βAPP-Holoproteins von der apikalen Plasmamembran zu basolateralen Kompartimenten, ist ein Hinweis darauf, dass auch βAPP-CTF von der apikalen zur basolateralen Plasmamembran transcytiert werden können. Damit wird die Vermutung unterstützt, dass der direkte Vorläufer von Aβ, βAPP-CTFβ zur basolateralen Oberfläche transportiert wird und dort Aβ ins basolaterale Medium freigesetzt wird, auch wenn das korrespondierende l-βAPPβ apikal sezerniert wurde (Abbildung 46).

Deletion des basolateralen βAPP-Sortierungssignals und Auswirkung auf die βAPP-Prozessierung

Eine Änderung des basolateralen βAPP-Transports müsste nach den bisherigen Erkenntnissen eine Veränderung der βAPP-Prozessierung bewirken. Durch einen vermehrten Transport von βAPP zur apikalen Plasmamenbran wäre eine erhöhte amyloidogene Prozessierung von βAPP durch BACE zu erwarten, da BACE apikal sortiert wird und die bisherigen Ergebnisse nicht auf eine apikale α-Sekretase Aktivität schließen lassen. Ferner könnte durch den apikalen Transport von βAPP geklärt werden, ob γ-Sekretase Aktivität auch im apikalen Transportweg vorliegt.

Die Einführung eines Stoppkodons hinter der TM Domäne von βAPP (βAPPΔC) deletiert das basolaterale Sortierungssignal und wie bereits gezeigt wurde, wird βAPPΔC gleichmäßig zur apikalen und basolateralen Plasmamembran transportiert (1.5.2) (Haass et al., 1995).

Die Sezernierung von l-βAPP wurde in βAPPΔC und BACE transfizierten oder in nur βAPPΔC transfizierten MDCK Zellen analysiert. Auf Filtern gewachsene, polarisierte MDCK Zellen wurden mit [S]Methionin/Cystein metabolisch markiert, apikal und basolateral konditioniertes Medium wurde getrennt gesammelt. Aliquote der Medien wurden mit dem l-βAPPα epitopspezifischen AK 1736 oder AK 5313, der alle l-βAPP-Spezies erkennt, immunopräzipitiert.

Abbildung 49: Sezernierung der l-βAPPα und l-βAPPβ-Spezies in BACE und βAPPΔC transfizierten MDCK Zellen βAPPΔC transfizierte oder BACE und βAPPΔC transfizierte MDCK Zellen wurden in Filterkammern polarisiert und 4 h mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert. Konditionierte Medien wurden apikal und basolateral getrennt gesammelt und zur Immunopräzipitation von l-βAPPα (50 %) mit AK 1736 (A) und von l-βAPP_total(50 %) mit AK 5313 (B) aufgeteilt. Die Immunopräzipitate von l-βAPP wurden in der 8%-SDS-PAGE aufgetrennt, abgebildet sind Autoradiografien der getrockneten Gele. Unterhalb der Autoradiografie ist die Quantifizierung mittels Phosphor-Imagers dargestellt. Mittelwerte und Standardabweichungen von 3 unabhängigen Experimenten sind angegeben.

Obwohl βAPPΔC gleichmäßig zur apikalen und basolateralen Plasmamembran transportiert wird (Haass et al., 1995), wird in MDCK Zellen die nur βAPPΔC exogen exprimieren, l-βAPPα fast ausschließlich basolateral sezerniert (Abbildung 49A, Spur 3 / 4) wohingegen die Immunopräzipitation mit AK 5313 eine deutliche apikale Sezernierung von l-βAPP_total zeigt (Abbildung 49B, Spur 3 / 4). Bei dem l-βAPP_total das apikal sezerniert wird, muss es sich um l-βAPPβ handeln, da fast kein l-βAPPα apikal sezerniert wird. Das basolateral sezernierte l-βAPP_total besteht überwiegend aus l-βAPPα, dies ist auch am geringfügig größeren Molekulargewicht erkennbar (Abbildung 49B, Spur 3 / 4).

Eine zusätzliche BACE-Transfektion führt wiederum zu einer fast ausschließlichen BACE-Prozessierung von βAPPΔC und zur gleichmäßigen apikalen und basolateralen Sezernierung von l-βAPP_total (Abbildung 49B, Spur 1 / 2). Dies unterstützt die Vermutung, dass die Überexpression von BACE zu einer sehr frühen Prozessierung von βAPP führt, die unabhängig von der Sortierung des Enzyms und des Substrates ist.

Um Aufschluss über die Lokalisierung der γ-Sekretase Aktivität zu bekommen, wurde die Aβ und p3-Sezernierung der βAPPΔC exprimierenden MDCK Zellen untersucht.

Abbildung 50: Sezernierung von Aβ und p3 in βAPPΔC transfizierten MDCK Zellen βAPPΔC transfizierte MDCK Zellen wurden in Filterkammern polarisiert und 4 h mit [S]Methionin/Cystein radioaktiv markiert. Konditionierte Medien wurden apikal und basolateral getrennt gesammelt und Aβ und p3 wurden mit AK 3926 immunopräzipitiert. Die Immunopräzipitate wurden im Tris-Tricine-Gel aufgetrennt, abgebildet ist die Autoradiografie des getrockneten Gels.

Tatsächlich wird Aβ apikal und basolateral sezerniert (Abbildung 50), die basolateral sezernierte Aβ-Menge ist im Vergleich zu der, in βAPP transfizierten Zellen reduziert (Abbildung 45). Die Ursache für die reduzierte basolateral sezernierte Aβ-Menge ist vermutlich die Blockierung der Reinternalisierung von βAPP. Durch die Deletion des C-Terminus wurde auch das Reinternalisierungssignal von βAPP entfernt (Haass et al., 1995;Lai et al., 1995). Die apikal entstehende Aβ-Spezies migriert im Tris-Tricine-Gel bei einem Molekulargewicht zwischen dem von Aβ_(1-40/42) und p3 (Abbildung 50), damit entspricht das Migrationsverhalten dem der Aβ_Glu11Spezies (Abbildung 45).

Oberflächenlokalisierung der Komponenten des γ-Sekretase-Komplexes in polarisierten MDCK Zellen

Die apikale Sezernierung von Aβ in βAPPΔC transfizierten MDCK Zellen ist ein Hinweis darauf, dass γ-Sekretase Aktivität auch im apikalen Kompartiment vorhanden ist. Um die Zelloberflächenlokalisierung des γ-Sekretase-Komplex zu untersuchen wurde die Lokalisierung der Komplex-Komponenten PS1 und Nicastrin, analysiert(Capell et al., 1998;Capell et al., 2000;Yang et al., 2002;Yu et al., 2000). Endogenes PS1 in MDCK Zellen konnte mit den zur Verfügung stehenden, gegen humanes PS1 gerichteten AK, nicht nachgewiesen werden. Für die Untersuchung der PS1 Sortierung wurden MDCK Zellen stabil mit PS1 transfiziert. Endogenes Nicastrin konnte detektiert werden. Apikale und basolaterale Oberflächenbiotinylierungen wurden durchgeführt.

Abbildung 51: Biotinylierung von γ-Sekretase Komponenten an der Zelloberfläche von polarisierten MDCK Zellen A: PS1 überexprimierende MDCK Zellen wurden auf Filtern polarisiert, die Oberfläche des Zellmonolayers wurde entweder basolateral oder apikal biotinyliert. Zelllysate wurden hergestellt und biotinylierte Proteine mit Strepavidin-Sepharose präzipitiert, in der PAGE aufgetrennt, und PS1 wurde mit monoklonalem AK PS1-NT und mit AK 3027 im Western Blot nachgewiesen. Als Kontrolle wurde PS1 mit dem AK 3027, der das C-terminale PS1 Fragment erkennt, aus dem Zelllysat immunopräzipitiert. Für die Immunopräzipitation wurde nur 1/5 des Materials der Biotinylierung eingesetzt. Der Stern kennzeichnet eine unspezifische Bande B: EndogenesNicastrin wurde an der Oberfläche polarisierter MDCK Zellen biotinyliert und wie unter A mit AK NCT-CT nachgewiesen.

N-terminale und C-terminale PS1 Fragmente, aber auch das PS1 Holoprotein konnten an der apikalen und basolateralen Oberfläche nachgewiesen werden (Abbildung 51A). In der Kontrolle, in der PS1 aus dem MDCK Zelllysat mit AK 3027 immunopräzipitiert wurde, wurden nur 20 % der Lysatmenge eingesetzt, die für die Biotinylierung eingesetzt wurden. Somit liegen nur sehr geringe Mengen des exprimierten PS1 an der Zelloberfläche vor (Kaether et al., 2002;Leem et al., 2002;Ray et al., 1999).Der zur Immunopräzipitation eingesetzte AK 3027 ist gegen den „Loop“ im C-terminalen PS1 Fragments gerichtet und präzipitiert unter den gewählten Lysisbedingungen kein N-terminales Fragment (1.3.2.3). Endogenes Nicastrin, kann an der apikalen und basolateralen Plasmamembran zu ungefähr gleichen Mengen nachgewiesen werden (Abbildung 51B).

Damit kann davon ausgegangen werden, dass der γ-Sekretase Komplex nicht polarisiert transportiert wird und in apikalen und basolateralen Kompartimenten aktiv ist.

In vitro Charakterisierung von BACE

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Charakteristik von BACE bezüglich der enzymatischen Aktivität analysiert. Durch die Analyse von BACE werden komplexe Einflüsse, z.B. durch zelluläre Transportvorgänge oder durch die Entstehung von Mikrodomänen, auf die BACE-Aktivität eliminiert. Damit kann sichergestellt werden, dass die primären Enzymeigenschaften analysiert werden. Es wurde ein BACE Assay entwickelt um weitere Aufschlüsse über das pH-Optimum und die Enzymkinetik zu erhalten.

Generell ist ein BACE Assay von immenser pharmakologischer Bedeutung, da BACE eins der beiden Aβ freisetzenden Enzyme ist und damit ein therapeutischer Hauptangriffspunkt zur Behandlung der Alzheimer Krankheit. In einem BACE Assay können pharmakologisch Substanzen auf die Inhibition von BACE untersucht werden. Ferner kann der Assay eingesetzt werden, um Regionen von BACE zu untersuchen, die für die Struktur von BACE oder für die Substratbindung und damit für die Aktivität des Enzyms notwendig sind.

Entwicklung eines Assays für BACE

Es wurde ein Fluoreszenz Assay entwickelt. Ein Peptidsubstrat konjugiert mit einer fluoreszierenden und einer quenchenden Gruppe wurde synthetisiert, durch Inkubation mit dem Enzym kommt es zum Schnitt des Substrats, und aufgrund der Trennung von quenchender und fluoreszierender Gruppe zur Fluoreszenz (2.7.2). Vorteile sind, dass der Substratumsatz kontinuierlich verfolgt werden kann und dass der Assay im „high-throughput“ System eingesetzt werden kann (Osborn, 2002).

Enzymquelle und Enzymaufreinigung für den BACE-Assay

konnte gezeigt werden, dass BACE-L enzymatische Aktivität aufweist (Abbildung 30 / Abbildung 31) und über das konjugierte 6fach-His ließe sich BACE-L leicht aufreinigen. Konditioniertes Medium von BACE-L exprimierenden HEK 293 Zellen wurde als eine mögliche Enzymquelle untersucht. Konditioniertes, serumfreies Medium von BACE-L exprimierenden HEK 293 Zellen oder untransfizierten Kontrollzellen wurde gesammelt. Da andere Arbeitgruppen BACE-Aktivität in einem Natrium-Acetat Puffer (pH 4-4,8) zeigen konnten (Lin et al., 2000;Sinha et al., 1999)wurde dieser Puffer als Assay-Puffer eingesetzt (2.7.3). Zunächst wurde ein Teil des konditionierten Mediums gegen den Natrium-Acetat Puffer dialysiert. Aliquote des BACE-L enthaltenden Mediums, des Kontrollmediums und des dialysierten BACE-L Mediums wurden in der SDS-PAGE getrennt und anschließend in der Silberfärbung und im Western Blot mit AK 9E10 und AK GM190 analysiert (Abbildung 52A). Zur Aufreinigung von BACE-L wurde das konditionierte Medium im „batch-Verfahren“ mit Nickel-Agarose inkubiert (2.7.1.1). Aliquote der Aufreinigungsschritte wurden in der SDS-PAGE getrennt und anschließend in der Silberfärbung und im Western Blot mit AK 9E10 und AK GM190 analysiert (Abbildung 52B).

Abbildung 52 Partielle Aufreinigung von BACE-L über Ni-Agarose Es wurde 16 h konditioniertes, serumfreies Medium (Optimem) von BACE-L exprimierenden HEK 293 Zellen oder Kontrollzellen gesammelt. A: 125 µl des BACE-L Mediums, Kontrollmediums und des gegen Na-Acetat Puffer dialysierte BACE-L Medium wurden TCA gefällt, in der 10%-SDS-PAGE aufgetrennt und zur Silberfärbung oder zum Western Blot mit AK 9E10 und AK GM190 eingesetzt. B: 125 µl konditioniertem BACE-L Medium entsprechende Aliquote der Aufreinigungsschritte mit Ni-Agarose wurden in der 10%-SDS-PAGE aufgetrennt, zur Silberfärbung oder zum Western Blot mit AK 9E10 und AK GM190 eingesetzt. Die Fraktion der Ni-Agarose zeigt die Menge BACE-L, die nicht eluiert werden konnte.

In der Silberfärbung des SDS-Gels sind zwischen den konditionierten Medien von BACE-L exprimierenden Zellen und Kontrollzellen keine Unterschiede erkennbar, bei den kräftigen Proteinbanden handelt es sich nicht um BACE-L, sondern vermutlich um Albumine. Die Dialyse vermindert geringfügig den Proteingehalt. Im Westen Blot erkennen beide AK spezifisch BACE-L, keine Reaktion ist mit konditioniertem Medium von HEK 293 Zellen zu detektieren. Aufgrund der kräftigen Reaktion im Western Blot mit AK GM190 ist davon auszugehen, dass große Mengen von sezerniertem BACE-L das Propeptid enthalten (Abbildung 52A).

Die Aufreinigung von BACE-L aus konditioniertem Medium über Nickel-Agarose, zeigt, dass BACE-L effizient an der Nickel-Agarose bindet und die meisten Proteine im Überstand nach Inkubation mit Nickel-Agarose verbleiben. In den Waschschritten werden noch unspezifisch gebundene Proteine eliminiert, jedoch auch große Mengen BACE-L (Abbildung 52B, Spur 2, vgl. Silberfärbung v. s. Western Blot). Die aufgereinigte Fraktion enthält fast ausschließlich BACE-L, in der Silberfärbung sind, neben der auch im Western Blot detektierten Bande, keine weiteren Proteinbanden erkennbar (Abbildung 52B, Spur 3 / 4, vgl. Silberfärbung v. s. Western Blot). Die Elution von BACE-L von der Nickel-Agarose ist nicht vollständig, trotzdem sollte die aufgereinigte BACE-L Menge ausreichend sein um Aktivität im Assay zu zeigen.

Substrat für den BACE-Assay

Als Substrat wurde ein βAPP-Peptid gewählt, dass die schwedische Mutation enthält, da gezeigt werden konnte, das BACE eine deutlich höhere Affinität zu βAPPsw als zu βAPPwt hat (Citron et al., 1992;Citron et al., 1995;Sinha et al., 1999;Vassar et al., 1999). Das Peptid musste relativ kurz sein, damit die Fluoreszenz durch die quenchende Gruppe effektiv unterdrückt werden kann. Dass kurze Peptide als BACE-Substrat ausreichend sind wurde bereits gezeigt (Lin et al., 2000;Vassar et al., 1999;Yan et al., 1999).

Es wurden 3 Substrate synthetisiert, die in der Peptidsequenz P5-P4` der βAPPsw-Schnittstelle identisch sind. Durch Einfügen von weiteren Argeninresten wurde jedoch die Peptidlänge der Substrate verändert und der Abstand zwischen quenchender und fluoreszierender Gruppe erhöht (Cy3, Cy3 R), oder die Umgebung der quenchenden Gruppe verändert (Cy3 RR). Zur Kontrolle der Schnittspezifität wurde ein potentiell nicht durch BACE schneidbares Peptid Substrat synthetisiert, ein AS Austausch an Position P1 von Leu zu Val verhindert die βAPP-Prozessierung durch BACE (Citron et al., 1995;Vassar et al., 1999). Als Enzym wurde das aufgereinigte BACE-L eingesetzt (3.6.1.1) und als Assay-Puffer wurde der beschriebene Na-Acetat Puffer gewählt (Sinha et al., 1999). Die Änderung der Fluoreszenz wurde in Abhängigkeit von der Zeit gemessen (2.7.3).

Abbildung 53: Optimierung der Substratkettenlänge A: CyDye Peptid-Substrate für den BACE Assay. Die βAPP-Sequenz ist blau, die βAPPsw-Sequenz grün und der AS-Austausch zum nicht schneidbaren Kontrollpeptid rot dargestellt. B: Aufgereinigtes BACE-L (2,5 µl, s. Abbildung 52) wurde mit den Substraten Cy3, Cy3 R und Cy3 RR (100 nM) und dem nicht schneidbaren Peptid Cy3 Kontrolle im Na-Acetat Puffer (pH 4,5) bei RT inkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei Ansätzen. Gemessen wurde die Fluoreszenzzunahme in Abhängigkeit von der Zeit.

Das aufgereinigte BACE-L ist enzymatisch aktiv, es kommt zu keiner zeitabhängigen Zunahme der Fluoreszenz, und das Cy3 Kontrollpeptid wird nicht prozessiert. Das Substrat Cy3 zeigt, verglichen mit den verlängerten Substraten Cy3R und Cy3RR, unter Enzymzugabe den größten Fluoreszenzanstieg in Abhängigkeit von der Inkubationszeit (Abbildung 53). Vermutlich wird es am schnellsten katalytisch umgesetzt, damit ist dieses Substrat für den Assay am besten geeignet.

Konditioniertes Medium als Enzymquelle

Da es bei der Aufreinigung von BACE-L zu erheblichen Enzymverlusten kam, wurde untersucht ob konditioniertes Medium direkt oder nach einer Aufkonzentrierung im Assay eingesetzt werden kann.

Abbildung 54: Aufbereitung des konditionierten Mediums BACE-L exprimierender Zellen Konditioniertes Medium von BACE-L exprimierenden HEK 293 Zellen wurde partiell aufgereinigt (5 µl, 100x), ca. 4fach konzentriert (5 µl, 4x) oder direkt (10 µl, 1x) im Assay eingesetzt (Substrat Cy3, 100 nM). Als Kontrolle wurde konzentriertes Medium von HEK 293 Zellen eingesetzt (5 µl, 4x). Dargestellt sind die Mittelwerte aller Messpunkte aus drei Ansätzen, gemessen wurde die Fluoreszenzzunahme in Abhängigkeit von der Zeit.

Über Nickel-Agarose aufgereinigtes BACE-L zeigt die größte Aktivität, wobei die eingesetzte Enzymmenge am größten war und das Enzym für eine Reaktion aus 500 µl Medium aufgereinigt wurde. Aber auch 4fach konzentriertes Medium (20 µl / Reaktion) und direkt eingesetztes Medium (10 µl / Reaktion) zeigen im Vergleich zu Kontrollmedien, konditioniert auf HEK 293 Zellen, deutliche BACE-Aktivität. Die BACE-Aktivität des konzentrierten Mediums erhöht sich fast entsprechend des Konzentrationsfaktors, der Einsatz der doppelten Enzymmenge führt zu einer ca. 2fachen Aktivitätserhöhung (Abbildung 54). Die Konzentration des Mediums erfolgte mittels Zentrifugation durch einen Membranfilter mit einem „cut-off“ von 10 kDa (2.7.1.3). Die geringen Verluste können durch ein Haften bleiben der Proteine am Filter erklärt werden. Trotz dieser Verluste wurde für die weiteren Assays überwiegend konzentriertes, konditioniertes Medium BACE-L exprimierender HEK 293 Zellen eingesetzt. Eine Dialyse des Mediums mit dem Assay-Puffer veränderte die Enzymaktivität nicht (Ergebnisse nicht gezeigt).

Um Assays über einen längeren Zeitraum mit einer Enzymquelle durchführen zu können und so eine bessere Vergleichbarkeit, der an verschiedenen Tagen durchgeführten Assays, zu erzielen wurde die Stabilität von BACE-L untersucht. Es wurden Studien zur Lagerung von BACE-L in konditioniertem Medium durchgeführt.

Abbildung 55: Stabilität von BACE-L im konditionierten Medium Konditioniertes Medium von BACE-L exprimierenden HEK 293 Zellen wurde gesammelt. Aliquote wurden auf Eis, bei 4°C, im flüssigen Stickstoff oder bei -80°C gelagert. Nach 48 h wurden die unterschiedlich gelagerten, konditionierten Medien im Assay eingesetzt (Medium 10 µl / Substrat Cy3 100 nM). Dargestellt sind die Mittelwerte aller Messpunkte aus drei Ansätzen, gemessen wurde die Fluoreszenzzunahme in Abhängigkeit von der Zeit

Die Aktivität von BACE-L ändert sich durch Lagerung auf Eis kaum, auch eine längere Lagerung auf Eis beeinflusst die BACE-Aktivität kaum (Daten nicht gezeigt). Einfrieren bei
- 80°C oder im flüssigen Stickstoff reduziert die BACE-L-Aktivität, ebenso wie eine Lagerung bei 4°C (Abbildung 55).

Charakterisierung der Aktivität von BACE-L Bestimmung des pH-Optimums der BACE-L-Aktivität

Es wurde beschrieben, dass BACE die maximale Aktivität im sauren Milieu entwickelt (Lin et al., 2000;Sinha et al., 1999;Vassar et al., 1999). Endogen konnte BACE-Aktivität überwiegend in Endosomen und Lysosomen des endocytotischen Transportwegs nachgewiesen werden (Koo und Squazzo, 1994;Perez et al., 1999;Thinakaran et al., 1996;Vassar et al., 1999). Die exogene Expression von BACE in HEK 293 Zellen führt zu einer BACE-Aktivität im gesamten sekretorischen Transportweg (3.3.2) (Benjannet et al., 2001;Haniu et al., 2000;Huse et al., 2000)so ist eine Untersuchung des pH-Wert Optimums von BACE in BACE exogen exprimierenden Zelllinien nicht möglich.

Der Assay ermöglicht die Untersuchung der BACE-L-Aktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert. Der pH-Wert der konditionierten, konzentrierten Medien wurde dem jeweiligen Assay pH-Wert entsprechend eingestellt.

Abbildung 56: BACE-L-Aktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert. A: Konditioniertes Medium von BACE-L exprimierenden HEK 293 Zellen wurde ca. 4fach konzentriert, 5 µl / Reaktion wurden im Assay eingesetzt (Substrat Cy3, 250 nM). Der Assay Puffer wurde auf die angegebenen pH-Werte eingestellt. Dargestellt sind die Mittelwerte aller Messpunkte aus drei Ansätzen, gemessen wurde die Fluoreszenzzunahme in Abhängigkeit von der Zeit. B: Die Reaktionsgeschwindigkeit von BACE-L wurde für die verschiedenen pH-Werte im Inkubationszeitraum von 60-70 min aus der Steigung der Fluoreszenz ermittelt. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit, bei einem pH-Wert von 4,4 wurde als 100 % gesetzt, die Reaktions-geschwindigkeiten bei den anderen pH-Werten wurden dazu ins Verhältnis gesetzt. Die relative Reaktionsgeschwindigkeit ist in Abhängigkeit vom pH-Wert dargestellt.

Bei einem pH-Wert von 3,0 ist BACE-L kaum aktiv, ebenso bei pH-Werten von 6,0 und 7,0. Interessant ist, dass bei niedrigen pH-Werten von 3,2-4,0 BACE-L anfänglich, in den ersten 10 Minuten, im Assay eine hohe Aktivität zeigt, die bei längerer Inkubation (>10 min) im sauren Milieu sehr stark zurückgeht. Dieser Rückgang in der Enzymaktivität deutet auf eine säureabhängige Denaturierung von BACE hin und kann nicht auf mangelnde Substratmenge zurückgeführt werden, da bei ähnlichem Substratverbrauch bei einem pH-Wert von 4,4 die Fluoreszenzzunahme weiterhin linear ist. Lässt man die Anfangsaktivitäten von BACE-L außer Acht und ermittelt die Geschwindigkeit des Substratumsatzes bei einer Inkubationszeit von 60-70 min, erreicht BACE-L sein Aktivitätsmaximum bei einem pH-Wert von 4,4, die Aktivität fällt sowohl zum niedrigeren pH-Wert 4,0 als auch zum höheren pH-Wert 5,0 deutlich ab (Abbildung 56).

Die BACE-L-Aktivität in Abhängigkeit von der Substrat-konzentration

Der Assay wurde zunächst mit einer Substratkonzentration von 100 nM durchgeführt, der Substratumsatz, gemessen als Zunahme der Fluoreszenz, war bis zu 2 Stunden Inkubationszeit linear (Abbildung 54), eine Erhöhung der Enzymkonzentration führte zu einer entsprechenden Erhöhung des Substratumsatzes (Abbildung 54). Eine Erhöhung der Substratkonzentration, bei gleicher Enzymkonzentration, wie bei der Ermittlung des pH-Optimums geschehen (Abbildung 54, pH-Wert 4,5 v. s. Abbildung 56, pH-Wert 4,4), von 100 nM auf 250 nM führte jedoch überraschender Weise zu einer Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit. Um weiteren Aufschluss über die BACE Substratinteraktion zu bekommen, wurde die Kinetik der von BACE katalysierten Reaktion untersucht. Es wurden im Assay bei gleicher Enzymkonzentration ansteigende Substratmengen eingesetzt.

Abbildung 57: BACE-L-Kinetik

Bei einer Substratkonzentration von 250 nM liegt unter den gewählten Assay Bedingungen keine Substratsättigung vor, die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion, gemessen als Änderung der Fluoreszenz, nimmt noch bis zu einer Substratkonzentration von 500 nM zu. Erst bei Substratkonzentrationen von 500 nM und 750 nM ist die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit gleich (Abbildung 57A). Bei diesen Konzentrationen kommt es zu einer von der Inkubationszeit abhängigen Autofluoreszenz des Substrats (Abbildung 57B). Für die weiteren, in dieser Arbeit gezeigten, Assays wurde eine Substratkonzentration von 250 nM eingesetzt.

Zur Beurteilung der BACE-Kinetik wurde die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion in Abhängigkeit von der Substratkonzentration dargestellt (Abbildung 57C). Der Kurvenverlauf entspricht nicht dem Verlauf einer einfachen Substrat-Produkt-Umsetzung nach Michaelis-Menten. Die bei niedrigen Substratkonzentrationen sehr langsame Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit bei Anstieg der Substratkonzentration, weist auf Geschwindigkeit begrenzende Faktoren hin. Der Verlauf der Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration ist unabhängig von der BACE-L Aufreinigung (Daten nicht gezeigt), damit ist die Verzögerung der Substratumsetzung durch weitere Kofaktoren unwahrscheinlich. Eine weitere Möglichkeit wäre die Geschwindigkeit begrenzende Entstehung von Intermediaten, durch Enzymumfaltung oder durch Konformationsänderungen im Enzym-Substrat-Komplex (4.2).

Spezifische Inhibitoren von BACE-L

Der BACE-Assay wurde neben der weiteren Charakterisierung von BACE auch zur Identifikation von BACE-Inhibitoren entwickelt. In dem Assay können pharmakologisch Substanzen im „high-throughput“ Verfahren auf die Inhibition von BACE untersucht werden. Die Analyse des Profils von BACE-Inhibitoren lässt weitere Aufschlüsse über das katalytische Zentrum von BACE zu.

Zunächst wurden zum Substrat homologe Peptide synthetisiert, die zur Erhöhung der Stabilität C-terminal mit einer Amidgruppe und N-terminal mit einer Acylgruppe konjugiert sind. Durch Einfügung eines Statins an der postulierten Schnittstelle sind die Peptide nicht schneidbar und kompetitieren mit dem Substrat um das aktive Zentrum des Enzyms. Die Peptidinhibitoren GL189und GL190 (2.7.3.1) wurden entsprechend dem bereits beschriebenen Inhibitor (Sinha et al., 1999) synthetisiert und im Assay in Konzentrationen von 5 nM bis 5 µM eingesetzt (Abbildung 58).

Die Inhibitoren GL189 und GL190 unterscheiden sich unwesentlich in ihrem Effekt auf BACE-L, beide inhibieren BACE mit einem IC₅₀-Wert von ca. 100 nM. Die Inhibition von GL189 und GL190 ist spezifisch, ein Proteaseinhibitor-Mix zeigt keinen Effekt auf die BACE-Aktivität (Abbildung 58).

Abbildung 58: Hemmung von BACE-L durch Peptidinhibitoren A/B: Konditioniertes Medium von BACE-L exprimierenden HEK 293 Zellen wurde ca. 4fach konzentriert, 2,5 µl / Reaktion wurden im Assay eingesetzt. Die für die jeweilige Reaktion eingesetzte Konzentration für Inhibitor GL189 (A) und Inhibitor GL190 (B) ist angegeben. Dargestellt sind die Mittelwerte aller Messpunkte aus drei Ansätzen, gemessen wurde die Fluoreszenzzunahme in Abhängigkeit von der Zeit. C: Die BACE-Aktivität in [%] bezogen auf die Aktivität ohne Inhibitor ([A_i / A₀]x100) ist in Anhängigkeit von der Inhibitorkonzentration dargestellt, die Reaktionsgeschwindigkeit wurde für den Zeitraum 40-60 min berechnet. D: Der Assay wurde wie unter A durchgeführt. Neben der Kontrolle wurden zum Reaktionsansatz der Inhibitor GL189 (5 µM) oder ein Mix verschiedenen Proteaseinhibitoren zugesetzt (2.7.3.1). Dargestellt sind die Mittelwerte aller Messpunkte aus drei Ansätzen. Gemessen wurde die Fluoreszenzzunahme in Abhängigkeit von der Zeit.

Zusammenfassend kann festgestellt werden: Es wurde im Rahmen dieser Arbeit ein funktioneller BACE Assay entwickelt, der auch im „highthrough-put“ System eingesetzt werden kann. BACE konnte mit Hilfe des Assays weiter charakterisiert werden, so konnte gezeigt werden, dass die Membranbindung von BACE für die proteolytische Aktivität nicht notwendig ist und das Aktivitätsverhalten von BACE in Abhängigkeit von der Substratkonzentration nicht der einfachen Michaelis-Menten-Kinetik entspricht. Das pH-Optimum, liegt bei einem pH-Wert von ca. 4,5. Ferner sind kurze, lösliche Peptide, von P5 bis P4`, als Substrat ausreichend und auf Statin basierende Peptidinhibitoren, gerichtet gegen das aktive Zentrum von BACE, sind funktionell.

Der Assay kann neben Tests von möglichen BACE-Inhibitoren auch für die Überprüfung der enzymatischen Aktivität von BACE-Konstrukten genutzt werden.