1  Einleitung

• 1.1  Einführung: "Wanderer, kommst du nach 7q31.2" (FAZ, 7.3.00) oder "Wohin mit drei Milliarden Buchstaben?" (FAZ, 9.10.01).

• 1.2 Definitionen

• 1.3 Hintergründe und Potential der Transkriptomanalyse

• 1.4 Verhältnis Boten-RNS und molekularer Phänotyp

• 1.5 Methoden der Transkriptomanalyse

  • 1.5.1  Klassische Technologien der Genexpressionsanalyse

  • 1.5.2 Neue Verfahren zur Untersuchung der gesamten Expression einer Zellpopulation

  • 1.5.3  Wahl einer geeigneten Methode zur globalen Untersuchung der Genexpression

  • 1.5.4 Serielle Analyse der Genexpression (SAGE)

• 1.6 Verfahrensetablierung und Testgütekriterien

  • 1.6.1  Nebengütekriterien

  • 1.6.2 Hauptgütekriterien

• 1.7 Reliabilität

  • 1.7.1  Reliabilität und ihre verschiedenen Komponenten

  • 1.7.2 Gründe für die Messung der Reliabilität

  • 1.7.3 Die Reliabilität von SAGE in der Literatur

• 1.8 Problemstellung und Hypothese

2 Materialien

• 2.1  Kits

• 2.2 Vektoren und Bakterien

• 2.3 Enzyme

• 2.4 Chemikalien und weitere Stoffe

• 2.5 Puffer, Lösungen und Medien

• 2.6 Nukleotide, Linker und Primer

• 2.7 Geräte und Hilfsmaterial

• 2.8 Computer und Software

3 Methoden

• 3.1  RNase freies Arbeiten

• 3.2 Steriles Arbeiten

• 3.3 Phenol - Choroform - Extraktion

• 3.4 3. 4 Ethanolpräzipitation von Nukleinsäuren

• 3.5 Bestimmung von Nukleinsäurenkonzentrationen

  • 3.5.1  Messung der optischen Dichte

  • 3.5.2 Semiquantitative DNS Mengenbestimmung mit Ethidiumbromid

• 3.6 Gelelektrophorese

  • 3.6.1  Agarosegelelektrophorese

  • 3.6.2 Polyacrcylamidgelelektrophorese

• 3.7 Restriktionsenzymverdau

• 3.8 Begradigen von cDNS

• 3.9 Ligation

• 3.10 Präparation kompetenter Bakterien und Anlegen einer Bakterienstammsuspension

• 3.11 Transformation per Elektroporation

• 3.12 Gesamt-RNS Isolierung aus Gewebe

• 3.13 Boten-RNS - Präparation mittels Message Maker ^™ Kit

• 3.14 cDNS - Herstellung

• 3.15 Polymerasekettenreaktion (PCR)

  • 3.15.1  Allgemeine Prinzipien

  • 3.15.2  PCR - Programme

• 3.16 Fluoreszein - Markierung von DNS - Sonden

  • 3.16.1  Markierung in der PCR

  • 3.16.2 Kontrolle des Fluoreszein-Einbaus

• 3.17 Northern - Blot

  • 3.17.1  Transfer der RNS auf eine Nylonmembran

  • 3.17.2 Hybridisierung und Detektion von Northern-Blots mit dem Gene-Images-System

• 3.18 cDNS Southern - Blot

  • 3.18.1  Transfer von cDNS auf eine Nylonmembran

  • 3.18.2 Hybridisierung und Detektion von cDNS Southern -Blots mit dem Gene-Images-System

• 3.19 Präparative Gelelektrophorese

  • 3.19.1  QIAqick Gel Extraction Kit

  • 3.19.2 Präparation von DNS-Fragmenten nach Polyacrylamidgelelektrophorese

• 3.20 Binden von biotinylierten cDNS-Fragmenten an Dynabeads

• 3.21 Vektorisolation

  • 3.21.1  Reinigen von Plasmid-DNS mit dem Plasmid Mini Purifikation Kit (Qiagen)

  • 3.21.2 Reinigen von Plasmid-DNS mit Qiaprep 96 Turbo Miniprep Kit

• 3.22 Sequenzierung

  • 3.22.1  Sequenzierung mit fluoreszierenden Primern

  • 3.22.2 Sequenzierung mit fluoreszierenden Nukleotiden

• 3.23 Statistische Methoden

4 Etablierung von SAGE

• 4.1  Ergebnisse der Etablierung

  • 4.1.1  Ausgangssituation und Ziel

  • 4.1.2  Zusammenfassende Beschreibung der Methode

  • 4.1.3  Vorbereitende Tests

    • 4.1.3.1 Streptavidin Gelshift – Assay

    • 4.1.3.2  Selbstligation der Linker

  • 4.1.4  SAGE-Durchlauf

    • 4.1.4.1  Isolierung der Gesamt-RNS

    • 4.1.4.2  Präparation der Boten-RNS aus der Gesamt-RNS

    • 4.1.4.3  Northern - Blot

    • 4.1.4.4  cDNS Herstellung mit Oligo(dT)₂₀-Biotin Primern

    • 4.1.4.5  cDNS Southern Blot

    • 4.1.4.6  Restriktionsenzymverdau der biotinylierten cDNS mit dem Verankerungsenzym NlaIII

    • 4.1.4.7  Binden der biotinylierten cDNS-Fragmente an magnetische mit Streptavidin bedeckte Partikel

    • 4.1.4.8  Ligation der Linker an die gebundene cDNS

    • 4.1.4.9  Restriktionsenzymverdau der gebundenen cDNS mit dem Tags produzierendem Enzym BsmFI

    • 4.1.4.10  Begradigung der Tags

    • 4.1.4.11 Ligation der Monotags zu Ditags

    • 4.1.4.12  Amplifikation der Ditags mittels PCR

    • 4.1.4.13 Entfernung der Linker mittels NlaIII Verdau

    • 4.1.4.14  Ligation der Ditags zu Ketten

    • 4.1.4.15 Klonieren der Ditagketten

    • 4.1.4.16 Sequenzieren

    • 4.1.4.17 Auswertung

      • 4.1.4.17.1 Auswertung der Sequenzrohdaten

      • 4.1.4.17.2 Aufbereitung der sequenzierten Tagketten

      • 4.1.4.17.3 Sekundäre Elimination verbliebener Linker

      • 4.1.4.17.4 Sequenzfehlerkorrektur

      • 4.1.4.17.5 Homologierecherche

    • 4.1.4.18 Quantitatives Resultat

• 4.2 Diskussion der Etablierung von SAGE

  • 4.2.1  Methodische Probleme der Durchführung von SAGE

    • 4.2.1.1  Kontamination mit Linkersequenzen

    • 4.2.1.2 Amplifikation der Ditags

    • 4.2.1.3 Verdau der 102bp Fragmente mit NlaIII

    • 4.2.1.4 Behandlung der Ditag-Lösungen

    • 4.2.1.5  Ligation der Ditags zu Polytags

    • 4.2.1.6 Länge der klonierten Inserts

  • 4.2.2  Probleme der Auswertung

    • 4.2.2.1  Replikative Ditags und PCR Bias

    • 4.2.2.2 Elimination der Linkersequenzen

    • 4.2.2.3 Sequenzfehler

    • 4.2.2.4 Homologierecherche

  • 4.2.3 Implikationen für SAGE bei Sonderfällen der Boten-RNS

    • 4.2.3.1  Transkripte ohne Erkennungssequenz für das Verankerungsenzym

    • 4.2.3.2 Besondere Lage der Erkennungssequenz für NlaIII (5')

    • 4.2.3.3  Besondere Lage der Erkennungssequenz für NlaIII (3')

    • 4.2.3.4  Transkripte, deren komplementärer Strang die Enzymerkennungssequenz für BsmFI enthält

  • 4.2.4  Beurteilung des quantitativen Resultats

    • 4.2.4.1  Verteilung der Häufigkeiten

    • 4.2.4.2 Repräsentativität

• 4.3  Fazit der Praxis von SAGE

5  Statistische Evaluation und Reliabilität von SAGE

• 5.1  Ergebnisse

  • 5.1.1  Ausgangsituation und Strategie

  • 5.1.2  Vergleich der Gesamtverteilungen

    • 5.1.2.1  Chi²-Test für k x 2- Felder-Tafeln (Simulationen)

    • 5.1.2.2  Kontingenzkoeffizient

  • 5.1.3 Paarweise Vergleiche

    • 5.1.3.1  Test nach Madden et al. (1997)

    • 5.1.3.2 Test nach Audic und Claverie (1997)

    • 5.1.3.3 Vier-Felder-Chi²-Test

    • 5.1.3.4  Z-Test

  • 5.1.4  Zusammenfassung der Ergebnisse der Simulationen üblicher Experimente

  • 5.1.5  Statistischer Vergleich der angewandten paarweisen Tests

  • 5.1.6  Zusammenfassung der Berechnungen zur Reliabilität von SAGE

  • 5.1.7  Sequenzfehlerkorrektur

• 5.2 Diskussion

  • 5.2.1  Der statistische Entscheidungsprozeß

    • 5.2.1.1  Welche Teststruktur ist entscheidend?

    • 5.2.1.2 α-Fehler-Adjustierung

    • 5.2.1.3  Praktische Bedeutsamkeit

    • 5.2.1.4 Struktur des statistischen Entscheidungsprozesses

  • 5.2.2  Evaluation nicht angewandter Tests

    • 5.2.2.1  Bayes-Test nach Chen et al. (1998)

    • 5.2.2.2 Fishers Exakt Test

    • 5.2.2.3 SAGE 300

  • 5.2.3  Evaluation der angewandten Tests

    • 5.2.3.1  Tests zum Vergleich der Gesamtverteilungen

      • 5.2.3.1.1  Chi²-Test für k x 2- Felder Tafel (Simulationen)

      • 5.2.3.1.2 Kontingenzkoeffizient

    • 5.2.3.2 Tests zum paarweisen Vergleich

      • 5.2.3.2.1  Test nach Madden et al. (1997)

      • 5.2.3.2.2  Test nach Audic und Claverie (1997)

      • 5.2.3.2.3 Vier-Felder-Chi²-Test

      • 5.2.3.2.4 Z-Test

  • 5.2.4  Reliabilität

    • 5.2.4.1  Die Reliabilität von SAGE in der Literatur

    • 5.2.4.2 Formale Grundvoraussetzungen der Reliabilitätsuntersuchung

    • 5.2.4.3 Die statistische Überprüfung der Reliabilität

    • 5.2.4.4  Exkurs: Validierung von SAGE Daten in der Literatur

    • 5.2.4.5 Inhaltliche Bewertung der Reliabilität von SAGE

    • 5.2.4.6  Möglichkeiten zur Behandlung des zufälligen Fehlers

    • 5.2.4.7  Fazit der ermittelten Reliabilität

    • 5.2.4.8  Ausblick

6  Zusammenfassung

Abkürzungsverzeichnis

Literaturverzeichnis

Danksagung

Lebenslauf

Eidestattliche Erklärung

Tabelle 1. Analoge Methoden.

Tabelle 2. Digitale Methoden.

Tabelle 3. Puffer und Lösungen.

Tabelle 4. Nukleotide, Linker und Primer.

Tabelle 5. PCR-Programme.

Tabelle 6. Liste der Linkerartefakte

Tabelle 7. Sekundär eliminierte Linkerartefakte.

Tabelle 8. Resultate der Homologiesuche für die 50 häufigsten Gene.

Tabelle 9. Verteilung der Häufigkeiten in Klassen (in Prozent).

Tabelle 10. Vierfeldertafel zur Überprüfung des CG Gehaltes.

Tabelle 11. Wahrscheinlichkeiten für genau n Fehler.

Tabelle 12. Gründe für uneindeutige oder möglicherweise falsche Resultate der Homologierecherche unter Verwendung der speziell auf SAGE zugeschnittenen Datenbank.

Tabelle 13. Wahrscheinlichkeiten, ein Transkript mindestens einmal zu detektieren.

Tabelle 14. Chi²-Werte der Verteilungen der Tagpaare mit einem Mittelwert von m≥ 5.

Tabelle 15. Chi²-Werte der Verteilungen der Tagpaare mit einem Mittelwert von m ≥ 10.

Tabelle 16. Prototypische Kontingenztafel.

Tabelle 17. Chi²-Werte, Freiheitsgrade und Quantil der Kontingenztafeln.

Tabelle 18. Cramérs V.

Tabelle 19. Ergebnisse des Tests nach Madden et al. (1997).

Tabelle 20. Ergebnisse des Tests nach Audic und Claverie.

Tabelle 21. Vier-Felder-Tafel für den Chi²-Test.

Tabelle 22. Ergebnisse des Vier-Felder-Chi²-Tests.

Tabelle 23. Ergebnisse des modifizierten Z-Testes.

Tabelle 24. Vier-Felder-Tafel zum Testvergleich.

Tabelle 25. Vergleich der Ergebnisse der paarweisen Tests.

Tabelle 26. Vergleich des Tests nach Audic und Claverie mit dem Chi²-Test.

Tabelle 27. Vergleich des modifizierten Z-Testes mit den anderen paarweisen Tests mit "m ≥ 5".

Tabelle 28. Prototypische Vier-Felder -Tafel für den Vergleich der beiden Datensätze (mit beziehungsweise ohne Sequenzfehlerkorrektur) mittels Chi²-Test.

Tabelle 29. P-Werte des Vier-Felder-Chi²-Testes.

Tabelle 30. Werte der korrigierten standardisierten Residuen.

Abb. 1: Das Prinzip von SAGE.

Abb. 2: Unreliable (A) und reliable (B) Messungen.

Abb. 3: Schema eines SAGE Durchlaufes.

Abb. 6: Gesamt-RNS.

Abb. 7: Reamplifikations-PCR Akap149 (B5).

Abb. 8: Northern Blot mit Akap149.

Abb. 9: cDNS Auftrennung.

Abb. 10: cDNS Southern Blot mit Akap149.

Abb. 11: Die Entstehung eines SAGE-Tags.

Abb. 12: Schema eines Ditags.

Abb. 13: K2 Ditag PCR in verschiedenen Verdünnungsstufen.

Abb. 14: K1 Ditag PCR. Vergleich zweier dNTP Konzentrationen.

Abb. 15: Massenextraktion der 102bp Fragmente (K1).

Abb. 16: Verdau der 102bp Fragmente mit NlaIII.

Abb. 17: K1 Konkatemerisierung (5U Li-gase, 1h).

Abb. 18: Zweite K2 Ligation der Ditags zu Ketten

Abb. 19: Plasmidscreening PCR.

Abb. 20: Ausgabe der Analyse eines Konkatemers mit SAGE300.

Abb. 21: Scatterblot von K1 gegen K2.

Abb. 22: Verteilung der SAGE Tags gemäß ihres GC-Gehaltes.

Abb. 23: 3' der 10. Base liegende Sequenzen der 9 reliablen Zuordnungen für "CCTTTAATCC".

Abb. 24: Vergleich der Häufigkeiten und der Anzahl der verschiedenen Tags in den verschiedenen Expressionsklassen.

Abb. 25: Monte-Carlo Simulationen der gesamten Daten mit Korrektur.

Abb. 26: Monte-Carlo Simulationen der gesamten Daten ohne Korrektur.