Franke, Patrick: Vitamin D3-Analogon / -Cyclodextrin-Kavitate - Herstellung, Charakterisierung und In-vitro-Liberation aus Dermatika -

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Kapitel 2. Untersuchungen und Ergebnisse

2.1. Substanzen

2.1.1. Methylprednisolonaceponat

Methylprednisolonaceponat (MPA) ( siehe ) ist ein nicht halogenierter Diester des 6alpha-Methylprednisolons und gehört zur Gruppe der partialsynthetischen Glucocorticoide. Als potentes Glucocorticoid leistet es in einer der wichtigsten Substanzgruppen zur topischen Behandlung von Hauterkrankungen seinen Beitrag [ siehe ]. Im Vordergrund bei der topischen Applikation stehen der antiphlogistische und antiproliferative (antimitotische) Effekt. Hinzu kommen eine immunsuppressive, antipruriginöse und vasokonstriktorische Wirkung [ siehe ].

MPA ist ein bei Raumtemperatur geruchloses, weißes Pulver. Es hat die Summenformel C27H36O7 und besitzt eine relative Molmasse von 472,6 g/mol. MPA erweist sich als leicht löslich in Ethanol, Ethylacetat und Ether, schwer löslich in Aceton und praktisch unlöslich in Wasser.

Abb. 5: Strukturformel von Methylprednisolonaceponat (MPA)


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Für die Therapie ist MPA unter dem geschützten Namen Advantan® als 0,1%ige Zubereitung in Form einer Milch, Creme, Salbe und Fettsalbe im Handel. Die Präparate sind vorrangig bei endogenen Ekzemen, wie der atopischen Dermatitis und Neurodermitis, indiziert. MPA dient in der vorliegenden Arbeit als Modellsubstanz für die Einstellung optimaler Parameter bei Freisetzungsuntersuchungen von Steroiden und anderen Dermatika aus Salbensystemen.

2.1.2. Calcitriol-Analogon

Das Calcitriol-Analogon (CA) ( siehe ) ist eine Modifikation des natürlichen Calcitriols (1alpha,25-Dihydroxy-cholecalciferol). Calcitriol ist ein aktiver Metabolit des Colecalciferols (INN), Vitamin D3.

Unter D-Vitaminen versteht man aus Steroiden durch photochemische Reaktion gebildete Substanzen mit antirachitischer Wirkung [ siehe ]. Von diesen besitzt Vitamin D3, das im menschlichen Körper durch Bestrahlung von 7-Dehydroxycholesterol (Provitamin D3) mit UV-Licht in der Haut entsteht, die größte Bedeutung. Das in der Haut gebildete Colecalciferol gelangt in die Leber und wird dort mittels Cholecalciferol-25-Hydroxylase zu 25-Hydroxy-cholecalciferol hydroxyliert, welches im Fett- und Muskelgewebe gespeichert wird [ siehe ]. 25-Hydroxy-cholecalciferol wird schließlich in der Niere mittels 25-Hydroxy-cholecalciferol-1alpha-Hydroxylase ein zweites Mal hydroxyliert; es entsteht das Calcitriol, die Hauptwirkform. Die an C-24 hydroxylierten Metaboliten besitzen kaum antirachitische Aktivität und gelten als Endprodukte des Vitamin-D-Stoffwechsels [ siehe ].

Vitamin D ist maßgeblich an der Regulation des Calcium-, Phosphat-, und Citrat-Haushalts im menschlichen Organismus beteiligt. In der Haut moduliert Vitamin D3 epidermales Wachstum, Keratinisierung und Inflammation [ siehe ].

In klinischen Studien konnte gezeigt werden, daß der aktive Metabolit Calcitriol eine hohe Effektivität bei topischer und oraler Behandlung der Psoriasis besitzt [ siehe ]. Der therapeutische Einsatz von Calcitriol und seinen Derivaten ist jedoch aufgrund ihrer unerwünschten irritativen lokalen Wirkung und des ausgeprägten hypercalcämischen Effektes (Calcinose-Wirkung) eingeschränkt [ siehe , siehe ].


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Das CA läßt sich als Strukturvariante des Vitamin D3 in die Reihe der Vitamin D3-Derivate Calcipotriol (INN) und Tacalcitol (INN) einordnen. Es besitzt wie Calcipotriol eine Hydroxy-Gruppe am C-Atom 24 und eine Doppelbindung am C-Atom 23, variiert aber mit einer Isopropylesterkomponente in der Seitenkette. Die IUPAC-Bezeichnung des CA lautet Isopropyl (5Z,7E,22E) - (1S,3R,24R) -1,3,24-Trihydroxy-9,10-secocholesta-5,7,10(19),22-tetraene-25-carboxylat. Wie in der systematischen Nomenklatur des Colecalciferols wird vom Steroid-Kohlenwasserstoff Cholestan ausgegangen. Das Präfix seco mit den vorangestellten Lokanten 9,10 drückt unter Beibehaltung der Bezifferung des Steroidsystems die Ringöffnung zwischen C-9 und C-10 aus.

Das CA ist ein bei Raumtemperatur geruchloses, weißes kristallines Pulver. Es hat die Summenformel C31H48O5 und besitzt eine relative Molmasse von 500,719 g/mol. Entsprechend eigenen Untersuchungen erweist sich das CA als leicht löslich in Ethanol, Ethylacetat und Ether und praktisch unlöslich in Wasser.

Abb. 6: Strukturformel des Calcitriol-Analogons (CA): Isopropyl (5Z,7E,22E) - (1S,3R,24R) -1,3,24-Trihydroxy-9,10-secocholesta-5,7,10(19),22-tetraene-25-carboxylat

2.1.3. Cyclodextrine

2.1.3.1. Allgemeines

Cyclodextrine sind zyklische, nicht reduzierende Maltooligosaccharide in Torusform, die durch enzymatischen Abbau von Stärke hergestellt werden können. Sie bestehen aus alpha-


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D-Glucoseeinheiten, die über 1,4-glycosidische Bindungen ringförmig miteinander verknüpft sind. Die wichtigsten Cyclodextrine bestehen aus 6,7 oder 8 Glucosemolekülen und werden als alpha-Cyclo-, beta-Cyclo- und gamma-Cyclodextrine bezeichnet. Durch die ringförmige Verknüpfung der Glucosemoleküle entstehen Hohlräume mit Durchmessern von 0,5 nm, 0,65 nm bzw. 0,8 nm [ siehe , siehe ]. Cyclodextrine sind in der Lage, mit Gastmolekülen Einschlußverbindungen (Kavitate) zu bilden, ohne daß es zur Ausbildung einer echten, kovalenten Bindung kommt. Wesentliche Voraussetzung hierfür ist die richtige Größe des Gastmoleküls, das den Hohlraum gut ausfüllen muß [ siehe ]. Große Moleküle können teileingeschlossen werden, dazu müssen sie über ein in den Hohlraum passendes Strukturelement verfügen [ siehe ]. Hydrophobe Moleküle haben dabei eine größere Affinität zum Hohlraum als Moleküle oder Teile von ihnen, die hydrophil sind.

Treibende Kräfte bei der Einschlußbildung mit polaren bzw. polarisierbaren Gastmolekülen sind Van-der-Waals’sche Wechselwirkungen, bei unpolaren Substraten sind es hydrophobe Wechselwirkungen. Auch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Cyclodextrinen und Gast sind beschrieben worden [ siehe ].

In den Hohlraum lagern sich bevorzugt lipophile Strukturelemente ein, während polare Gruppen mit den hydrophilen Hydroxygruppen in Wechselwirkung treten.

Abb. 7: Schematische Darstellung eines Cycodextrin-Moleküls mit Lokalisation der Hydroxygruppen

In der Regel werden bei lipophilen Gastmolekülen die Wasserlöslichkeit und damit die Lösungsgeschwindigkeit verbessert. In manchen Fällen ist die Verbesserung der Lösungsgeschwindigkeit nicht auf eine verbesserte Löslichkeit zurückzuführen. Andere Parameter, wie molekulardisperse Verteilung des Arzneistoffs, vergrößerte Oberfläche und verbesserte Benetzbarkeit, sind in diesem Zusammenhang ebenso zu berücksichtigen, wie die verminderte Kristallinität vieler Kavitate.


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Abb. 8: Kristallstruktur eines beta-Cyclodextrins (Seiten- und Vorderansicht) mit dem umgebenden Kristallwasser [siehe]


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Diverse Cyclodextrin-Derivate wurden synthetisiert, um die Einschlußkapazität für eine Anzahl von Arzneistoffen zu erhöhen [ siehe ]. Diese chemisch modifizierten Cyclodextrine können in vier Gruppen eingeteilt werden:

Unter den hydrophilen Cyclodextrinen haben die alkylierten, hydroxyalkylierten und verzweigten CDe aufgrund ihrer nicht vorhandenen oder sehr geringen Toxizität und hohen Wasserlöslichkeit besondere Beachtung erlangt [ siehe ]. Eines der bekanntesten Vertreter der hydrophilen Cyclodextrin-Derivate ist das Heptakis(2,3,6-tri-O-methyl)-beta-Cyclodextrin (Dimeb). Seine Wasserlöslichkeit ist signifikant höher als die des nativen beta-CD, wahrscheinlich aufgrund seiner geringen Kristallgitterenergie im festen Zustand und der starken Hydratation in wässeriger Lösung.

Hydroxyalkylierte Cyclodextrin-Derivate sind eine amorphe Mischung von chemisch verwandten Komponenten mit verschiedenem Substitutionsgrad. Es wird dadurch Kristallisation verhindert, und dies ist der Grund für die hohe Wasserlöslichkeit. Die Oberflächenaktivität der hydroxyalkylierten Cyclodextrin-Derivate ist, bedingt durch die polaren Hydroxy-Gruppen, im allgemeinen geringer als die der alkylierten Cyclodextrin-Derivate.

Unter verzweigten Cyclodextrinen versteht man solche, bei denen ein oder zwei primäre Hydroxy-Gruppen mit Mono- oder Di-Sacchariden durch alpha(1-6) Verknüpfung verbunden sind. Als Vertreter sind das Glycosyl- (G1), Maltosyl- (G2) und Di-Maltosyl- ((G2)2) Cyclodextrin bekannt. Ihre Auflösungsgeschwindigkeit in Wasser ist gegenüber nativem Cyclodextrin und den alkylierten Cyclodextrin-Derivaten sehr hoch. Sie werden wegen ihrer besonders guten Verträglichkeit als Arzneistoffträger für Parenteralia empfohlen [ siehe ]. Es wurde eine vergleichsweise hohe Affinität von Steroiden zu verzweigten Cyclodextrinen gefunden [ siehe ].

Hydrophobe Cyclodextrine besitzen die Möglichkeit, als Wirkstoffträger wasserlöslicher Gastmoleküle zu fungieren, um ggf. durch Herabsetzen ihrer Wasserlöslichkeit die Freigaberaten zu verringern [ siehe ]. Durch Substitution der Hydroxy-Gruppen im Cyclodextrin-Molekül mit Ethyl-, Acetyl- oder längeren Alkyl-Gruppen wird die Wasserlöslichkeit dieser Komponenten mit steigender Kettenlänge vermindert. Ethylierte Cyclodextrine z.B. sind weniger hygroskopisch, aber oberflächenaktiver als unsubstituierte Cyclodextrine.

Ionische Cyclodextrine unterscheiden sich in vielen Effekten gegenüber nicht ionischen Cyclodextrin-Derivaten [ siehe ]. Insbesondere anionische Derivate stehen in der Diskussion


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als Träger von Wirkstoffen für eine gesteuerte Freisetzung. Ihre Wasserlöslichkeit hängt im wesentlichen vom pH-Wert der Lösung ab. CE-beta-CD, in dem die Hydroxy-Gruppen des beta-CD mit Carboxyethyl-Gruppen verethert sind, ist mit dem Ziel, als Wirkstoffträger für eine kontrollierte Freisetzung im intestinalen Bereich eingesetzt zu werden, synthetisiert worden [ siehe ].

Produkte, die zwei oder mehr kovalent gebundene Cyclodextrin-Einheiten enthalten, werden als Cyclodextrin-Polymere bezeichnet. Sie werden in der Regel mit Epichlorhydrin als Verknüpfungsagens hergestellt. Cyclodextrin-Polymere können wasserlöslich sein, wasserunlöslich und stark quellend oder leicht quellend als amorphe Pulver. Die Cyclodextrin-Einheiten behalten auch in polymerisierter Form ihre Fähigkeit, Kavitate zu bilden [ siehe ]. Wasserlösliche Cyclodextrin-Polymere werden als Substanzen definiert, die mindestens aus zwei Einheiten bestehen. Die untere Molekülmasse wasserlöslicher Cyclodextrin-Polymere liegt bei ca. 3000 g/mol, das obere bei ca. 10000 g/mol, bei mit Epichlorhydrin verknüpften Cyclodextrin-Polymeren bei ca. 20000 g/mol [ siehe ]. In der Regel bilden höher molekulare Cyclodextrin-Polymere gequollene unlösliche Gele [ siehe ].

2.1.3.2. Verwendete Cyclodextrine

Zur Assoziat (Kavitat)-Bildung mit dem neuen CA gelangten die in siehe aufgeführten beta-Cyclodextrine zur Überprüfung. Die ausgewählten Cyclodextrine sind hinsichtlich ihrer chemisch-physikalischen und toxikologischen Eigenschaften für den Einsatz in Dermatika und für eventuelle In-vivo-Studien geeignet.


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Tabelle 2: Ausgewählte beta-Cyclodextrine für CA-Einschlüsse

Löslich in

Unlöslich in

beta-Cyclodextrin (beta-CD) (MG: 1135 g/mol)

Wasser (1,85%)

Methanol Ethanol

1.8-Dimethyl-beta-cyclodextrin (Dimeb) (MG: 1310 g/mol)

Wasser (150%) Methanol (100%) Ethanol

Ether

beta-Cyclodextrin-Polymer (beta-CD-Polymer) (MG: \|[ap ]\|4000-4500 g/mol)

Wasser (>50%)

Aceton

Maltosyl-beta-cyclodextrin (G2-beta-CD) (MG: 1495 g/mol)

Wasser (>100%)

Methanol Ethanol

Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-beta-CD) (MG: 1500 g/mol)

Wasser (50%) Methanol Ethanol DMSO

Ether

Carboxyethyl-beta-cyclodextrin (CE-beta-CD) (MG: 1279 g/mol)

Wasser (>100%) DMSO (50%)

Methanol Ethanol Chloroform

2.1.3.3. Herstellung von Kavitaten

Feste Cyclodextrin-Einschlußverbindungen lassen sich durch verschiedene Verfahren herstellen. Die Auswahl der Methode hängt im wesentlichen von den Lösungseigenschaften des Gastmoleküls und des Cyclodextrins ab und muß somit individuell ausgewählt werden. Drei etablierte Verfahren, die zur Herstellung von CD-Komplexen in der vorliegenden Arbeit dienten, werden näher beschrieben.


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Knetmethode

Bei der Knetmethode wird das Gastmolekül zu einer Aufschlemmung des Cyclodextrins gegeben und kräftig, z. B. mittels Mörser und Pistill eingeknetet, bis eine Paste entstanden ist, die anschließend getrocknet wird. Die erhaltene Festsubstanz wird mit kleinen Mengen Lösungsmittel (z.B. Ether, Ethanol) gewaschen, um adsorbierte Reste der Gastkomponente zu entfernen. Diese Methode ist besonders für schwach wasserlösliche Wirkstoffe geeignet, da sich das Gastmolekül langsam durch Komplexbildung löst [ siehe , siehe , siehe ]. Vorteile der Knetmethode sind [ siehe ]:

Der Nachteil der Knetmethode liegt in der geringeren Reinheit der entstehenden Komplexe im Vergleich zur Kopräzipitationsmethode.

Lyophilisationsmethode

Die Gastkomponente wird zusammen mit dem Cyclodextrin in einem geeigneten molaren Verhältnis unter Rühren in Wasser gelöst. Anschließend wird gefriergetrocknet, das Produkt mit Ether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Methode liefert lockere Addukte in sehr guter Ausbeute [ siehe , siehe , siehe ]. Die Lyophilisationsmethode ist für wasserlösliche oder thermolabile Gastmoleküle geeignet, da sie zusammen mit dem Cyclodextrin, bevorzugt in wässeriger Lösung, gefriergetrocknet werden [ siehe ]. In einigen Fällen ist durch Zugabe von Lösungsvermittlern, wie Aceton oder Dioxan, das Verfahren auch schwer wasserlöslichen Wirkstoffen zugänglich.

Kopräzipitation

Durch Kopräzipitation läßt sich ein festes Kavitat aus gesättigter wässeriger Lösung isolieren. Die eingesetzten Mengen an Gastmolekül und Cyclodextrin orientieren sich am stöchiometrischen Verhältnis der Komponenten, welches sich aus dem Phasenlöslichkeitsdiagramm errechnet [ siehe ]. Die Komponenten werden in wässeriger Lösung bis zum


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Löslichkeitsgleichgewicht geschüttelt oder heiß gelöst und langsam durch Kühlen ausgefällt. Das Kavitat präzipitiert als mikrokristallines Pulver und wird durch Filtration abgetrennt und getrocknet [ siehe , siehe , siehe ]. Eine Modifikation dieser Methode besteht im Einsatz von wässerig-alkoholischen Mischungen als Lösungsmittel für schwer wasserlösliche Gastkomponenten. Diese Methoden sind bei Systemen mit A-Typ-Phasenlöslichkeitsdiagrammen nicht anwendbar, da das Kavitat nicht ausfällbar ist.

2.1.3.4. Charakterisierung von Kavitaten

Um die Bildung eines Komplexes zu bestätigen, kann die Interaktion zwischen Gastmolekül und Cyclodextrin anhand verschiedener indirekter Nachweismethoden untersucht werden. Die Ergebnisse mehrerer Methoden werden gemeinsam in die Bewertung einbezogen.

NMR-Spektroskopie

Einen Beweis für eine Einschlußverbindung in Lösung liefert im allgemeinen die 13C- oder 1H-NMR-Spektroskopie. Das Verfahren beruht auf der Resonanz-Wechselwirkung zwischen Radiowellen (d.h. einem hochfrequenten magnetischen Wechselfeld) und bestimmten Atomkernen der zu untersuchenden, meist flüssigen (gelösten) Substanz, die sich in einem sehr starken äußeren, homogenen Magnetfeld befindet. Grundlage der Messungen ist die Präzesionsbewegung, die Atomkerne mit Drehimpuls (Spin) und magnetischem Moment m in einem äußeren Magnetfeld um die Richtung des Magnetfeldes mit einer bestimmten Frequenz (Larmor-Frequenz w) ausführen. Man kann mit der NMR-Spektroskopie Lage, Zahl und Bindungsart von organisch gebundenen Wasserstoff-Kernen = Protonen untersuchen, weshalb man auch von Protonenresonanz-(PMR-) Spektroskopie spricht, weil 1H sowohl eine hohe natürliche Häufigkeit von 99,9% als auch ein großes magnetisches Moment aufweist. Im Frequenzbereich der Protonenresonanz gibt Deuterium kein Signal, weshalb perdeuterierte Verbindungen ideale Lösemittel abgeben.

Das angelegte äußere Magnetfeld wird durch die Induktionswirkung der Elektronen und durch die Felder benachbarter Kerne abgeschwächt, d.h. die ”effektive Feldstärke“ ist geringer als die angelegte (Abschirmung, E shielding). Sie ist von Kern zu Kern in Abhängigkeit von der zugehörigen Elektronenverteilung verschieden. Diese auf der


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Abschirmung durch die Elektronenhülle beruhende Verschiebung der Resonanzlinie gegenüber der des isolierten Atomkerns in Abhängigkeit vom Bindungszustand bezeichnet man jeweils als chemische Verschiebung (E chemical shift). Die chemische Verschiebung, d.h. die Lage eines Signals, wird statt in Hz in d angegeben, und zwar in ppm. Aus der chemischen Verschiebung kann man Rückschlüsse darauf ziehen, welche chemischen Gruppen oder in welchen Bindungsverhältnissen die H-Atome vorliegen.

Zur Vereinfachung komplizierter Spektren bedient man sich darüber hinaus einiger Kunstgriffe. Mittels der Doppelresonanz strahlt man Radiowellen geeigneter Wellenlänge in die Probe, die selektiv die Frequenzabsorption von einzelnen (oder mehreren magnetisch äquivalenten) Kernen anregen, worauf die Multipletts der mit diesen koppelnden Kernen zu einer einzelnen Linie kollabieren. Mit dieser Spinentkopplung lassen sich einzelne Protonen ”anpeilen“; spezielle Spielarten sind zum Beispiel der Kern-Overhauser-Effekt (engl. Abk.: NOE). Letzterer kommt durch magnetische Dipol-Dipol-Wechselwirkung zwischen 1H und 2H oder 13C auch durch den Raum hindurch und in Abhängigkeit von r6, zustande. Mit ihm erhält man eine Signal-Intensitätssteigerung und kann räumlich benachbarte, aber oft durch viele Bindungen getrennte Kerne einander zuordnen.

Eine Integration ist bei 13C-Spektren schwieriger durchzuführen als bei Protonen-Spektren. Sie verlangt die Zugabe von sogenannten Relaxationsreagentien zur Probe und die Unterdrückung des NOE, der die relativen Signalflächen verfälscht.

Eine Möglichkeit des Nachweises von CD-Komplexen besteht darin, im Rahmen einer 1H-NMR-spektroskopischen Untersuchung die Interaktion der im Inneren des Cyclodextrin-Torus lokalisierten Wasserstoff-Atome (H-3 und H-5) mit Strukturen des Gastmoleküls zu betrachten. Es kann durch Abschirmung dieser Protonen zu schwachen Hochfeldverschiebungen kommen [ siehe ]. Die Resonanzfrequenzen der äußeren Protonen sollten bei einem Kavitat wenig beeinflußt bleiben, um nicht gleichzeitig eine Assoziation des Gastes mit der Außenseite des Cyclodextrins anzunehmen. Dieses Verfahren führt aufgrund übereinanderliegender Signale und damit schlechter Auflösung häufig zu schwer interpretierbaren Spektren. Die Ursache ist unter anderem in der Unreinheit von Cyclodextrin-Derivaten zu suchen, die chemisch oft nicht einheitlich vorliegen. Es werden auch teilweise Lösungsmitteleinflüsse für Hochfeldverschiebungen der Protonen verantwortlich gemacht.


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Die Aufnahme von NOESY-Spektren, die den Nachweis räumlicher Nähen erlaubt, ist eine weitere Möglichkeit, um die Assoziation zwischen Gastmolekül und Cyclodextrin zu erfassen. Allerdings sind auch hier ”saubere Spektren“ Voraussetzung. Ein weiteres Problem von NMR-Untersuchungen liegt in der Probenvorbereitung, da viele Kavitate in D2O nur schwach löslich sind und somit keine ausreichenden Konzentrationen zur Erstellung aussagefähiger Spektren erreicht werden können. Organische Lösungsmittel führen daher oft zur Dissoziation der Kavitate [ siehe ]. Der direkte Nachweis einer Kavitatbildung mittels NMR-Spektroskopie ist deshalb nicht immer möglich.

Thermoanalytische Verfahren

Eines der wichtigsten Instrumente für den Nachweis von Cyclodextrin-Komplexen in festem Zustand stellen thermoanalytische Verfahren dar, insbesondere die Differential Scanning Calorimetry (DSC) [Fehler! Textmarke nicht definiert., siehe , siehe , siehe ]. Diese Methode basiert darauf, daß in den Thermogrammen von eingeschlossenen Arzneistoffen durch die ”molekulare Verkapselung“ die Schmelzpunktpeaks, die bei reinen kristallinen Arzneistoffen und den entsprechenden physikalischen Mischungen detektiert werden können, ausbleiben.

Thermoanalyse ist der Oberbegriff für Methoden, bei denen physikalische und chemische Eigenschaften einer Substanz, eines Substanzgemisches und / oder von Reaktionsgemischen als Funktion der Temperatur oder der Zeit erfaßt werden, wobei die Probe einem kontrollierten Temperaturprogramm unterworfen wird [ siehe ].

Bei der DSC wird der Wärmestrom zur Probe gemessen. Durch Integration des Wärmestromes, eigentlich eine Wärmeleistung (SI-Einheit: Watt), über die Zeit erhält man den Wärmeumsatz oder die Enthalpieänderung einer Probe [mJ]. Grundlage der quantitativen Bestimmung des Wärmeumsatzes bei der DSC ist ein definierter, von der Probe unabhängiger Wärmewiderstand [ siehe ].

Phasenlöslichkeitsdiagramm

Lipophile Arzneistoffe, welche in Wasser schwerlöslich sind, erfahren in Gegenwart von Cyclodextrinen oft eine Erhöhung ihrer Wasserlöslichkeit, was auf die Bildung eines wasserlöslichen Komplexes zwischen Arzneistoff und gelöstem Cyclodextrin zurückzuführen ist. Die Komplexierung verringert die thermodynamische Aktivität der gelösten Fraktion des Arzneistoffs. Konsequenterweise wird sich mehr, das heißt so viel Arzneistoff lösen, bis die Aktivität freier Substanz, welche in chemischem Gleichgewicht


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mit dem Komplex steht, gleich der Aktivität an reinem festen Arzneistoff ist. Das Phasenlöslichkeitsdiagramm nach Higuchi und Conners [ siehe ] dient als Methode zur Interpretation einer Einschlußbildung in wässeriger Lösung. Zum einen gibt es Auskunft über die Löslichkeit des Wirkstoff / Cyclodextrin-Assoziats und erlaubt die Berechnung einer scheinbaren Komplexstabilitätskonstanten. Zum anderen können die Konzentrationsverhältnisse von Gastmolekül und Cyclodextrin ermittelt werden. Die Methode basiert darauf, daß eine jeweils gleiche Menge an Gastsubstanz, die größer als seine Sättigungskonzentration ist, in wässerigen Cyclodextrin-Lösungen steigender Konzentration bis zur Gleichgewichtseinstellung bei konstanter Temperatur gerührt wird. Die gemessene Konzentration an Gastsubstanz in Lösung wird gegen die Cyclodextrin-Konzentration im Diagramm aufgetragen.

Die Löslichkeit von schwach wasserlöslichen Gastmolekülen erhöht sich unter steigender CD-Konzentration. Wenn sich eine lineare Korrelation ergibt (Komplex konstanter Zusammensetzung), wird die Isotherme als AL-Typ bezeichnet. Abweichungen von der Linearität bei höheren CD-Zugaben können Isotherme vom AP- und AN-Typ ergeben. Im Falle des AP-Typs steigt die Löslichkeit der Gastkomponente überproportional zur CD-Konzentration an; der umgekehrte Fall wird als AN-Typ beschrieben. Hierbei sind die Stöcheometrien nicht konstant [ siehe ].

Erreicht ein linearer Anstieg der Isotherme ein Maximum, d.h. es wird mit steigender CD-Konzentration keine weitere Löslichkeitsverbesserung der Gastkomponente erreicht, so ist das Löslichkeitsprodukt des Komplexes überschritten und der Komplex fällt aus. Dieses Profil wird als BS-Typ bezeichnet.

Die Existenz eines Komplexes in wässeriger Lösung garantiert nicht die Bildung desselben in kristallinem Zustand. Deshalb muß nach Abtrennung einer festen Komponente die Bildung eines Kavitats erneut bestimmt werden.

Die Tendenz einer Substanz, einen Einschluß in Lösung zu bilden, wird durch die Komplexstabilitätskonstante beschrieben. Sie wird über die Steigung alpha der Geraden des Phasenlöslichkeitsdiagramms mit siehe berechnet [ siehe ].

Gleichung 1

K: Komplexstabilitätskonstante

So: Sättigungskonzentration in Abwesenheit von CD


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Die Berechnung der Konstanten anhand des Phasenlöslichkeitsdiagramms wird in der Literatur teilweise kritisch diskutiert. Szejtli [Fehler! Textmarke nicht definiert.] beschreibt die Stabilitätskonstante als virtuell, mit der Maßgabe, keine direkten Schlüsse auf die wahre Stabilität eines Komplexes ziehen zu können. Auch sollte berücksichtigt werden, daß alkylierte Cyclodextrine, wie Dimeb, oberflächenaktive Eigenschaften besitzen und damit eine verbesserte Benetzbarkeit der Gastkomponente in wässeriger Lösung erreicht wird. Ein weiteres Problem bei substituierten Cyclodextrin-Derivaten ist die Tatsache, daß mit einer durchschnittlichen Molekülmasse gerechnet werden muß. Das Komplexierungsvermögen einzelner Komponenten ist möglicherweise unterschiedlich.

Weiterhin muß einkalkuliert werden, daß Cyclodextrine Wechselwirkungen mit der Außenseite ihres Torus verursachen. Dies hat zur Folge, daß teilweise unterschiedliche stöchiometrische Verhältnisse mit einer Gastkomponente und Cyclodextrinen eines Torusdurchmessers errechnet werden.

Röntgendiffraktometrie

Die Anwendung der Röntgendiffraktometrie zum Nachweis eines Kavitats im festen Zustand beruht auf der Ausbildung einer neuen Kristallstruktur, bedingt durch die Einschlußverbindung. Schon vor 20 Jahren sind Studien mittels dieser Technik publiziert worden [ siehe ]. Damals wurde eine Serie von Arzneistoff-CD-Komplexen mittels Röntgendiffraktometrie studiert. Voraussetzung ist jeweils das Vorliegen einer kristallinen Struktur des entstandenen Assoziats. Die meisten Kavitate mit Derivaten des nativen beta-Cyclodextrin weisen jedoch amorphe Strukturen auf. Der Einsatz der Röntgendiffraktometrie kann in diesem Fall nur als zusätzlicher Hinweis einer möglichen Einschlußverbindung dienen, nämlich wenn kristalliner Arzneistoff durch molekulare Verkapselung in eine röntgenamorphe Struktur überführt wird.

In der Literatur wird eine Reihe weiterer Methoden der Charakterisierung von Kavitaten beschrieben. Insbesondere spektroskopische Analysemethoden, wie z.B. Infrarot-Spektroskopie [ siehe , siehe ], Raman-Spektroskopie [ siehe , siehe ] und Massenspektroskopie [ siehe ] werden heute zur Interpretation von Inklusionen in der Cyclodextrin-Forschung herangezogen. Inzwischen werden zur Untersuchung von CD-Komplexen außerdem Scanning Electron Microscopy (SEM) und Fourier Transformation Infrared (FT-IR) Spectroscopy herangezogen [ siehe , siehe ].


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2.2. Liberation von Steroiden aus halbfesten Arzneiformen

2.2.1. In-vitro-Liberation

Die Freisetzung von Wirkstoffen aus topischen Zubereitungen innerhalb eines bestimmten Zeitraums ist ein wichtiger Parameter zur Beurteilung der Qualität einer Formulierung. Abweichungen im Liberationsverhalten lassen Rückschlüsse auf die Qualität der Ausgangsstoffe, auf Veränderungen oder Fehler im Herstellungsprozeß und nicht zuletzt auf die geeignete Wahl von Hilfsstoffen zu [ siehe ]. Da jede Zubereitung eine eigene Freisetzungscharakteristik hat, lassen In-vitro-Liberationsstudien auf den Zustand und die Eigenschaften der Arzneiform schließen. Voraussetzung ist, daß die Liberationsgeschwindigkeit ausschließlich durch die Zubereitung determiniert wird, d.h. apparative Parameter die Meßergebnisse nicht signifikant beeinflussen. Zu ihnen gehören folgende Parameter:

Werden die Einflüsse dieser Faktoren minimiert, so ist eine bestmögliche Differenzierung verschiedener Zubereitungen zu erreichen. Die synthetische Membran ist aus kinetischen Gründen das Kernstück einer Apparatur, sie dient ausschließlich zur Trennung von Donator und Akzeptor und soll nicht die Haut simulieren.

Das Barrierepotential von porösen Membranen wird von der Möglichkeit der Moleküle, in Abhängigkeit von ihrer Größe, Form und elektrostatischen Interaktionen durch die Poren zu diffundieren, bestimmt. Porenmembranen können aus Cellulose oder Cellulose-Derivaten, wie Celluloseacetat und Cellulosenitrat, bestehen. Weiterhin gelangen Membranen auf Basis von synthetischen Polymeren, wie z.B. Polycarbonat oder Polyester, zum Einsatz. Im allgemeinen eignen sich solche Membranen aufgrund ihrer geringen Barriereeigenschaften für In-vitro-Freisetzungsuntersuchungen von Arzneistoffen aus halbfesten Zubereitungen. Dabei bleibt die transdermale Kinetik unberücksichtigt.


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Bei nicht-porösen Membranen hängen die Barriereeigenschaften von der Löslichkeit der diffundierenden Moleküle in der Membran (Polymermatrix) ab. Diese stellen oft aufgrund hoher Barriereeigenschaften einen für die Freisetzung limitierenden Faktor dar und erhöhen somit die lag-time. Solche Diffusionsmembranen werden auch zur Simulation von biologischer Membranen (z.B. Humanhaut) eingesetzt [ siehe ]. In diesem Fall werden In-vitro- und In-vivo-Daten korreliert. Unter Umständen ist der Einsatz von Diffusionsmembranen bei In-vitro-Freisetzungsuntersuchungen notwendig. Dieses ist dann der Fall, wenn mit Porenmembranen keine ausreichende Trennung zwischen Donator und Akzeptor erreicht wird. Zum Beispiel können Silikonmatrices (Silastic®) als Membranen zur Untersuchung von ausgesprochen hydrophilen Zubereitungen dienen. Der Einsatz von Porenmembranen führt in solchen Fällen oft zu unerwünschten hydrodynamischen Effekten.

Es ist also unter Umständen möglich, In-vivo-Permeation mittels eines spezifischen In-vitro-Diffusionszellsystems mit Einschränkungen zu simulieren. In der Literatur finden sich zahlreiche Studien zur Bewertung von perkutaner Resorption von Arzneistoffen mit Hilfe von In-vitro-Methoden und synthetischen Membranen [ siehe , siehe ].

Im Gegensatz zur Haut sollen synthetische Membranen für In-vitro-Freisetzungsuntersuchungen einen möglichst niedrigen Diffusionswiderstand aufweisen. Beim Einsatz von Membranen sind die folgenden Eigenschaften von entscheidender Bedeutung [ siehe ]:

2.2.2. Diffusionskinetik

Die Freisetzung eines Arzneistoffs aus Suppositorien- und Salbengrundlagen wird grundsätzlich von verschiedenen Faktoren beeinflußt, z.B.:


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Die Liberationscharakteristik eines Wirkstoffs und sein Konzentrationsprofil in der Grundlage hängen insbesondere davon ab, ob er im Vehikel suspendiert, teilweise gelöst oder vollständig gelöst vorliegt. Je nach Löslichkeit des Arzneistoffs läßt sich bei Anwendung des 2. Fickschen Gesetzes die Wirkstofffreigabe nach Higuchi [ siehe , siehe ] in vereinfachten Beziehungen aufstellen. Die folgenden Betrachtungen sollen nur für Einphasensysteme gelten.

Im Falle einer vollständigen Lösung des Arzneistoffs in der Zubereitung, matrixkontrollierter Freisetzung und ausreichend dicker Vehikelschicht (Ct/F<30-50%) gilt siehe [ siehe ].

Gleichung 3

Ct : Konzentration zum Zeitpunkt t

F : Membranfläche

D : Diffusionskoeffizient im Vehikel

A : Ausgangskonzentration

t : Zeit

Die Gültigkeit von siehe ist an folgende Vorraussetzungen geknüpft [ siehe ]:


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Liegt der Arzneistoff ungelöst im Vehikel vor, so gilt siehe . Sie ist eine näherungsweise mathematische Beschreibung der Liberationskinetik eines Arzneistoffs in einem In-vitro-Modell als matrixkontrollierte Diffusion aus Suspensionssalben. Diese wird ebenfalls in vereinfachter Form dargestellt in der Annahme, daß im Normalfall in einer Suspension die Konzentration der Wirkstoffpartikeln wesentlich größer ist als deren Sättigungslöslichkeit. Weiterhin unterliegt das Quadratwurzelgesetz folgenden Bedingungen [ siehe , siehe ]:

Gleichung 4

Ct : Konzentration zum Zeitpunkt t

F : Membranfläche

D : Diffusionskoeffizient im Vehikel

CS : Sättigungskonzentration

A : Ausgangskonzentration

t : Zeit

Der Liberationsprozeß weist drei Phasen auf:

  1. Diffusionsfluß überwiegend membrankontrolliert
  2. Diffusionsfluß annähernd gleichermaßen membran- und matrixkontrolliert
  3. Diffusionsfluß überwiegend matrixkontrolliert (m/t1/2-Linearität)

Nach Ablauf einer unterschiedlich langen Anfangsphase wird die Liberation quasistationär, d. h., daß die freigesetzte Arzneistoffmenge der Wurzel aus der Zeit proportional ist. Nur bei Auswertungen in der matrixkontrollierten Phase werden zubereitungsspezifische Werte erhalten. Die Auswertung erfolgt durch lineare Regression des linearen Teils der Liberationskurve [ siehe ].


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Ein Vorteil der Higuchi-Gleichung ist ihre Einfachheit; ihr Nachteil ist, daß die Einhaltung der Voraussetzungen und Limitierungen zum Teil nur schwer kontrolliert werden kann.

2.2.3. Verteilungskoeffizient Vehikel / Akzeptormedium

Der Verteilungskoeffizient VK eines Arzneistoffs ist für die Verteilung zwischen einem Vehikel und dem Akzeptormedium definiert als [ siehe ]:

Gleichung 6

CA =Löslichkeit des Arzneistoffs im Akzeptormedium

CV = Löslichkeit des Arzneistoffs im Vehikel

f V = verfügbare Fraktionen an Substanz im Vehikel (dissoziiert)

f A = verfügbare Fraktionen an Substanz im Akzeptor (dissoziiert)

Jede Veränderung von CA oder CV bedingt eine Änderung des Verteilungskoeffizienten. Ein niedriger VK-Wert korrespondiert mit einem hohen Grad an Interaktion mit dem Vehikel und der Tendenz der Substanz, im Vehikel zu verbleiben. Auf der anderen Seite zeigt ein hoher VK-Wert eine verminderte Affinität und eine höhere Freisetzungsrate aus dem Vehikel.

Hinsichtlich des Vehikeleinflusses sind zwei völlig verschiedene Fälle zu betrachten, nämlich Suspensionen und Lösungen. Die Vorhersagen der Verteilung des Arzneistoffs, die sich auf die Löslichkeit eines Arzneistoffs in einer Grundlage beziehen und für die Diffusion eine große Rolle spielen, sind nur für Lösungssalben relevant. Hier stellt sich unter der Annahme keiner Anreicherung von diffundierbarem Arzneistoff in der Membran ein quasistationärer Zustand ein und damit ein exponentieller Konzentrationsabfall im Vehikel. Im Falle von Suspensionssystemen spielt der Verteilungskoeffizient unter der Voraussetzung, daß die Sättigungskonzentration des Arzneistoffs im Vehikel aufrecht erhalten bleibt bzw. sich der Wirkstoff rasch nachlöst, eine untergeordnete Bedeutung [ siehe , siehe ].


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2.2.4. Versuchsdurchführung

Zur Ermittlung der optimalen Parameter für Freisetzungsuntersuchungen aus halbfesten Zubereitungen wurden am Beispiel der Advantan®-Fettsalbe mit dem Corticosteroid MPA vier synthetische Membranen, imprägniert mit verschiedenen Agenzien, getestet. Zwei Akzeptormedien gelangten zum Einsatz. Weiterhin wurde die Freisetzung von MPA aus Advantan®-Salbe und -Creme bestimmt und mit Ergebnissen der Permeation des MPA durch haarlose, intakte und gestrippte Maushaut verglichen.

Als In-vitro-Liberationsapparatur diente das Diffusionszellsystem nach Franz [ siehe ] in einer Konsole mit Rührvorrichtungen (Apparatur 1, siehe , 4.2 siehe ). Die temperierte Akzeptorphase wurde blasenfrei in das Zellkompartiment eingefüllt und mit Hilfe eines Rührmagneten durchmischt. Das zu prüfende Dermatikum wurde in die offene Donatorvorrichtung der Zelle gebracht, indem die Prüfsubstanz auf die zuvor getränkte Membran mittels Einmalspritze oder Schablone appliziert wurde. Die Probenentnahmen von jeweils 1 ml erfolgten über den Gesamtzeitraum von sechs Stunden nach 30, 60, 120, 180, 240, (300) und 360 Minuten. Das Akzeptorkompartiment wurde nach jeder Probennahme mit der jeweils aliquoten Menge des Akzeptormediums aufgefüllt.

Die quantitative Erfassung des liberierten Arzneistoffs erfolgte mittels RP-HPLC. Durch Flächenvergleich nach der Methode des externen Standards wurden die Konzentrationen von freigesetztem Arzneistoff [µg/ml] berechnet. Nach Ablauf einer Anfangsphase (lag-time) wird die Liberation "quasistationär", d. h., die freigesetzte Menge an Arzneistoff ist der Wurzel aus der Zeit proportional. Nur für diese matrixkontrollierte Phase wurden zubereitungsspezifische Werte berechnet.

Vier handelsübliche synthetische Membranen auf Basis von Celluloseacetat, Polyester, Polycarbonat sowie regenerierter Cellulose wurden für die Untersuchungen herangezogen. Die Charakteristika der Membranen sind in siehe angegeben.

Isopropylmyristat (IPM), 5%ige Lösung von Polyvinylpyrrolidon (Kollidon® 12 PF) bzw. Phosphatpuffer (0,066 M, pH 5,0) dienten, jeweils im Verhältnis 1:1 (V/V) mit Methanol bzw. 1:1 (V/V) mit Propylenglycol, als Imprägnierungsflüssigkeit bzw. Akzeptormedium. Die Akzeptormedien gewährleisteten “sink-Bedingungen"<1>. Der pH Wert von 5,0 stellt für MPA ein Stabilitätsoptimum dar. Die Gehaltsbestimmung von MPA im Akzeptormedium erfolgte mittels HPLC ( siehe 4.3.10).


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Für die Markierungsversuche gelangte ein BSA-Puffer (pH 7,4) zur Untersuchung, bestehend aus 0,041 M Dinatriumhydrogenphosphat, 0,026 M Kaliumdihydrogenphosphat, 0,154 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumazid und 0,1% (m/V) Rinderserumalbumin. Die Gehaltsbestimmung von 3H-MPA wurde mit einem beta-Szintillator durchgeführt ( siehe 4.3.8).

Tabelle 3: Charakteristika der Membranen

Membran

Poren _ [µm[

Membrandicke [µm]

Polyester, Nucleopore® (Costar, Tübingen)

5,0

10

Celluloseacetat (Sartorius, Göttingen)

0,2

150

Polycarbonat, Nucleopore® (Costar, Tübingen )

0,03

10

Regenerierte Cellulose, Cuprophan® (AKZO Faser AG, Wuppertal)

0,005

11±0,5

2.2.5. Ergebnisse und Diskussion

2.2.5.1. Membranvarianten

Die Liberationsergebnisse von MPA aus Advantan®-Fettsalbe durch verschiedene Membranen ( siehe ) unter Verwendung von Methanol / Phosphatpuffer sowohl als Akzeptor als auch zur Imprägnierung sind in siehe dargestellt. Die Abbildung zeigt für die Polycarbonat-Membran sehr hohe Startwerte, die durch einen "burst-effect" (Lösungseffekt) erklärt werden können [ siehe ]. Dieser Effekt tritt auf, wenn die Lösungsgeschwindigkeit des Arzneistoffs in einer Membran(-imprägnierung) höher ist als die Diffusionsgeschwindigkeit in der Formulierung. In diesem Fall reichert sich der Arzneistoff zunächst sehr schnell in der Membran an und gelangt schnell in den Akzeptor. Wie am Freisetzungsprofil zu erkennen, führt dieser Effekt, bedingt durch die hohe Initialfreisetzung, zu den höchsten Freisetzungsraten. Die Polyester-, Celluloseacetat- und Cuprophan-Membranen zeigen anfänglich deutlich niedrigere Freisetzungsraten. Die Cuprophan-Membran stellt, verglichen mit der Polyester-und Celluloseacetat-Membran, die schwächste Diffusionsbarriere dar und verursacht keinen "burst-effect". Für sie berechnet sich die höchste Freisetzungsrate (p=0,05, entsprechend t-Test innerhalb der Freisetzungsprofile, siehe ).


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Abb. 9: In-vitro-Freisetzung von Methylprednisolonaceponat (MPA) aus Advantan®-Fettsalbe durch verschiedene Membranen unter Verwendung von Methanol / Phosphatpuffer sowohl als Akzeptormedium als auch zur Imprägnierung, n=3, R2>0,99

Tabelle 4: Freisetzungsraten von MPA durch synthetische Membranen in Abhängigkeit von Imprägnierung und Akzeptormedium

Membran

Imprägnierung

Akzeptormedium

Freisetzungsrate [µg/ml/min*10-3]

Polycarbonat MeOH / PhP MeOH / PhP

40,3 ± 8,9

Polycarbonat

PVP

MeOH / PhP

34,8 ± 8,4

Cuprophan

PG / PhP

PG / PhP

22,0 ± 7,8

Polyester

MeOH / PhP

MeOH / PhP

22,0 ± 4,9

Celluloseacetat

MeOH / PhP

MeOH / PhP

16,6 ± 1,8

Cuprophan

MeOH / PhP

MeOH / PhP

42,8 ± 6,6

ohne Membran

-

MeOH / PhP

36,9 ± 5,8

PVP Polyvinylpyrrolidon PG Propylenglycol

PhP Phosphatpuffer MeOH Methanol


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Die Liberation von MPA aus Advantan®-Fettsalbe durch die Cuprophan-Membran und die Polycarbonat-Membran unter Nutzung verschiedener Imprägnierungen und von zwei Akzeptormedien gibt siehe wieder. Die ermittelten Freisetzungsraten sind in siehe enthalten.

Abb. 10: In-vitro-Freisetzung von Methylprednisolonaceponat (MPA) aus Advantan®-Fettsalbe. Imprägnierung: mit Klammern, Akzeptor-medium: ohne Klammern. (PVP): 5%ige Lsg. Polyvinylpyrrolidon, (PhP/PG): Phosphatpuffer / Propylenglycol, (MeOH/PhP): Methanol/ Phosphatpuffer

Die mit den hydrophilen Flüssigkeiten 5%ige PVP-Lösung bzw. Propylen-glycol / Phosphatpuffer imprägnierten Polycarbonat- bzw. Cuprophan-Membranen zeigen eine ähnliche membrankontrollierte Freisetzung für das Steroid wie die mit Methanol / Phosphatpuffer imprägnierte Cuprophan-Membran. Allerdings führen eine schlechtere Benetzbarkeit der Polycarbonat-Membranen nach PVP-Imprägnierung und die daraus resultierenden Probleme bei der Applikation der zu prüfenden Dermatika zu größeren Streuungen der Meßwerte. Auch die mit Propylenglycol / Phosphatpuffer imprägnierte Cuprophan-Membran besitzt ungünstigere Eigenschaften beim "handling" in bezug auf das Glätten der Membran und die Haftung der Vehikel gegenüber der mit Methanol / Phosphatpuffer imprägnierten Cuprophan-Membran.


41

siehe gibt die Liberation von MPA aus Advantan-Fettsalbe durch die Cuprophan- und Polycarbonat-Membran nach Imprägnierung mit IPM, durch die mit Methanol / Phosphatpuffer imprägnierte Cuprophan-Membran sowie die Liberation ohne Membran wieder.

Abb. 11: In-vitro-Freisetzung von Methylprednisolonaceponat (MPA) aus Advantan-Fettsalbe durch die Polycarbonat -und Cuprophan-Membran sowie ohne Membran, (Imprägnierung in Klammern, Akzeptormedium ohne Klammern), Isopropylmyristat (IPM), Methanol/Phosphatpuffer (MeOH/PhP)

Die besseren Lösungseigenschaften für Steroide in IPM führen zu einem ausgeprägten "burst-effect", der die Differenzierung der Freisetzungsdaten verschiedener Zubereitungen schwer erlaubt. Beide Membranen zeigen, mit IPM getränkt, identische Freisetzungsprofile (P=0,05); sie unterliegen keiner matrixkontrollierten Freisetzung. Bemerkenswerterweise hat das Office of Generic Drugs (Department der FDA) IPM als geeignete Imprägnierung für Celluloseacetat oder -nitrat-Membranen zur Beschleunigung der Freisetzung von Corticosteroiden aus Salbengrundlagen vorgeschlagen [ siehe ].

Die Liberation ohne Membran zeigt gleiches Freisetzungsverhalten wie die mit Methanol / Phosphatpuffer imprägnierte Cuprophan-Membran (P<0,05). Die Untersuchungen ohne Membran waren mit Advantan-Fettsalbe aufgrund einer homogenen glatten Grenzfläche zwischen Donator und Akzeptor möglich.


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Die Cuprophan-Membran, hydrophil getränkt mit Methanol / Phosphatpuffer, erfüllt die Maßgabe einer matrixkontrollierten Freisetzung, besitzt hinreichende Lösungseigenschaften für die gewählte Modellsubstanz MPA und zeigt keinen nennenswerten Einfluß auf deren Liberation. Sie ist somit geeignet für In-vitro-Liberationsuntersuchungen an entsprechenden dermalen Topika und wurde im folgenden für die Untersuchungen an verschiedenen Vehikeln der Advantan-Reihe ausgewählt. Die Cuprophan-Membran wird auch in der USP XXIII [ siehe ] als synthetische Membran für transdermale Freisetzungssysteme vorgeschlagen.

2.2.5.2. Vehikelvarianten

Die Freisetzungsprofile von MPA aus Advantan-Fettsalbe, -Salbe und -Creme im etablierten In-vitro-Liberationsmodell (vgl. Abschnitt 4.2 siehe ) unter den optimierten Bedingungen zeigt siehe .

Abb. 12: In-vitro-Freisetzungsprofile von MPA aus Advantan-Fettsalbe, -Salbe, und -Creme durch die Cuprophan-Membran unter Verwendung von Methanol / Phosphatpuffer sowohl als Akzeptormedium als auch zur Imprägnierung, n=6, P=0,05, R2>0,99


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Die Freisetzungsrate nimmt in der Reihenfolge Creme > Salbe > Fettsalbe deutlich ab ( siehe ).

Tabelle 5: Freisetzungsraten von MPA durch die Cuprophan-Membran, imprägniert mit Methanol / Phosphatpuffer (1:1, V/V) aus Advantan-Fettsalbe, -Salbe, und -Creme

Vehikel

Freisetzungsrate [µg/ml/min*10-3]

Fettsalbe

42,8 ± 6,6

Salbe

154,0 ± 10,9

Creme

341,1 ± 24,3

Die Freisetzungscharakteristik des Wirkstoffs hängt u.a. von seinem Konzentrationsprofil und der Löslichkeit des Wirkstoffs im Vehikel ab. Während MPA in der Creme-Zubereitung hauptsächlich in Ölsäuredecylester (Cetiol V) gelöst ist, liegt das Steroid in Kohlenwasserstoffgrundlagen (Advantan-Fettsalbe, -Salbe) fast vollständig suspendiert vor. In der Salben-Zubereitung ist möglicherweise ein kleiner Anteil MPA im Emulgator (Dehymuls® E) gelöst.

Unter bestimmten Voraussetzungen können ungelöste Wirkstoffanteile den limitierenden Faktor für die Freigabe des Wirkstoffs darstellen. Während vollständig gelöster Wirkstoff primär diffusionskontrolliert freigesetzt wird, können im Falle suspendierten Wirkstoffs vorgeschaltete Lösungsvorgänge die Freigabe des Wirkstoffs in Salben verlangsamen [ siehe ].

Wesentlich für die Beeinflussung der Freisetzung ist ferner die Viskosität des Vehikels (Diffusionswege). Die Viskosität der Advantan-Vehikel nimmt in der Reihenfolge Creme < Salbe < Fettsalbe, entsprechend den abnehmenden Freisetzungsraten, zu ( siehe ).

Die rheologischen Untersuchungen der drei Dermatika wurden mittels Rotationsviskosimeter (Couette-Prinzip) durchgeführt ( siehe , 4.3.15). Als Berechnungsgrundlage für die erhobenen rheologischen Daten diente das Regressionsmodell nach Ostwald [ siehe ], welches aufgrund der höchsten Korrelationskoeffizienten zwischen verschiedenen Modellen ausgewählt wurde. Fettsalbe und Salbe weisen im gewählten Meßbereich bei zunehmender Schubspannung eine abnehmende scheinbare Viskosität auf und können mit sehr unscharfer Fließgrenze als


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plastische Körper charakterisiert werden. Die Creme zeigt deutliches Fließverhalten erst nach Überschreiten einer minimalen Schubspannung. Bei weiterer Zunahme der Schergeschwindigkeit nimmt allerdings die Schubspannung ab, d.h. die Viskosität nimmt ab. Dieses Fließverhalten ist untypisch für Cassonplastisches und Binghamplastisches Verhalten. Im Hinblick auf den mathematischen Zusammenhang zwischen Schubspannung und Schergeschwindigkeit im Regressionsmodell nach Ostwald ( siehe ) zeigt sich die zunehmende Viskosität in der Reihenfolge Creme < Salbe < Fettsalbe deutlich.

Tabelle 6: Rheologische Daten von Advantan-Fettsalbe, -Salbe und -Creme

Vehikel

Fluiditätsfaktor

Fließexponent

Korrelations koeffizient r

Fettsalbe

302

0,21

0,987

Salbe

94

0,37

0,981

Creme

440

- 0,14

0,826

Gleichung 7 Regressionsmodell nach Ostwald [ siehe , siehe ]

tau = K * Deta

tau: Schubspannung [Pa]

D: Schergeschwindigkeit [s-1]

K: Fluiditätsfaktor

eta: Pseudoplastizitätsfaktor (Fließexponent)

2.2.5.3. In vitro-Permeation durch Maushaut

Die Permeation von 3H-MPA aus Advantan-Fettsalbe, -Salbe und -Lösung durch haarlose intakte Maushaut gibt siehe wieder. Die Permeationsrate nimmt in der Reihenfolge Lösung > Salbe > Fettsalbe ab (P=0,05). In ihrer Rangordnung lassen sich die Freisetzungsprofile der verschiedenen Advantan-Zubereitungen mit den Ergebnissen der In-vitro-Liberationsuntersuchungen vergleichen.


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Obwohl ausschließlich Haut von haarlosen gleichgeschlechtlichen Mäusen gleichen Alters und identischer Provenienz verwendet wurde, ist die Streuung der experimentellen Ergebnisse sehr hoch. Die Variationskoeffizienten der gemessenen Radioaktivität in der Akzeptorphase waren anfänglich am höchsten und lagen nach 6 Stunden noch bei 40 %.

Abb. 13: In-vitro-Freisetzungsprofile (intakte Maushaut) von 3H-Methylprednisolon-aceponat (3H-MPA) aus Advantan-Fettsalbe, -Salbe und Lösung, BSA-Puffer als Akzeptormedium

Die Zeitkurven der Permeation, gemessen als Radioaktivität, durch die gestrippte Maushaut in das Akzeptormedium sind in siehe dargestellt. Sie sind für alle drei Formulierungen nicht differenzierbar (P>0,05). Die starke Streuung der experimentellen Daten läßt keinen Schluß auf einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Freisetzungsraten der drei Formulierungen zu.


46

Abb. 14: In-vitro-Freisetzungsprofile (gestrippte Maushaut) von 3H-Methylprednisolonaceponat (3H-MPA) aus Advantan-Fettsalbe, -Salbe und Lösung, BSA-Puffer als Akzeptormedium

2.2.5.4. Zusammenfassung

Die vorgestellte In-vitro-Liberationsmethode für Dermatika wurde für die Unterscheidung der Freisetzung von Methylprednisolonaceponat (MPA) aus verschiedenen Vehikeln eingesetzt. Aufgrund der guten Reproduzierbarkeit der experimentellen Daten (P<0,05), läßt die Methode Unterschiede im Freisetzungsverhalten von Wirkstoffen sichtbar werden. Sie besitzt Vorteile gegenüber In-vitro-"screening"-Untersuchungen mit haarloser Maushaut, da diese ein hohes Streuungsmaß aufweisen, deshalb einen höheren Stichprobenumfang bedingen und kaum Differenzierungen zulassen [ siehe ].

Für spätere Untersuchungen an noch niedriger dosierten Dermatika soll ein größer dimensioniertes Franz-Diffusionszellsystem eingesetzt werden, um durch ein günstigeres Verhältnis zwischen Membranfläche und Akzeptorvolumen sowie eine verbesserte Proben-Applikationstechnik die Empfindlichkeit der Methode weiter zu erhöhen und damit für geringere Freisetzungsraten zu optimieren. Ziel ist es, diese Methode für diskriminie


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rende Untersuchungen für die Freisetzung von CA-Cyclodextrin-Assoziaten aus Dermatika heranzuziehen.

Vier synthetische Membranen, verschiedene Imprägnierungsmittel sowie Akzeptormedien wurden getestet. Eine Cuprophan-Membran, imprägniert mit dem Akzeptormedium Methanol/Phosphatpuffer {1:1} (pH 5,0), erwies sich als besonders geeignet. Die erzielten Freisetzungsprofile für Advantan-Fettsalbe, -Salbe und -Creme bzw. -Lösung entsprechen in ihrer Rangordnung den in In-vitro-Versuchen an haarloser intakter Maushaut ermittelten Ergebnissen. Die erprobte Methode liefert reproduzierbare Resultate mit geringen Varianzen und eignet sich auch zur Beurteilung der Arzneimittelqualität in der Entwicklung und Optimierung entsprechender kutaner Arzneiformen.


48

2.3. Einschlußverbindungen des Vitamin-D3-Analogon mit beta-Cyclodextrin-Derivaten

2.3.1. Theoretische Betrachtungen zum Vitamin-D3-Analogon / beta-Cyclodextrin-Assoziat

Neben den experimentellen Versuchen wurden mit Hilfe einer Computersimulation am Beispiel des CA / beta-CD-Assoziates theoretische Betrachtungen vorgenommen.

Solche Molecular Modelling-Methoden zur Berechnung und graphischen Darstellung der Moleküle und Moleküleigenschaften kommen zur Anwendung, um einen Einblick in mögliche geometrische Verhältnisse einer Einschlußverbindung zu erhalten. Diese Untersuchungen dienen auch der Abschätzung der räumlichen Kompatibilität des Calcitriol-Analogon-Moleküls mit dem Hohlraum eines beta-CD.

Die Annährung des Gastmoleküls (Ligand) an das beta-CD und damit die molekulare Erkennung stellt einen wichtigen Schritt der Komplexbildung dar. Der Ligand ist bestrebt, sich an attraktive Bindungsstellen des beta-CD anzulagern. Aufgrund der komplexen Struktur des Oligosaccharids und der damit verbundenen Vielzahl von theoretisch möglichen Bindungsstellen ist es nahezu unmöglich, durch willkürliches Positionieren des Liganden zufällig eine sinnvolle Komplexgeometrie zu erhalten.

Eine wertvolle Hilfestellung bei der Ermittlung intermolekularer Wechselwirkung bietet das Softwareprogramm GRID [ siehe ]. GRID ist ein kommerzielles Programm, das zur Berechnung und Visualisierung molekularer Interaktionsfelder entwickelt wurde [ siehe ]. Zur Ermittlung der Wechselwirkungsbereiche wird um das Molekül ein dreidimensionales Gitterraster gelegt. Die Interaktionsfelder werden durch Berechnung der intermolekularen Wechselwirkungsenergie zwischen dem Molekül und einer vordefinierten chemischen Probe an jedem Gitterpunkt des Rasters bestimmt. Attraktive Bindungsstellen zeichnen sich dabei durch negative Energiewerte aus, während abstoßende Wechselwirkungen positive Energiebeträge aufweisen.

Innerhalb des Programms steht dem Benutzer eine Auswahl von ca. 30 Proben zur Verfügung. Diese besitzen genau definierte Eigenschaften und sind durch van-der-


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Waals-Radius, Polarisierbarkeit, Ladung usw. charakterisiert. Die Auswahl der Probe bestimmt die physikochemischen Eigenschaften, die in dem zu untersuchenden Molekül analysiert werden können und richtet sich in der Regel nach den charakteristischen Eigenschaften des potentiellen, komplimentären Bindungspartners. So dient eine Methylprobe zur Lokalisierung hydrophober Regionen, während eine Hydroxylprobe zur Entdeckung möglicher Bindungsstellen für Wasserstoffbrücken verwendet wird.

Die Berechnung der Wechselwirkungsenergien zwischen chemischer Probe und dem Molekül erfolgt an jedem Gitterpunkt mit Hilfe von siehe :

Gleichung 8

Eges = Evdw + Eelec + Ehb

Eges

Gesamtwechselwirkungsenergie

Evdw

van-der-Waals-Wechselwirkungsenergie

Eelec

elektrostatische Wechselwirkungsenergie

Ehb

Wechselwirkungsenergie durch Ausbildung von Wasserstoffbrücken

Der Berechnung der Teilenergiebeträge liegen eine Reihe von Potentialtermen zugrunde, die in der Molecular Modelling-Software implementiert sind. Die berechneten Gesamt-Wechselwirkungsenergien können anschließend auf bestimmten Energieniveaus kontuiert werden. Durch Verbindung von Gitterpunkten gleicher Energie erhält man dreidimensionale GRID-Felder, die zusammen mit dem Molekül auf Graphikbildschirmen visualisiert und analysiert werden können. Die Auswertung dieser Felder liefert eine detaillierte Beschreibung attraktiver Raumsegmente für die Probe und das Molekül. Die Zuverlässigkeit des Programms zur Ermittlung energetisch günstiger Wechselwirkungsbereiche in Molekülen konnte in zahlreichen Arbeiten gezeigt werden [ siehe , siehe , siehe ].

Zur Untersuchung von realistischen Wechselwirkungen innerhalb des Komplexes von Molekülen benötigt man möglichst genaue Angaben über die räumliche Geometrie der einzelnen Moleküle. Energetisch günstige Konformationen der Kristallstrukturen konnten aus einer Datenbank herausgesucht werden (Cambridge Structural Database). Im Falle des CA wurde die Struktur des Vitamin D3 zugrunde gelegt. Anschließend wurde das CA gebildet (Seitenkette verändert) und erneut einer Konformationsanalyse unterzogen.


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Zur Berechnung der GRID-Interaktionsfelder des CA / beta-CD-Assoziates wurden für das beta-CD eine aliphatische Hydroxyl- und Methylprobe sowie eine Ethersauerstoffprobe ausgewählt, um günstige Wechselwirkungsbereiche für die funktionellen Gruppen des CA zu ermitteln. Umgekehrt wurden die Felder des CA mit den Proben berechnet. Damit war es möglich, Wechselwirkungsbereiche sowohl für van-der-Waals-Wechselwirkungen als auch für potentielle Wasserstoffbrücken zu bestimmen und zu lokalisieren.

siehe , siehe und siehe zeigen die ermittelten GRID-Felder für das CA und das native beta-CD in ausgewählten energetisch günstigen Konformationen.

Die GRID-Berechnungen der Ethersauerstoffprobe und der Hydroxylprobe in siehe zeigen die Möglichkeit des CA, mit Arealen für potentielle Wasserstoffbrückenbindungen des beta-CD Wechselwirkungen einzugehen. Erwartungsgemäß sind die dargestellten Wechselwirkungsbereiche in den Regionen vorhandener Hydroxyl-Gruppen (A-Ring) sowie in der Seitenkette (Esterstruktur) besonders ausgeprägt ( siehe 2.1.2 siehe ). In Abhängigkeit sterischer Hinderung weisen die Wechselwirkungen unterschiedlich große Ausdehnungen auf. Die Berechnungen mit der Methylprobe, dargestellt in siehe , zeigen mögliche Positionen, mit hydrophoben Bindungsarealen des beta-CD in Wechselwirkung zu treten. Je nach Raumposition stellen sich die GRID-Felder der möglichen, besonders günstigen van-der-Waals-Wechselwirkungen unterschiedlich groß dar.

Abb. 15: Calcitriol-Analogon: GRID-Interaktionsfelder unter Verwendung einer aliphatischen Hydroxylprobe (dunkel gezeichnet) und einer Ethersauerstoffprobe (hell gezeichnet)


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Abb. 16: Calcitriol-Analogon: GRID-Interaktionsfelder unter Verwendung einer Methylprobe (hell)

Abb. 17: beta-CD: GRID-Interaktionsfelder unter Verwendung einer aliphatischen Hydroxylprobe (dunkel gezeichnet) und einer Methylprobe (hell gezeichnet)


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siehe verdeutlicht die GRID-Interaktionsfelder für eine ausgewählte Konformation des beta-CD unter Verwendung einer aliphatischen Hydroxylprobe wie sie im CA-Molekül vorkommt. Ebenfalls werden Interaktionen mit einer Methylprobe berechnet. Maximale Wechselwirkungsenergien zeigen sich im Hohlraum des beta-CD. Hier sind starke van-der-Waals-Wechselwirkungen mit hydrophoben Strukturen des Gastmoleküls zu postulieren. Die dunkler gezeichneten Interaktionsfelder zeigen Bereiche für einen potentiellen Wasserstoffbrückendonator. Obwohl im beta-CD-Molekül eine Vielzahl an Ethersauerstoffatomen prinzipiell als Akzeptor für Wasserstoffbrücken fungieren kann, sind sie in dieser Konformation nicht alle gleichermaßen in der Lage, eine optimale Wechselwirkung einzugehen. Die Auffindung dieser räumlich getrennten Areale ist mit Hilfe der GRID-Berechnungen möglich. Es läßt sich in den drei Abbildungen gut erkennen, daß komplementäre Wechselwirkungen innerhalb eines Assoziats zwischen dem CA und dem beta-CD-Molekül eingegangen werden können.

Die Ergebnisse dieser theoretischen Betrachtungen lassen auf die Möglichkeit einer echten Einschlußverbindung schließen. Vorstellbar sind einerseits Einschlüsse der Partialstruktur des A-Ringes des CA-Moleküls in den Hohlraum eines beta-CD-Moleküls. Andererseits ist ein Einschluß der Esterseitenkette des Secosteroids ebenso plausibel. Diesen Betrachtungen zufolge müßte die Bildung eines 2:1-Komplexes möglich sein. Die Bildung von 2:1-Komplexen von Vitamin D3 und beta-CD wurde von Szejtli et al. [ siehe ] mit 13C-NMR Spektren bereits postuliert.

2.3.2. Untersuchungen

Sechs wasserlösliche beta-Cyclodextrin-Typen ( siehe ) gelangten als Komplexbildner für das CA in die Untersuchungen. Die Herstellung möglicher Kavitate erfolgte nach verschiedenen Verfahren ( siehe , 4.3.3):


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Die Charakterisierung der Reaktionsprodukte erfolgte mit Hilfe verschiedener physiko-chemischer Verfahren: Der Erfolg des Einschlusses wurde mittels Differential Scanning Calorimetry (DSC) beurteilt. Am Beispiel des beta-CD erfolgten zur Veranschaulichung thermischer Effekte thermomikroskopische Aufnahmen von der physikalischen Mischung und dem Kavitat. Durch Aufnahme von Phasenlöslichkeitsdiagrammen und anschließender Berechnung der Komplexstabilitätskonstanten wurden die sechs CD-Systeme in Lösung charakterisiert. Des weiteren dienten 1H-NMR-Untersuchungen an den Systemen CA / beta-CD und CA / Dimeb zur eventuellen Strukturaufklärung.

Die CA-Gehaltsbestimmung in den festen Kavitaten erfolgte hochdruckflüssigkeitschromatographisch.

2.3.3. Ergebnisse und Diskussion

2.3.3.1. Herstellung der Kavitate

Die Auswahl des Herstellungsverfahrens ist von den Lösungseigenschaften beider Komponenten abhängig. Soll ein fester CD-Einschluß mit der Kopräzipitationsmethode hergestellt werden, darf die Einschlußverbindung nur begrenzt in Wasser löslich sein. Wenn die Löslichkeit der Gastkomponente in Wasser zu gering ist, werden heißes Wasser oder Alkohol/Wasser-Mischungen verwendet. CD-Einschlußverbindungen mit hoher Wasserlöslichkeit können mit der Knetmethode, Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung hergestellt werden. Während ein CA / beta-CD-Einschluß nach der Kopräzipitationsmethode hergestellt werden kann, müssen die höher wasserlöslichen Derivate dagegen nach anderen Verfahren hergestellt werden.

Die Herstellung des Einschlüsse vom CA mit nativem beta-CD erfolgte mittels Kopräzipitation. Für die Herstellung von Einschlüssen mit beta-Cyclodextrin-Derivaten gelangten die Lyophilisation und die Knetmethode zum Einsatz ( siehe 4.3.3). Da gefriergetrocknete CA amorphen Charakter aufweist, werden die DSC-Untersuchungen nur an Knetprodukten durchgeführt.


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2.3.3.2. Charakterisierung der Calcitriol-Analogon / beta-Cyclodextrin-Assoziate

2.3.3.2.1. Phasenlöslichkeitsdiagramme

Das Phasenlöslichkeitsdiagramm dient als Methode zur Interpretation einer Einschlußbildung in wässeriger Lösung. Es gibt Auskunft über die Löslichkeit des Wirkstoff / Cyclodextrin-Assoziats und erlaubt die Berechnung einer scheinbaren Komplexstabilitätskonstanten ( Charakterisierung von Kaviaten , 2.1.3.4). Die Durchführung der Phasenlöslichkeitsuntersuchungen erfolgte analog der Beschreibung im Experimentellen Teil ( Phasenlöslichkeitsuntersuchungen , 4.3.13).

beta-Cyclodextrin (beta-CD)

Das Ergebnis der Untersuchung der Phasenlöslichkeit des CA / beta-CD-Systems ( siehe ) zeigt nach der Einteilung von Higuchi und Conners [ siehe ] einen BS-Kurven-Typ. Es läßt sich am Kurvenmaximum die Sättigungskonzentration des Kavitats in Wasser ablesen. Im Bereich des abfallenden Astes errechnet sich ein Konzentrationsverhältnis CA / beta-CD von ca. 1:200. Die Herstellung eines CA / beta-CD-Kavitats mittels Kopräzipitation ist somit in rein wässeriger Lösung aufgrund der geringen Löslichkeit von CA ungeeignet. Durch Einsatz einer wässerig-alkoholischen Mischung als Lösungsmittel läßt sich aufgrund der besseren Löslichkeit des CA die Ausbeute an Komplex deutlich erhöhen ( siehe , 4.3.3 siehe ).

Abb. 18: Phasenlöslichkeitsdiagramm des Calcitriol-Analogon in wässeriger beta-CD-Lösung (pH=6,5) bei 25°C


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1.8-Dimethyl-beta-cyclodextrin (Dimeb)

Infolge der gegenüber nativem beta-CD wesentlich besseren lösungsvermittelnden Eigenschaften von Dimeb ergeben sich mit Arzneistoffen in den meisten Fällen Löslichkeitsisothermen vom AL-Typ [ siehe ]. Diese Kurvenform charakterisiert das Phasenlöslichkeitsdiagramm vom CA und Dimeb ( siehe ).

Abb. 19: Phasenlöslichkeitsdiagramm des Calcitriol-Analogon in wässeriger Dimeb-Lösung (pH=6,5) bei 25°C

Es kommt zu einer linearen Erhöhung der Löslichkeit der Gastkomponente in Abhängigkeit von der Dimeb-Konzentration, ohne Ausfällung des Komplexes aus der wässerigen Lösung. Derartige lineare Lösungsisothermen bilden sich bei Konstanz der Stöchiometrie (2:1) des Kavitats über den gesamten Konzentrationsbereich. Feste Kavitate werden in diesem Fall deshalb oft mit der Knetmethode [ siehe ] aus organisch-wässerigen Systemen [ siehe ], durch Erwärmen der Lösung oder durch Entfernen des Lösungsmittels gewonnen [ siehe ].


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Maltosyl-beta-cyclodextrin (G2-beta-CD)

siehe veranschaulicht den Kurvenverlauf als AL-Typ im untersuchten Bereich bis 5 % G2-beta-CD-Zusatz.

Abb. 20: Phasenlöslichkeitsdiagramm des Calcitriol-Analogon in wässeriger G2-beta-CD-Lösung (pH=6,5) bei 25°C

Vitamin D2 und D3 zeigen mit G2-beta-CD [ siehe ] in Phasenlöslichkeitsuntersuchungen eine BS-Typ-Löslichkeitskurve, allerdings erst im hochkonzentrierten Bereich des G2- beta-CD (15%). Es ist nicht auszuschließen, daß das CA ein ähnliches Verhalten in hohen G2-beta-CD Konzentrationen aufweist, was in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht wurde.

beta-Cyclodextrin-Polymer (beta-CD-Polymer)

Im untersuchten Konzentrationsbereich bis 6 % besteht ein linearer Zusammenhang zwischen der Konzentration des Gastmoleküls und des beta-CD-Polymers ( siehe ). Die Löslichkeitsisotherme läßt sich als AL-Typ beschreiben.

2.3.3.2.2. Berechnung der Komplexstabilitätskonstanten

Die Berechnung der Komplexstabilitätskonstanten ( siehe ) erfolgte aus den Phasenlöslichkeitsdiagrammen mittels linearer Regression ( siehe , 5). Für das System CA / beta-CD wurde der ansteigende Ast für die Berechnung herangezogen. Im Falle von beta-CD-Polymer wurde von einem mittleren Molekülmasse von 4350 g/mol


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ausgegangen. Die so erhaltenen Ergebnisse und Bestimmtheitsmaße sind siehe zu entnehmen.

Abb. 21: Phasenlöslichkeitsdiagramm des Calcitriol-Analogon in wässeriger beta-CD-Polymer-Lösung (pH=6,5) bei 25°C

Tabelle 7: Komplexstabilitätskonstanten (K) der verschiedenen Komplexe in wässeriger Lösung

System

K [l/mol]

Bestimmtheitsmaß R2

CA / beta-CD

37 989

0,99

CA / Dimeb

57 612

0,98

CA / G2-beta-CD

28 575

0,98

CA / beta-CD-Polymer

17 715

0,98

2.3.3.2.3. Gehaltsbestimmung

Die quantitative Erfassung des CA in allen festen beta-CD-Einschlußverbindungen erfolgte mittels Umkehrphasen-Chromatographie (RP-HPLC) unter UV-Detektion ( siehe , 4.3.10). Es gelangten gewaschene Produkte in die Untersuchungen. Die Ergebnisse der Gehaltsbetimmungen von CA im festen Komplex sowie die daraus berechneten molaren Verhältnisse sind in siehe gelistet. Die Gehaltsbestimmumgen von CA in HP-beta-CD und CE-beta-CD ergaben keine reproduzierbaren Resultate.


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Tabelle 8: Gehalt an CA und molare Verhältnisse

System

Gehalt an CA [%]

n=3

Molares Verhältnis CA : beta-Cyclodextrin

CA / beta-CD

6,5

1:7

CA / Dimeb

16,1

1:2

CA / G2-beta-CD

6,3

1:5

CA / beta-CD-Polymer

5,6

1:2

2.3.3.2.4. Differential Scanning Calorimetrie

Als Nachweismethode für das Vorliegen von Cyclodextrin-Komplexen in festem Zustand wird die Differential Scanning Calorimetry (DSC) herangezogen. Diese Methode basiert darauf, daß in den Thermogrammen von eingeschlossenen Arzneistoffen durch die ”molekulare Verkapselung“ die Schmelzpunktpeaks, die bei reinen kristallinen Arzneistoffen und den entsprechenden physikalischen Mischungen detektiert werden können, ausbleiben ( siehe , 2.1.3.4). Die Messungen erfolgten gemäß der Beschreibung im Experimentellen Teil (4.3.11).

Da gefriergetrocknete CA-Substanz aufgrund ihrer amorphen Struktur im DSC-Thermogramm keinen Schmelzpunktpeak ausbildet, konnten die DSC-Untersuchungen nicht an Lyophilisaten vorgenommen werden. Dieses Phänomen wurde in einem Vorversuch ermittelt. Zur Untersuchung gelangten nur die Knetprodukte und Kopräzipitate.

beta-Cyclodextrin (beta-CD)

siehe zeigt die DSC-Thermogramme von CA / beta-CD-Systemen. Entscheidend für den Nachweis der Komplexverbindung ist der Temperaturbereich, in dem die Verbindung schmilzt. Reines CA (a) bildet bei ca. 105°C einen endothermen Schmelzpunktpeak aus. Zusätzlich zeigt die Substanz eine höherschmelzende Modifikation bei ca. 122°C. Diese bildet sich möglicherweise nach längerer Lagerung bzw. durch Temperatureinfluß während der Messung. Bei ca. 60°C zeigt sich ein weiterer endothermer Vorgang durch Verlust der Restfeuchte des CA. beta-CD (d) zeigt einen steilen Kurvenanstieg mit ausgeprägter Auslenkung im Bereich um 90-100°C. Dieser endotherme Vorgang wird


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durch Wasseraustritt aus dem beta-CD hervorgerufen und führt zu einer Überlagerung der thermischen Effekte im Schmelzpunkt vom CA in der physikalischen Mischung (b). Dadurch ist der CA-Peak im Thermogramm der physikalischen Mischung verdeckt. Durch molekulare Verkapselung des CA durch beta-CD (c) bleiben die Schmelzpunktpeaks aus. Auch hier ist eine endotherme Auslenkung aufgrund von Wasseraustritt plausibel. Die Zersetzung von beta-CD ab 270°C (Karamelisierung) ist in dieser Aufnahme nicht dargestellt.

Abb. 22: DSC-Thermogramme von CA / beta-CD-Systemen, a) reines CA, b) physikalische Mischung (1:7), c) Kopräzipitat (gewaschen), d) beta-CD-Referenz

1.8-Dimethyl-beta-cyclodextrin (Dimeb)

siehe zeigt die DSC-Thermogramme von CA / Dimeb-Systemen. Reines CA (a) bildet bei ca. 105°C einen endothermen Schmelzpunktpeak aus. Dimeb (e) zeigt als Referenzsubstanz einen stetigen Kurvenanstieg mit ausgeprägter Auslenkung im Bereich von 60-90°C. Dieser endotherme Vorgang wird durch Wasseraustritt aus Dimeb hervorgerufen (Trocknung).


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Die Überlagerung der thermischen Effekte in der physikalischen Mischung (b) führt zu einem verminderten Schmelzpunktpeak des CA. Für den Einschluß des CA durch Dimeb (c und d) spricht das Ausbleiben des endothermen Schmelzpunktpeaks für CA, sowohl beim ungewaschenen als auch beim gewaschenen Kavitat.

Abb. 23: DSC-Thermogramme von CA / Dimeb-Systemen, a) reines CA, b) physikalische Mischung (1:2), c) Knetprodukt (ungewaschen), d) Knetprodukt (gewaschen), e) Dimeb-Referenz

Maltosyl-beta-cyclodextrin (G2-beta-CD)

siehe zeigt die DSC-Thermogramme von CA / G2-beta-CD-Systemen. Reines CA (a) bildet den bei ca. 105°C erwarteten endothermen Schmelzpunktpeak aus. Als Referenzsubstanz zeigt G2-beta-CD (e) einen bauchigen Kurvenverlauf im Bereich von 60-120°C. Dieser endotherme Vorgang wird durch Wasseraustritt aus G2-beta-CD hervorgerufen (Trocknung). Die physikalischen Mischung (b) zeigt den Schmelzpunktpeak des nicht eingeschlossenen CA‘s. Das Thermogramm des ungewaschenen Produktes (c) demonstriert, daß wahrscheinlich nur ein geringer Teil des CA eingeschlossen wird.


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Abb. 24: DSC-Thermogramme von CA / G2-beta-CD-Systemen a) reines CA, b) physikalische Mischung (1:5), c) Knetprodukt (ungewaschen), d) Knetprodukt (gewaschen), e) G2-beta-CD-Referenz

beta-Cyclodextrin-Polymer (beta-CD-Polymer)

siehe stellt die DSC-Thermogramme der Einzelkomponenten, der physikalischen Mischung und des Knetprodukts aus Calcitriol-Analogon und Polymer-beta-CD dar. Reines beta-CD-Polymer (e) ergibt keinen Peak, sondern einen Kurvenverlauf mit ausgeprägter Auslenkung im Bereich von 60-100°C. Diese Erscheinung des Verdampfens von anhaftendem Wasser und Kristallwasser zeigt sich auch in den Thermogrammen der physikalischen Mischung und des Kavitats. Der Schmelzpeak des CA zeigt sich bei der physikalischen Mischung (b) deutlich, wenngleich abgeschwächt durch Überlagerung der Auslenkung durch den Wasserverlust aus dem beta-CD-Polymer. Es tritt beim gewaschenen Knetprodukt (d) nur eine schwache Erhebung im Bereich des Schmelzpunktes des Gastmoleküls auf. Entweder ist das CA nicht quantitativ eingeschlossen worden oder anhaftende Gastkomponente konnte im Waschprozeß nicht vollständig vom Kavitat entfernt werden.


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Abb. 25: DSC-Thermogramme von CA / beta-Cyclodextrin-Polymer-Systemen (1:2), a) reines CA, b) physikalische Mischung, c) Knetprodukt (ungewaschen), d) Knetprodukt (gewaschen), e) beta-CD-Polymer-Referenz

Carboxyethyl-beta-cyclodextrin (CE-beta-CD)

In siehe sind DSC-Thermogramme von CA / CE-beta-CD-Systemen dargestellt. CE-beta-CD (e) zeigt als Referenzsubstanz wiederum einen bauchigen Kurvenverlauf im Bereich von 60-120°C, welcher durch Wasseraustritt aus dem Cyclodextrinderivat hervorgerufen wird (Trocknung). Auffällig ist der nahezu identische Kurvenverlauf der physikalischen Mischung (b) und der des ungewaschenen Produkts (c). Vermutlich hat die Herstellmethode nicht zur Formation eines Kavitats geführt. Durch Waschprozesse (d) läßt sich teilweise CA aus dem Assoziat entfernen.

Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-beta-CD)

In siehe sind DSC-Thermogramme von CA / HP-beta-CD-Systemen dargestellt. Der CA-Referenzpeak (a) ist aufgrund einer höheren Einwaage ausgeprägter vorhanden. Wie schon beim CA / CE-beta-CD-System beobachtet, ist davon auszugehen, daß die Herstellmethode für ein CA / HP-beta-CD-System nicht zur Ausbildung eines Komplexes geführt hat. Der Kurvenverlauf der physikalischen Mischung (b) zeigt nahezu den Verlauf des ungewaschenen und gewaschenen Produktes (c und d).


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Abb. 26: DSC-Thermogramme von CA / CE-beta-CD-Systemen, a) reines CA, b) physikalische Mischung, c) Knetprodukt (ungewaschen), d) Knetprodukt (gewaschen), e) CE-beta-CD-Referenz

Abb. 27: DSC-Thermogramme von CA / HP-beta-CD-Systemen, a) reines CA, b) physikalische Mischung, c) Knetprodukt (ungewaschen), d) Knetprodukt (gewaschen), e) HP-beta-CD-Referenz


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2.3.3.2.5. Thermomikroskopie

Die Thermomikroskopie dient zur visuellen Beobachtung der thermischen Veränderungen oder der Messung der Lichtdurchlässigkeit einer Probe auf einem Mikroskopheiztisch. Dabei wird sie einem Temperaturprogramm unterworfenen. Diese Untersuchung erfolgte exemplarisch an der physikalischen Mischung und der Einschlußverbindung des CA mit beta-CD. siehe und siehe lassen das Verhalten der physikalischen Mischung und der Einschlußverbindung des CA mit beta-CD in einer Heizkammer bei 25°C, 90°C und 120°C vergleichen ( siehe , 4.3.12).

25°C

90°C

120°C

Abb. 28: Thermomikroskopische Aufnahmen der physikalischen Mischung aus CA und beta-CD

25°C

90°C

120°C

Abb. 29: Thermomikroskopische Aufnahmen des CA / beta-CD-Kopräzipitats

In siehe zeigen sich im zweiten Bild (90°C) erste thermische Effekte einiger Strukturen. Dieses beginnende Schmelzen bei ca. 90°C ist der CA-Reinsubstanz zuzuordenen, ihr Schmelzpunktpeak liegt bei ca. 105°C. Die Strukturen des beta-CD werden bei Temperaturen bis 120°C nicht sichtbar beeinflußt. Im dritten Bild (120°C) sind nur noch kristalline Strukturen des beta-CD zu erkennen. Der Arzneistoff ist vollständig geschmolzen. siehe läßt im Temperaturbereich bis 120°C keine visuellen erfaßbaren thermischen Effekte an den betrachteten Fraktionen des CA / beta-CD-Knetprodukts erkennen und deutet somit auf Einschluß des CA hin. Da auch über den Schmelzpunkt des CA hinaus kein partielles Schmelzen eintritt, ist hier ein deutlicher Unterschied zur physikalischen


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Mischung zu sehen. Die thermomikroskopischen Aufnahmen bestätigen insofern die DSC-Befunde, die im Kavitat keinen Schmelzpunktpeak des CA signalisieren. (vgl. siehe ).

2.3.3.2.6. 1H-NMR-Spekroskopie

Die Ergebnisse der DSC-Untersuchungen von CA / beta-CD und CA / Dimeb ergaben von allen sechs geprüften beta-Cyclodextrinen die eindeutigsten Hinweise auf Bildung von echten Einschlüssen. Deshalb sollten im folgenden mittels 1H-NMR-Spekroskopie die Kavitatbildung unterstützend bewiesen und gegebenenfalls Aufschluß über genaue stöchiometrische Verhältnisse erhalten werden.

beta-Cyclodextrin (beta-CD)

In D2O konnte von der Verbindung kein brauchbares Spektrum erhalten werden. Das Protonenspektrum des Calcitriol-Analogon in Methanol -D4 zeigte im Bereich von 3,0 bis 4,2 ppm keine Signale, die zur Verbindung gehörten. Die Signale der Methylgruppen, der Olefine und der funktionalisierten Protonen ließen sich gut erkennen und zuordnen.

Da das Kavitat auch nicht ausreichend wasserlöslich (D2O) ist, wurden Lösungsversuche in folgenden Lösungsmitteln durchgeführt.

Es resultierte in allen Fällen nur eine sehr geringe Löslichkeit des Kavitats (<< 1 mg / ml). Die Ethanol / Wasser Gemische wurden nach Zugabe des Komplexes bis 40°C erwärmt, um eine bessere Löslichkeit zu erzielen. Dies gelang jedoch nur bedingt, so daß aufgrund der Trübung der Probe keine präzisen Langzeitmessungen vorgenommen werden konnten.

In allen Fällen zeigte sich im Protonenspektrum, daß das Calcitriol-Analogon zur Isomerisierung neigt und meist zwei äquimolare Komponenten vorlagen. Bereits die einfachen Protonenspektren konnten nur nach sehr langer Meßzeit mit Lösemittelunterdrückung


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mit geringem Signal/Rausch-Verhältnis erhalten werden. 2D-COSY, NOESY bzw. ROESY-Spektren lieferten daher keine auswertbaren Ergebnisse.

Da sich aber reines Calcitriol-Analogon sehr gut in Methanol -D4 löst und 1H-NMR-spektrometrisch untersuchen läßt, kann zumindest auf das tatsächliche Vorliegen eines Komplexes aufgrund von stark veränderten Lösungseigenschaften geschlossen werden. Strukturaussagen konnten wegen unzugänglicher Meßresultate nicht getroffen werden.

In einem aprotischen Lösungsmittel, wie DMSO, löst sich der Komplex sehr gut, doch konnte eine Wechselwirkung zwischen beiden Komponenten nicht nachgewiesen werden. Offenbar dissoziiert der Komplex in diesem Lösemittel.

1,8-Dimethyl-beta-Cyclodextrin

1,8-Dimethyl-beta-Cyclodextrin zeigt im Protonenspektrum (in D2O) sehr diffuse Signale zwischen 3,4 und 4,0 ppm sowie anomere Protonen bei etwa 5,2 ppm. Der Gemischcharakter des Spektrums läßt sich durch den durchschnittlichen Substitutionsgrad von 1,81 Methylgruppen pro Glucoseeinheit (laut Herstellerangaben) ableiten. Durch dieses diffuse Erscheinungsbild ist es schwer, die Protonen H-3' und H-5', die sich im Inneren des torusförmigen Cyclodextrinderivats befinden, zuzuordnen. Diese sind aber von entscheidener Bedeutung, um Wechselwirkungen des Cyclodextrins mit dem Gastmolekül in der Kavität nachzuweisen.

Vom Kavitat selbst wurden Protonenspektren, COSY- sowie NOESY-Spektren in D2O bei Raumtemperatur und 500 MHz aufgenommen. Das Protonenspektrum zeigte vor allem für das Calcitriol-Analogon verbreiterte Linien. Wegen der heterogenen Signalform des Dimeb konnte keine genaue Stöchiometrie für den Komplex ermittellt werden.

Die breiten Linien haben zur Folge, daß das COSY-Spektrum nur Korrelationen für den Cyclodextrinteil zeigte, während alle anderen allenfalls zu erahnen waren. Die erkennbaren Signale für das Calcitriol-Analogon ließen sich dadurch nur sehr schwer zuordnen.

Im NOESY-Spektrum (Nachweis räumlicher Nähen) konnten intensive Wechselwirkungen von Protonen der Methylgruppen der Seitenkette an C-17 und der Protonen H-18 des CA zu den Protonen des Cyclodextrins nachgewiesen werden. Weiterhin zeigte auch H-1 des


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CA noch deutliche Wechselwirkungen mit den Cyclodextrin-Wasserstoffen. Die interessanten Signale H-19 und H-3 konnten durch Überlappung nicht eindeutig lokalisiert werden, doch scheinen auch diese mit den Cyclodextrinprotonen in Wechselwirkung zu stehen.

Sowohl der A-Ring als auch der D-Ring und die Seitenkette des Gastmoleküls sind dem Cyclodextrin räumlich recht nahe (< 5 Anström). Leider konnte zwischen den "inneren" Protonen H-3' und H-5' sowie den "aüßeren" Protonen H-2', H-4' und H-6' des CD-Derivats nicht unterschieden werden, da das Dimeb nicht einheitlich vorlag (heterogene Substitution). Damit war die genaue Struktur des Komplexes mittels 1H-NMR-Spekroskopie nicht nachweisbar, jedoch konnte ein Einschluß aufgrund dieser Ergebnisse bestätigt werden.

2.3.4. Resümee

Eine besondere Eigenschaft der Cyclodextrine ist ihre Fähigkeit, Einschlußverbindungen mit geeigneten Gastmolekülen in festem Zustand und in Lösung zu bilden.

Die Komplexbildung in Lösung kann zu einer Erhöhung oder Erniedrigung der Löslichkeit des eingeschlossenen Gastmoleküls führen. Zur Ermittlung von Löslichkeitsisothermen des CA wurden mit vier der sechs untersuchten beta-CD-Derivaten Phasenlöslichkeitsdiagramme aufgenommen. Die Fähigkeit des CA, einen Einschluß in Lösung zu bilden, wird durch die ermittelte Komplexstabilitätskonstante für das jeweilige System beschrieben.

Dimeb, G2-beta-CD und beta-CD-Polymer führen im gemessenen Bereich (Konzentration des Cyclodextrin-Derivats bis ca. 6 %) zu Isothermen vom AL-Typ. Es resultiert lineare Erhöhung der Löslichkeit des CA in Wasser in Abhängigkeit von der CD-Konzentration ohne Ausfällung des Komplexes aus der wässerigen Cyclodextrin-Lösung. Für das System CA / Dimeb errechnet sich die höchste Komplexstabilitätskonstante. Die für die Systeme G2-beta-CD und beta-CD-Polymers ermittelten Konstanten liegen um den Faktor 2 bzw. 3,3 niedriger.

Das System CA / beta-CD ist durch einen BS-Kurventyp charakterisiert. Die Berechnung der Komplexstabilitätskonstanten wird im ansteigenden Ast der Kurve (Konzentration an


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Cyclodextrin bis ca. 0,6 %) vorgenommen. Sie ist um den Faktor 1,5 niedriger als die für das System CA / Dimeb errechnete.

Zur Charakterisierung der festen Assoziate wurden DSC-Untersuchungen durchgeführt. Zur Untersuchung gelangten lediglich mittels Kopräzipitation und Knetmethode hergestellte Produkte. Durch Lyophilisation hergestellte Assoziate des Systems CA / Dimeb waren aufgrund ihres amorphen Charakters nicht thermoanalytisch zu charakterisieren. Eine Unterdrückung des Schmelzpeaks wird in der DSC als Nachweis für die Existenz eines Kavitats angesehen. Dieses Phänomen ist bei den Systemen CA / beta-CD und CA / Dimeb deutlich zu beobachten. Die Komplexbildung führt bereits bei den ungewaschenen Produkten zum vollständigen Verschwinden der Schmelzpeaks. Die Systeme des CA mit G2-beta-CD und beta-CD-Polymer lassen dagegen den Schmelzpunktpeak des Arzeistoffs in den ungewaschenen Addukten erkennen. Durch Waschvorgänge konnte am Komplex adsorbierter Arzneistoff teilweise entfernt werden. Eine quantitative Entfernung anhaftender Gastkomponente konnte ohne Gefahr der Dissoziation der Komplexe nicht durchgeführt werden. Infolgedessen sind in den dargestellten Thermogrammen dieser Systeme noch Schmelzpunktpeaks des CA detektierbar. Die Thermoanalyse der Systeme des CA mit CE-beta-CD und HP-beta-CD erlaubten nicht, auf Komplexbildung zu schließen. Die eingesetzten Herstellverfahren führten zu Systemem, die sich thermoanalytisch ähnlich den physikalischen Mischungen verhielten.

Am Beispiel des CA / beta-CD-Systems ließen sich exemplarisch das Verhalten der physikalischen Mischung und der Einschlußverbindung mittels Thermomikroskopie veranschaulichen und die DSC-Befunde unterstützen.

Die Systeme, CA / beta-CD und CA / Dimeb, die als echte Kavitate anzusehen sind werden mittels 1H-NMR-Spekroskopie untersucht. Aufgrund der zu geringen Löslichkeit des CA / beta-CD-Kavitats in D2O waren jedoch keine auswertbaren Spektren zu erhalten. Im Falle von CA / Dimeb konnten räumliche Nähen mit Hilfe der Aufnahme von NOESY-Spektren gezeigt werden. Sowohl der A-Ring als auch der D-Ring und die Seitenkette des CA sind dem Cyclodextrin räumlich recht nahe. Allerdings war wegen unscharfer Spektren, die auf den Gemischcharakter des Dimeb zurückzuführen sind, die Zuordnung der im Innern des CD-Torus lokalisierten Protonen unmöglich. Eine Wechselwirkung der Protonen des A-Rings als auch des D-Rings und der Seitenkette mit den ”inneren“ Protonen des Dimeb-Torus ist wahrscheinlich.


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2.4. beta-Cyclodextrin-Kavitate in Dermatika

Die Auswahl des Vehikels für eine hochpotente Wirkstoffkomponente, wie das CA, ist für die Steuerung der Freisetzung und damit für die Wirksamkeit und Verträglichkeit von entscheidender Bedeutung. Für den zukünftigen Einsatz in der lokalen Therapie der Psoriasis wird eine Fettsalbe entwickelt. Weiterhin ist eine hydrophile Zubereitung in Form eines Hydrogels als Variante für die Applikation am Haaransatz vorgesehen.

Im Rahmen dieses Abschnittes wird der Einfluß von beta-Cyclodextrinen auf das In-vitro-Liberationsverhalten des CA aus Fettsalben und Hydrogel untersucht. Anschließend werden ausgewählte Formulierungen am Tiermodell im Hinblick auf ihre Irritation, Effektivität und transdermale Resorption des CA geprüft.

2.4.1. Versuchsdurchführung

Zur Ermittlung der Einflüsse von beta-Cyclodextrinen auf die In-vitro-Freisetzung des CA aus Fettsalben wurden Vehikel auf Basis von Kohlenwasserstoff (V) und Triglycerid-Kohlenwasserstoff (TK) zur Aufnahme der Wirkstoff-Systeme mit beta-CD, Dimeb, G2-beta-CD und beta-CD-Polymer hergestellt.

Zur Durchführung der In-vitro-Liberationsstudien dienten zunächst TK-Zubereitungen ( siehe ) mit CA / beta-Cyclodextrin-Systemen entsprechend einer Wirkstoffkonzentration von 0,01 %. Mit fortschreitender Entwicklung der klinischen Prüfungen zur Dosisfindung wurde die Konzentration halbiert, so daß zum Zeitpunkt der Herstellung der V-Zubereitungen Konzentrationen von 0,005 %, berechnet auf den Wirkstoff, rezeptiert wurden. Eine dieser V-Zubereitungen wurde neben den In-vitro-Liberationsuntersuchungen auch in vivo an haarlosen Mäusen ( siehe , 4.3.9) geprüft.

Weiterhin wurde die Liberation von CA aus einem Hydrogel auf Polyacrylatbasis unter Verwendung der beta-Cyclodextrin-Derivate Dimeb und G2-beta-CD bestimmt. Diese Auswahl erfolgte im Hinblick auf die Absicht, CA in therapeutischen Konzentrationen in Hydrogelen zu ”solubilisieren“. Dafür wurden CD-Konzentrationen von 1 bzw. 2 % benötigt


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( siehe , 2.3.3.2.1). beta-CD gelangte aufgrund der geringen Wasserlöslichkeit des CA / beta-CD-Kavitats nicht in Untersuchungen mit Hydrogelen.

Die CA-Konzentration in den Hydrogelen mit CA / beta-Cyclodextrin-Komplex betrug 0,005 %, sowohl bei den In-vitro-Liberationsuntersuchungen als auch bei den In-vivo-Untersuchungen mit haarlosen Mäusen.

Als In-vitro-Liberationsapparatur diente wiederum das Diffusionszellsystem nach Franz [ siehe ] in einer Konsole mit Rührvorrichtungen (Apparatur 2: siehe , 4.2). Die thermostatierte Akzeptorphase wurde blasenfrei in das Zellkompartiment eingefüllt und mit Hilfe eines Rührmagneten durchmischt. Das zu prüfende Dermatikum wurde in die offene Donatorvorrichtung der Zelle gebracht, indem die Prüfsubstanz auf die zuvor getränkte Membran mittels Schablone appliziert wurde. Als Membran zur Trennung von Donator- und Akzeptorkompartiment gelangte die Cuprophan-Membran zum Einsatz. Die Probenentnahmen von jeweils 1 ml erfolgten über den Gesamtzeitraum von sechs Stunden nach 30, 60, 120, 180, 240, 300 und 360 Minuten. Das Akzeptorkompartiment wird nach jeder Probenentnahme mit der jeweils aliquoten Menge des Akzeptormediums aufgefüllt. Die quantitative Erfassung des liberierten Arzneistoffs erfolgte mittels RP-HPLC. Methanol und gereinigtes Wasser (pH\|[ap ]\|6,5) dienten im Verhältnis 1:1 (V/V) als Imprägnier- bzw. Akzeptormedium. Im Akzeptor sind “sink Bedingungen" für den Wirkstoff gewährleistet. Bei dem pH Wert von 6,5 verhält sich das CA stabil. Für die In-vitro-Liberationsuntersuchungen aus Hydrogelen wurde die Cuprophan-Membran mit Silikonöl beschichtet ( siehe , 2.2.1 siehe ), um die physikalische Trennung zwischen hydrophiler Donator- und Akzeptorphase zu gewährleisten sowie hydrodynamische Effekte zu vermindern.

2.4.2. Formulierungen

Die Entwicklung einer Grundlage für die Behandlung der psoriatrisch veränderten Haut sollte den Anforderungen dieses Hautzustandes gerecht werden. Ferner werden hohe chemische und physikalische Stabilität, Kompatibilität mit dem Wirkstoff sowie In-vivo-Verträglichkeit der Grundlage vorausgesetzt.

Neben einer Fettsalbe ist die Entwicklung eines Hydrogels vorgesehen. Die Lösung eines hydrophoben Arzneistoffs wie CA, in einem Hydrogel in therapeutischer Dosierung ist


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ohne Zusatz von ”Solubilisatoren“ nicht möglich. Der Zusatz von Alkoholen oder Emulgatoren muß bei psoriatrisch erkrankter Haut aufgrund deren irritativer Potenz als kritisch eingeschätzt werden. Ein Zusatz von Cyclodextrinen könnte dagegen durch die verbesserte Löslichkeit des CA den Einsatz von Lösungsvermittlern überflüssig machen.

Die Herstellung der Placebo- und Verumformulierungen ist im Experimentellen Teil ( siehe , 4.3.6) beschrieben. Die lipophilen Zubereitungen wurden für die Freisetzungsuntersuchungen mindestens 24 h vor Versuchsbeginn hergestellt, um die direkte Nachhärtung nach der Herstellung abzuwarten. Homogenität der Grundlage und Verteilung der Wirkkomponenten (gelöst oder suspendiert) werden mikroskopisch kontrolliert.

Zur Sicherstellung des deklarierten Gehalts wurden Gehaltsbestimmungen von CA in den zu prüfenden Zubereitungen durchgeführt. Im Falle der Fettsalben mußte eine Extraktionsmethode entwickelt werden, die quantitativ den Wirkstoff von Fettbestandteilen separiert, um eine störungsfreie HPLC-Analytik zu gewährleisten ( siehe , 4.3.10).

In der Vergangenheit konnte gezeigt werden, daß das Verfahren zur Einarbeitung von Cyclodextrinen in Vehikel eine wichtige Rolle bezüglich der Freisetzungsbeeinflussung spielt [ siehe ]. Frühere Ergebnisse wurden mit vorgefertigten Cyclodextrin-Einschlüssen erhalten aber oft nicht mit dem Einsatz physikalischer Mischungen verglichen. Untersuchungen verdeutlichten, daß separat eingearbeitetes Cyclodextrin zu keiner Freisetzungsbeeinflussung führte [ siehe ].

In den vorliegenden Untersuchungen gelangen ausschließlich separat hergestellte beta-Cyclodextrin-Assoziate in die wasserfreien Salben, da eine In-situ-Formation eines Kavitats normalerweise eine wässerige Phase voraussetzt. Daneben werden auch physikalische Mischungen zum Vergleich getestet.

Bei der Herstellung der Hydrogel-Systeme wird eine In-situ-Formation von CA / beta-Cyclodextrin-Komplexen vorausgesetzt ( siehe , 2.3.3).

Die in siehe aufgeführten Testvehikel wurden in Anlehnung an aktuelle Entwicklungen im Rahmen des “CA-Projektes“ der Schering AG Berlin ausgewählt.


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Tabelle 9: Zusammensetzungen der Testvehikel

Triglycerid-Kohlenwasserstoff-Rezeptur (TK)

Kohlenwasserstoff-Rezeptur (V)

Plastibase® 40,0 g Softisan® 378 50,0 g Glycerolmonostearat 5,0 g Miglyol® 812 5,0 g

Gesamt 100,0 g

Vaseline, weiß 75,0 g Paraffin, dickfl. 5,0 g Cetylstearylalkohol 5,0 g Softisan® 649 5,0 g Brij® 72 5,0 g Diisopropyladipat 5,0 g

Gesamt 100,0 g

Hydrogel + Propylenglycol (HP)

Hydrogel + Liposomen (HL)

Carbopol® 980 NF (vorneutr.) 0,5 g Propylenglycol 5,0 g Wasser 94,5 g

Gesamt 100,0 g

Carbopol® 980 NF(vorneutr.) 0,5 g Liposomen(Sojalecithin) 10,0 g Wasser 89,5 g

Gesamt 100,0 g

Hydrogel + Dimeb (HD)

Hydrogel + G2-beta-CD (HM)

Carbopol® 980 NF (vorneutr.) 0,5 g Dimeb 1,0 g Wasser 98,5 g

Gesamt 100,0 g

Carbopol® 980 NF(vorneutr.) 0,5 g G2-beta-CD 1,2 g Wasser 98,3 g

Gesamt 100,0 g


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2.4.3. In-vitro-Liberation

2.4.3.1. Salben auf Kohlenwasserstoffbasis

2.4.3.1.1. Dimeb

In siehe ist die Liberation verschiedener Dimeb-Assoziate aus der Formulierung auf Basis von Triglyceriden und Kohlenwasserstoffen (TK-Zubereitungen) dargestellt. Alle Zubereitungen wurden vor Versuchsbeginn auf ihren Gehalt an CA überprüft (Spezifikation: 95 - 105 % der Sollmenge).

Abb. 30: Freisetzungsprofile von CA / Dimeb-Systemen aus einer Trigycerid-Kohlenwasserstoff-Grundlage in Methanol / Wasser bei 32°C (n=6, P=0,01)

Die Freisetzungsuntersuchungen werden über einen Zeitraum von 6 h durchgeführt, wobei die erste Messung nach 30 Minuten erfolgt, da die analytische Erfassung des CA erst zu diesem Zeitpunkt möglich ist (Bestimmungsgrenze). Alle drei Assoziate führen zu einer signifikanten Verminderung der Freisetzungrate von CA. Aus der Zubereitung mit dem Knetprodukt wird schon initial weniger Arzneistoff liberiert. Nach 6 h befinden sich nur 72 % CA im Akzeptor, bezogen auf die Referenzformulierung mit reinem CA. Die


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Assoziate in Form des Lyophilisats und der physikalischen Mischung zeigen ebenfalls eine Verminderung der CA-Freisetzung in den Akzeptor: Nach 6 h können 83 % bzw. 82 %, bezogen auf die liberierte Menge aus der Referenzformulierung, im Akzeptor nachgewiesen werden. Die aus dem linearen Bereich (matrixkontrollierte Phase) ermittelten Freisetzungsraten sind in siehe enthalten.

Tabelle 10: Freisetzungsraten aus der Triglycerid-Kohlenwasserstoffgrundlage (TK)

Komponente im TK-Vehikel

Korrelations-koeffizient

Freisetzungsrate [µg/ml/min*10-3]

Reines CA

0,999

47,6 ± 0,3

Dimeb-Kavitat (geknetet)

0,999

34,5 ± 2,6

Dimeb-Kavitat (lyophilisiert)

0,999

38,9 ± 0,2

Physikalische Mischung

0,999

39,1 ± 0,8

beta-CD

0,999

18,1 ± 0,4

G2-beta-CD

0,999

35,5 ± 0,9

beta-CD-Polymer-Kavitat

0,999

36,7 ± 1,4

Initial verhalten sich die Formulierungen mit Lyophilisat und der physikalischen Mischung wie die Referenzzubereitung. Die Freisetzungsprofile von CA im Lyophilisat und in der physikalischen Mischung unterscheiden sich nicht signifikant (P=0,01). Es ist deshalb davon auszugehen, daß das Einschlußverfahren mittels Lyophilisation nicht erfolgreich ist bzw. ein partieller Einschluß von CA in Dimeb bei der Anfertigung der physikalischen Mischung (Verreibung) nicht ausgeschlossen werden kann. Für die Verreibung der physikalischen Mischung wurde gefriergetrocknete röntgenamorphe CA-Substanz eingesetzt, um beim Vergleich mit dem hergestellten Lyophilisationsprodukt Differenzen im Liberationsverhalten durch Modifikationsunterschiede auszuschließen. Es ist nicht auszuschließen, daß die geringfügig verminderten Freisetzungsraten gegenüber der Referenzzubereitung aus der veränderten Diffusionskinetik aufgrund der amorphen Struktur des Arzneistoffs resultieren.

Des weiteren ist von einer erhöhten Viskosität durch den erhöhten Feststoffanteil (Dimeb) auszugehen. Im allgemeinen sind die Diffusionskoeffizienten, die die Beweglichkeit der Moleküle in einem System charakterisieren, umgekehrt proportional zur Viskosität [ siehe ].


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Dies gilt allerdings nur dann, wenn die makroskopisch erfaßbare Viskosität repräsentativ für kleinste Volumenelemente des Systems ist.

Es ist wahrscheinlich, daß sich in gefriergetrockneten Produkten von CA und Dimeb keine Kavitate bilden, sondern ein physikalisches Gemisch auftritt. Diese Beobachtung wurde mit anderen Arzneistoffen ebenfalls gemacht [ siehe , siehe ].

Eine Erklärung liefert das Phasenlöslichkeitsdiagramm, welches sich als AL-Typ abbildet ( siehe , 2.3.3.2.1). Wenn am eutektischen Punkt, bei Sättigungskonzentrationen der Einzelkomponenten, das Löslichkeitsprodukt des Kavitats nicht überschritten wird, kann keine feste Einschlußverbindung während des Gefriertrocknungsprozesses präzipitieren.

2.4.3.1.2. Weitere Cyclodextrin-Derivate

In siehe ist die Liberationsbeeinflussung weiterer CA / Cyclodextrin-Assoziate aus der TK-Grundlage dargestellt.

Abb. 31: Freisetzungsprofile von verschiedenen CA / beta-Cyclodextrin-Systemen aus einer Trigycerid-Kohlenwasserstoff-Grundlage in Methanol / Wasser bei 32°C (n=6, P<0,01)


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Die Liberation von CA wird durch die Anwesenheit der verwendeten beta-Cyclodextrin-Derivaten aus der TK-Formulierung vermindert. Inital werden aus der beta-CD- und der beta-CD-Polymer-Zubereitung ähnlich geringe Mengen freigesetzt. Die Referenzzubereitung (reines CA) und die Formulierung mit G2-beta-CD zeigen vergleichsweise hohe Startwerte. Nach 6 h werden aus der G2-beta-CD-Zubereitung 75 %, aus der beta-CD-Polymer-Formulierung 77 % und aus der beta-CD- Formulierung lediglich 38 %, bezogen auf die aus der Referenzformulierung freigesetzte Menge, im Akzeptor bestimmt. Die ermittelten Freisetzungsraten (matrixkontrollierte Phase) sind in siehe enthalten. Die Unterschiede der Freisetzungsraten von CA / beta-CD-Derivaten aus der Triglycerid-Kohlenwasserstoff-Grundlage sind relativ gering. Eine Ausnahme bildet die CA / beta-CD- Formulierung. Der Wirkstoff wird aus diesem System stark verzögert freigesetzt.

In siehe ist die Liberationsbeeinflussung durch CA / beta-CD aus der V-Zubereitung dargestellt.

Abb. 32: Freisetzungsprofil eines CA / beta-CD-Systems gegenüber reinem CA und einer physikalischen Mischung aus einer Kohlenwasserstoff-Grundlage (V) in Methanol / Wasser bei 32°C (n=6, P<0,01)


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Die Liberation von CA ist durch den Einschluß mit beta-CD aus der V-Formulierung ebenfalls erheblich verringert. Gegenüber der Referenzformulierung, die reines CA enthält, zeigt sich schon anfänglich eine verminderte Freisetzungsrate. Nach 6 h befinden sich lediglich 14 % der Menge an CA, bezogen auf die Referenzformulierung, im Akzeptor. Die physikalische Mischung zeigt keine deutliche Abweichung gegenüber der Referenzformulierung und entspricht damit dem bereits in siehe für die TK-Formulierung dargestellten Verhalten. Die aus dem linearen Bereich (matrixkontrollierte Phase) ermittelten Freisetzungsraten sind in siehe enthalten.

Tabelle 11: Freisetzungsraten aus einer Kohlenwasserstoffgrundlage (V)

Komponente im V-Vehikel

Korrelations-koeffizient

Freisetzungsrate [µg/ml/min*10-3]

Reines CA

0,999

11,9 ± 1,1

beta-CD-Kavitat

0,998

1,7 ± 0,2

Physikalische Mischung

0,999

12,2 ± 0,2

Dem Effekt der Einflußnahme von beta-Cyclodextrinen auf die Liberation von CA aus den wasserfreien Formulierungen liegen folgende Überlegungen zugrunde: In Anwesenheit des komplexierenden Agens (beta-Cyclodextrin) im Vehikel kann folgendes Gleichgewicht angenommen werden:

CA + beta-Cyclodextrin hArr CA-beta-Cyclodextrin

Wenn die Konzentration des Arzneistoffs in den membranangrenzenden Diffusionsschichten aufgrund der Permeation in das Akzeptormedium abnimmt, dient der Komplex möglicherweise als Reservoir. Der Verlust unverkapselter Substanz aus der Donor-Phase wird durch Dissoziation des Komplexes kompensiert, um somit die “pseudo-steady-state“-Diffusion durch die Membran aufrecht zu erhalten.

CA ist in den Komponenten Miglyol® 812 und Diisopropyladipat in den eingesetzten Konzentrationen löslich. Die Anwesenheit der beta-Cyclodextrine setzt die Konzentration an freiem bzw. gelöstem CA herab. Dies ist möglicherweise ein Grund für die leicht verminderte Freisetzung der korrespondierenden physikalischen Mischungen gegenüber dem Profil von reinem CA, insbesondere aus der TK-Formulierung.


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Für die geringere Freisetzung infolge CA-Einschlusses könnte auch die Einflußnahme auf die thermodynamische Aktivität des Wirkstoffs verantwortlich sein. Ein Wirkstoff besitzt im gelösten Zustand seine größte thermodynamische Aktivität [ siehe ]. Die Löslichkeit einer Substanz wird durch Einschluß in ein Cyclodextrin maßgeblich beeinflußt, da ein Komplex mit neuen physikalischen Eigenschaften entsteht. Liegen reines CA und Komplex nebeneinander vor, wird nicht gebundenes CA leichter in der Vehikelmatrix und durch die Membran diffundieren, da Diffusion direkt abhängig ist von der Molekülgröße. Zusätzlich ist die Diffusion des CA abhängig von den Komplexstabilitätskonstanten. Je stärker ein Cyclodextrin in Wechselwirkung mit Strukturen der Grundlage tritt und je höher seine Konstante mit dem CA ist, desto geringer wird die Diffusion von CA durch die Vehikelmatrix in den Akzeptor sein. Ein Nachweis von diffundierendem CD konnte nicht vorgenommen werden, da die freigesetzten Konzentrationen an CD im Akzeptor unterhalb der Nachweisgrenze lagen.

Das Ausmaß an freiem CA in den Kavitat-enthaltenden Zubereitungen hängt nicht nur von den Komplexstabilitätskonstanten, sondern auch von Konkurrenzreaktionen der beta-Cyclodextrine mit Bestandteilen der Salbengrundlage ab. Ausgehend von den berechneten Komplexstabilitätskonstanten in wässeriger Lösung ( siehe ) müßten die Freisetzungsraten von CA aus den Dimeb-, G2- und Polymer-beta-CD-Systemem stärker differieren. Offensichtlich lassen sich die Affinitäten des Gastmoleküls zu den beta-Cyclodextrinen in wässerigen Systemen nicht unmittelbar auf lipophile halbfeste Systeme übertragen. Diese Beobachtung wurde auch von Orienti et al. [ siehe ] mit Ketoprofen gemacht. Die in verschiedenen Vehikeln ermittelten Stabilitätskonstanten sind signifikant erniedrigt gegenüber den in Wasser ermittelten. Dieses Verhalten könnte durch die unterschiedliche Affinität des Arzneistoffs zum hydrophoben Ring des beta-Cyclodextrins einerseits und dem Vehikel, in dem der Arzneistoff gelöst oder dispergiert ist, andererseits erklärt werden. Es ist davon auszugehen, daß eine größere Löslichkeit eines Arzneistoffs im Vehikel mit einer geringeren Affinität zur hydrophoben Kavität eines beta-Cyclodextrins korreliert.

Aufgrund der Herabsetzung von Komplexstabilitätskonstanten in halbfesten Zubereitungen und möglicher Konkurrenzreaktionen können in wässerigen Systemen gemessene Unterschiede der Wechselwirkungen zwischen Gastmolekül und Cyclodextrinen in halbfesten Zubereitungen nivelliert sein.


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Die Stöchiometrie der in die Salbengrundlagen eingearbeiteten Komplexe spielt zusätzlich eine wichtige Rolle für die Liberation von CA. Ein Überschuß an beta-Cyclodextrinderivat im Komplex, begründet durch periphere Wechselwirkungen der beta-Cyclodextrine mit CA oder mangelnde Reindarstellung, kann das Gleichgewicht zugunsten einer verstärkten ”Komplexformation“ mit Vehikelkomponenten verschieben. Dieser Einfluß wird sich in Abhängigkeit von der Größe der Komplexstabilitätskonstanten bemerkbar machen [ siehe ]. Werden die molaren Verhältnisse der verwendeten Komplexe verglichen, so weist das CA / beta-CD-System das größte molare Verhältnis auf. In Verbindung mit einer relativ großen Komplexstabilitätskonstante ist die erhebliche Verminderung der Liberation von CA erklärbar. Die vergleichsweise niedrigeren Komplexstabilitätskonstanten der CA / Polymer-beta-CD- und G2-beta-CD-Systeme sowie die kleineren molaren Verhältnisse führen zu höheren Freisetzungsraten gegenüber dem CA / beta-CD-System.

Trotz der größeren Komplexstabilitätskonstante, ist die Freisetzungsrate von CA aus dem CA / Dimeb- System im Vehikel doppelt so hoch gegenüber dem CA / beta-CD-System ( siehe ). Es ist anzunehmen, daß Dimeb besondere Affinitäten zu Salbenbestandteilen besitzt und deshalb das Gleichgewicht der Komplexbildung zwischen CA und Dimeb verschoben wird.

Für diese Hypothese sprechen auch Literaturbefunde. Es wird darüber berichtet, daß beta-Cyclodextrine in der Lage sind, mit Hartfett [ siehe ], Fettsäuren [ siehe ], Mono-, Di- und Triglyceriden [ siehe ] Einschlußverbindungen zu bilden. Der Einschluß von Cetylstearyalkohol in beta-Cyclodextrin wurde nachgewiesen [ siehe ]. Aus Literatur geht hervor, daß Dimeb eine besonders hohe Potenz zur Komplexbildung mit lipophilen Molekülen aufweist [ siehe , siehe ].

2.4.3.2. Hydrogele auf Polyacrylatbasis

In siehe ist die Liberation der Systeme CA / Dimeb und CA / G2-beta-CD gegenüber reinem CA aus Hydrogelen dargestellt.


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Abb. 33: Freisetzungsprofile der Systeme CA / Dimeb und CA / G2-beta-CD gegenüber reinem CA aus Hydrogelen in Methanol / Wasser bei 32°C (n=6, P<0,01)

Die In-vitro-Liberation von CA aus der Hydrogel-Formulierung mit Propylenglycol (HP) zeigt sehr hohe Startwerte, die aus dem "burst-effect" resultieren. Die Liberation verläuft demnach nicht membrankontrolliert. Die Lösungsgeschwindigkeit vom CA in der silikonisierten Cuprophan-Membran, vermittelt durch Propylenglycol, ist höher als die Diffusionsgeschwindigkeit im Hydrogel. Dadurch reichert sich der Arzneistoff sehr schnell in der Membran an und gelangt schnell in den Akzeptor.

Die Profile der Systeme mit Dimeb und G2-beta-CD demonstrieren lineare Freisetzungscharakteristiken bis 3 h. Der Diffusionswiderstand der Membran(-imprägnierung) ist im Vergleich zu dem Diffusionswiderstand im Hydrogel sehr viel höher. Nach 3 h sind ca. 90 % CA in der Akzeptorphase nachzuweisen.

In den Hydrogelen mit beta-Cyclodextrin-Zusatz liegt CA vollständig ”solubilisiert“ vor. Nach der Herstellung werden transparente Gele erhalten. Die Mengen an Dimeb bzw. G2-beta-CD zur Löslichmachung von CA können aus den Phasenlöslichkeitsdiagrammen ( siehe ) abgeleitet werden. Es werden 1,0 % Dimeb und 1,2 % G2-beta-CD benötigt, um 0,005 % CA in Wasser zu lösen ( siehe , 4.3.1).


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Das Hydrogel ohne CD mit 5 % PG-Zusatz ist dagegen milchig trüb. Die Menge von 5 % PG im Hydrogel ist nicht ausreichend, um sämtliches CA in Lösung zu bringen.

Durch beta-Cyclodextrine eingeschlossenes und damit gelöstes CA steht der Diffusion durch eine Zweischichtenmembran (Cuprophan mit Silikonöl beschichtet) nicht oder nur bedingt zur Verfügung [ siehe ]. Da die Komplexstabilitätskonstante von CA / Dimeb im Vergleich zu CA / G2-beta-CD relativ groß ist, liegt im Hydrogel mit Dimeb das gelöste CA in einem höheren Ausmaß komplexgebunden vor als im Hydrogel mit G2-beta-CD. Damit ist der Anteil an freiem und gelöstem CA, das durch die Membran diffundieren kann, im Hydrogel mit CA / Dimeb kleiner als im Hydrogel mit CA / G2-beta-CD. Es resultiert eine geringere Diffusionsrate.

2.4.3.3. Hydrogele mit Liposomen

Im Rahmen der Fragestellung einer Retardierung der perkutanen Resorption von CA sind CA / Liposomen-Systeme in die In-vivo-Untersuchungen einbezogen worden. Diese sollen in der vorliegenden Arbeit als Ergänzung betrachtet werden, da sie nicht in direktem Zusammenhang mit der molekularen CD-Verkapselung stehen. Liposomale Formulierungen können effektive Freisetzungssysteme für die Behandlung von Hautkrankheiten darstellen. Insofern wächst das Interesse an Liposomen für die externe Therapie, um effektive lokale Wirkung mit geringen systemischen Effekten zu verbinden [ siehe ].

Für die Entwicklung eines Hydrogels mit der Indikation Psoriasis wäre eine Liposomen-Hydrogel-Zubereitung durchaus interessant. Ein wesentlicher Vorteil könnte hierbei die Verarbeitbarkeit von CA ohne Alkohol sowie eine hohe Stabilität des Arzneistoffs in einer wässerigen Grundlage sein.

Werden Liposomendispersionen in Grundlagen eingearbeitet, so muß gewährleistet sein, daß die Vesikeln intakt bleiben und ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften nicht durch das Vehikel verändert werden. Cremes benötigen als Zweiphasensysteme Emulgatoren, die zur unerwünschten Fusion der Vesikeln führen können. Detergentien werden in Liposomendispersionen in den Bilayer inkorporiert und verursachen Veränderungen in seinen physikalischen Eigenschaften [ siehe ]. In Untersuchungen zur topischen


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Applikation und klinischen Testung von Liposomen werden hauptsächlich wässerige Liposomendispersionen [ siehe ] oder Hydrogele [ siehe ] eingesetzt. Am geeignetsten erscheint eine Hydrogelgrundlage, die gleichzeitig die Viskosität des Systems erhöht, zur Immobilisierung der Vesikeln führt und damit zur Stabilisierung der Liposomendispersion beiträgt. Um konzentrationsbedingte Wechselwirkungen im System möglichst gering zu halten, wurde in Form von Polyacrylsäure ein Gelbildner ausgewählt, der schon bei niedrigen Konzentrationen Gele hoher Viskosität ausbildet.

Zur Herstellung des liposomenhaltigen Hydrogels wurde vorneutralisierte Polyacrylsäure in die Liposomendispersion eingerührt, um ein Ausflocken der Dispersion (keine Gelbildung) bei Zugabe von Polyacrylsäure (pH=3) zu vermeiden ( siehe , 4.3.2). Aufgrund einer mittleren Vesikelgröße von < 100 nm und der Konzentration an Liposomen von 10 % ist von der Bildung unilamellarer Liposomen auszugehen. Eine Einlagerung des lipophilen Secosteroids CA in den Bilayer ist anzunehmen [ siehe ]. Mit den Liposomenzubereitungen wurden keine In-vitro-Untersuchungen durchgeführt.

2.4.4. In-vivo-Studien am Tiermodell

Im Verlauf der Wirkstoffindung (CA) hat die Experimentelle Dermatologie, Schering AG Berlin, ein Tiermodell ( siehe , 4.3.9 siehe ) als Screeningtest zur Ermittlung der lokalen und systemischen Wirksamkeit nach topischer Vitamin-D-Applikation entwickelt.

In diesem Modell wurden die V-Formulierung mit dem CA / beta-CD-Kavitat, die Hydrogele mit den Systemen CA / Dimeb und CA / G2-beta-CD und eine Liposomenpräparation geprüft. Die V-Formulierung mit dem CA / beta-CD-Kavitat wurde ausgewählt, weil diese Präparation die stärkste Retardierung in den In-vitro-Liberationsstudien gezeigt hatte. Die Hydrogele gelangten in die Untersuchungen, um vor allem das Verhältnis zwischen Effektivität und Verträglichkeit gegenüber der Referenzformulierung mit Propylenglykol zu testen.

Die dünne Haut haarloser Mäuse reagiert sensibel und schnell auf äußere Einflüsse. Beispielsweise wird durch Kontakt mit einem Irritanz [ siehe , siehe ] eine epidermale Hyperproliferation und Hyperplasie ausgelöst. Diese Eigenschaften der Maushaut ermöglichen es, die Verträglichkeit von flüssigen und halbfesten Grundlagen nach topischer Applikation bereits nach kurzen Behandlungszeiten zu erfassen.


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Nach topischer Applikation auf normaler Maushaut lösen Vitamin-D-Analoga, im Gegensatz zum antiproliferativen Effekt in Human- und Maus-Keratinozytenkulturen und in der Psoriasis, eine epidermale Proliferations- und Differenzierungsinduktion aus. Diese Wirkung resultiert in einer dosis- und zeitabhängigen Zunahme der Epidermisdicke und einer verstärkten Hautschuppenbildung. Die Epidermisdickenzunahme kann histologisch gut beobachtet werden. Darüber hinaus wird ein dosis- und zeitabhängiges Erythem induziert, jedoch wird dieser Parameter durch die Epidermishyperplasie und Schuppenbildung überdeckt und ist schlecht quantifizierbar.

Vitamin-D-Analoga, die nur schwach an den Vitamin-D-Rezeptor binden, zeigen in diesem Modell nur eine geringere Reaktion. Daher werden die nach lokaler Applikation vom CA beobachteten Effekte als rezeptormediiert und Vitamin-D-spezifisch angesehen. Systemisch verfügbare und aktive Vitamin-D-Analoga mobilisieren dosis- und zeitabhängig Calcium aus Darm und Knochen (Hypercalcämie). Ein Anstieg des Serumcalciumspiegels nach topischer Applikation läßt daher prinzipiell indirekte Rückschlüsse auf die Freisetzung des Wirkstoffs aus der Grundlage und dessen Penetration durch die Haut zu.

2.4.4.1. Ergebnisse

Die Wirkungen der Grundlagen sowie die Verumwirkungen auf die Epidermishyperplasie sind in siehe dargestellt. Im Vergleich mit unbehandelter Maushaut haben die Placebo-Hydrogel-Grundlagen keinen signifikanten Einfluß auf die Epidermisdicke, mit Ausnahme des Liposomenplacebos, der eine leichte Wirkung zeigt. Alle anderen getesteten Zubereitungen führten zu einer Epidermishyperplasie, inklusive der Placebo-Salbenformulierungen. Die eingesetzten Salben auf Kohlenwasserstoffbasis besitzen okklusiven Charakter. Die beobachtete Hyperplasie der Epidermis in der Maushaut ist vermutlich auf die Salbenhilfsstoffe (z.B. Emulgatoren) zurückzuführen, deren Wirkung durch die Okklusion verstärkt werden kann.

Psorcutan® (Wirkstoff: Calcipotriol) diente als Referenzformulierung in diesem Modell zur Einstufung der Wirkstärke der neuen Formulierungen. Der neue Wirkstoff CA in identischer Salbenformulierung erwies sich in diesem Modell als etwas wirksamer als Psorcutan. Ähnlich wirksam wie Psorcutan verhielt sich das Polyacrylatgel mit 5 % Propylenglycol.


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Abb. 34: Epidermis-Hyperplasie

Der Einschluß des CA in das beta-CD führte im Falle der Salbenformulierung zu einem deutlich verminderten Effekt in bezug auf die Epidermishyperplasie. Die Zunahme der Epidermisdicke ist nicht signifikant gegenüber dem Placebo ausgeprägt. Das Hydrogel mit CA / Dimeb-System zeigt ebenso keine ausgeprägte Wirkung auf die Epidermisdicke. Das CA / G2-beta-CD-Hydrogel und die Inkorporierung des Wirkstoffs in Liposomen bzw. in Liposomenmembranen führten zu einem signifikanten, aber verminderten Effekt auf die Epidermis gegenüber den Referenzformulierungen ohne beta-Cyclodextrin. In siehe ist die um die Grundlagen korrigierte Verumwirkung graphisch dargestellt.

Systemisch verfügbare Vitamin-D-Derivate können substanzspezifisch eine Hypercalcämie induzieren. Die systemische Wirkstoffbelastung wird mit Hilfe des Serumcalciumspiegels und des Körpergewichts abgeschätzt.


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Abb. 35: Epidermis-Hyperplasie, Verum- abzüglich Placebowirkung

In siehe sind die Placebo-Grundlagen sowie die Verumwirkung (CA-haltig) auf die Serumcalciumkonzentration dargestellt. Im Vergleich mit unbehandelter Maushaut haben die Grundlagen bis auf die V-Zubereitung keinen signifikanten Einfluß auf die Serumcalciumkonzentration (p=0,05). Die Verumwirkung aller Formulierungen ist gegenüber den Placebos dagegen statistisch signifikant ausgeprägt (p=0,05).

Tendenziell am stärksten ist dieser Effekt nach Applikation von Psorcutan und der V-Formulierung zu beobachten.


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Abb. 36: Serumcalciumkonzentration

Zur Veranschaulichung sind in siehe die Grundlagenwirkungen erneut von den Verumwirkungen subtrahiert worden. Nach Abzug der Placebowirkung zeigt das Hydrogel in Anwesenheit von 1,2 % G2-beta-CD die stärkste Wirkung auf die Serumcalciumkonzentration. Etwas schwächere Effekte sind bei der Referenz Psorcutan sowie dem Hydrogel mit Liposomen zu beobachten. Die anderen Zubereitungen zeigen geringere Werte in vergleichbarer Größenordnung.

Interessanterweise zeigt sich, daß die gemessenen Serumcalciumkonzentrationen im Falle der beta-Cyclodextrin-Systeme nicht mit den Effekten der Epidermishyperplasie korrelieren. Diese Tatsache führt zu folgenden Annahmen: Da die Mäuse während der topischen Behandlung keine Halskrause trugen, ist eine orale Aufnahme nicht auszuschließen. Dies würde einen Anstieg der Serumcalciumkonzentration durch alle Formulierungen erklären. Die gefundenen Erhöhungen des Serumcalciumspiegels können daher lediglich einen orientierenden Hinweis bezüglich Freisetzung des Wirkstoffs aus der Grundlage und dessen Permeation durch die Haut liefern.


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In weiteren getesteten Formulierungen<2> wurde allerdings die Beobachtung gemacht, daß eine schwache Hautwirkung bezüglich der gemessenen Parameter nicht mit einer Hypercalcämie im Zusammenhang steht. Dies könnte darauf hindeuten, daß die Freisetzung und Penetration des Wirkstoffs aus diesen Vehikeln geringer ist. Darüber hinaus spricht diese Beobachtung dafür, daß wahrscheinlich das oral aufgenommene CA für die Auslösung einer Hypercalcämie quantitativ keine Bedeutung besitzt. In diesem Fall ist anzunehmen, daß die Zubereitungen mit Cyclodextrin-Systemen und Liposomen geringere Epidermishyperplasie verursachen, aber trotzdem eine Permeation von CA durch die Maushaut stattfindet ( siehe , 2.4.4.2).

Abb. 37: Serumcalciumkonzentration, Verum- minus Placebowirkung

2.4.4.2. Vergleich der In-vitro- / In-vivo-Daten

Untersuchungen zur perkutanen Resorption werden aus unterschiedlichen Zielsetzungen heraus unternommen und liefern je nach Anforderung und Betrachtungsweise des Durchführenden bestimmte Ausschnitte des gesamten Resorptionsprozesses. Eine


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Methode, die alle Abschnitte des Prozesses der perkutanen Resorption, von der Liberation bis hin zu pharmakodynamischen Effekten nach Penetration oder Permeation, modelliert, kann es nicht geben ( siehe , 1.1).

Da in In-vitro-Modellen nur Teilaspekte der Arzneistoffverfügbarkeit geprüft werden können, ist eine In-vitro / In-vivo-Korrelation nur in definierten Fällen zulässig.

Bei Messungen der Liberation aus Dermatika sind die Voraussetzungen für ein aussagekräftiges Experiment hinreichend definiert, wenn der Akzeptor sink-Bedingungen zuläßt und die gewählte Membran keinen geschwindigkeitslimitierenden Faktor darstellt. Die Geschwindigkeit der Liberation wird dann durch die Diffusion des Arzneistoffs im Vehikel und/oder auch durch die Auflösung suspendierten Arzneistoffs bestimmt. In diesem Fall ist die liberierte Menge der Wurzel der Zeit proportional. Dieser Parameter repräsentiert als gemessene ”maximale Liberation der Zubereitung“ eine Größe, die auf Zustand und Eigenschaften der Formulierung schließen läßt ( siehe , 2.2.1 siehe ). Inwieweit diese Größe in vivo relevant ist, hängt vom Applikationsort und dem Zustand der Haut ab. Je geringer der Diffusionswiderstand an der applizierten Stelle ist, desto stärker beeinflußt die Liberation aus dem Vehikel den Resorptionsprozeß in und durch die Haut. Hautstellen mit fehlender oder krankhaft veränderter Hornschicht (z.B. bei Psoriasis) oder nicht verhornte Schleimhäute büßen ihre Barriereeigenschaften ein. In diesen Fällen kann die In-vivo-Resorptionsgeschwindigkeit des Arzneistoffs der In-vitro-Liberationsgeschwindigkeit nahe kommen.

Zur Abschätzung von Konzentrationsprofilen in der Haut und des transdermalen Flusses (systemische Verfügbarkeit) werden In-vitro-Untersuchungen mit exzidierter Haut durchgeführt. Die Haut von Menschen und Säugetieren hat zwar eine grundsätzlich ähnliche Struktur, allerdings unterscheiden sich ihre Permeabilitäten beträchtlich [ siehe ].

Die Haut haarloser Mäuse wird in der Erforschung transdermaler Resorption aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit Humanhaut weit verbreitet eingesetzt. Das Stratum corneum von haarlosen Mäusen ist jedoch weniger als halb so dick, verglichen mit Humanhaut. Dies zeigt sich auch in einer mehr als zweifachen Reduktion der Barriereeigenschaften [ siehe ].

In Abschnitt 2.2.5 werden die Freisetzungsprofile von Advantan-Zubereitungen aus In-vitro-Liberationsuntersuchungen mit den Ergebnissen an haarloser Maushaut in ihrer Rangordnung verglichen. Die vorgestellte Liberationsmethode besitzt Vorteile gegenüber In-vitro-screening-Untersuchungen mit haarloser Maushaut. Für Aussagen über pharma


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kodynamische Effekte in der Haut und im System müssen allerdings In-vivo-Untersuchungen durchgeführt werden.

Die In-vitro-Liberationsstudien mit CA / beta-Cyclodextrin-Systemen aus Fettsalben demonstrieren eine Reduktion der Freisetzung von CA nach erfolgreicher Assoziatbildung mit den eingesetzten beta-CD-Derivaten. Die stärkste Retardierung kann durch Einschluß mit beta-CD erreicht werden.

Im Nacktmausmodell zeigt die V-Formulierung mit beta-CD eine deutlich verminderte Effektivität in Hinblick auf die Epidermishyperplasie ( siehe ). Es liegt nahe, die verminderte Liberation von CA aus dem Vehikel für dieses Phänomen verantwortlich zu machen. Betrachtet man die Ergebnisse der In-vitro-Freisetzungen aus den Hydrogel-Formulierungen, sind die Unterschiede zur Referenzformulierung mit Propylenglycol vor allem in der Freisetzungscharakteristik zu suchen ( siehe , 2.4.3.2). Nach 3 h liberieren alle drei Hydrogele 90 % CA in den Akzeptor. Die Freisetzungsraten entsprechen in ihrer Rangordnung dem Einfluß auf die Epidermisdicke haarloser Mäuse, allerdings sind die Wirkungen der beta-CD-Systeme maßgeblich vermindert gegenüber der Referenz Psorcutan®. Es ist nicht anzunehmen, daß die gemessenen Unterschiede in der Freisetzung in vitro für die eklatanten Unterschiede in vivo verantwortlich sind. Unter diesen Gesichtspunkten muß der Einfluß der beta-Cyclodextrine auf pharmakodynamische Zusammenhänge angenommen werden.

Diese These wird auch durch die Tatsache gestützt, daß bei allen Formulierungen erhöhte Serumcalciumkonzentrationen nach erfolgter Behandlung gemessen wurden. Damit wurde gezeigt, daß CA das Blutkompartiment erreichte und eine Wirkung entfalten konnte. Die Wirkung von CA am Vitamin D-Rezeptor in der Haut haarloser Mäuse könnte demnach durch die Anwesenheit der CD verringert oder sogar verhindert sein. Diese Vorgänge setzen eine Diffusion intakter Komplexe in die Epidermis voraus. Über die Vorgänge der Verteilung und Diffusion von Komplexen im Vergleich zu den Einzelkomponenten, Wirts- und Gastmolekül, sind keine experimentellen Daten erhoben worden. Eine Differenzierung der beschriebenen Diffusionsvorgänge von reinem CA bzw. CA im beta-CD-System im Vehikel und zwischen Haut und Vehikel konnte daher nur auf theoretischer Basis erfolgen.


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2.4.5. Stabilitätsuntersuchungen

Als konjugiertes Trien unterliegt das CA verschiedenen Isomerisierungsreaktionen, wobei die Isomerisierung zum Prävitamin des CA die größte Bedeutung hat. Während das CA in Kristallform nicht isomerisiert, liegt in Lösung ein Gleichgewicht zwischen dem CA und dem Prävitamin vor. Die Strukturformel des Prävitamins ist siehe zu entnehmen. Die IUPAC-Bezeichnung des Prävitamins lautet Isopropyl (6Z,22E)-(1S,3R,24R)-1,3,24-trihydroxy-9,10-secocholesta-5(10),6,8,22-tetraene-25-carboxylat.

Abb. 38: Prävitamin des CA

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Stabilitätsuntersuchungen an zwei ausgewählten Formulierungen auf Basis der TK-Rezeptur durchgeführt (vgl. Abschnitt 2.4.2). Da die TK-Rezeptur als Ölkörper Miglyol 812 enthält, in dem sich das CA zu einem gewissen Anteil löst, sind im Laufe der Zeit verschiedene Abbau- und Isomerisierungsreaktionen des Moleküls zu erwarten. Der Einschluß des CA in ein Kavitat könnte diese Abbau- und Isomerisierungsreaktionen teilweise verhindern. Um dies zu prüfen, wurden eine CA / Dimeb-haltige und eine CD-freie TK-Zubereitung in Konzentrationen von 0,01 %, jeweils bezogen auf den Wirkstoff, hergestellt und über einen Zeitraum von sechs Monaten bei 25°C und 40°C eingelagert. Zu definierten Zeitpunkten wurde der Gehalt an CA mittels HPLC überprüft ( siehe , 4.3.10). Die so ermittelten Gehaltswerte sind graphisch in siehe dargestellt.

Bei den bei 25°C gelagerten Proben ist eine leichte Abnahme des Gehaltes an CA über den Gesamtzeitraum von sechs Monaten zu verzeichnen. Die bei 40°C gelagerten Proben verhalten sich in den ersten drei Monaten ähnlich den bei 25°C gelagerten Proben, zeigen jedoch nach sechs Monaten eine deutliche Abnahme des Gehaltes an CA, die bis zu 40 % beträgt. Die zwei Lagerbedingungen lassen leichte Unterschiede zwischen den beiden Formulierungen erkennen: Der Gehalt an CA in der Kavitat-Formu


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lierung liegt jeweils etwas höher (ca. 5 %) als in der Formulierung mit reinem CA. Offensichtlich bewirkt der Einschluß des CA-Moleküls in das Dimeb eine leichte Stabilitätserhöhung des CA in diesem System.

Abb. 49: Stabilität von CA in TK-Formulierungen bei 25°C und 40°C


Fußnoten:
<1>

Im Akzeptor gelöst vorliegendes MPA unterschreitet 10 % seiner Sättigungskonzentration

<2>

nicht veröffentlicht


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