3 Methoden

3.1  RNase freies Arbeiten

↓28

Um die Degradierung durch ubiquitär vorhandene RNasen beim Arbeiten mit RNS zu umgehen, wurden bei 180°C für mindestens acht Stunden sterilisierte Glasgefäße sowie fabrikneue Reaktionsgefäße, Pipetten und Chemikalien benutzt. Sämtliche Reagenzien wurden RNase-frei angesetzt. Lösungen, welche keine Substanzen mit reaktiven Aminogruppen enthielten, wurden über Nacht mit 0,1% DEPC inkubiert und anschließend autoklaviert. Elektrophoreseapparaturen wurden gründlich mit handelsüblichen Geschirrspülmitteln gereinigt, mit 10% SDS behandelt und mit RNase freiem Wasser gespült. Außerdem wurden die Arbeiten mit Handschuhen durchgeführt.

3.2 Steriles Arbeiten

↓29

Um beim Arbeiten mit Reinkulturen Kontaminationen mit anderen Organismen zu verhindern, wurden Nährlösungen und Gerätschaften im Autoklaven bei 1bar Überdruck und 121°C für zwanzig Minuten sterilisiert beziehungsweise steril erhältliche Materialien verwendet. Arbeiten, welche Sterilität erforderten, wurden unter einem gesonderten Abzug durchgeführt.

3.3 Phenol - Choroform - Extraktion

Zur Entfernung von Proteinen und hydrophoben Stoffen aus wäßrigen DNS-Lösungen wurden diese auf Eis mit dem gleichen Volumen eines Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisches (25:24:1) versetzt und vermischt. Die Phasentrennung erfolgte durch zehnminütige Zentrifugation (Eppendorf Zentrifuge 5804 R) bei 4°C mit 15000 x g. Die obere wäßrige Phase, welche die DNS enthält, wurde abgenommen und mittels Ethanol gefällt, während die Interphase und die phenolische Phase verworfen wurden.

Alternativ wurde ein Gemisch aus Phenol, 0,5M TrisHCl - Puffer (pH 8) und Chloroform im Verhältnis 3:2:4 (PC8) verwendet. Bei ansonsten gleicher Vorgehensweise wurde hier lediglich zwei Minuten lang bei 4°C mit 6.000 х g zentrifugiert.

3.4 3. 4 Ethanolpräzipitation von Nukleinsäuren

↓30

Zur Fällung von Nukleinsäuren in wäßrigen Lösungen wurden soweit nicht anders angegeben die Ansätze auf 0,3M Ammoniumacetat eingestellt, mit 60µg Glycogen und zweifachem Volumen kalten 100% Ethanol versetzt und für mindestens eine Stunde bei -20°C inkubiert. Die gefällte DNS beziehungsweise RNS wurde für zehn Minuten bei 6.000 х g (4°C) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen, das Sediment zweimal mit kaltem 75% Ethanol gewaschen, einige Minuten bei Raumtemperatur getrocknet und in LoTE - Puffer aufgenommen.

Bei der in einigen Schritten von SAGE verwendeten sogenannten hoch konzentrierten Fällung wurden die Nukleinsäure-Lösungen auf 0,8M Ammoniumacetat eingestellt, ebenfalls mit 60µg Glycogen und hier mit dem dreifachem Volumen kaltem Ethanol versetzt. Anschließend wurde wie oben vorgegangen.

3.5 Bestimmung von Nukleinsäurenkonzentrationen

3.5.1  Messung der optischen Dichte

Im Photometer erfolgte die Messung der optischen Dichte (OD) bei 280nm (OD280) und bei 260nm (OD260). Der Grad der Verunreinigung mit Proteinen wurde aus dem Quotienten OD280/OD260 bestimmt, wobei ein Wert von größer 1,5 angestrebt wurde. Bei der üblicherweise für die Messungen verwendeten Verdünnung von 1:100 ergab sich die Konzentration K der Nukleinsäuren nach folgender Formel: K [µg/ml] = OD260 х 100 х c. Für c wurde bei Messungen von Doppelstrang-DNS 50µg/ml, 37µg/ml bei Einzelstrang-DNS, im Falle von RNS 40µg/ml (Einzelstrang-RNS) eingesetzt.

3.5.2 Semiquantitative DNS Mengenbestimmung mit Ethidiumbromid

↓31

Aus DNS-Marker (Konzentration der Stocklösung: 500ng/µl) wurden folgende DNS-Standards hergestellt: 0ng/µl, 1ng/µl, 2,5ng/µl, 5ng/µl, 7,5ng/ml, 10ng/µl und 20ng/µl. Von der zu quantifizierenden DNS-Lösung wurde aus 1µl 1:5, 1:25, 1:125 und 1:625 Verdünnungen hergestellt. Zu jeweils 4µl der Standards und der Proben wurde das gleiche Volumen an 1µg/ml Ethidiumbromid zugegeben. Auf einer auf einem UV-Bildschirm plazierten Plastikfolie wurden sämtliche Lösungen punktförmig aufpipettiert und fotographiert. Durch den visuellen Vergleich der Intensitäten von Standards und Proben wurde die DNS Konzentration der Proben geschätzt.

3.6 Gelelektrophorese

3.6.1  Agarosegelelektrophorese

Die Auftrennung von DNS beziehungsweise RNS nach ihrer Länge erfolgte im Agarosegel in einer horizontalen Gelelektrophoreseapparatur, wobei die Agarosekonzentration entsprechend dem gewünschten Trennbereich zwischen 0,7% und 3% lag. Nach Lösen der Agarose (Sigma, USA) in 1x TAE-Puffer oder 1x TBE-Puffer durch Aufkochen in einem Mikrowellengerät wurde sie auf mindestens 60°C abgekühlt und mit Ethidiumbromid (Endkonzentration 1µg/ml) versetzt. Nach Gießen und Verfestigen des Gels wurden die mit entsprechendem Puffer versetzten Nukleinsäurengemische aufgetragen. Für den Lauf wurde eine Gleichspannung von ein bis fünf Volt/cm über einen Zeitraum von ein bis zwei Stunden angelegt. Anschließend wurde das Gel auf einem UV - Schirm fotographiert.

3.6.2 Polyacrcylamidgelelektrophorese

Im Rahmen bestimmter SAGE - Schritte wurde je nach erwünschtem Trennbereich ein 18%, 12%, 8% oder 6% Polyacrylamidgel verwendet. Diese Elektrophorese fand in einer vertikalen Elektrophoreseapparatur (PEQLAB PSD9S - Kammer mit 1,5 mm Abstandhaltern) statt. Als Laufpuffer wurde 1x TAE-Puffer verwendet.

↓32

Für ein 12% Gel wurde folgende Zusammensetzung verwendet (Adjustierung der Polyacrylamidanteile je nach gewünschter Konzentration):

Nach mindestens einstündigem Polymerisieren des Gels wurde der Kamm vorsichtig entfernt und die ebenfalls mit entsprechendem Puffer versehenen Proben aufgetragen. Anschließend wurde die Elektrophorese bei 90 bis 160 V drei Stunden durchgeführt, wobei mit niedriger Spannung (90 V) begonnen wurde, diese nach einer halben Stunde auf 110 V und nach insgesamt einer Stunde auf 130 V gesteigert wurde. Während des gesamten Laufs wurde auf 10°C gekühlt.

↓33

Um die DNS sichtbar zu machen, wurde das Gel nach Beendigung der Elektrophorese, das heißt sobald das Bromphenolband das Ende des Gels erreicht hatte, für zwanzig Minuten in einer Färbelösung, welche aus 65ml 1x TAE-Puffer und 6ml SYBR Green I (Molecular Probes Inc.) einer 1:10000 Verdünnung bestand, bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Dokumentation wurde das Gel auf einem UV - Schirm unter Verwendung eines SYBR Green Filters (Molecular Probes Inc.) fotographiert.

3.7 Restriktionsenzymverdau

Zum enzymatischen Verdau von DNS wurden die DNS-Lösungen (1 - 20 µg DNS) mit biszu 100µg/ml BSA, dem zum Enzym passenden Restriktionspuffer und mit der entsprechenden Menge des Enzyms versetzt. Bei dem Verdau mit BsmFI waren dies 4U, mit NlaIII 17 (1. Verdau) oder 25 (2. Verdau) U/µg DNS. Nach Inkubation für eine Stunde bei 37°C beziehungsweise 65°C wurde eine Phenol - Chloroform - Extraktion und eine Ethanolfällung durchgeführt. Wenn eine Analyse des Verdaus von Interesse war, wurde diese per Gelelektrophorese ermöglicht.

3.8 Begradigen von cDNS

Um Überhänge von verdauter doppelsträngiger cDNS zu beseitigen und stumpfe Enden herzustellen, wurde in einem 50µl Ansatz 10µl der gereinigten DNS-Lösung (circa 2 - 3µg) mit der entsprechenden Menge (5µl) des Zweitstrangsynthese Puffers (BRL cDNA Synthese Kit), 1µl 100 x BSA, 1µl einer dNTP Mischung (25mM; Amersham) und 3U Klenow (Pharmacia) versetzt. Nach einer Inkubation von dreißig Minuten bei 37°C wurde eine Phenol - Chloroform - Extraktion und eine Ethanolfällung durchgeführt.

3.9 Ligation

↓34

Zur Ligation zweier DNS - Sequenzen wurden im 10µl Ansatz die DNS-Lösungen (mehrere hundert Nanogramm bis 4µg) mit 2 µl 5 x T4 Ligase Puffers und T4 Ligase (GibcoBRL) (Endkonzentration: 1U/µl) versetzt. Die Inkubation bei 16°C erfolgte über Nacht, wenn DNS Stücke in einen Vektor geklont wurden, oder zwischen zehn Minuten und zwei Stunden lang im Falle der Ligation zweier DNS-Stückchen.

Im Fall der Ligation der SAGE-Linker an cDNS-Fragmente wurde jeweils die gesamte Menge der immobilisierten cDNS und 2µg von einem der beiden Linkerduplexe (A beziehungsweise B) eingesetzt. Nach Inkubation bei 50°C für zwei Minuten und anschließend bei Raumtemperatur für eine Viertelstunde wurde jedem Ansatz 10 Units T4 Ligase zugegeben und bei 16°C für zwei Stunden inkubiert. Nach der Ligation wurde viermal mit 200µl B&W Puffer und zweimal mit 200µl 1x NEB Puffer gewaschen.

3.10 Präparation kompetenter Bakterien und Anlegen einer Bakterienstammsuspension

Auf M9-Platten wurde ein Einzelaustrich von XL1-Blue MRF Bakterien (Stratagene) (mit 12,5µg/ml Tetrazyklin) angelegt. Nach Inkubation dieses Ausstrichs bei 37°C über Nacht wurde als Vorkultur 5 ml LB-Medium (mit 0,2% Maltose, 10mM MgSO4, 12,5µl/ml Tetrazyclin) mit einer einzelnen Kolonie inokuliert und erneut über Nacht bei 37°C inkubiert. Für die Hauptkultur wurde damit 250 ml 2 x YT- Mediums (inklusive 1 ml Tetrazyclin der Konzentration 5 mg/ml) inokuliert und für vier Stunden bei 37°C inkubiert. Nach zehnminütigem Kühlen auf Eis wurde die Bakterienkultur bei 4000 х g (4°C) für zehn Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Bakterienpellet in kaltem sterilem Wasser gelöst. Dieses Vorgehen wurde mit absteigenden Volumina Wasser sechsmal wiederholt, wobei ab dem drittenmal die Bakterien in 10%igem kalten anstelle von Wasser gelöst wurden. Die gereinigten Bakterien wurden in 90 µl 10% sterilem Glyzerol aufgenommen und entweder sofort weiterverwendet oder mittels flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C aufbewahrt.

3.11 Transformation per Elektroporation

↓35

Zur Elektroporation kompetenter Bakterien wurde 40µl Bakterienlösung mit 1µl der zu sequenzierenden DNS-Lösung versetzt. Nach Inkubation auf Eis für eine Minute wurde die Mixtur in einem Elektroporationsapparat (Bio Rad E.coli Pulser) einem Strompuls (12,5 kV/cm, 200 Ohm, 25µF Kapazität, 4ms) ausgesetzt und anschließend sofort mit 1ml SOC-Medium versetzt. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurden die Bakterien auf Low Salt LB-Agar-Platten, welche IPTG und Antibiotika (Zeocin und Tetrazyclin) enthielten, ausplattiert und über Nacht bei 37°C wachsen gelassen. Bei Verwendung des Vektors pZErO™ - 1 (Invitrogen) konnten so nur Kolonien entstehen, deren Bakterien den die entsprechende Antibiotikaresistenz tragenden Vektor aufgenommen hatten, wobei wiederum lediglich Bakterien überlebensfähig waren, welche Vektoren mit Fremd-DNS aufwiesen, da ohne DNS-Insert ein letal wirkendes Protein (CcdB) gebildet wurde (doppelte positive Selektion). Die Zugabe von Tetrazyklin sollte das Wachstum anderer Bakterien als der zur Transfektion verwendeten verhindern. Die entstandenen Kolonien konnten einer Kontroll-PCR unterzogen werden und wurden dann einzeln gepickt und in 2ml SOB-Medium, das Zeozin enthielt, über Nacht bei 37°C vermehrt. Es schloß sich eine Reinigung der Plasmide an.

3.12 Gesamt-RNS Isolierung aus Gewebe

Die Isolierung von RNS aus Gewebe erfolgte mit Trizol ® entsprechend dem von GibcoBRL mitgelieferten Protokoll. Pro 50mg Gewebe wurde 1ml Trizol ® zur Homogenisation verwendet, was 8 ml Reagenz pro Maushirn entsprach. Nach fünfminütiger Inkubation des homogenisierten Materials bei Raumtemperatur wurde pro ml verwendeten Trizols® 200µl Chloroform dazugegeben und erneut für drei Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zentrifugation bei 12.000 х g (4°C) für 15 Minuten wurde die obere wäßrige Phase, in welcher die RNS gelöst war, abgenommen, während die phenolische und die Interphase verworfen wurden. Die Fällung der RNS erfolgte mittels Zugabe von 500µl Isopropylalkohols und 0,5 - 1µl RNase freien Glycogens pro anfangs verwendeten ml Trizol ® durch zehnminütige Inkubation bei Raumtemperatur und anschließender Zentrifugation bei 12.000 х g (4°C) für zehn Minuten. Nachdem das RNS-Pellet anschließend einmal mit 75% kaltem Ethanol gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet worden war, wurde es in LoTE aufgenommen. Um nachzuweisen, daß die RNS in Verlauf der Isolierung nicht degradiert worden war, wurde in einem 1% Agarosegel eine Elektrophorese durchgeführt. Die Konzentration der RNS-Lösung wurde per Messung der optischen Dichte bestimmt.

3.13 Boten-RNS - Präparation mittels Message Maker Kit

Für die Synthese von Boten-RNS wurde der Message Maker Kit (Gibco/BRL) nach Angaben des Herstellers verwendet. Um die Entfernung der ribosomalen RNS zuverlässig zu gewährleisten, wurde die Konzentration der isolierten Gesamt-RNS auf 0,55mg/ml oder geringer eingestellt. Nach Denaturierung der RNS bei 60°C für zwanzig Minuten und folgender Inkubation auf Eis für fünf Minuten wurde die NaCl - Konzentration der Proben auf 0,5M adjustiert. Zur Bindung der Boten-RNS wurde diese mit einem der Menge an Gesamt-RNS entsprechendem Volumen einer Oligo(dT) Cellulose - Suspension (zum Beispiel 1ml bei 0,5 - 1mg an Gesamt-RNS) bei 37°C unter mehrmaligem Invertieren für 30 Minuten inkubiert. Im Anschluß daran wurde die RNS - Oligo(dT) Cellulose Lösung mit den mitgelieferten Waschpuffer in einer Filterspritze zweimal gewaschen. Zum Lösen der Boten-RNS wurde 65°C warmes destilliertes Wasser verwendet, die folgende Zentrifugation bei 2.600 х g (4°C) für drei Minuten diente der Entfernung restlicher Cellulosepartikel. Der die Boten-RNS enthaltende Überstand wurde einer Ethanolfällung über Nacht unterzogen, wobei in diesem Fall 50µg/ml RNS-Lösung an Glycogen, ein Zehntel des Gesamtvolumens an 7,5M Ammoniumacetat und das zweifache Volumen an -20°C kaltem Ethanol verwendet wurden. Nach Zentrifugation bei 2.600 х g (4°C) für dreißig Minuten wurde die Boten-RNS in LoTE aufgenommen und ihre Konzentration per Messung der optischen Dichte bestimmt. Die Qualität der Boten-RNS wurde per Agarosegelelektrophorese und Northern Blot auf DNS Kontamination und Degration der RNS überprüft.

3.14 cDNS - Herstellung

↓36

Die Herstellung von biotinylierter cDNS erfolgte entsprechend dem von GibcoBRL mit dem cDNA Synthesis System mitgelieferten Protokoll. Die Herstellung des ersten DNS-Stranges aus mindestens 5µg Boten-RNS erfolgte in einen 50µl Ansatz mit folgenden Komponenten auf Eis :

Das Volumen wurde mit DEPC behandeltem Wasser auf 47,5µl ergänzt. Nach Inkubation bei 65°C für zwei Minuten und anschließend für den gleichen Zeitraum bei Raumtemperatur wurde der Ansatz mit 2,5µl M-MLV Reverse Transkriptase, was einer Endkonzentration von 10000 Einheiten/ml entsprach, versetzt, erneut inkubiert (eine Stunde bei 37°C) und anschließend auf Eis gestellt. Falls lediglich eine einsträngige und nicht-biotinylierte cDNS erwünscht war (zum Beispiel als Matrize für die Herstellung von Sonden), wurde zu diesem Zeitpunkt die Reaktion durch Zugabe von 1µl 0,25M Na2EDTA (pH 7,5) beendet. Außerdem wurde hierzu anstelle des biotinylierten Primers ein einfacher Oligo (dT)- Primer verwendet.

↓37

Zur Synthese des zweiten Stranges wurden zu obiger Probe auf Eis folgende Reagenzien hinzugegeben:

Nach Inkubation bei 16°C für zwei Stunden wurde die Probe mit 25µl 0,25M Na2EDTA (pH 7,5) versetzt, die cDNS mittels Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 21µl LoTE aufgenommen. Zur Überprüfung der Qualität der cDNS wurde mit 1µl der Lösung eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt. Des weiteren wurde die Konzentration der cDNS mittels Ethidiumbromid Punktquantifikation (siehe S. 36) abgeschätzt sowie ein cDNS Southern - Blot durchgeführt.

3.15 Polymerasekettenreaktion (PCR)

3.15.1  Allgemeine Prinzipien

↓38

Die Optimierung der PCR erfolgte standardmäßig in einem 50µl Ansatz aus folgenden Komponenten:

Zur Amplifikation von Plasmid-DNS und spezifischer SAGE-DNS-Stücke wurde dem Reaktionsansatz DMSO zugefügt.

↓39

Zur Amplifikation der SAGE-Ditags wurden für einen 50µl Standardansatz folgende Reagenzien verwendet:

Für die Screening-PCRs der klonierten Tagketten mit M13 F (universal) und R (reverse) Primern wurde folgender 25µl Ansatz gewählt:

↓40

Sämtliche Proben wurden zum Schutz gegen Volumenschwankungen durch Verdunstung mit circa 30µl Öl überschichtet, zusätzlich wurde stets die Deckelheizung des Thermocyclers (Trio-Thermoblock, Biometra) eingeschaltet.

Um eine größere Spezifität und Sensitivität zu erreichen, wurde eine Warmstart-PCR durchgeführt, das heißt, daß die Polymerase erst nach einem ersten Denaturierungsschritt bei 95°C von zwei Minuten auf Eis dem Ansatz zugegeben wurde. Aus diese Weise wurde beispielsweise eine unspezifische Anlagerung von Primern bei niedrigeren Temperaturen und die anschließende Verlängerung - bei bereits vorhandener Polymerase - vermindert. Zur Gewinnung von Amplifikaten mit möglichst wenigen Sequenzfehlern wurde bei der Herstellung von Sonden (Northern und cDNS Southern Blot) die Polymerase DyNAzyme (Biometra) verwendet, welche nach Herstellerangaben eine wesentlich geringere Fehlerrate als die Taq DNA Polymerase aufweist.

↓41

Bei unbefriedigenden Resultaten der Standard-PCR wurde diese durch Variation der einzelnen Parameter wie Konzentration, Temperatur, Länge der einzelnen Schritte im Verlauf der Amplifikation und Anzahl der Zyklen optimiert. Erfahrungsgemäß spielt die Wahl der Primer und des Temperaturprofils dabei die größte Rolle. Die Spezifität der PCR läßt sich beispielsweise durch eine Erhöhung der Temperatur um 2°C - 5°C während der Anlagerung der Primer steigern. Nach Beendigung der Amplifikation wurden die Ansätze im Agarosegel oder PAGE aufgetrennt und anhand eines DNS-Längenstandards analysiert. Falls eine Weiterverarbeitung des PCR-Produktes erforderlich war, wurde die gewünschte Bande aus dem Gel präpariert (siehe S. 48). Generell wurde beim Ansetzen einer PCR versucht, so kontaminationsfrei wie möglich zu arbeiten, wobei insbesondere auf die Verwendung separater Arbeitsgeräte beim Pipettieren von PCR Ansätzen und Amplifikaten geachtet wurde. Als Primer wurden erprobte Standard-Primer verwendet oder neue mit dem Programm PRIMER ausgewählt, wobei besonderes Augenmerk darauf gelegt wurde, daß die Schmelzpunkte beider Primer möglichst nahe beieinander lagen, und daß die Primer nicht mehr als drei Basenpaare zu sich selbst oder zueinander komplementäre Sequenzen enthielten, so daß sich keine Primer-Dimere ausbilden konnten. Die Sequenz zwischen den Primern wurde auf Homologien untersucht, wobei eine möglichst geringe Anzahl erwünscht war. Die gelieferten Primer wurden für eine Stockkonzentration von 100 pmol/µl in Wasser gelöst und mit einer Konzentration von 5 pmol/µl aliquotiert.

3.15.2  PCR - Programme

Diese sind Tabelle 5 zu entnehmen.

Tabelle 5. PCR-Programme.

Amplifikat

1. Dena-turierung

Zy-klen

Denatu-rierung

Anlage-rung

Elonga-tion

Extension

Endelon-gation

AKAP

2'/ 95°C

35

1'/ 95°C

1'/ 60°C

2'/ 72°C

keine

10'/ 72°C

AKAP (S)

2'/ 95°C

35

1'/ 95°C

1'/ 60°C

2'/ 72°C

5''

10'/ 72°C

SAGE -Ditags

10''/ 95°C

26

30''/ 95°C

1'/ 55°C

1'/ 70°C

keine

5'/ 70°C

Plasmide

20'/ 95°C

30

1'/ 95°C

1'/60°C

2'/ 72°C

keine

10'/ 72°C

Anmerkungen: Amplifikat - die zu amplifizierende DNS Matrize; 1. Denaturierung- Initialer Denaturierungsschritt; Zyklen - Anzahl der Wiederholungen der Schritte Denaturierung, Anlagerung und Elongation; Denaturierung - Trennung des DNS Doppelstranges; Anlagerung Schritt, bei welchen sich die Primer anlagern; Elongation - Schritt, während dem die Polymerase den komplementären DNS Strang synthetisiert; Extension - die Zeit, um die der Elongationsschritt bei jedem Durchlauf verlängert wird; Endelongation - terminaler Elongationsschritt; (S) - Programme zur Fluoreszeinmarkierung der entsprechenden Sonden.

3.16 Fluoreszein - Markierung von DNS - Sonden

3.16.1  Markierung in der PCR

↓42

Für die Markierung von DNS-Sonden mittels PCR wurde ein Verfahren angewendet, das auf dem Gene Images Kit (Amersham) basiert. Das zu markierende Amplifikat einer vorangegangenen PCR wurde auf einem präparativen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, mit dem QIAquick Gel Extraction Kit gereinigt (siehe S.48) und nach erfolgter Optimierung der PCR in einem Reamplifizierungsschritt mit Fluoreszein markiert. Dies geschah im 50µl Ansatz in folgender Zusammensetzung:

Die Überschichtung der Probe mit circa 30µl Öl, die Art und Weise des Pipettierens, der Warmstart und die Wahl des PCR Programms entsprach dem üblichen Vorgehen bei einer PCR (siehe S. 41).

3.16.2 Kontrolle des Fluoreszein-Einbaus

↓43

Der Erfolg der Fluoreszeinmarkierung der amplifizierten Sonden wurde in einem Standardagarosegel abgeschätzt. Nach der Gelelektrophorese wurde auf dem UV-Schirm die Bandenintensität mit einer Positivkontrolle verglichen, bei welcher in einem sonst identischen PCR-Reaktionsansatz dTTP anstelle von Fluoreszein-dUTP eingesetzt worden war. Um die Sonde zu reinigen, wurde diese aus dem Gel herausgeschnitten und per QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) aufbereitet. Zur Abschätzung der Konzentration der gelgereinigten Sonde wurde ein Zehntel ihre Volumens im Agarosegel aufgetragen und die Menge anhand einer DNS-Leiter bekannter Konzentration bestimmt.

3.17 Northern - Blot

Die Durchführung der Northern-Blot Analyse erfolgte in Anlehnung an Sambrook (1989).

3.17.1  Transfer der RNS auf eine Nylonmembran

Denaturierung der RNS

Die RNS (10 - 40µg in 5,4µl) wurde mit 5,4µl deionisiertem Glyoxal, 16µl DMSO (Dimethylsulfoxid) und 3µl 0,1M Natriumphosphatpuffers (pH 7) versetzt und für eine Stunde bei 50°C inkubiert. Nach der Denaturierung wurden die Proben auf Eis gestellt und 4µl Probenpuffer (50% Glyzerin, 10mM Natriumphosphatpuffer (pH 7), 0,1% Bromphenolblau) hinzugegeben.

Gelelektrophoretische Auftrennung der RNS

↓44

Als Laufpuffer für das 1% Agarosegel wurde 1mM Natriumphosphatpuffer (pH 7) verwendet. Die Proben wurden mit einem Volumen von je 33,8µl aufgetragen. Zur Molekulargewichtbestimmung wurden ein DNS- und ein RNS- Größenstandard verwendet. Es wurde eine Spannung von 3 - 4 V/cm angelegt, was bei 100V eine Laufzeit von drei bis vier Stunden ergab. Dabei wurde der Laufpuffer kontinuierlich durch eine Umwälzpumpe umgewälzt. Nach einer Laufstrecke der Bromphenollaufbande von circa 11cm wurde das Gel auf dem UV-Schirm mit angelegtem fluoreszierendem Lineal fotografisch dokumentiert. Zur Orientierung wurde eine Ecke des Gels abgeschnitten.

Kapillartransfer der RNS

Die RNS wurde mit 20 x SSC als Puffer von dem Agarosegel auf eine Nylonmembran (Böhringer Mannheim) transferiert. Dazu wurde die Membran kurz in Aqua bidest. getaucht und für circa zehn Minuten in 2 x SSC geschüttelt. Mit fünf Lagen des 3MM-Papiers (Whatman) wurde genauso verfahren. Der Transferturm wurde in folgender Reihenfolge aufgebaut: unten ein 3MM-Papierstreifen, welcher an beiden Enden in das Pufferreservoir ragte, darauf das Gel, die feuchten 3MM-Papiere, fünf trockene 3MM-Papiere, mehrere Lagen saugfähiger Papiertücher und zuoberst ein Gewicht von circa 500 g. Die Zeit für den Transfer betrug zwölf bis fünfzehn Stunden. Nach Abbau des Turms und Markierung der Gelkanten auf der Membran wurde diese auf Gelgröße zurecht geschnitten und beschriftet. Anschließend wurde sie in 6 x SSC geschwenkt. Zum Binden der RNS an die Nylonmembran wurde diese für zwei Stunden bei 180°C inkubiert. Die Lagerung erfolgte trocken bei Raumtemperatur. Benutzte Membranen wurden feucht bei -20°C aufbewahrt.

3.17.2 Hybridisierung und Detektion von Northern-Blots mit dem Gene-Images-System

Hybridisierung

Die Hybridisierung mit fluoreszeinmarkierten DNS-Sonden erfolgte entsprechend dem mitgelieferten Protokoll des Herstellers (Gene-Images-System, Amersham). Die Prähybridisierung wurde bei 60 - 66 °C für mindestens zwei Stunden in einem Puffer mit 5% Dextransulfat, 5 x SSC, 0,1% SDS und 1/20 Volumenanteil Liquid Block-Reagenz (Amersham) durchgeführt. Die markierte Sonde wurde durch fünfminütige Inkubation bei 100°C und für weitere fünf Minuten auf Eis denaturiert und anschließend unter Schütteln zur die Prähybridisierungslösung gegeben. Pro Blot wurden 300 - 400ng Sonde verwendet. Die Hybridisierung erfolgte über Nacht bei 60 - 66°C unter ständigem Schütteln. Im Anschluß wurde die Membran kurz in einer Mischung aus 0,5 x SSC und 0,1% SDS gewaschen und dann bei 60 - 64°C für je 15 Minuten zweimal in der gleichen Lösung und in einem dritten Schritt in 0,1 x SCC und 0,1 SDS geschüttelt.

Detektion

↓45

Diese erfolgte mit einem Anti-Fluoreszein-Antikörper. Dafür wurde nach der Hybridisierung die Membran mit einem Verdünnungspuffer (100mM Tris-HCl [pH 7,5] und 300mM NaCl) gespült und für eine Stunde bei Raumtemperatur mit Liquid Block -Reagenz (1:10 in dem Verdünnungspuffer) zur Blockierung unspezifischer Verbindungen inkubiert. Nach erneutem Spülen der Membran mit dem Verdünnungspuffer wurde sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit Anti-Floureszein-Ig-Alkalische-Phosphatase-Konjugat (1:5000 in dem Verdünnungspuffer inklusive 0,5% BSA) inkubiert. Es schloß sich ein dreimaliger Waschvorgang von je 15 Minuten mit dem Verdünnungspuffer, welcher zusätzlich 0,3% Tween enthielt, an. Vor der eigentlichen Detektion wurde ein letztes Mal mit dem puren Verdünnungspuffer gespült. Die gebundenen Antikörperkonjugate wurden so dann mit einem Substrat für die alkalische Phosphatase detektiert, welches ein fluoreszierendes Produkt ergab. Dieses wurde über die Belichtung eines Films (Kodak BioMax MS) sichtbar gemacht, wobei die Expositionszeit zwischen einigen Sekunden und mehreren Tagen betrug.

Entfernen einer Sonde von einer Membran

Um nach einer Hybridisierung die Membran wiederverwenden zu können, mußte die Sonde entfernt werden. Hierzu wurde ein "Stripping"-Puffer (10mM Tris [pH 8], 1mM EDTA und 1% SDS) in einem großen Becherglas auf dem Bunsenbrenner zum Kochen gebracht. Bei einer Temperatur von 90 - 100°C wurde die Membran zehn bis fünfzehn Minuten inkubiert. Dieser Vorgang wurde mit einem frischen Puffer wiederholt. Bis die Membran erneut hybridisiert wurde, wurde sie bei -20°C feucht aufbewahrt.

3.18 cDNS Southern - Blot

Die Durchführung erfolgte in Anlehnung an Sambrook (1998).

3.18.1  Transfer von cDNS auf eine Nylonmembran

↓46

Die elektrophoretische Auftrennung der cDNS erfolgte im 1% Agarosegel bei einer Spannung von 1V/cm mit 1 x TAE als Laufpuffer. Das Gel wurde auf dem UV-Schirm fotographiert und die rechte untere Ecke zur Orientierung abgeschnitten. Für den Kapillartransfer wurde wie beim Northern Blot eine positiv geladene Nylonmembran (Böhringer Mannheim) verwendet. Zur Denaturierung der doppelsträngigen DNS wurde das Gel vor dem Transfer 45 Minuten bei Raumtemperatur in 1,5M NaCl und 0,5M NaOH inkubiert und nachfolgend kurz in Wasser gespült. Zur Neutralisierung wurde bei Raumtemperatur in 1,5M NaCl und 0,5M TrisHCl (pH 7,5) für 15 Minuten und ein zweites Mal für 30 Minuten inkubiert. Nach diesen Inkubationsschritten wurde das Gel, einige Lagen 3MM-Papier (Whatman) und die Nylonmembran mit 2 x SSC gespült sowie der Transferturm (siehe S.45) mit einem 20 x SSC Reservoir als Puffer aufgebaut. Im Anschluß an den Transfervorgang, der zwölf bis fünfzehn Stunden dauerte, wurde der Turm abgebaut und die Membranorientierung gekennzeichnet. Die Membran wurde kurz in 6 x SSC und dann für zwei Stunden bei 80°C im Ofen inkubiert. Sie wurde trocken bei Raumtemperatur beziehungsweise nach erfolgter Hybridisierung feucht bei -20°C gelagert.

3.18.2 Hybridisierung und Detektion von cDNS Southern -Blots mit dem Gene-Images-System

Diese erfolgte nach demselben Schema wie beim Northern - Blot (vergleiche S. 46). Allerdings wurde die Hälfte der dort angegebenen Menge an Sonde benötigt.

3.19 Präparative Gelelektrophorese

3.19.1  QIAqick Gel Extraction Kit

Zur Isolierung von DNS-Fragmenten einer Länge von 100 bis 10000 Basenpaaren aus Agarosegelen kam der QIAqick Gel Extraction Kit (Qiagen) zur Anwendung. Nach der elektrophoretischen Auftrennung der DNS wurde der Bereich des Gels, welcher das gewünschte Fragment enthielt, unter UV-Kontrolle ausgeschnitten. Die Agarose wurde anschließend in drei Volumina des mitgelieferten QX1 Puffers für zehn Minuten bei 50°C unter intermittierendem Invertieren inkubiert. Nach Verflüssigung des Gels wurde ein Volumen Isopropanol zugegeben und die Mixtur in einer vom Hersteller mitgelieferten Zentrifugationssäule für eine Minute bei 10000 x g zentrifugiert. Dieser Vorgang wurde nach der Zugabe von 500µl QX1 Puffers auf die Säule wiederholt. Zum Waschen wurde die Säule für fünf Minuten mit 750µl des mitgelieferten PE Puffers inkubiert und anschließend zweimal für eine Minute bei 10000 x g Umdrehungen zentrifugiert. Nach den Zentrifugationsschritten wurden die durchgelaufenen Lösungen jeweils verworfen. Zur Elution der gebundenen DNS wurde die Säule mit 50µl Tris-HCl (pH 8,5) für eine Minute inkubiert und durch eine einminütige Zentrifugation (10000 x g) aus der Membran der Säule gelöst. Bis zum weitern Gebrauch wurde die gereinigte DNS bei -20°C aufbewahrt.

3.19.2 Präparation von DNS-Fragmenten nach Polyacrylamidgelelektrophorese

↓47

Hierzu wurde nach der Auftrennung der DNS Probe im PAGE das Zielfragment nach SYBR Green I Färbung (vergleiche S. 37) auf dem UV-Schirm herausgeschnitten und in ein 0,5ml Mikrozentrifugenröhrchen, in dessen Boden zuvor mit einer Nadel ein circa 0,5mm großes Loch gebohrt worden war, plaziert. Dieses 0,5 ml Röhrchen wurde vor einer zweiminütigen Zentrifugation bei 10000 x g und 4°C in ein 1,5ml Gefäß gesetzt. Auf diese Weise wurden die exzidierten Gelbanden fragmentiert in dem äußeren Gefäß gesammelt. Zu diesen Fragmenten wurden jeweils 800µl LoTE dazugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Im nächsten Schritt wurde nach einer 15 minütigen Inkubation bei 65°C oder 37°C die Mixtur in SpinX (0,22µm)-Zentrifugationssäulen (Costar Inc.) geladen und für mindestens fünf Minuten bei 10000 x g und 4°C zentrifugiert, bis die Lösung durch die gesamte Säule gelaufen war. Dieser Durchlauf wurde in 300µl Portionen aufgeteilt und einer Ethanolfällung unterzogen. Anschließend wurden die gefällten und gewaschenen DNS Pellets in je 10µl LoTE resuspendiert und in einem Reaktionsgefäß gesammelt.

3.20 Binden von biotinylierten cDNS-Fragmenten an Dynabeads

Um mit Biotin markierte cDNS-Fragmente isolieren zu können, wurden sie an magnetische mit Straptavidin bedeckte Partikel (Dynabeads) gebunden.

Zur Vorbereitung wurden die Partikel (50µl, entspricht 0,5mg) mittels eines entsprechenden Magnets immobilisiert und der Überstand abgenommen. Zum Waschen wurden 200µl des B&W Puffers zugegeben, die Partikel aufgemischt, wieder immobilisiert und der Puffer entfernt. Um die Biotin-cDNS Fragmente zu binden, wurden 100µl B&W Puffer, 90µl LoTE und 10µl der cDNS-Lösung hinzugefügt. Anschließend wurde bei Raumtemperatur für zwanzig Minuten inkubiert und dreimal mit je 200µl B&W Puffer und einmal mit 200µl LoTE gewaschen.

3.21 Vektorisolation

3.21.1  Reinigen von Plasmid-DNS mit dem Plasmid Mini Purifikation Kit (Qiagen)

↓48

Die Präparation der DNS erfolgte entsprechend dem von Qiagen mitgelieferten Protokoll. Die über Nacht in 3ml LB-Medium gewachsenen E. coli Kulturen wurden halbiert. Nach Zentrifugation bei 5000 x g (4°C) für fünf Minuten und Entfernung des Überstandes wurden zum Resuspendieren des Bakterienpellets diese mit 300µl des mitgelieferten P1 Puffers versetzt. Um die Bakterien zu lysieren, wurde den Ansätzen Puffer P2 (300µl) zugegeben und bei Raumtemperatur fünf Minuten inkubiert. Nach Zugabe von 300µl P3 zur Präzipitation von Proteinen und genomischer DNS erfolgte eine Inkubation von zehn Minuten auf Eis. Nach Zentrifugation bei 15000 x g (4°C) für 15 Minuten wurde der Überstand, der die Plasmide enthielt, sofort entfernt und auf die mit 1ml QBT Puffer equilibrierten Reinigungssäulen gegeben. Um sämtliche kontaminierenden Bestandteile zu entfernen, wurde viermal mit je 1ml QL Puffer gewaschen. Zur Elution der DNS wurden 800µl QF Puffer auf die Säule pipettiert. Die gelöste DNS wurde mit je 560µl Isopropanol gefällt, zweimal mit Ethanol gewaschen und in je 20µl LoTE aufgenommen.

3.21.2 Reinigen von Plasmid-DNS mit Qiaprep 96 Turbo Miniprep Kit

Dieser Schritt sowie die Sequenzierung mit dem BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Kits (Perkin Elmer, Vaterstetten, BRD) wurde in Kooperation mit dem Institut für Molekulare Biotechnologie (IBM) in Jena durchgeführt.

Die Präparation der DNS erfolgte entsprechend dem von Qiagen mitgelieferten Protokoll. Die über Nacht in LB-Medium gewachsenen E. coli Kulturen wurden zum Resuspendieren des Bakterienpellets mit 250µl des mitgelieferten P1 Puffers versetzt. Nach Transfer der Suspension in einen speziellen Block, welcher Teil des Kits ist, wurde jeder Probe 250µl des Puffers P2 zugesetzt, der Block mehrfach invertiert und bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubiert. Nach anschließender Zugabe von 350µl Puffer N3 wurden die Zellysate in die TurboFilter Platten des Herstellers pipettiert. Mit einer Geschwindigkeit von ein bis zwei Tropfen pro Sekunde wurden durch Anlegen eines Vakuums denaturierte und gefällte Zellbestandteil abgefiltert, während die Partikel freien Lysate im QIAprep Modul aufgefangen wurden. Die an eine Silicagelmembran gebundene DNS wurde durch erneutes Anlegen eines Vakuums von RNS, zellulären Proteinen und Metaboliten gereinigt. Nach zweimaligem Waschen mit 0,9ml PE Puffer wurden die Membranen durch zehnminütiges Anlegen des maximalen Vakuums getrocknet. Zur Elution der DNS wurden 100µl EB Puffer (10mM TrisHCl mit einem pH von 8,5) verwendet.

3.22 Sequenzierung

3.22.1  Sequenzierung mit fluoreszierenden Primern

↓49

Nach Reinigung einer Über-Nacht-Kultur des Plasmids (siehe S.49) erfolgte die Sequenzierung anhand des Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit (Amersham, Braunschweig, Deutschland) und eines ALFexpress DNA Sequenzierautomaten (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland). Dazu wurden zu 5µl des Plasmids 1µl fluoreszierender Primer (M13 universal; Konzentration: 1,5pmol/µl) und 2µl der vier Nukleotidgemische gegeben, mit 30µl Öl beschichtet und folgendem Programm unterzogen: 95°C für 30 Sekunden, 20 Zyklen mit 95°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute, abschließend 72°C für 5 Minuten. Nach Entfernung des Öls wurden je 5µl Ladepuffer zugegeben und das Gemisch auf das 6% Polyacrylamid-Gel (15ml 30%Acrylamidlösung, 7ml Aqua bidest., 37,5ml 47% Harnstofflösung, 15ml 5 x TBE-Puffer, 375µl 10% APS und 30µl TEMED) aufgetragen.

3.22.2 Sequenzierung mit fluoreszierenden Nukleotiden

Die zu sequenzierende Plasmid-DNS wurde vor der Sequenzierung mittels Qiaprep 96 Turbo Miniprep Kit (Qiagen) (siehe S.50) gereinigt. Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung eines ABI PRISM® DNA Sequencing Kits (Perkin Elmer, Vaterstetten, BRD), nämlich des BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Kits, und von DNS Sequenzierautomaten (ABI 373A/ ABI Perkin Elmer, Weiterstadt, BRD), wobei die Terminatoren - Didesoxynukleotide - markiert waren. Entsprechend den Empfehlungen des Herstellers wurde nach Zugabe von pro Sequenzierungsansatz 4µl Kit (enthielt Puffer, AmpliTaq FS DNA Polymerase, dNTPs und die Terminatoren), 3µl H2O, 1µl des M13 Vorwärtsprimers zu 4µl der aufbereiteten DNS-Lösungen die Sequenzierungs-PCR mit folgendem Programm durchgeführt: 3 Minuten: 95°C, 10 Sekunden: 95°C, 1 Minute: 50°C, 4 Minuten: 60°C. Die Schritte zwei bis vier wurden 34 mal wiederholt, bevor die Reaktion auf 4°C gekühlt wurde. Um nicht eingebaute markierte ddNTPs zu entfernen, wurde ein Ethanolpräzipitation durchgeführt. Die gefällte DNS wurde in 2µl Probenpuffer (1ml Ansatz: 40µl EDTA [0,5 M], 960µl Formamid, 6mg Dextranblau) aufgenommen und für fünf Minuten bei 80°C denaturiert, bevor sie auf das Gel aufgetragen wurde. Für die Gelelektrophorese und zur Detektion wurde der oben genannte Sequenzierautomat benutzt.

3.23 Statistische Methoden

Im Folgenden wird eine Test übergreifende Berechnung dargestellt (Berechnung der Regulation). Die Beschreibung sämtlicher weiterer Methoden erfolgt im Rahmen der Darstellung des jeweiligen Testes.

↓50

Um das Ausmaß des Unterschieds zwischen den beiden Kontrollprofilen berechnen zu können, wurden - um Division durch Null zu vermeiden - sämtliche Nullen durch den Wert eins ersetzt (nur für diese Berechnung). Anschließend wurden die so entstandenen Gesamthäufigkeiten berechnet (Daten ohne Sequenzfehlerkorrektur beispielsweise: K1 von 13584 auf 19462 und K2 von 13915 auf 20036 gestiegen) und zur Normalisierung (Lal et al. 1999) K1 auf K2 hochgerechnet (Daten ohne Sequenzfehlerkorrektur: Faktor 1,0295). Die Division von K1 durch K2 ergab die Faktoren der "Regulation". Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden als "reguliert" nur die Tagpaare betrachtet, deren Faktor ≤ 0,5 beziehungsweise ≥ 2 war.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
23.08.2006