Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

• 1 Einleitung

  • 1.1  Epidemiologie der Alzheimer Krankheit

  • 1.2 Das histopathologische Krankheitsbild

  • 1.3 Molekulare und genetische Grundlagen der Alzheimer Krankheit

    • 1.3.1  Struktur und Funktion des β-Amyloid Vorläuferproteins (βAPP)

    • 1.3.2  Die proteolytische Prozessierung von βAPP und die Entstehung des Aβ-Peptids

      • 1.3.2.1 Der α-Sekretase-Schnitt

      • 1.3.2.2 Der β-Sekretase-Schnitt

      • 1.3.2.3 Der γ-Sekretase-Schnitt

  • 1.4 Aspartylproteasen

  • 1.5 Die Rolle des intrazellulären Transports in der Alzheimer Krankheit

    • 1.5.1  Polarisierter Transport in MDCK Zellen

    • 1.5.2 Polarisierter Transport von βAPP in MDCK Zellen

  • 1.6  Zielsetzung

• 2 Material und Methoden

  • 2.1 Geräte und Materialien

    • 2.1.1 Allgemein

    • 2.1.2 Molekularbiologie

    • 2.1.3 Zellkultur

    • 2.1.4 Proteinbiochemie und Immunocytochemie

  • 2.2 Enzyme, Kits (Versuchssysteme), Chemikalien,

    • 2.2.1 Allgemein

    • 2.2.2 Molekularbiologie

      • 2.2.2.1 Vektoren

      • 2.2.2.2 Oligonukleotide und cDNA Konstrukte

    • 2.2.3 Zellkultur

      • 2.2.3.1 Transfizierte HEK 293 und MDCK Zelllinien

    • 2.2.4 Proteinbiochemie und Immunocytochemie

      • 2.2.4.1  Antikörper

  • 2.3 Molekularbiologische Methoden

    • 2.3.1 PCR (Polymerasekettenreaktion)

    • 2.3.2 Agarose-Gelelektrophorese

    • 2.3.3 Isolierung und Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

    • 2.3.4 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

    • 2.3.5 Dephosphorylierung von DNA

    • 2.3.6 Ligation von DNA

    • 2.3.7 E. coli Kulturen

    • 2.3.8 Herstellung kompetenter E. coli Zellen

    • 2.3.9 Transformation von DNA-Konstrukten in kompetente Bakterien

    • 2.3.10 Präparation von Plasmid-DNA in kleinem Maßstab (Mini-Präp)

    • 2.3.11 Präparation von Plasmid-DNA in großem Maßstab (Maxi-Präp)

    • 2.3.12 Sequenzierung der DNA-Konstrukte

  • 2.4 Zellkultur

    • 2.4.1  Kultivierung und Verdünnung von HEK 293 Zellen

      • 2.4.1.1 Anlegen von Dauerkulturen (Kryokonservierung)

      • 2.4.1.2 Transfektion von HEK 293 Zellen mit rekombinanter DNA

      • 2.4.1.3  Beschichtung von Kulturschalen und Deckgläschen mit Poly L-Lysin

      • 2.4.1.4 Zählen von Zellen

    • 2.4.2 Kultivierung der MDCK Zellen

      • 2.4.2.1 Verdünnung, Kryokulturen und Transfektion

      • 2.4.2.2 Wachstum von MDCK Zellen in Filterkammern

  • 2.5 Proteinbiochemische Methoden

    • 2.5.1 Herstellung von Zelllysaten

      • 2.5.1.1  Gesamtproteinlysat

      • 2.5.1.2  Membranproteinlysat

    • 2.5.2 Proteinbestimmung

    • 2.5.3 Nachweis von Proteinen

      • 2.5.3.1  TCA-Fällung von Proteinen

      • 2.5.3.2 Immunopräzipitation von Proteinen

      • 2.5.3.3  SDS-Polyacrylamid Gelektrophorese (SDS-PAGE)

      • 2.5.3.4 Tris-Tricine-Gelelektrophorese

      • 2.5.3.5 Western Blot Analyse

      • 2.5.3.6 Fluorografische Analyse radioaktiv markierter Proteine

      • 2.5.3.7 Quantifizierung radioaktiv markierter Proteine

    • 2.5.4 Metabolische radioaktive Markierung von Proteinen

      • 2.5.4.1 Langzeitmarkierung von HEK 293 Zellen mit [S]Methionin/ Cystein

      • 2.5.4.2  Langzeitmarkierung von MDCK Zellen mit [S]Methionin/ Cystein

      • 2.5.4.3 „Pulse/chase“-Markierung von HEK 293 Zellen

      • 2.5.4.4 „Pulse/chase“-Markierung von MDCK Zellen

      • 2.5.4.5 Markierung von MDCK Zellen mit [H]Phenylalanin und Radiosequenzierung

    • 2.5.5 Analyse der Protein-Glycosylierung

      • 2.5.5.1  N-Glycosidase F Behandlung

      • 2.5.5.2 Endoglycosidase H Behandlung

      • 2.5.5.3 Tunicamycin Behandlung

    • 2.5.6 Analyse zellulärer Transport Mechanismen

      • 2.5.6.1 Behandlung von HEK 293 Zellen mit Brefeldin A und Monensin

      • 2.5.6.2 Behandlung von HEK 293 mit Furininhibitor und Calcium-Ionophor

      • 2.5.6.3 Biotinylierung von apikalen und basolateralen Oberflächenproteinen polarisierter MDCK Zellen.

      • 2.5.6.4 Untersuchung der Endocytose und Transcytose in polarisierten MDCK Zellen

  • 2.6 Immunocytochemische Methoden

    • 2.6.1  Immunofluoreszenz von transfizierten, auf Deckgläschen gewachsenen HEK 293 Zellen

    • 2.6.2 Oberflächenimmunofluoreszenz von transfizierten, in Filter- kammern polarisierten MDCK Zellen

  • 2.7 BACE in vitro Assay

    • 2.7.1 Enzympräparationen

      • 2.7.1.1  Aufreinigung von BACE-L(His)₆ über Nickel-Agarose

      • 2.7.1.2 Dialyse von konditioniertem Medium

      • 2.7.1.3 Konzentration von konditioniertem Medium

      • 2.7.1.4  Membranpräparation

    • 2.7.2 BACE-L -Substate

    • 2.7.3 Durchführung des BACE-Assay

      • 2.7.3.1  Bestimmung der IC₅₀-Werte von BACE-Inhibitoren

• 3 Ergebnisse

  • 3.1 Expression und Nachweis von BACE

    • 3.1.1  Expression von BACE in HEK 293 Zellen und MDCK Zellen

    • 3.1.2 Antikörper zum Nachweis von BACE

    • 3.1.3 Spezifität der Antiseren und Nachweis von BACE im Western Blot und in der Immunopräzipitation

  • 3.2  Maturierung von BACE durch post-translationale Modifikationen

    • 3.2.1 Kinetik der Maturierung von BACE

    • 3.2.2 N-Glycosylierung von BACE

    • 3.2.3 Analyse der Propeptidprozessierung von BACE

      • 3.2.3.1  Zelluläre Lokalisierung der BACE-Propeptidabspaltung

      • 3.2.3.2 Bestimmung der Schnittstelle der BACE-Propeptidkonvertase

  • 3.3 Einfluss von BACE auf die βAPP-Prozessierung

    • 3.3.1 Antikörper zum Nachweis des βAPP und der βAPP-Prozessierungsprodukte

    • 3.3.2  Prozessierung von βAPP durch BACE und die BACE-Varianten: ΔC, L, R45A

  • 3.4 Identifizierung der Propeptidkonvertase von BACE

  • 3.5 Polarisierter Transport von BACE

    • 3.5.1 BACE-Prozessierung in MDCK Zellen

    • 3.5.2 BACE-Aktivität in MDCK Zellen

    • 3.5.3 Zelloberflächenverteilung von BACE in MDCK Zellen

      • 3.5.3.1 Immunocytochemische Detektion von BACE an der Plasma- membran

      • 3.5.3.2 Biochemische Detektion von BACE an der Plasmamembran

    • 3.5.4 Einfluss der BACE-Sortierung auf die Prozessierung von βAPP

      • 3.5.4.1  Polarisierte Sezernierung von l-βAPPα und l-βAPPβ

      • 3.5.4.2 Polarisierte Sezernierung von Aβ und p3

      • 3.5.4.3 Polarisierte Verteilung von βAPP-CTF an der Plasma- membran

      • 3.5.4.4 Reinternalisierung und Transcytose von βAPP

      • 3.5.4.5 Deletion des basolateralen βAPP-Sortierungssignals und Auswirkung auf die βAPP-Prozessierung

    • 3.5.5 Oberflächenlokalisierung der Komponenten des γ-Sekretase-Komplexes in polarisierten MDCK Zellen

  • 3.6  In vitro Charakterisierung von BACE

    • 3.6.1 Entwicklung eines Assays für BACE

      • 3.6.1.1  Enzymquelle und Enzymaufreinigung für den BACE-Assay

      • 3.6.1.2 Substrat für den BACE-Assay

      • 3.6.1.3 Konditioniertes Medium als Enzymquelle

    • 3.6.2 Charakterisierung der Aktivität von BACE-L

      • 3.6.2.1  Bestimmung des pH-Optimums der BACE-L-Aktivität

      • 3.6.2.2 Die BACE-L-Aktivität in Abhängigkeit von der Substrat-konzentration

      • 3.6.2.3 Spezifische Inhibitoren von BACE-L

• 4 Diskussion

  • 4.1  Charakterisierung von BACE im Zellkultursystem

    • 4.1.1 Expression von BACE in HEK 293 und MDCK Zellen

    • 4.1.2 Maturierung und Stabilität von BACE

    • 4.1.3 Die Glycosylierung von BACE

    • 4.1.4 Die Prozessierung des BACE-Propeptids

    • 4.1.5  Die βAPP-Prozessierung durch BACE und BACE-Varianten

    • 4.1.6 Polarisierter Transport von BACE

      • 4.1.6.1  Auswirkungen des polarisierten Transports von BACE auf die βAPP-Prozessierung

      • 4.1.6.2 βAPP prozessierende Sekretase Aktivitäten in MDCK Zellen

  • 4.2 Charakterisierung von BACE - in vitro

  • 4.3 Relevanz der Ergebnisse bezüglich der Alzheimer Krankheit

• Abkürzungsverzeichnis

• Literaturverzeichnis

• Danksagung

• Erklärung

• Lebenslauf

• Publikationen

• Tabelle 1: Oligonukleotide für die PCR

• Tabelle 2: Bezeichnung und exogene Proteinexpression der benutzten Zelllinien

• Tabelle 3: Übersicht der Primär-Antikörper

• Tabelle 4: Übersicht der Sekundär-Antikörper

• Tabelle 5: Eigenschaften der eingesetzten Fluorochrome

• Tabelle 6: CyDye-Peptid-Substrate für den BACE Assay

• Tabelle 7: Peptidinhibitoren für BACE

• Abbildung 1: Dokumentation der neurofibrillären Pathologie nach Alois Alzheimer

• Abbildung 2: Histopathologische Charakteristika der Alzheimer Krankheit

• Abbildung 3: Vereinfachte schematische Darstellung der Amyloid-Kaskade

• Abbildung 4: Schematische Darstellung von βAPP₇₇₀

• Abbildung 5: Proteolytische Prozessierung von βAPP durch α-, β- und γ-Sekretase

• Abbildung 6: Übersicht über die FAD-Mutationen im βAPP-Gen

• Abbildung 7: Schema der BACE-Protease

• Abbildung 8: Struktur von PS1 und Lokalisation der FAD-Mutationen

• Abbildung 9: Schematische Darstellung des γ-Sekretase Komplexes

• Abbildung 10: Evolutionäre Verwandtschaft von BACE zu anderen Aspartylproteasen

• Abbildung 11: Mechanismus der Peptidspaltung durch Aspartylproteasen

• Abbildung 12: MDCK Zellmonolayer in einer Transwell-Filterkammer

• Abbildung 13: Polarisierte Sortierung von βAPP

• Abbildung 14: Schematische Darstellung der Entstehung des Fluoreszenzsignals durch Protease Aktivität

• Abbildung 15: Schema der BACE-CyDye-Substrate

• Abbildung 16: Schematische Darstellung von BACE mit Angabe der Antikörper

• Abbildung 17: Nachweis von BACE im Western Blot

• Abbildung 18: Nachweis von BACE in der Immunopräzipitation

• Abbildung 19: Darstellung der eingesetzten BACE-Konstrukte

• Abbildung 20: Maturierung von BACE-wt, BACE-ΔC und BACE-L analysiert im „pulse/chase“-Experiment

• Abbildung 21: Quantifizierung der Maturierung und des Abbaus von BACE-wt, BACE-ΔC und BACE-L

• Abbildung 22: N-Glycosidase F Behandlung von BACE

• Abbildung 23: Tunicamycin Behandlung BACE exprimierender Zellen

• Abbildung 24: Endoglycosidase H Behandlung von BACE

• Abbildung 25: Propeptidabspaltung von BACE, analysiert im „pulse/chase“-Experiment und in der Immunofluoreszenz

• Abbildung 26: BFA- und Monensin Behandlung BACE exprimierender Zellen

• Abbildung 27: Darstellung des BACE R45A Konstruktes

• Abbildung 28: BACE R45A analysiert im „pulse/chase“-Experiment

• Abbildung 29: Schematische Darstellung von βAPP₆₉₅ mit Angabe der Antikörper

• Abbildung 30: βAPP-Prozessierung in Abhängigkeit von BACE und BACE-Varianten

• Abbildung 31: Quantitative Auswertung der l-βAPP- und Aβ-Sezernierung

• Abbildung 32: Sezernierung von Aβ_Asp1 und Aβ_Glu11 in Abhängigkeit von der BACE-Variante

• Abbildung 33: Einfluss eines Furin-Inhibitors auf BACE-wt Maturierung, analysiert im „pulse/chase“-Experiment

• Abbildung 34: Einfluss des Furin-Inhibitors auf die BACE-Prozessierung von βAPP

• Abbildung 35: Einfluss von Calcium-Ionophor A23187 auf BACE-wt Maturierung, analysiert im „pulse/chase“-Experiment

• Abbildung 36: Maturierung von BACE in MDCK Zellen analysiert im „pulse/chase“-Experiment

• Abbildung 37: Analyse der Glycosylierung von BACE in MDCK Zellen

• Abbildung 38: Enzymatische Aktivität von BACE, exprimiert in MDCK Zellen

• Abbildung 39: Immunofluoreszenz von BACE an der Zelloberfläche von polarisierten MDCK Zellen

• Abbildung 40: Biotinylierung von BACE an der Zelloberfläche vonpolarisierten MDCK Zellen

• Abbildung 41: Biotinylierung von BACE-STOP₄₉₄ an der Zelloberfläche von polarisierten MDCK Zellen

• Abbildung 42: Einfluss von BACE auf βAPP-Prozessierung in MDCK Zellen

• Abbildung 43: Sezernierung der l-βAPPα- und l-βAPPβ-Spezies in BACE und βAPP transfizierten MDCK Zellen

• Abbildung 44: Polarisierte Sezernierung l-βAPPα und l-βAPPβ

• Abbildung 45: Sezernierung von Aβ und p3 in BACE und βAPP transfizierten MDCK Zellen

• Abbildung 46: Polarisierte Sezernierung von l-βAPPβ und Aβ in BACE transfizierten MDCK Zellen

• Abbildung 47: Biotinylierung von βAPP-CTF an der Zelloberfläche von polarisierten MDCK Zellen

• Abbildung 48: Reinternalisierung vom βAPP-Holoprotein

• Abbildung 49: Sezernierung der l-βAPPα und l-βAPPβ-Spezies in BACE und βAPPΔC transfizierten MDCK Zellen

• Abbildung 50: Sezernierung von Aβ und p3 in βAPPΔC transfizierten MDCK Zellen

• Abbildung 51: Biotinylierung von γ-Sekretase Komponenten an der Zelloberfläche von polarisierten MDCK Zellen

• Abbildung 52 Partielle Aufreinigung von BACE-L über Ni-Agarose

• Abbildung 53: Optimierung der Substratkettenlänge

• Abbildung 54: Aufbereitung des konditionierten Mediums BACE-L exprimierender Zellen

• Abbildung 55: Stabilität von BACE-L im konditionierten Medium

• Abbildung 56: BACE-L-Aktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert.

• Abbildung 57: BACE-L-Kinetik

• Abbildung 58: Hemmung von BACE-L durch Peptidinhibitoren

• Abbildung 59: Modell des BACE Transports und Lokalisierung der posttranslationalen Modifikationen

• Abbildung 60: Sezernierung von l-βAPPα und l-βAPP_total in βAPP und βAPPΔC transfizierten MDCK Zellen

• Abbildung 61: Polarisierte Sortierung von βAPP und den prozessierenden Proteasen