5  Diskussion

In unseren Versuchen zeigt die durchflusszytometrische Analyse der Zellen einen durch Hypoxie induzierten Anstieg des Anteils von ANN+ und ANN+/PI+ Zellen. Nach Walton et al. (1997) repräsentieren Annexin-V positive Zellen früh-apoptotische Zellen. Simultane Färbung von Annexin-V und Propidium-Jodid repräsentieren Zellen später Phasen der Apoptose und nekrotische Zellen (Walton et al., 1997). Ähnlich wie in vorhergehenden Untersuchungen fanden wir, dass Hypoxie Apoptose und Nekrose parallel induziert (Yoshimura et al., 1998).

Interessanterweise zeigt die Methode der Durchflusszytometrie im Vergleich zur Analyse der Enzymaktivitäten, die für die Messung des Zellschadens benutzt wurden, ein unterschiedliches Ausmaß und eine unterschiedliche Qualität von Hypoxie-induziertem Zellschaden. Eventuell ist der Grund für diese Unterschiede der Zeitpunkt der Bewertung des Zelltodes nach der Hypoxie, bedingt durch verschiedene Färbemethoden. Die Ergebnisse dieser Arbeit stützen vorangegangene Untersuchungen von Keilhoff und Wolf (1993), die zeigten, dass Fluoreszenz-Labelling von Zellen nicht parallel zur LDH-Freisetzung läuft.

Wie seit langem bekannt, bewirkt NGF eine Differenzierung von PC12-Zellen. Die Wirkung von NGF auf den Zelltod hängt offensichtlich von den jeweiligen Versuchsbedingungen ab. Unsere Versuche zeigen einen Anstieg der Hypoxievulnerabilität der PC12-Zellen nach Behandlung mit NGF im Vergleich zu unbehandelten PC12-Zellen. Verursacht wird diese erhöhte Hypoxievulnerabilität wahrscheinlich durch NGF vermittelte Mechanismen, wie die Modifizierung der Glutamat-Rezeptor-Expression und die veränderte Wirkung von freien Radikalen (Satoh et al., 1999). In Neuronen wird der apoptotische Zelltod durch autonome Mechanismen in der Zelle kontrolliert, die durch Neurotrophine, wie den Nervenwachstumsfaktor, beeinflusst werden (Edwards und Tolkovsky, 1994; Mesner et al., 1992). Dabei kommt es zu komplexen Wechselwirkungen zwischen der Signaltransduktion und pro-apoptotischen Faktoren wie Mitgliedern der bcl-2 Familie (z.B. Bax) und den Mitochondrien (Crompton, 2000). Es wurde allerdings auch gezeigt, dass das anti-apoptotische Protein bcl-2 durch NGF hochreguliert wird (Katoh et al., 1996). In unserem Modell scheint eine mögliche Hochregulation durch NGF nicht ausreichend zu sein, um PC12-Zellen vor dem Hypoxie-induzierten Zelltod zu schützen.

Es ist bekannt, dass die Differenzierung von PC12-Zellen eng assoziiert ist mit unterschiedlicher Genexpression. Beispielsweise kommt es zu einer Hochregulation des NGF-Rezeptors p75 und einer Hemmung der Expression des Proliferation-assoziierten-Genes (PAG) und des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor-1 (Satoh und Kuroda, 2000), was möglicherweise mit dem Hypoxie-induzierten Zelltod in mit NGF behandelten Zellen zusammenhängt. Zusätzlich zu den trophischen Funktionen, die durch den Trk-A-Rezeptor vermittelt werden, wurde auch gezeigt, dass NGF, an p75 bindend, neuroprotektiv wirken kann (Kume et al., 2000).

Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass die Temperatur einen großen Einfluss auf den Zelltod hat. Durch eine verringerte Körpertemperatur sinkt der Bedarf an Sauerstoff und Glukose. Adaptativ wird die neuronale Aktivität durch inhibitorische Neuromodulatoren wie Gamma-amino-butyric-acid (GABA) vermindert (Nilsson und Lutz, 1991). Aus der Literatur ergeben sich zahlreiche Hinweise, sowohl für eine vermehrte Nekrose, als auch für eine vermehrte Apoptose nach hyperthermer Exposition (Busto et al., 1987; Khan und Brown, 2002). Es wird beschrieben, dass Langzeit-Hyperthermie zu Nekrose und Kurzzeit-Hyperthermie zu einer vermehrten Apoptose führt.

Aus unseren Versuchen lässt sich erkennen, dass eine Hyperthermie von 42°C im Vergleich zur Kontrolle (36°C) und zur Hypothermie (32°C), zu einem Anstieg der ANN+ und ANN+/PI+ PC12-Zellen führt (Tabelle 4). Die ANN+ und ANN+/PI+ PC12-Zellen repräsentieren wahrscheinlich die früh- und spät-apoptotischen PC12-Zellen. Interessanterweise kommt es in der Hypoxie zu keinem Anstieg der ANN+ und ANN+/PI+ Zellen. Es scheint ein Hypoxie-induzierter Effekt zu existieren, der in unseren Versuchsbedingungen die Apoptose verhindert. In der Literatur wird nur beschrieben, dass durch eine Hyperthermie von 42°C in retinalen Ganglienzellen die Expression von 72-kDa Heat-shock-Protein erhöht wird und die Toleranz gegenüber einer Hypoxieexposition steigt und es zu weniger exitotoxischen Schäden kommt (Caprioli et al., 1996). Turman und Rosenfeld berichten gegenteilig, dass eine Überexpression von Heat-shock-protein 70 in der Lage ist, Zellen vor einer Hyperthermie zu schützen, nicht aber vor einer Hypoxie (Turman und Rosenfeld, 1999).

Bedeutend für den Zelltod unter unseren Kulturbedingungen sind die während einer Hypoxieexposition vermehrt produzierten sauren Metaboliten, welche zu einer Verminderung des intrazellulären pH-Wertes führen. Diese intrazellulären Bedingungen bewirken eine verstärkte Thermosensitivität (Lyons und Song, 1995; Ohtsubo et al., 2000).

Des weiteren wird beschrieben, dass physiologischer Stress, wie Hyperthermie, p53 aktiviert (Guan et al., 2002). Über pro-apoptotische Faktoren (z.B. Bax) kommt es durch eine Aktivierung von Caspase-3 zu einer vermehrten Hyperthermiesensitivität und schließlich zur Apoptose (Ohnishi und Ohnishi, 2001; Yonezawa et al., 2002). Interessanterweise wird in der Literatur beschrieben, dass hyperthermische Apoptose p53-Gen abhängig, aber auch p53-Gen unabhängig, ablaufen kann (Goto et al., 1999). Es wird auch berichtet, dass in humanen kolorektalen Tumorzellen Hyperthermie (42°C) -induzierte Apoptose durch p53 vermindert wird und dass bcl-2 und Bax nicht in die Induktion der Apoptose involviert sind (Ohtsubo et al., 2000).

Zur Überprüfung der Transfektionseffizienz wählten wir den Vektor pGFP. Bei genauer Betrachtung ist ein Einfluss der verschiedenen Versuchsbedingungen auf die Transfektionseffizienz zu erkennen. In Normoxie zeigt der Vektor pGFP in der SUS-Kultur eine höhere Transfektionseffizienz als in der KOLL-AD-NGF-Kultur. Die SUS-Kultur lässt sich leichter mit pGFP transfizieren. Dieses Bild ergibt sich nach ca. 4 Tagen. Am Tag 1 kann noch keine Aussage über Unterschiede in der Transfektionseffizienz gemacht werden (Abbildung 18).

Aus der Transfektion mit dem Vektor pGFP lässt sich schließen, dass 5-10 % der Zellen mit dem Transfektionsverfahren von TransFast transfiziert werden und das Verfahren ausreichend für die Messung der Luciferase und die Beurteilung der HIF-1-Aktivität ist. Aus der unterschiedlichen Transfektionseffizienz der einzelnen Phänotypen muss man die Schlussfolgerung ziehen, bei der Berechnung der HIF-1-Aktivität immer auf den Kontrollvektor pGL3 zu normieren, um einen verfälschenden Einfluss der Transfektionseffizienz zu umgehen.

Die Genexpression der Vektoren wird von den unterschiedlichen Versuchsbedingungen beeinflusst. Wie besonders aus der Tabelle 1 ersichtlich, beeinflusst NGF die Expression des Vektors pGL3. In Normoxie erhöht NGF die Expression des Vektors pGL3 mit steigender NGF-Konzentration. In Hypoxie scheint NGF dagegen die Expression zu vermindern. Am wahrscheinlichsten führt eine Interaktion der Hypoxie mit NGF zu einer Verminderung der SV40-Promotor-Aktivität und folglich zur Verminderung der pGL3-Vektor-Aktivität. Die Verminderung der Genexpression durch Hypoxie scheint von den jeweiligen Versuchsbedingungen abzuhängen.

Wahrscheinlich beeinflusst die Hypoxie die bei einer Transfektion stattfindende Vektorfreisetzung aus Lipidvesikeln in das Zytoplasma und deren Weg in den Zellkern. Der limitierende Schritt im intrazellulären DNA-Trafficking scheint der Eintritt der DNA in den Zellkern, hauptsächlich durch Veränderungen der nukleären Membran während der Zellteilung zu sein (Zauner et al., 1999). Allerdings sieht man auch bei Transfektionen im Pool und erst 2 Tage später folgender Hypoxie (Absolutwerte nicht dargestellt) eine Verminderung des pGL3-Vektors durch die Hypoxie.

Einen möglichen Einfluss der signifikant unterschiedlichen Proliferationsrate in unbehandelten und NGF-behandelten PC12-Zellen kann man ausschließen, da der pGL3-Vektor in NGF- behandelten Zellen, die eher eine verminderte Proliferationsrate zeigen, stärker exprimiert wird. Zellteilungsprozesse können somit nicht für die beobachteten phänotypischen Unterschiede in der Expression der Reportergene verantwortlich sein.

Die Temperatur hat ebenfalls einen signifikanten Einfluss auf die Expression des Kontrollvektors pGL3. Wie aus Tabelle 5 ersichtlich, sinkt die Vektorexpression mit steigender Temperatur, sowohl unter normoxischen als auch unter hypoxischen Bedingungen. In der Literatur wird besonders von einem Anstieg der Promotoraktivität des Heat-Shock-Protein Promotors berichtet (Braiden et al., 2000; Gerner et al., 2000). In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen wird auch in der Literatur beschrieben, dass Hypothermie die Expression von einem Luciferase-Reporter-Gen verstärkt (Chevrier-Miller et al., 1996).

Unsere Versuche zeigen, dass unter verschiedenen Bedingungen die HIF-1-Aktivität vermindert ist: Das Primen von PC12-Zellen mit NGF in Suspension vermindert die HIF-1-Aktivität proportional zur NGF-Konzentration (Abbildung 31). Dies gilt auch für PC12-Phänotypen, die adhärent wachsen, allerdings in geringerem Ausmaß. Bei NGF-differenzierten PC12-Zellen war die HIF-1-Aktivität gegenüber den undifferenzierten PC12-Zellen signifikant vermindert (Abbildung 33).

Verschiedene Mechanismen für die NGF-bedingte Verminderung von HIF-1 sind denkbar:

1. Eine verminderte Bindungskapazität von HIF-1 an die Promotorregion von Reporter-Genen, ein verstärkter Abbau von HIF-1 durch Ubiquitinierung oder eine Heterodimerisierung mit Partnern von NGF-induzierten Transkriptionsfaktoren sind denkbar. Der HIF-1 alpha Level wird durch die Ubiquitinierung reguliert (Kallio et al., [Seite 67↓]1999). Da gezeigt wurde, dass NGF die Ubiquitinierung aktiviert (Obin et al., 1999), ist ein vermehrter Abbau von HIF-1 durch Ubiquitinierung oder durch Heterodimerisierung mit Partnern von NGF-induzierten Transkriptionsfaktoren denkbar.
2. Eine weitere mögliche Erklärung für den inhibierenden Effekt von NGF ergibt sich aus der Aktivierung der Transkriptionsfaktoren: Nukleärer Faktor-κB (NF-κB) und dem aktivierendem Protein-1 (AP-1) (Maggirwar et al., 2000). Der Nukleäre Faktor-κB kann direkt um die Bindung von dem sogenannten Coaktivator-p300 konkurrieren. Dieser transkriptionelle Coaktivator-p300 interagiert mit HIF-1 alpha (Arany et al., 1996) und ist eventuell an dem inhibierenden Effekt von NGF auf die Hypoxie-induzierte HIF-1 Aktivierung beteiligt.
3. Eine weitere Studie zeigte, dass Zytokine die Bindung von HIF-1 in humanen Leberzelllinien stimulieren, was eine Interaktion zwischen Zytokinen und Transkriptionsfaktoren und folglich noch weiteren Einflussfaktoren in der Regulation der HIF-1-Aktivität vermuten lässt (Hellwig-Burgel et al., 1999).
4. Ein großer Teil der Reaktionen auf Hypoxie beruht auf der Stabilisierung von HIF-1 mRNA und dem HIF-1 Protein (Kallio et al., 1999). Assays, auf Reportergenen basierend, haben die Limitierung, dass andere Transkriptionsfaktoren als HIF-1 die Expression der Reportergene beeinflussen können. Da PC12-Zellen in Suspension Tumorzellen und NGF behandelte PC12-Zellen differenzierte, neuronen-ähnliche Zellen darstellen, ist es durchaus möglich, dass andere Phänotyp-spezifische Faktoren zu der beobachteten Verminderung der HIF-1-Aktivität durch NGF beitragen. Tumorzellen haben aufgrund ihrer hohen glykolytischen Aktivität eine höhere Resistenz gegenüber Hypoxie. Es ist auch bekannt, dass Tumorzellen eine hohe HIF-1-Aktivität haben, welche eventuell zu deren vermehrter Hypoxie-Resistenz beiträgt (Ryan et al., 1998). Generell sind differenzierte Zellen empfindlicher gegenüber Hypoxie als undifferenzierte Zellen. Der Fakt, dass sich in Zellen in Suspensionskulturen, genau wie in adhärent gewachsenen Kulturen, welche eine reduzierte HIF-1-Aktivität aufweisen, die Hypoxieempfindlichkeit erhöht, weist darauf hin, dass NGF als ein hierarchisch organisiertes Signal-Molekül fungiert.

Bei den unterschiedlichen PC12-Phänotypen (SUS, KOLL-AD, KOLL-AD-NGF), die unmittelbar vor der Hypoxie transfiziert wurden, konnte kein signifikanter Unterschied in der HIF-1-Aktivität gefunden werden. Der Grund dafür liegt wahrscheinlich in der Versuchsanordnung. Durch die Transfektion der PC12-Zellen unmittelbar vor der Hypoxie wird eher das Verhalten der Plasmide in verschiedene Phänotypen analysiert, als die HIF-1-Aktivität. Die Suspensionszellen z.B. unterscheiden sich durch ein reges Teilungsverhalten gegenüber den adhärenten PC12-Zellen. Bei den adhärenten PC12-Zellen kommt es zusätzlich zu Wechselwirkungen über transmembranale Moleküle der Plasmamembran, die mit dem Zytoskelett in Verbindung stehen. Die Ligandenbindung und die Interaktion von Adhäsionsmolekülen mit dem Zytoskelett vermitteln spezifische Signale in die Zelle, über die Proliferation, Apoptose, Motilität und Differenzierung gesteuert werden. Diese Integrin-Zytoskelett-Wechselwirkungen können einen bedeutenden Einfluss auf die Transfektion und die Expression der Luciferase haben und die HIF-1-Aktivität beeinflussen. Es ist auch bekannt, dass aus der Differenzierung zu adhärenten, NGF-behandelten PC12-Zellen (KOLL-AD-NGF), eine unterschiedliche Genexpression resultiert, die Einfluss auf die Luciferase-Expression nehmen kann. Aussagefähig für den Einfluss von NGF auf die HIF-1-Aktivität sind daher jene Versuche, bei denen die Transfektion vor der Aussaat erfolgte und die Zellen 2 Tage nach der Transfektion einer Hypoxieexposition ausgesetzt wurden (Abb. 32).

Diese Arbeit zeigt einen Einfluss der Temperaturbedingungen auf die HIF-1-Aktivität in PC12-Zellen. Deutlich wird eine signifikante Verminderung der HIF-1-Aktivität bei einer Hyperthermie von 42°C. Die unter hyperthermischen Konditionen verminderte HIF-1-Aktivität spielt womöglich eine wichtige Rolle für den hyperthermen Zelltod. Ursächlich für die hypertherme Verminderung der HIF-1-Aktivität können die gleichen Faktoren sein, wie bei der Verminderung der HIF-1-Aktivität durch den Nervenwachstumsfaktor beschrieben. So könnte eine verminderte Bindungskapazität von HIF-1 an die Promotorregion von Reportergenen oder ein verstärkter Abbau von HIF-1 durch die Ubiquitinierung, die durch Hyperthermie aktiviert wird, beteiligt sein. Auch eine hypertherme Verminderung von Zytokinen, die zu einer Verminderung der Bindung von HIF-1 führen, ist denkbar (Hellwig-Burgel et al., 1999). Die Temperatur könnte auch einen Einfluss auf die Stabilisierung der HIF-1 mRNA und des HIF-1 Proteins haben und somit zu deren Verminderung führen.

Ein Einfluss der Temperatur auf die HIF-1-Aktivität ist in der Literatur bislang noch nicht beschrieben.

Vorangegangene Untersuchungen von Leclere zeigten, dass die in der AG Prof. Gross entwickelten HIF-1 alpha Antisense PC12-Zellen in frühen Passagen zu einer Verminderung der HIF-1-Aktivität führten. Allerdings zeigen die vorliegenden Untersuchungen, dass der Antisense-Effekt nicht stabil ist. Nach Hypoxieexposition war eine verminderte HIF-1-Aktivität nicht kontinuierlich zu erreichen. Ursächlich könnte hierfür eine Inaktivierung des Promotors sein, wie in der Literatur bereits beschrieben (Herweijer et al., 2001; Yu und Chandrasekhar, 1997). Kano et al. (2001) beschrieben, dass während kontinuierlichen Kultivierens von PC12-Zellen spontane Mutationen auftreten, welche eine Inaktivierung des Antisense-Effektes erklären könnten.

In den Parallelversuchen der HIF-1 alpha Antisense-Einzelzellklone, die eine verminderte HIF-1-Aktivität zeigten, konnte kein Einfluss auf die Hypoxievulnerabilität festgestellt werden. Die HIF-1-Aktivität scheint nicht ausreichend vermindert zu sein, um Einfluss auf den Hypoxie-induzierten Zelltod zu nehmen.

Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen eine Korrelation zwischen HIF-1-Aktivität und dem Hypoxie-induzierten Zelltod vermuten: PC12-Zellen mit einer verminderten HIF-1 Expression zeigen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber Hypoxie. In der Abbildung 42 ist die Beziehung zwischen der HIF-1-Aktivität und dem Zelltod anhand der Ergebnisse dieser Arbeit aus den NGF- und Temperaturversuchen zusammengefasst. Alle Versuche deuten auf die gleiche Tendenz: Eine hohe HIF-1-Aktivität vermindert den Zelltod, eine niedrige HIF-1-Aktivität vermehrt den Zelltod.

	Abbildung 42: Dargestellt ist die Beziehung zwischen HIF-1-Aktivität (Hypoxie/Normoxie) und Zelltod (Hypoxie/Normxie). Die Daten der HIF-1-Aktivität und des Zelltodes entstammen den verschiedenen Differenzierungsgraden (SUS, KOLL-AD, KOLL-AD-NGF) und den verschiedenen Temperaturen (32°C, 36°C und 42°C). Die Daten sind eine Zusammenfassung der Versuche zur Analyse des Zelltodes und der HIF-1-Aktivität der verschiedenen PC12-Phänotypen.

Gründe für die zellprotektive Wirkung einer erhöhten HIF-1-Aktivität können vielseitig sein. Unter extrem hypoxischen Bedingungen werden „pro-death“ Gene wie das Tumor Supressor Gen p53 (Banasiak und Haddad, 1998), Caspase-3 und Bax (Chae et al., 2001; Shen und White, 2001) und Fas (Felderhoff-Mueser et al., 2000) aktiviert. Neuere Studien scheinen zu bestätigen, dass es eine Verbindung zwischen p53 und HIF-1 alpha gibt. Der genaue Zusammenhang ist noch nicht vollständig geklärt. Der Mechanismus scheint abhängig von der jeweiligen Zellart zu sein. Vor kurzem zeigte Zaman et al. (1999), dass Eisenchelatoren ihre neuroprotektive Wirkung in Form von HIF-1 Aktivierung und Induktion von anderen Hypoxie- und oxidativen Stress-vermindernden Proteinen ausüben. Es ist möglich, dass eine NGF-induzierte Verminderung der HIF-1-Aktivität dementsprechend zu einer erhöhten Hypoxievulnerabilität beiträgt. Des weiteren könnte für die protektive Wirkung von HIF-1 eine Interaktion mit dem anti-apoptotischen Protein bcl-2 verantwortlich sein. Bcl-2 vermindert die Apoptose in neuronalen Zellen, wie an einer bcl-2 Antisense-Zelllinie gezeigt wurde (Banasiak et al., 1999) und der bcl-2 Gehalt von Zellen korreliert mit der HIF-1-Aktivität (Ju et al., 2002).

Die Versuche dieser Arbeit deuten darauf hin, dass mit der Modulierung der HIF-1 Expression eine klinisch anwendbare Einflussmöglichkeit besteht, die Zellen gegen Hypoxie/Ischämie zu schützen.

Allerdings wird in der Literatur auch Gegenteiliges beschrieben. An et al. (1998) zum Beispiel berichtet, dass ein direkter Zusammenhang zwischen HIF-1 alpha und dem p53-Protein besteht. In anderen Studien ist ein pro-apoptotischer Effekt von HIF-1 in embryonalen Stammzellen und kortikalen Neuronen unter Hypoxie beschrieben worden (Carmeliet et al., 1998; Halterman et al., 1999). In beiden Studien führt eine HIF-1 induzierte Aktivierung von p53 und eine Hemmung der bcl-2 Expression zum Zelltod.

	Abbildung 43: Schematische Zusammenfassung der Interaktion von Hypoxie/Ischämie, HIF-1, p53 und bcl-2. Hypoxie/Ischämie führt zu einer HIF-1 Aktivierung. Dargestellt sind die in der Literatur beschriebenen Interaktionen von HIF-1 mit verschiedenen Faktoren, die entweder zum apoptotischen Zelltod oder zu einer Zellprotektion führen.

Entscheidend für das Ausmaß der Apoptose ist die Aktivierung von Zelltod-induzierenden Proteinen, wie der Faktor p53 und das anti-apoptotische Protein bcl-2. Da sowohl NGF, als auch Hypoxie p53 aktivieren (Aloyz et al., 1998; Poluha et al., 1997; Saikumar et al., 1998), ist wahrscheinlich dieser Synergismus von NGF und Hypoxie verantwortlich für eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber der Hypoxie in adhärenten, mit NGF behandelten Zellen (KOLL-AD-NGF).