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In dieser Arbeit wurden vier verschiedene Phänotypen von PC12-Zellkulturen einer Hypoxie ausgesetzt: PC12-Zellen in Suspension (SUS), PC12-Zellen in Suspension, die mit NGF geprimt wurden (SUS-NGF), PC12-Zellen die adhärent auf mit Kollagen beschichteten Plastikoberflächen wuchsen (KOLL-AD) und PC12-Zellen, die adhärent auf mit Kollagen beschichteten Plastikoberflächen wuchsen und mit NGF behandelt wurden (KOLL-AD-NGF).

In Abbildung 5a) ist das morphologische Bild von PC12-Zellen in Suspension dargestellt. Suspensionszellen wachsen in Form von lockeren Aggregaten und haften nicht an der Kavitätenoberfläche. In Abbildung 5b) ist die Morphologie von PC12-Zellen, die adhärent auf einer mit Kollagen beschichteten Oberfläche wachsen, dargestellt. Die Zellen wachsen adhärent als Monolayer und bilden kleine Neurite. In Abbildung 5c) sind PC12-Zellen dargestellt, denen NGF zugesetzt wurde und die auf einer mit Kollagen behandelten Oberfläche wachsen. Sie wachsen als Monolayer und bilden Neuriten aus, die untereinander Kontakt aufnehmen.

Der Versuchsablauf ist in Abbildung 6 dargestellt. Der Tag der Aussaat wurde als Tag 0 definiert. Die Transfektion erfolgte am Tag 2, unmittelbar vor der Hypoxieexposition. Die Dauer der Hypoxie variiert und ist in der jeweiligen Versuchsbeschreibung angegeben. Direkt nach der Hypoxieexposition wurden die Proben entnommen und mit den jeweiligen Methoden analysiert.

	Abbildung 5: PC12-Zellen am Tag 2 nach Aussaat in einer 24-Kavitätenplatte. a) Die Zellen wachsen in lockeren Aggregaten und haften nicht an der Kavitätenoberfläche (200-fache Vergrößerung). b) PC12-Zellen auf Kollagen. Die Zellen wachsen adhärent als Monolayer und fangen an kleine Neuriten zu bilden (400-fache Vergrößerung). c) PC12-Zellen auf Kollagen mit NGF. Die Zellen wachsen adhärent als Monolayer und bilden viele Neurite aus (400-fache Vergrößerung).

	Abbildung 6: Versuchsablauf. Am Tag 0 wurden die Kulturen den jeweiligen Versuchsbedingungen ausgesetzt: SUS, SUS-NGF, KOLL-AD und KOLL-AD-NGF. Zu jedem Versuch wurde parallel eine Kontrollgruppe angesetzt, die sich lediglich durch die fehlende Hypoxieexposition unterschied.

Die Laktat-Dehydrogenase- (LDH) Aktivität im Medium gilt als ein allgemeiner Parameter für die Zellschädigung. Eine Erhöhung der LDH im Medium lässt entweder einen erhöhten Zelltod oder eine Erhöhung der Zellpermeabilität erkennen.

	Abbildung 7: LDH-Aktivität im Medium nach 36 Stunden Hypoxie bei PC12-Zellen in Suspension (SUS), adhärenten Zellen auf Kollagen (KOLL-AD) und adhärenten Zellen mit NGF (KOLL-AD-NGF). Die Daten stellen die Mittelwerte ± SEM dar. n = 4 unabhängige Versuche. Die LDH-Aktivität ist in mU/ml angegeben. * = p<0,01 im Vergleich zu Normoxie. # = p< 0,01 im Vergleich zu KOLL-AD-NGF-Kultur.

In Normoxie besteht kein signifikanter Unterschied zwischen den Kulturen SUS, KOLL-AD und KOLL-AD-NGF (Abbildung 7). Nach einer Hypoxieexposition von 36 Stunden steigt bei allen Zellkulturbedingungen die LDH-Aktivität im Medium an. Die LDH-Aktivität im Medium steigt [Seite 31↓]bei den PC12-Zellen in Suspension (SUS), sowie bei adhärenten PC12-Zellen auf Kollagen (KOLL-AD) von Normoxie zur Hypoxie um ca. das 4-fache an. Bei den adhärenten PC12-Zellen auf Kollagen mit NGF (KOLL-AD-NGF) ist der Anstieg höher. Die LDH-Aktivität im Medium steigt von der Normoxie zur Hypoxie um ca. das 11-fache, ein Indikator dafür, dass adhärente Zellen nach Zugabe von NGF hypoxievulnerabler sind.

Als weitere Methode zur Beurteilung der Zellvitalität benutzen wir das Dehydrogenase-Kit „EZ4U“, um die mitochondriale Dehydrogenase-Aktivität mittels Tetrazolium-Reduktionsverfahren zu bestimmen.

	Abbildung 8: Dehydrogenase-Aktivität („EZ4U“) in Normoxie und nach 36 Stunden Hypoxieexposition bei PC12-Zellen in Suspension (SUS), adhärenten Zellen auf Kollagen (KOLL-AD) und adhärenten Zellen auf Kollagen mit NGF (KOLL-AD-NGF). Die dargestellten Daten sind Mittelwert ± SEM. n=8 unabhängige Versuche. * = p< 0,01 im Vergleich zu Normoxie der jeweiligen Kultur. # = p<0,01 im Vergleich zu Normoxie SUS.

Bei Normoxie erkennt man einen Unterschied zwischen den einzelnen Phänotypen. Die Dehydrogenase-Aktivität steigt im Vergleich zur SUS sowohl bei KOLL-AD, als auch bei KOLL-AD-NGF als Ausdruck eines veränderten Wachstums signifikant an. Ein Differenzierungsanreiz der PC12-Zellen durch Aussaat auf mit Kollagen beschichteten Mikrotiterplatten und die Zugabe von NGF scheint die mitochondriale Dehydrogenase-Aktivität zu aktivieren. Nach Hypoxieexposition erfolgt in der SUS-Kultur ein signifikanter Anstieg der [Seite 32↓]Dehydrogenase-Aktivität im Vergleich zur Normoxie (Abbildung 8). Die Hypoxie wirkt hier aktivierend auf die Dehydrogenase-Aktivität. Adhärente PC12-Zellen, die auf mit Kollagen beschichteten Mikrotiterplatten wuchsen (KOLL-AD), zeigen keine signifikanten Veränderungen der Dehydrogenase-Aktivität durch die Hypoxieexposition. Bei den adhärenten PC12-Zellen mit NGF (KOLL-AD-NGF) erkennt man einen deutlichen Abfall der Dehydrogenase-Aktivität nach der Hypoxieexposition. Die Extinktion sinkt, als Ausdruck der Zellschädigung, um ca. 40 % im Vergleich zur Normoxie.

Um herauszufinden, ob die Hypoxieexposition den nekrotischen oder den apoptotischen Zelltod induziert, färbten wir die PC12-Zellen direkt nach Hypoxieexposition mit Annexin-V und Propidium-Jodid (PI) und analysierten sie im Durchflusszytometer. Drei verschiedene Gruppen von gefärbten Zellen wurden ausgewertet: Annexin-V positive (ANN+), Propidium-Jodid positive (PI+) und sowohl Annexin-V, als auch Propidium-Jodid positive Zellen (ANN+/PI+) (Banasiak et al., 1999).

Im Folgenden ist jeweils ein exemplarischer Versuch als Punktehistogramm dargestellt, anschließend erfolgt die Auswertung aller Versuche in Form eines Balkendiagramms (Mittelwert ± SEM).

In der Normoxie befinden sich die meisten Zellen in einer großen Population als ungefärbte Zellen im unteren linken Quadranten. Wie in der Abbildung 9 dargestellt, kommt es nach einer Hypoxieexposition von 36 Stunden zu keinen Veränderungen. Undifferenzierte PC12-Zellen in Suspension (SUS) weisen eine hohe Resistenz gegenüber einer Hypoxieexposition auf.

Nach einer Hypoxieexposition von 72 Stunden erkennt man im Vergleich zur Normoxie bei den PC12-Zellen in Suspension (SUS) eine ANN+ Population im linken oberen Quadranten und eine ANN+/PI+ Population im rechten oberen Quadranten (Abbildung 10). Die Anzahl von PI+ Zellen ist gering.

	Abbildung 9: Punktehistogramm von PC12-Suspensionszellen. a) in Normoxie und b) nach 36 Stunden Hypoxie. Dargestellt ist ein exemplarischer Versuch mit einer Doppelfärbung mit Annexin-V und PI. FL1-H stellt die grüne Fluoreszenz (ANN) dar und FL2-H die rote Fluoreszenz (PI).

	Abbildung 10: Punktehistogramm von PC12-Suspensionszellen nach 72 Stunden Hypoxie. Dargestellt ist ein exemplarischer Versuch mit einer Doppelfärbung mit Annexin-V und PI. FL1-H stellt die grüne Fluoreszenz (ANN) dar, FL2-H die rote Fluoreszenz (PI).

Wenn man die Versuche in einem Balkendiagramm darstellt (Abbildung 11), erkennt man, dass nach 72 Stunden Hypoxieexposition der prozentuale Anteil der ANN+ Zellen bis auf 30 % ansteigt. Der Anteil von PI+ Zellen bleibt von der Hypoxie unbeeinflusst. Am stärksten ist der Einfluss der Hypoxie auf den Anteil der ANN+/PI+ Zellen: Der prozentuale Anteil der ANN+/PI+ Zellen steigt bis auf 55 % an.

	Abbildung 11: PC12-Zellen in Suspension in Normoxie und nach 72 Stunden Hypoxieexposition. Durchflusszytometrische Analyse mit Doppelfärbung von Propidium-Jodid (PI) und Annexin-V. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte ± SEM in Prozent. n = 3 unabhängige Versuche. * = p< 0,01.

Wie in Abbildung 12 im Punktehistogramm exemplarisch dargestellt, verhalten sich PC12-Zellen in Suspension anders, wenn sie mit NGF geprimt werden. Im Vergleich zur Normoxie a) sind nach einer Hypoxieexposition von 36 Stunden b) im oberen rechten Quadranten ein Anteil von etwa 14 % ANN+/PI+ Zellen, und im oberen linken ein Anteil von etwa 15 % ANN+ Zellen zu messen.

In Abbildung 13 sind alle Versuche als Balkendiagramme dargestellt. Wie man erkennen kann, reagieren PC12-Zellen, die mit 2500 ng/ml NGF geprimt wurden (SUS-NGF), im Vergleich zu PC12-Zellen in Suspension ohne NGF (SUS), wesentlich empfindlicher auf eine Hypoxieexposition von 36 Stunden. Man erkennt, dass nicht nur die Anzahl der ANN+/PI+ Zellen, sondern auch die der ANN+ Zellen deutlich ansteigen. Bei den PI+ Zellen bewirkt die Hypoxie keine Veränderung.

	Abbildung 12: Punktehistogramm von PC12-Suspensionszellen, die mit NGF geprimt wurden (2500 ng/ml). a) In Normoxie und b) nach einer Hypoxieexposition von 36 Stunden. Dargestellt ist ein exemplarischer Versuch mit einer Doppelfärbung mit Annexin-V und PI. FL-III stellt die grüne Fluoreszenz (ANN) dar und FL-I die rote Fluoreszenz (PI). Die Analyse der Zellen erfolgte mit dem Galaxy FlowSystems von DAKO und wurde mit FlowMax-Software ausgewertet.

	Abbildung 13: Geprimte PC12-Zellen mit 2500 ng/ml NGF in Normoxie und nach 36 Stunden Hypoxieexposition. Durchflusszytometrische Analyse bei einer Doppelfärbung mit Propidium-Jodid (PI) und Annexin-V. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte ±SEM in Prozent. n=3 unabhängige Versuche. * = p< 0,01.

Bei den adhärenten PC12-Zellen auf Kollagen (KOLL-AD) zeigt sich ein anderes Bild als in der Suspensionskultur (SUS). In Abbildung 14 sind als Punktehistogramm adhärente PC12-Zellen (KOLL-AD) mit einer Doppelfärbung von Annexin-V und PI dargestellt. In der Normoxie befindet sich eine große Population ungefärbter Zellen im unteren linken Quadranten (a). Nach der Hypoxieexposition ist eine Population von ANN+/PI+ Zellen im oberen rechten Quadranten messbar (b). Im oberen linken Quadranten ist ein Anteil von ANN+ Zellen zu erkennen.

	Abbildung 14: Punktehistogramm von adhärenten PC12-Zellen auf Kollagen (KOLL-AD). a) In Normoxie und b) nach einer Hypoxieexposition von 36 Stunden. Dargestellt ist ein exemplarischer Versuch mit einer Doppelfärbung mit Annexin-V und PI. FL1-H stellt die grüne Fluoreszenz (ANN) dar und FL2-H die rote Fluoreszenz (PI).

Im Balkendiagramm der Abbildung 15 erkennt man deutlich, wie nach 36 Stunden Hypoxie die Anzahl der ANN+ Zellen ansteigt. Bei den PI+ Zellen gibt es keine Veränderung durch die Hypoxie. Bei den ANN+/PI+ Zellen ist der Unterschied am deutlichsten. Der Anteil der ANN+/PI+ Zellen steigt bis auf 60 % an.

	Abbildung 15: Adhärente PC12-Zellen auf Kollagen (KOLL-AD) in Normoxie und nach 36 Stunden Hypoxieexposition. Durchflusszytometrische Analyse mit Doppelfärbung von Propidium-Jodid und Annexin-V. Die dargestellten Werte sind Mittelwerte ± SEM in Prozent. n=3 unabhängige Versuche. * = p< 0,01.

Bei adhärenten PC12-Zellen auf Kollagen mit NGF (KOLL-AD-NGF), zeigt sich ein ähnliches Bild wie bei adhärenten PC12-Zellen auf Kollagen ohne NGF (KOLL-AD). In der Abbildung 16a, als Punktehistogramm dargestellt, erkennt man die Verteilung der gefärbten Zellen. In der Normoxie befindet sich ein großer Anteil ungefärbter Zellen im unteren linken Quadranten. Nach der Hypoxieexposition von 36 Stunden (Abbildung 16b) ist ein hoher Anteil von ANN+/PI+ Zellen im oberen rechten Quadranten und ein geringer Anteil von ANN+ Zellen im oberen linken Quadranten messbar. Bereits nach 36 Stunden ist ein deutlicher Zelltod zu erkennen.

Die Darstellung des Mittelwertes ± SEM der Versuche der adhärenten PC12-Zellen mit NGF (KOLL-AD-NGF) bestätigt das Ergebnis des exemplarisch dargestellten Punktehistogramms (Abbildung 17). Nach Hypoxie steigt die Anzahl von ANN+ Zellen auf ca. 27% und von ANN+/PI+ Zellen auf ca. 45% an. Bei den PI+ Zellen zeigt die Hypoxie keine Veränderung.

	Abbildung 16: Punktehistogramm von adhärenten PC12-Zellen auf Kollagen mit NGF (2500 ng/ml) (KOLL-AD-NGF). a) In Normoxie und b) nach einer Hyoxieexposition von 36 Stunden. Dargestellt ist ein exemplarischer Versuch mit einer Doppelfärbung mit Annexin-V und PI. FL1-H stellt die grüne Fluoreszenz (ANN) dar, FL2-H die rote Fluoreszenz (PI).

	Abbildung 17: Adhärente PC12-Zellen auf Kollagen mit NGF in Normoxie und nach 36 Stunden Hypoxieexposition. Durchflusszytometrische Analyse bei einer Doppelfärbung mit Propidium-Jodid und Annexin-V. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM in Prozent. n = 3 unabhängige Versuche. * = p< 0,01

Wie im Abschnitt Zelltod gezeigt, reagieren die verschiedenen Phänotypen der PC12-Zellen unterschiedlich auf eine Hypoxieexposition. Der Vergleich der Häufigkeit des Zelltodes zur HIF-1-Aktivität der Phänotypen kann Aufschluss über die Beziehungen zwischen HIF-1-Aktivität und dem Zelltod liefern. Zur Bestimmung der HIF-1-Aktivität benutzten wir die Reporterplasmide pGL3 und pHBE (Kietzmann et al., 2001). Vorversuche ergaben, dass eine Transfektion mit Kalzium-Phosphat-Kopräzipitation nicht möglich war. Wir entschieden uns daher für das Transfektionsreagenz Transfast (Promega, Mannheim).

Für die Beurteilung der Messergebnisse von verschiedenen Zell-Phänotypen ist es wichtig, die Transfektionseffizienz zu untersuchen. Hierzu haben wir die Transfektion mit pGFP und die Zählung der fluoreszierenden Zellen gewählt.

Das Plasmid pGFP eignet sich zur Messung der Transfektionseffizienz, da die transfizierten Zellen sich fluoreszenzmikroskopisch nachweisen lassen. Hierzu wurden PC12-Zellen am Tag 0 ausgesät und am Tag 2 mit pGFP transfiziert. Am Tag 3 ließen sich noch keine Unterschiede erkennen (Abbildung 18). Ab Tag 4 zeigte sich allerdings eine unterschiedlich hohe Prozentzahl der mit pGFP transfizierten PC12-Zellen in Suspension (SUS), adhärent auf Kollagen (KOLL-AD) und adhärent auf Kollagen mit NGF (KOLL-AD-NGF) wachsenden Zellen. Um die Gesamtheit der transfizierten Zellen zu erfassen, wählten wir die Darstellung in Form einer kumulativen Verteilung über 10 Tage (Abbildung 18b). Der größte Anteil der pGFP transfizierten Zellen ließ sich in der Suspensionskultur (SUS) nachweisen. Nach 10 Tagen kontinuierlichen Anstiegs der mit pGFP transfizierten PC12-Zellen sind über 13 Prozent der Zellen transfiziert. Bei den adhärenten PC12-Zellen auf Kollagen (KOLL-AD) sind nach 10 Tagen ca. 7 Prozent transfiziert. Bei den adhärenten PC12-Zellen auf Kollagen mit NGF (KOLL-AD-NGF) sind nach 10 Tagen ca. 5 Prozent transfiziert.

Die große Streuung der prozentualen Darstellung (Abb.18a) lässt sich wahrscheinlich durch die Vielzahl der beteiligten Prozesse erklären. Die Transfektion mit pGFP beinhaltet die Aufnahme der DNA in die Zelle, den Transport über die Zellmembran, die Synthese der Luciferase, die Absterbe- und Proliferationsrate der Zellen. In der kumulativen Darstellung wird die Kinetik der Einzelprozesse nicht erfasst, daraus resultiert eine geringere Streuung als in der prozentualen Darstellung.

Durch die Transfektion mit Transfast werden ungefähr 5-10 % der Zellen transfiziert. Man erkennt an der Abbildung 18b), dass die Transfektionseffizienz der adhärenten PC12-Zellen auf Kollagen mit NGF (KOLL-AD-NGF) deutlich geringer ist als die der Suspensionskultur (SUS) und die der adhärenten PC12-Zellen ohne NGF (KOLL-AD). Das ausgewählte Transfektionsverfahren ist aber ausreichend, um eine Aussage zur Expression eines Plasmides zu treffen. Aus den Messungen der Transfektionseffizienz ergibt sich, dass der Bezug auf den Kontrollvektor pGL3, zum Vergleich der unterschiedlichen Phänotypen, unerlässlich ist.

Für eine zuverlässige Messung der luminometrischen Aktivität bei einer Transfektion mittels Reportergenen ist eine Optimierung der Messbedingungen notwendig. Ziel der Optimierung ist es, jene Reaktionsbedingungen zu finden, die eine reproduzierbare und richtige Messung der Expression erlauben.

	Abbildung 19: Abhängigkeit der luminometrischen Aktivität vom Plasmidgehalt. Dargestellt sind die RLE-Absolutwerte der einzelnen Vektoren in Kontrolle und nach 24 Stunden Hypoxieexposition. Die verwendeten Plasmidmengen sind: 0,1 µg, 0,5 µg, 1,5 µg und 3 µg Plasmid/Kavität, RLE = Relative luminometrische Einheit.

Zunächst untersuchten wir die Abhängigkeit der luminometrischen Aktivität der Vektoren pGL3 und pHBE vom Plasmidgehalt/Kavität in Normoxie und Hypoxie (Abbildung 19). In Normoxie steigt mit zunehmender Plasmidmenge die luminometrische Aktivität der Vektoren pGL3 und pHBE bis 1,5 µg Plasmid/Kavität an und geht dann in ein Plateau über. Es gibt keine Unterschiede in der luminometrischen Aktivität zwischen pGL3 und pHBE in der Normoxie.

In der Hypoxie ist die Expression der Vektoren pGL3 und pHBE unterschiedlich. Die Aktivität des Vektors pHBE steigt ebenfalls bis zu einer Plasmidmenge von 1,5 µg/Kavität an, erreicht aber höhere Absolutwerte (265 RLE) in der luminometrischen Aktivität. Oberhalb einer Konzentration von 1,5 µg Plasmid/Kavität sinkt die Aktivität bis auf 150 RLE. Der Vektor pGL3 steigt bis 1,5 µg Plasmid/Kavität an und geht in ein Plateau über. In diesen Versuchen waren die Absolutwerte von pGL3 in Hypoxie geringer als pGL3 in Normoxie. Der höchste erreichte Wert liegt bei ca. 40 RLE. Hypoxie scheint einen Einfluss auf die Expression von pGL3 zu haben.

	Abbildung 20: Abhängigkeit der HIF-1 Aktivität vom Plasmidgehalt. Dargestellt ist der Quotient pHBE/pGL3 in Normoxie und nach 24 Stunden Hypoxieexposition. Die verwendeten Plasmidmengen sind: 0,1 µg, 0,5 µg, 1,5 µg und 3 µg Plasmid/Kavität.

In der Abbildung 20 ist die für die jeweilige Versuchsbedingung errechnete HIF-1-Aktivität, abhängig von der Plasmidkonzentration, dargestellt. Die höchste HIF-1-Aktivität liegt bei 0,5 µg Plasmid/Kavität und nimmt in Hypoxie mit steigendem Plasmidgehalt/Kavität ab. Bei 0,1 µg Plasmid/Kavität ist eine kaum messbare HIF-1-Aktivität in Normoxie und Hypoxie zu erkennen.

Aus dem Vergleich von Abbildung 19 und Abbildung 20 erkennt man, dass der Absolutwert der luminometrischen Aktivität der Vektoren bei 0,5 µg Plasmid/Kavität sehr gering ist und mit höherem Plasmidgehalt steigt. Um eine ausreichend hohe luminometrische Aktivität und keine großen Schwankungen aufgrund von Abweichungen kleiner Plasmidmengen zu erhalten, entschieden wir uns für 2 µg Plasmid/Kavität für die weiteren Versuche.

	Abbildung 21: Abhängigkeit der luminometrischen Aktivität von der Lipidkonzentration. Dargestellt sind die Absolutwerte der einzelnen Vektoren in Kontrolle und nach 24 Stunden Hypoxieexposition. Die verwendeten Lipidmengen sind: 4 µl Lipid/Kavität, 6 µl Lipid/Kavität und 12 µl Lipid/Kavität.

Weiter untersuchten wir die Abhängigkeit der luminometrischen Aktivität von der Lipidkonzentration. In der Abbildung 21 ist die luminometrische Aktivität der Vektoren pGL3 und pHBE in Normoxie und Hypoxie in Abhängigkeit zum Lipidgehalt/Kavität dargestellt. Die Vektoren pGL3 und pHBE verhalten sich in Normoxie gleich und steigen mit zunehmendem Lipidgehalt von ca. 200 RLE bei 4 µl Lipid/Kavität bis ca. 380 RLE bei 12 µl Lipid/Kavität an. In der Hypoxie ist die Expression der Vektoren unterschiedlich: Der Vektor pGL3 in Hypoxie ist von der Lipidkonzentration unbeeinflusst und liegt bei 100 RLE. Der Vektor pHBE ist in der luminometrischen Aktivität höher und steigt bis fast 700 RLE an.

Die HIF-1-Aktivität (Abbildung 22) zeigt ein ähnliches Bild wie die absoluten Werte der RLE der Vektoren in Abbildung 21. In Normoxie beeinflusst der steigende Lipidgehalt die HIF-1-[Seite 44↓]Aktivität nur gering. Sie steigt mit zunehmendem Lipidgehalt leicht an. Nach Hypoxieexposition erkennt man deutliche Unterschiede: Die höchste HIF-1-Aktivität wird bei 12 µl Lipid/Kavität mit 6,1 erreicht. Bei 4 und 6 µl Lipid/Kavität liegt sie bei ca. 4.

Da die Lipide relativ teuer sind und mit einem geringeren Lipidgehalt eine ausreichende RLE-Aktivität bei geringen Schwankungen gemessen werden kann, entschieden wir uns, die weiteren Versuche mit 6 µl Lipid/Kavität durchzuführen.

	Abbildung 22: Abhängigkeit der HIF-1-Aktivität von dem Lipidgehalt. Dargestellt ist der Quotient pHBE/pGL3 in Normoxie und nach Hypoxieexposition. Die verwendeten Lipidmengen sind: 4 µl Lipid/Kavität, 6 µl Lipid/Kavität und 12 µl Lipid/Kavität.

Als weitere Optimierungsuntersuchung analysierten wir die Abhängigkeit der luminometrischen Aktivität von der Zellzahl/Kavität. In der Abbildung 23 ist die luminometrische Aktivität der Vektoren pGL3 und pHBE in Normoxie und nach 24 Stunden Hypoxieexposition bei unterschiedlicher Zellzahl/Kavität dargestellt. Die Vektoren pGL3 und pHBE verhalten sich in Normoxie ähnlich und lassen keinen Unterschied mit zunehmender Zellzahl/Kavität erkennen.

In der Hypoxie verhalten sich die Vektoren unterschiedlich: Der pGL3 Vektor in Hypoxie sinkt mit zunehmender Zellzahl/Kavität ab. Der Vektor pHBE ist in der luminometrischen Aktivität höher und steigt mit steigender Zellzahl/Kavität leicht an.

	Abbildung 23: Luminometrische Aktivität bei unterschiedlicher Zellzahl/Kavität. Dargestellt sind die Absolutwerte der einzelnen Vektoren in Kontrolle und Hypoxie. Gewählt wurde folgende Zellzahl/Kavität: 50000 Zellen, 100000 Zellen, 200000 Zellen und 600000 Zellen. Leerwert = 0,1 RLE.

	Abbildung 24: HIF-1-Aktivität bei unterschiedlicher Zellzahl/Kavität. Dargestellt ist der Quotient pHBE/pGL3 in Normoxie und nach 24 Stunden Hypoxieexposition. Gewählt wurden folgende Zellzahl/Kavität: 50000 Zellen, 100000 Zellen, 200000 Zellen und 600000 Zellen.

In der Normoxie scheint sich die HIF-1-Aktivität mit steigender Zellzahl leicht zu vermindern (Abbildung 24). Bei 50000 Zellen/Kavität liegt sie bei 1, bei 600000 Zellen/Kavität bei 0,5. Nach Hypoxieexposition steigt die HIF-1-Aktivität mit zunehmender Zellzahl/Kavität an. Bei 50000 Zellen/Kavität findet durch die Hypoxie eine Aktivierung um den Faktor 2 statt. Bei 100000 Zellen/Kavität liegt die HIF-1-Aktivität bei 3, bei 200000 Zellen/Kavität bei 4 und bei 600000 Zellen/Kavität liegt sie bei 18.

An den RLE-Absolutwerte in Abbildung 23 wird deutlich, dass diese große Aktivierung sowohl durch eine Verminderung des pGL3-Vektors in der Hypoxie als auch durch eine Erhöhung des pHBE-Vektors mit zunehmender Zellzahl erklärbar ist. Um eine ausreichend hohe luminometrische Aktivität zu messen, aber nicht in den Bereich der Glukosedeprivation nach der Hypoxieexposition zu kommen, entschieden wir uns für 300000 Zellen/Kavität.

Wie die vorangegangenen Versuche zeigen, werden sowohl die errechnete HIF-1-Aktivität, als auch die absolute luminometrische Aktivität durch die unterschiedlichen Bedingungen beeinflusst. Daher kommt der Einhaltung konstanter Messbedingungen große Bedeutung zu. Alle nachfolgenden Untersuchungen wurden unter standardisierten Bedingungen durchgeführt: 2 µg Plasmid/Kavität, 6 µl Lipid/Kavität, 300000 Zellen/Kavität.

Aus den vorherigen Versuchen wurde deutlich, dass die Expression des Kontrollvektors durch Hypoxie beeinflusst wird (Abbildung 19). Um eine mögliche Beeinflussung der Expression des pGL3-Vektors durch NGF zu untersuchen, prüften wir den Einfluss steigender NGF-Dosen auf die RLE-Aktivität in Normoxie und Hypoxie (Tabelle 1).

In Normoxie steigt mit steigender Konzentration des NGF die Expression des pGL3-Vektors. Unter hypoxischen Bedingungen beobachtet man den gegenteiligen Effekt: Mit steigender Konzentration des NGF verringert sich die Expression des pGL3-Vektors.

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Tabelle 1: Einfluss von NGF auf die Expression des Kontrollvektor pGL3 in geprimten PC12-Zellen

Dargestellt in % von der Kontrolle und als Mittelwert ± SEM. n = 3 unabhängige Versuche. * = p<0,05 gegenüber der Kontrolle (Scheffé-Test). Die PC12-Zellen wurden am Tag 0 mit NGF geprimt und am Tag 2 transfiziert.

	Abbildung 25: Luminometrische Aktivität des pGL3-Vektors bei PC12-Zellen in Suspension (SUS) und bei adhärenten PC12-Zellen mit NGF (KOLL-AD-NGF) in Normoxie. Dargestellt ist die Anzahl der Versuche, die jeweils in einen definierten RLE-Bereich fallen (0-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300 und 300-350). Die Zellen wurden am Tag 0 ausgesät und am Tag 2 transfiziert. Die KOLL-AD-NGF-Kultur wurde mit 500 mg/ml NGF ausgesät.

Wie in Abbildung 25 gezeigt, liegen bei den meisten Transfektionen die gemessenen RLE-Werte der PC12-Zellen in Suspension (SUS) zwischen 0 und 50 RLE (n=11). Wenige Transfektionen erreichen hohe RLE-Werte. Lediglich zwei Versuche liegen zwischen 300 und 350 RLE.

Bei den adhärenten PC12-Zellen, auf Kollagen gewachsen und mit NGF behandelt, sind die Schwankungen sehr groß. Drei Transfektionen liegen im Bereich von 0 bis 50 RLE, vier Transfektionen zeigen RLE-Werte im Bereich zwischen 150 und 200 und weitere zwei liegen im Bereich zwischen 250 und 300 RLE.

Mit dem Kolmogoroff-Smirnoff-Zwei-Proben-Test zeigt sich, dass die Phänotypen einer unterschiedlichen Verteilung folgen. Mit dem Mann-Withney-Test ergibt sich ein signifikanter Unterschied von p<0,01 zwischen der Suspensionskultur (SUS) und den adhärenten PC12-Zellen auf Kollagen mit NGF (KOLL-AD-NGF). NGF erhöht folglich die Expression des pGL3-Vektors auch in adhärenten PC12-Zellen mit NGF (KOLL-AD-NGF) unter normoxischen Bedingungen.

Wie an Abbildung 26 erkennbar, vermindert die Hypoxie die Expression des Kontrollvektors pGL3 im Vergleich zur Normoxie in der KOLL-AD-NGF-Kultur. Die Expression in Hypoxie ist geringer als die Expression der Suspension Kultur (SUS).

	Abbildung 26: Luminometrische Aktivität des pGL3-Vektors bei PC12-Zellen in Suspension und bei adhärenten PC12-Zellen nach 24 Stunden Hypoxieexposition. Dargestellt ist die Anzahl der Versuche, die jeweils in einen definierten RLE-Bereich fallen (0-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300 und 300-350). Die Zellen wurden am Tag 0 ausgesät und am Tag 2 transfiziert. Die KOLL-AD-NGF-Kultur wurde mit 500 mg/ml NGF ausgesät.

Die Versuche zeigen, dass Hypoxie- und NGF- induzierte Veränderungen immer das Resultat einer veränderten Expression sowohl des Kontrollvektors, als auch des Hypoxie-empfindlichen Vektors sind.

Als erstes untersuchten wir die HIF-1-Aktivität der verschiedenen PC12-Phänotypen (Abbildung 28) und transfizierten die Zellen am Tag 2, unmittelbar vor der Hypoxieexposition. Der Versuchsablauf ist in Abbildung 27 dargestellt.

	Abbildung 27: Versuchsablauf der PC12-Kulturen SUS, KOLL-AD und KOLL-AD-NGF. Zu einer Kultur unter hypoxischen Bedingungen wurde parallel eine Kontrollgruppe in Normoxie angesetzt.

	Abbildung 28: HIF-1-Aktivität in den drei Zellkulturen Suspension (SUS), adhärente Zellen auf Kollagen (KOLL-AD) und adhärente Zellen auf Kollagen mit NGF (KOLL-AD-NGF). * = p<0,01 im Unterschied zur Normoxie. n=15 unabhängige Versuche in Suspension (SUS) und n=5 bei adhärenten Zellen (KOLL-AD) und adhärenten Zellen mit NGF (KOLL-AD-NGF). Hypoxiedauer = 24 Stunden. NGF-Konzentration = 500 ng/ml.

Die HIF-1-Aktivität in verschiedenen Phänotypen von PC12-Zellen (SUS, AD-KOLL, AD-KOLL-NGF) ist in Abbildung 28 dargestellt. Es ergeben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Phänotypen in der Normoxie. Bei allen drei Phänotypen führt eine [Seite 50↓]Hypoxie zu einem Anstieg der HIF-1-Aktivität. Auch in der Hypoxie ergeben sich zwischen den Phänotypen keine statistisch signifikanten Unterschiede. Es scheint sich anzudeuten, dass die PC12-Zellen auf Kollagen mit NGF (KOLL-AD-NGF) eine geringere HIF-1-Aktivität im Vergleich zu der adhärenten PC12-Zellkultur auf Kollagen ohne NGF haben.

	Abbildung 29: HRE abhängige Luciferase-Aktivität (pHBE-pGL3/pGL3). Dargestellt sind PC12-Zellen in Normoxie und nach 24 Stunden Hypoxieexposition in SUS, KOLL-AD, KOLL-AD-NGF. Ausgewertet wurden die Versuche der Abbildung 28. * = p<0,01 und ** = p<0,001 im Vergleich zur Normoxie.

Um den Einfluss von NGF auf die Hypoxie-induzierte Expression weiter zu analysieren, berechneten wie die Differenz der RLE-Aktivität von pHBE und pGL3 und bezogen diese auf den pGL3-Vektor (Abbildung 29). Die Differenz reflektiert die absolute RLE-Aktivität, die auf das Vorliegen der HRE-Sequenz im pHBE-Vektor zurückzuführen ist. Normiert man die RLE-Aktivität auf den pGL3-Vektor in Normoxie, fällt auf, dass die RLE-Aktivität der KOLL-AD-NGF Zellen in Hypoxie dramatisch abfällt. Die Wechselwirkung von NGF und Hypoxie führt zu einer generell verminderten Expression, sowohl vom pGL3-Vektor, als auch vom pHBE-Vektor. Der dramatische Abfall der RLE abhängigen Luciferase-Aktivität ist Ausdruck einer Verminderung der RLE-Aktivität des pGL3- und des pHBE-Vektors in Hypoxie, wobei die des pHBE-Vektors deutlich stärker abfällt.

Um den Einfluss von NGF unabhängig von dem adhärenten Wachstum der Zellen auf Kollagen zu untersuchen, primten wir PC12-Zellen in Suspension mit NGF-Konzentrationen von 100 ng/ml, 500 ng/ml und 2000 ng/ml (SUS-NGF) und untersuchten die HIF-1-Aktivität in Normoxie und nach einer Hypoxieexposition von 24 Stunden.

Die HIF-1-Aktivität wurde nach folgendem Versuchsschema gemessen:

	Abbildung 30: Versuchsablauf der PC12-Zellen geprimt mit unterschiedlichen Konzentrationen von NGF. Zu jedem Versuch wurde parallel noch eine Kontrollgruppe angesetzt, die sich lediglich durch die fehlende Hypoxieexposition unterschied.

In der Normoxie verändert die NGF-Konzentration die HIF-1-Aktivität nicht signifikant. Sie liegt bei ca. 2. Nach einer Hypoxieexposition findet in allen Kulturen eine HIF-1 Aktivierung statt. Mit steigender NGF-Konzentration nimmt aber die HIF-1 Aktivierung deutlich ab. Signifikant unterschiedlich zur unbehandelten Suspensionkultur (SUS) zeigten sich die Kulturen mit 500 ng/ml und 2000 ng/ml NGF. Die dosis-abhängigen Veränderungen der HIF-1-Aktivität sind in der Abbildung 31 dargestellt.

	Abbildung 31: Mit NGF geprimte PC12-Zellen in Suspension in Normoxie und nach 24 Stunden Hypoxie. Verwendete NGF-Konzentrationen sind 0 ng/ml , 100 ng/ml , 500 ng/ml und 2000 ng/ml NGF. n=6 unabhängige Versuche, dargestellt mit dem Mittelwert ± SEM. # = p < 0,01 im Vergleich zu 0 ng/ml NGF. * = p < 0,01 im Vergleich zur Normoxie.

Um eventuelle Unterschiede in der zeitlichen Expression des Reportergens in den verschiedenen Phänotypen auszuschließen, transfizierten wir PC12-Zellen im Pool am Tag 0 und säten sie anschließend auf Kollagen und auf Kollagen mit NGF aus. Die Zellen differenzierten sich 2 Tage und wurden dann der Hypoxie ausgesetzt. Nach einer Hypoxie von 24 Stunden wurde die HIF-1-Aktivität gemessen.

Die HIF-1-Aktivität wurde nach folgendem Versuchschema gemessen:

	Abbildung 32: Versuchsablauf der Transfektion von PC12-Zellen im Pool und anschließender Aussaat auf Kollagen (KOLL-AD) und auf Kollagen mit NGF (KOLL-AD-NGF). Zu jedem Versuch wurde parallel noch eine Kontrollgruppe angesetzt, die sich lediglich durch die fehlende Hypoxieexposition unterschied.

In Normoxie zeigen sich keine Unterschiede in der HIF-1-Aktivität. Die Hypoxie erhöht in beiden Kulturen die HIF-1-Aktivität. Allerdings erkennt man in den verschiedenen Phänotypen eine unterschiedliche HIF-1-Aktivität nach Hypoxieexposition: Die adhärenten PC12-Zellen auf Kollagen mit NGF behandelt, zeigen eine signifikante Verminderung der HIF-1-Aktivität im Vergleich zu den auf Kollagen gewachsenen adhärenten PC12-Zellen ohne NGF. In der Abbildung 33 ist die HIF-1-Aktivität der im Pool transfizierten PC12-Zellen dargestellt.

	Abbildung 33: Adhärente PC12-Zellen auf Kollagen (KOLL-AD) und auf Kollagen mit NGF (KOLL-AD-NGF), im Pool transfiziert. Dargestellt ist die HIF-1-Aktivität in Normoxie und nach 24 Stunden Hypoxieexposition. n = 3 unabhängige Versuche. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM. * = p<0,01 im Unterschied zur Normoxie. # = p< 0,001 im Vergleich zu KOLL-AD.

Um die Beziehung zwischen Zelltod und HIF-1-Aktivität weiter zu charakterisieren, wählten wir ein alternatives Modell: Die in der Arbeitsgruppe Prof. Gross generierten Zellklone, die mit Antisense HIF-1 alpha permanent transfiziert wurden. Durch die Analyse der Antisense-Zelllinie mit einer verminderten HIF-1-Aktivität nach Hypoxieexposition, erhofften wir uns Informationen über den spezifischen Einfluss von HIF-1 auf den Zelltod. Es standen drei Zelllinien zur Verfügung: Ein mit pCMV transfizierter stabiler Klon (CMV) als Kontrolle und zwei mit Antisense HIF-1 alpha transfizierte Klone (19P und 19T).

	Abbildung 34: Expression von pGFP der Zelllinien CMV, 19P und 19T. Dargestellt ist der prozentuale Anteil der mit pGFP transfizierten Zellen im Vergleich zum Wildtyp (= 100%). 19P und 19T als transgene PC12-Zelllinien mit Antisense-Konstrukt und die Zelllinie CMV als transgene Zelllinie ohne Antisense-Konstrukt. n = 4, Mittelwert ± SEM.

Wir verglichen zwei Antisense-Zelllinien und eine Kontrollzelllinie (Abbildung 34). Die Transfektionseffizienz wurde mittels pGFP untersucht und im Vergleich zum Wildtyp (100%) dargestellt. Die Transfektionseffizienz entspricht der Anzahl der mit pGFP transfizierten Zellen. Die transgene Antisense-Zelllinie 19P zeigt eine Transfektionseffizienz von ca. 85 % im Vergleich zum Wildtyp. Die transgene Zelllinie 19T ließ sich kaum transfizieren. Nur ca. 25 % der Zellen wurden im Vergleich zum Wildtyp transfiziert. Die transgene CMV Kontrollzelllinie zeigt eine ähnliche Transfektionseffizienz wie die 19P Zelllinie: Ca. 70 % der Zellen wurden transfiziert. Aufgrund der vergleichbaren Transfektionseffizienz entschieden wir uns, für die weiteren Versuche, den stabil mit Antisense HIF-1 alpha transfizierten Zellklon 19P zu verwenden. Leclere zeigte, dass dieser Zellklon eine deutlich verminderte HIF-1-Aktivität aufwies (Leclere, 2000).

Die aufgetaute Antisense-Zelllinie erwies sich als sehr variabel in der berechneten HIF-1-Aktivität. In Normoxie war die HIF-1-Aktivität der Antisense-Zelllinie lediglich in einigen [Seite 55↓]Versuchen geringer als in der CMV- und WT-Zelllinie. Abb. 35 zeigt die mit diesem Zellklon durchgeführten Versuche, wobei als Kontrolle die Wildtyp-Zelllinie immer mitbestimmt wurde.

	Abbildung 35: HIF-1-Aktivität von verschiedenen Passagen der 19P Antisense-Zelllinie nach 24 Stunden Hypoxieexpoxition. Dargestellt sind 10 verschiedene Versuche, der Größe nach sortiert.

Die Varianz der HIF-1-Aktivität nach Hypoxieexposition ist groß. In einigen Versuchen ist die HIF-1-Aktivität der Antisense-Zelllinie 19P im Vergleich zur CMV-Kontrollzelllinie vermindert (Versuche 3, 4, 5 und 10). In anderen Versuchen ist die HIF-1-Aktivität der Antisense-Zelllinie 19P höher als die der Kontrollzelllinie CMV (Versuch 1, 2, 6, 7, 8 und 9).

	Abbildung 36: Die HIF-1-Aktivität (pHBE/pGL3) in den Zelllinien WT, CMV und 19P in Normoxie und nach 24 Stunden Hypoxieexposition. Dargestellt ist der Mittelwert von n=10 mit SEM. * = p < 0,01 im Vergleich zur Normoxie.

Die Mittelwerte der durchgeführten Versuche ergaben keine Verminderung der HIF-1-Aktivität in der Antisense-Zelllinie 19P nach einer Hypoxieexposition (Abbildung 36). Signifikante Unterschiede ergeben sich lediglich im Vergleich zur Normoxie.

Die HIF-1-Aktivität der PC12-Zellen auf Kollagen gleicht denen der PC12-Zellen in Suspension. Es gibt keine signifikante Verminderung der HIF-1-Aktivität der Antisense-Zelllinie im Vergleich zur Kontrollzelllinie CMV (Tabelle 2). Signifikante Unterschiede ergeben sich lediglich im Vergleich zur Normoxie.

Tabelle 2: HIF-1-Aktivität (pHBE/pGL3) in KOLL-AD-Kulturen in den Zelllinien WT, CMV und 19P in Normoxie und nach 24 Stunden Hypoxieexposition

Dargestellt ist der Mittelwert ± SEM von n=10. * = p < 0,01 im Vergleich zur Normoxie.

Auch die HIF-1-Aktivität der PC12-Zellen auf Kollagen mit NGF gleicht denen der PC12-Zellen in Suspension. Es gibt keine signifikante Verminderung der HIF-1-Aktivität der Antisense-Zelllinie im Vergleich zur Kontrollzelllinie CMV (Tabelle 3).

Tabelle 3: HIF-1-Aktivität (pHBE/pGL3) in KOLL-AD-NGF-Kulturen in den Zelllinien WT, CMV und 19P in Normoxie und nach 24 Stunden Hypoxieexposition

Dargestellt ist der Mittelwert von n=10 ± SEM. * = p < 0,01 im Vergleich zur Normoxie.

Unter der Annahme, dass auch die Antisense-Zelllinie 19P heterogen ist und Zellen mit unterschiedlicher HIF-1-Aktivität enthält, wurden die Zellen in 96-Well-Platten vereinzelt, vermehrt und anschließend die HIF-1-Aktivität in den Antisense-Subklonen gemessen.

	Abbildung 37: HIF-1-Aktivität (pHBE/pGL3) in den Zelllinien WT, CMV und dem Einzelzellklon
	19P/5 in Normoxie und nach 24 Stunden Hypoxieexposition.

Abbildung 37 zeigt die HIF-1-Aktivität eines dieser Subklone (19 P/5). Ca. 30 % ist die HIF-1-Aktivität gegenüber der CMV und der WT-Zelllinie vermindert.

PC12-Zellen aus der gleichen Kultur des Antisense-Einzelzellklons, bei denen die verminderte HIF-1-Aktivität in Abbildung 37 mittels Reportergenen dargestellt ist, wurden in einem Durchflusszytometer mit Doppelfärbung durch Annexin-V und Propidium-Jodid gemessen.

Die Analyse der Durchflusszytometrie in Abbildung 38 im Punktehistogramm dargestellt, zeigt die Verteilung der Annexin-V und Propidium-Jodid Färbung der CMV-Zelllinie. Es ist zu erkennen, dass in Normoxie a) die Population ungefärbter Zellen 83,1 % beträgt. PI+ sind 3,7 % der Zellen. Lediglich 1 % der Zellen sind ANN+ .

	Abbildung 38: Punktehistogramm von PC12-Zellen der Kontrollzelllinie CMV in Suspension. a) Normoxie und b) nach einer Hypoxieexposition von 72 Stunden. Dargestellt ist ein exemplarischer Versuch mit einer Doppelfärbung mit Annexin-V und PI. FL1 stellt die grüne Fluoreszenz (ANN) dar und FL2 die rote Fluoreszenz (PI).

Eine Hypoxieexposition von 36 Stunden bewirkt keine messbare Zellschädigung (nicht dargestellt). Nach 72 Stunden Hypoxieexposition (b) erkennt man einen deutlichen Einfluss der Hypoxie: 9,4 % der Zellen sind ungefärbt, ANN+ sind 32 % der Zellen und ANN+/PI+ sind

53,8 % der Zellen. Nur 4,8 % der Zellen sind PI+.

	Abbildung 39: Punktehistogramm von PC12-Zellen des Antisense-Subklons 19P/5 in Suspension in Normoxie a) und nach einer Hypoxieexposition von 72 Stunden b). Dargestellt ist ein exemplarischer Versuch mit einer Doppelfärbung mit Annexin-V und PI. FL1 stellt die grüne Fluoreszenz (ANN) dar und FL2 die rote Fluoreszenz (PI).

Die Durchflusszytometrie (Abbildung 39) zeigt die Hypoxie-induzierte Reaktion des Antisense-Subklons 19P/5. Man erkennt, dass in der Normoxie (a) eine große Population ungefärbter Zellen vorhanden ist. Der Anteil der ungefärbten Zellen macht 87,7 % aus. 3,8 % der Zellen sind PI+ und im rechten unteren Quadranten zu erkennen. 7,4 % der Zellen sind ANN+.

Nach der Hypoxieexposition von 72 Stunden (b) wird eine deutliche Veränderung sichtbar:

14,1 % der Zellen sind ungefärbt, lediglich ANN+ sind 16,4 % der Zellen und ANN+/PI+ sind 59,8 % der Zellen. Nur 9,7 % der Zellen sind PI+. Signifikante Unterschiede zwischen der CMV und 19P Zelllinie sind nicht zu auszumachen.

Als ein weiteres Modell zur Aufklärung der Beziehung zwischen Zelltod und HIF-1-Aktivität wählten wir den Einfluss der Hypo- bzw. Hyperthermie auf den Zelltod und die HIF-1-Aktivität von PC12-Suspensionszellen. Es ist bekannt, dass Hypothermie protektiv auf den Zelltod wirkt und Hyperthermie den Zelltod fördert. Wir entschieden uns für eine Hypothermie von 32°C, einer 36°C-Kontrollgruppe und einer Hyperthermie von 42°C. In Abbildung 40 ist der Versuchsaufbau dargestellt.

	Abbildung 40: Versuchsaufbau der PC12-Zellen mit unterschiedlicher Temperaturexposition. Die PC12-Zellen wurden in Suspension ausgesät und am Tag 2, unmittelbar vor der Hypoxie, transfiziert. Anschließend wurden die Zellen bei der jeweiligen Temperatur inkubiert. Die Hypoxiedauer betrug 36 Stunden. Zu jedem Versuch wurde eine Kontrollgruppe angesetzt, die sich lediglich durch die fehlende Hypoxieexposition unterschied.

Mittels Durchflusszytometrie und einer Doppelfärbung mit Annexin-V und Propidium-Jodid, untersuchten wir den Einfluss der Temperaturbedingungen bei einer Hypoxiedauer von 72 Stunden auf Apoptose und Nekrose.

Tabelle 4: Durchflusszytometrie von PC12-Suspensionszellen in Normoxie und nach 72 Stunden Hypoxie in 32°C, 36°C und 42°C.

Doppelfärbung mit Annexin-V und Propidium-Jodid. n = 6, Mittelwert ± SEM. * = p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle bei 32°C, # = p<0,05 im Vergleich zur Kontrolle bei 36°C.

In Tabelle 4 sind die Ergebnisse der Durchflusszytometrie mit Doppelfärbung von Annexin-V und Propidium-Jodid in Normoxie und nach 72 Stunden Hypoxie dargestellt, wobei die ANN+ und ANN+/PI+ zusammen gefügt wurden. Bei 32°C kommt es zu keinen statistisch signifikanten Veränderungen. Die Anzahl der ANN+ und ANN+/PI+ Zellen und die Anzahl der PI+ Zellen liegen in Normoxie und Hypoxie bei 5%. Ca. 90% der Zellen bleiben ungefärbt. Bei den PC12-[Seite 61↓]Zellen in der Kontrollgruppe bei 36°C steigen die Werte von ANN+ und ANN+/PI+ Zellen von 3,8 in Normoxie auf 11,3 in Hypoxie signifikant an. Die Anzahl von PI+ Zellen bleibt unbeeinflusst. Bei 42°C lässt sich ein Temperatureinfluss bereits in der Kontrolle vermuten: Die ANN+ und ANN+/PI+ Zellen steigen von 3,8 bei 36°C in Normoxie auf 13,5 bei 42°C in Normoxie an. Ein Einfluss der Hypoxie innerhalb der Kultur bei 42 °C ist statistisch nicht zu erkennen.

Wie bereits dargestellt, wird die Expression des Kontrollvektors pGL3 durch NGF und Hypoxie beeinflusst. Deshalb untersuchten wir auch den Einfluss der Temperatur auf die Expression des pGL3-Vektors. An Tabelle 5 wird deutlich, dass in Normoxie die Expression mit steigender Temperatur verringert wird. Auch in Hypoxie ist dieser Effekt erkennbar: Die Expression von pGL3 sinkt von 31,4 RLE bei 32°C auf 5,6 RLE bei 42°C.

Tabelle 5: Einfluss der Temperatur auf die Expression des Kontrollvektors pGL3 in PC12-Zellen in Suspension.

Dargestellt ist der Mittelwert ± SEM der RLE. n = 7 unabhängige Versuche. * = p < 0,01 im Vergleich zu 32°C. # = p < 0,001 im Vergleich zu 36°C. Die PC12-Zellen wurden am Tag 0 in Suspension ausgesät. Die Transfektion fand am Tag 2 vor der Hypoxie und Temperaturexposition statt.

Die HIF-1-Aktivität von PC12-Wildtyp-Zellen, die bei verschiedenen Temperaturen einer Hypoxie ausgesetzt wurden, ist in Abbildung 41 dargestellt. Mit steigender Temperatur sinkt die HIF-1-Aktivität. Die Kultur bei 32°C zeigt eine ähnliche HIF-1-Aktivität wie bei 36°C. Die HIF-1-Aktivität der Kultur von 42°C ist signifikant geringer als die der Kultur von 32°C und die der Kultur von 36°C.

	Abbildung 41: Dargestellt ist die HIF-1-Aktivität in PC12-Zellen nach Hypoxieexposition bei unterschiedlichen Temperaturen in Normoxie und nach 24 Stunden Hypoxie. n=7, Mittelwert ± SEM. * = p < 0,01 im Vergleich zu Normoxie. # = p<0,01 im Vergleich zu 32°C und 36°C.