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Kapitel 4. Experimenteller Teil

4.1. Substanzen

Substanzen	Hersteller
Aceton	Merck, Darmstadt
Acetonitril	Riedel-de Haen, Hannover
Advantan®-Creme	Schering AG, Berlin
Advantan®-Fettsalbe	Schering AG, Berlin
Advantan®-Lösung	Schering AG, Berlin
Advantan®-Salbe	Schering AG, Berlin
Bienenwachs	Astor-Stag SA, Eupen, Belgien
Calcitriol-Analogon	Schering AG, Berlin
Carbopol® 980	Goodrich, Neuss
Carboxyethyl--cyclodextrin	Cyclolab, Budapest, Ungarn
-Cyclodextrin	Wacker Chemie AG, München
-Cyclodextrin-Polymer (highly soluble)	Cyclolab, Budapest, Ungarn
Dickflüssiges Paraffin	Parafluid, Hamburg
Diethylether	Merck, Darmstadt
Diisopropyladipat	Dragocco, Holzminden
1.8-Dimethyl--cyclodextrin (Dimeb)	Wacker Chemie AG, München
Dinatriumhydrogenphosphat	Merck, Darmstadt
Dioxan	Merck, Darmstadt
Ethanol	Merck, Darmstadt
Ethylacetat	Merck, Darmstadt
Glycerolmonostearat	Henkel, Düsseldorf
Hydroxypropyl--cyclodextrin	Wacker Chemie AG, München
Isopropylmyristat (IPM)	Merck, Darmstadt

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Substanzen	Bezugsquelle
Kaliumdihydrogenphosphat	Merck, Darmstadt
Lipoid S 100, Sojalecithin	Lipoid GmbH. Ludwigshafen
Maltosyl--Cyclodextrin	Ensuiko Sugar Ref. Co., Ltd., Yokohama, Japan
Methanol	Riedel-de Haen, Hannover
Methylprednisolonaceponat (MPA)	Schering AG, Berlin
mikrokristallines Wachs	Astor-Stag SA, Eupen, Belgien
mittelkettige Triglyceride (Miglyol® 812)	Hüls AG, Witten
Natriumazid	Riedel-de Haen, Hannover
Natriumchlorid	Merck, Darmstadt
Natriumhydroxid	Merck, Darmstadt
n-Heptan	Merck, Darmstadt
Plastibase®	Caelo, Hilden
Polyoxyethylen-2-stearylalkohol (Brij® 72)	ICE, Essen
Polyvinylpyrrolidon (PVP) Kollidon® 12 PF	BASF, Ludwigshafen
Propylenglycol	Merck, Darmstadt
Psorcutan®	Leo, Kopenhagen, Dänemark
Rinderserumalbumin	Serva, Heidelberg
Silikonöl AK 350	Wacker Chemie AG, München
Softisan® 649	Hüls, AG, Witten
Sojaöl AK 350	Wacker Chemie AG, München
Toluol	Merck, Darmstadt
Weißes Vaselin	Esso AG, Hamburg

Alle verwendeten Chemikalien und Stoffe haben entweder Arzneibuchqualität oder entsprechen den Anforderungen von Prüfspezifikationen der Schering AG Berlin.

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4.2. Geräte

Geräte	Bezugsquelle
Ultrazentrifuge	Heraeus Sepatech GmbH, Osterode
IKA TER 2 Temperierbad/Magnetrührer	IKA Labortechnik, Staufen
Telesystem 605 EM/FT 200	H+P Labortechnik GmbH, München
500 MHz-Spektrometer, Typ AMX 500	Bruker, Karlsruhe
Lichtmikroskop Zeiss Axioplan mit installierter THMS 600 Heizkammer	Carl Zeiss, Oberkochen
Thermoanalytisches System TA 8000 mit Meß-Modul DSC 820 und Datenstation TAS 810	Mettler, Gießen
-Szintillator, Betaszint BF 5000/300	Berthold, Wildbad
Durchflußwasserbad Typ 001 3292	Haake, Karlsruhe
Sonorex Super Ultraschallbad RK 103H	Bandelin Elec., Berlin
Rüttelapparatur SM	unbekannt
Colora Gefrierschrank UF 85-300 S	Colora Meßtechnik GmbH, Lorch
Gefriertrocknungsanlage Lyosystem GT3	Leybold-Heraeus, Köln
Submicron Particle Sizer, Autodilute, Model 370 (PCS)	Nicomb PSS, Santa Barbara, USA
Rotavapor®-R	Fa. Büchi, Flawil, Schweiz
Millipore “high press filter holder“	Millipore Corporation, Milford, USA
IKA Rührgerät RW 20 DZM mit Flächen- bzw. Flügelrührer	IKA Labortechnik, Staufen
Celluloseacetat-Filter	Sartorius®, Göttingen
Polycarbonat-Filter	Nucleopore®, Costar, Tübingen
Isokratisches HPLC-Komponentensystem	siehe 4.3.10
NMR-Spektrometer AMX 500	Bruker, Karlsruhe
Rotationsviskosimeter Rheomat 115 Thermostat Rheotherm 115 Rheoanalyser Meßsystem MS 114 EDV-System, Software SWR 37	Fa. Mettler, Schwerzenbach, Schweiz

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Tabelle 12: Franz-Diffusionszellsysteme

	Apparatur 1	Apparatur 2
Diffusionszelltyp	Franz-Zelle FDC-400 Improved flat ground	Franz-Zelle FDC-400 Improved flat ground
Membrandurchmesser	9 mm	25 mm
Membranfläche	0,64 cm²	4,9 cm²
Probenmenge	ca. 300 mg	ca. 400 mg
Schichtdicke (Probe)	0,4-0,7 cm	~1 mm
Volumen des Akzeptors	4 ml	18,5 ml
Versuchsaufbau	9 Franz-Zellen / Konsole	6 Franz-Zellen / Konsole

4.3. Methoden

4.3.1. Herstellung wässeriger Lösungen des Calcitriol-Analogon (CA) mit Cyclodextrinen

Zur Herstellung der wässerigen Lösungen vom CA mit Dimeb bzw. G2--CD wurden 3,0 g ( 1%) bzw. 3,6 g ( 1,2%) Cyclodextrin in einen Jodzahlkolben mit Schliff eingewogen und in 300 ml gereinigtem Wasser im Ultraschallbad -zur besseren Benetzung- gelöst. Sodann wurden jeweils 15,0 mg CA-Substanz unter Rühren mittels Magnetrührer den Lösungen zugegeben. Anschließend wurde mit Hilfe einer Rüttelapparatur agitiert bis klare Lösungen entstanden.

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4.3.2. Herstellung von Liposomen

Zur Herstellung der Liposomen wurden 35 g Sojalecithin Lipoid S 100 bei 60°C mit 200 ml Ethanol (96 %) in einem 2 L-Rundkolben zur Lösung gebracht. Anschließend wurde die Lipoidlösung mittels Rotationsverdampfer bei 60°C auf dem Wasserbad zu einem Film, der sich an der Wandung des Kolbens niederschlug, eingeengt. Der Film wurde in ca. 300 ml gereinigtem Wasser dispergiert. Die Suspension wurde 6 x über Polycarbonat-Filter (s.u.) mit einem Millipore “high press filter holder“ extrudiert:

Porendurchmesser	Preßdruck
1,0 µm	2 MPa
0,6 µm	< 2 MPa
0,4 µm	< 2 MPa
0,2 µm	6 MPa
0,1 µm	8 MPa
0,05 µm	6 Mpa

Der mittlere Vesikeldurchmesser und die relative Standardabweichung der Liposomengrößenverteilung wurde mit Hilfe der Photonen-Korrelations-Spektroskopie (PCS), einem Verfahren der quasielastischen Lichtstreuung, gemessen. Daraus resultierte eine mittlere Vesikelgröße von 68 nm (Vk:23,9 %). Zuletzt erfolgte die Abfüllung der kolloid-dispersen Lösung über einen sterilen Druckfilter (0,2 µm Celluloseacetat) in 100 ml-Glasvials.

Zur Beladung der Liposomen wurden 5,0 mg CA in einen Jodzahlkolben eingewogen. Nach Zugabe von 100 ml wässeriger Liposomendispersion (10 % Lipidanteil) wurde 24 h mittels Magnetrührer gerührt.

4.3.3. Herstellung fester Kavitate

Die Herstellung der Kavitate mit nativem -CD durch Kopräzipitation wurde in Anlehnung an die Herstellung des Einschlusses von Vitamin D3 in -CD nach [ ] durchgeführt. Dafür wurden 20 ml Ethanol (60 %) in einem Jodzahlkolben auf 60°C erwärmt. Darin wurden 50 mg (0,1 mmol) CA unter Rühren vollständig gelöst. 600 mg (0,53 mmol) -Cylcodextrin wurden zugefügt und mittels Magnetrührer bis zum Entstehen einer klaren Lösung gerührt.

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Die Ausbeute an getrocknetem Kopräzipitat bei diesem Verfahren betrug ca. 70-80 %, nach Filtration des gefällten Produktes (Nutsche). Das Produkt wurde über Phosphorpentoxid im Exsikkator getrocknet und mehrmals mit 1 ml Aceton gewaschen. Die Aufbewahrung erfolgte in Glasvials bei 6-8°C unter Lichtausschluß.

Für die weiteren eingesetzten Cyclodextrine ( ) gelangte die Knetmethode zur Anwendung. Eine definierte Menge an Cyclodextrin wurde in einem Porzellanmörser vorgelegt und mit dem jeweiligen Lösungsmittel angefeuchtet (ca. 0,2-0,5 ml), so daß eine pastöse Masse entstand. Eine stöchiometrische Menge CA wurde hinzugegeben und mittels Pistill eingearbeitet. Es wurde geknetet, bis die Beschaffenheit der Masse weiteres Kneten nicht mehr zuließ oder die Masse trocken war. Im Falle von CE--CD und HP--CD(1) und HP--CD(2) war ein Nachfeuchten notwendig, um eine gleichmäßige Durchmischung zu erhalten. In die Untersuchungen gelangte nur HP--CD(2). Die Produkte wurden im Mörser über Phosphorpentoxid im Vakuum mindestens 12 h getrocknet. Anschließend wurde mehrmals mit 1 ml gekühltem Ether gewaschen. Die Lagerung erfolgte in Glasvials bei 6-8°C unter Lichtausschluß.

Tabelle 13: Herstellungsverfahren zur Bildung fester Kavitate

	Cyclodextrin-menge	Wirkstoff-menge	Lösungs-mittel	Knet-dauer	Beschaffen-heit	Literat. Bezug
Dimeb	1,042 g (0,8 mmol)	0,1974 g (0,4 mmol)	Ethanol 96%	20 min.	klebrig, honigartig	[ ]
CE--CD	0,5103 g (0,4 mmol)	0,0995 g (0,2 mmol)	Methanol	10 min.	klebrig, hart	[ ]
G2--CD	1,2185 g (0,8 mmol)	0,199 g (0,4 mmol)	Ethanol 96%	5 min.	pulvrig	[ ]
-CD-Polymer	0,8656 g (ca. 0,2 mmol)	0,100 g (0,2 mmol)	Ethanol 96%	5 min.	klebrig, fest	[ ]
HP--CD(1)	0,3091 g (0,2 mmol)	0,099 g (0,1 mmol)	Wasser	2 min.	hart	[ ]
HP--CD(2)	0,3011 g (0,2 mmol)	0,049 g (0,1 mmol)	Methanol/ Wasser 1:1	2 min.	hart	[ ]

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Zur Herstellung von Dimeb-Kavitaten wurde darüber hinaus die Lyophilisationsmethode herangezogen [ ]. Dazu wurden 3,93 g (2,98 mmol) Dimeb in 100 ml gereinigtem Wasser unter Verwendung eines Ultraschallbades gelöst. Anschließend erfolgte die Zugabe von 0,209 g (0,42 mmol) CA unter Agitation (48 h Schütteln mittels Rüttelapparatur) bis zum Erreichen der maximalen Löslichkeit. Die Dispersion wurde filtriert und das Filtrat in einer Metallkruke bei -79°C in einem Gefrierschrank eingefroren. Die Lyophilisation erfolgte 24 h mittels Gefriertrocknungsanlage Lyosystem GT3. Es resultierte ein lockeres Produkt, das sich leicht aus der Kruke entnehmen ließ. Nach mehrmaligem Waschen mit jeweils 1 ml gekühltem Ether erfolgte die Lagerung in Glasvials bei 6-8°C.

4.3.4. Herstellung physikalischer Mischungen

Die physikalischen Mischungen der sechs Cyclodextrine mit CA wurden für Freisetzungsversuche im analogen molaren Verhältnis, entsprechend den jeweiligen Kavitaten durch fünfminütiges Verreiben der Substanzen im Mörser mittels Pistill hergestellt. Für DSC-Untersuchungen wurden Arzneistoff und Cyclodextrin im Aluminiumtiegel übereinander geschichtet und mit einem Stempel angedrückt.

4.3.5. Beschichtung der Cuprophan-Membran mit Silikonöl

Zur Beschichtung der Cuprophan-Membran mit Silikonöl für die In-vitro-Freisetzungsversuche mit Hydrogelen wurde zunächst eine 2%ige Lösung von Silikonöl (AK 350) in Diethylether hergestellt. Die trockene Cuprophan-Membran wurde für ca. 5 Sekunden in diese Lösung getaucht und anschließend zum Abdampfen des Ethers ausgebreitet, bevor sie auf die Rezeptorkammer aufgespannt wurde.

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4.3.6. Herstellung der halbfesten Zubereitungen

Alle verwendeten Verum- und Placebo-Salben auf der Grundlage von Vaselin, Plastibase oder Triglyceriden wurden nach folgendem Prinzip hergestellt: Die verwendeten Hilfsstoffe bzw. Grundlagen wurden in Stahlkruken eingewogen und bei 60-70°C im Paraffinbad klargeschmolzen. Anschließend wurde die Fettschmelze unter Rühren (ca. 90 Upm) mittels elektrischem Rührwerkzeug (Flächenrührer) kaltgerührt.

Für die Verumansätze bis 100 g dienten Fantaschalen mit Pistill zur Herstellung. Die für die Verumkonzentration erforderliche Menge an Arzneistoff bzw. Kavitat wurde vorgelegt und in kleiner Menge Placebo suspendiert (Stammverreibung). Anschließend wurde die weitere Grundlage in kleinen Anteilen in die Gesamtmenge eingearbeitet.

Die Herstellungsverfahren wurden durch makroskopische und mikroskopische Beurteilung der Produkte auf Qualität geprüft. Die Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß in 50 g Kruken (Fa. Aponorm).

Die Herstellung der verschiedenen Polyacrylatgele ist in schematisch dargestellt.

Abb. 40: Hydrogelherstellung

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Die Herstellung der Liposomen-Hydrogele erforderte energischere Agitation (ca. 400 Upm) beim Auflösen und Homogenisieren von vorneutralisiertem Carbopol 980. Durch Anwesenheit der kolloid-dispersen Lipidphase (10%) war die Ausrichtung der Gelstruktur aufgrund mangelnder Benetzung und Lösung der Polyacrylsäure sonst nicht möglich. Dies hatte eine verstärkte Bildung von Luftblasen zur Folge, die sich im Vakuum entfernen ließen. Die Aufbewahrung erfolgte bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß in 50 g Kruken (Fa. Aponorm).

4.3.7. In-vitro-Liberationsuntersuchungen

Als In-vitro-Liberationsapparatur diente das Diffusionszellsystem nach Franz [41] in einer Konsole mit Rührvorrichtungen (Apparaturen 1 und 2, ). Die Akzeptorphase, auf 32°C ± 0,5 temperiert, wurde blasenfrei in das Zellkompartiment eingefüllt und bei 600 Upm mit Hilfe eines Rührmagneten durchmischt. Das zu prüfende Dermatikum wurde in die offene Donatorvorrichtung der Zelle gebracht, indem die Prüfsubstanz auf die zuvor ca. 15 min mit Akzeptormedium getränkte Membran appliziert wurde. Dazu wurde eine aus Edelstahl angefertigte Schablone auf die auf eine Teflon^®-Platte ausgebreitete Membran gelegt und mit Probe beladen. Anschließend konnte die präparierte Membran mittels Pinzette zwischen Donator- und Akzeptorvorrichtung positioniert werden. Die Probenentnahmen von jeweils 1 ml Akzeptorphase mittels Einmalspritze (Pharma-Plast, DK-Rodby) erfolgten über den Gesamtzeitraum von 6 h nach 30, 60, 120, 180, 240, (300) und 360 min. Das Akzeptorkompartiment wurde anschließend mit der jeweils aliquoten Menge des Akzeptormediums aufgefüllt.

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Die Werte für die Plots wurden aus drei bzw. sechs separaten Diffusionszellen gemittelt sowie Standardabweichungen berechnet. Die Auswertung erfolgte durch lineare Regression nach der Methode der kleinsten Quadrate des linearen Teils der Liberationskurve. Die Dokumentation und Umrechnung der gemessenen Flächenwerte erfolgte mit Hilfe der Software Access*Chrom und anschließender Dokumentation und Auswertung mit Microsoft Excel Version 5.0.

Gleichung 9

,	Qt : pro Zeitspanne freigesetzte Arzneistoffmenge Rt: im gesamten Prüfvolumen vorhandene Arzneistoffmenge Vo: Gesamtvolumen Vp: Probenvolumen at: Gesamtmenge an freigesetztem Arzneistoff zum Zeitpunkt t

4.3.8. Untersuchungen an Maushaut

Permeationsstudien mit tierischer Membran erfolgten unter Verwendung von intakter und gestrippter Bauchhaut (20fach mit Tesafilm^®, Beiersdorf, Hamburg) haarloser Mäuse (Balb/c, nu/nu, Bomholtgard, Dänemark, 4-5 Wochen alt, weiblich) in Analogie ebenfalls mittels Franz-Diffusionszellsystems (vgl. Abschnitt 4.2). ³H-Methylprednisolonaceponat (³H-MPA) wurde als 0,1 %ige Lösung, 0,1 %ige Salbe und 0,1 %ige Fettsalbe in einer Flächendosierung von 5 mg pro cm² Haut appliziert (n=6 oder n=8). Der Zeitverlauf der Radioaktivität, die in das Akzeptormedium von 3,7 ml BSA-Puffer^<3> (pH 7,4), bestehend aus 0,041 M Dinatriumhydrogenphosphat, 0,026 M Kaliumdihydrogenphosphat, 0,154 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumazid und 0,1 % (w/v) Rinderserumalbumin, permeierte, wurde mit einem -Szintillator gemessen. 10 ml Atomlicht (NEN, Boston) wurden zu Aliquots von 0,05 ml Akzeptorfluid zugegeben. Die Probenentnahmen von jeweils 50 µl

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Am Ende des Experiments wurde der verbleibende Arzneistoff von der Hautoberfläche durch Abtupfen mit 5 Wattestäbchen entfernt. Im Falle der intakten Haut wurde das Stratum corneum mit 10 Tesafilmstreifen (s.o) entfernt.

Die Wattestäbchen und Tesafilmstreifen (5 Vials zu je 2 Abrissen) wurden mit je 10 ml TE Lösung (Toluol/Dioxan/Ethylacetat = 2:1:1, V/V) extrahiert und Aliquots von 0,1 ml (Wattepads) und 1 ml (Tesafilmstreifen) in 10 ml Atomlicht vermessen. Die Resthaut wurde in kleine Stücke zerschnitten und in 5 ml TE Lösung ebenfalls extrahiert.

Die Werte für die Plots wurden aus sechs oder acht separaten Diffusionszellen gemittelt sowie Standardabweichungen berechnet.

4.3.9. In-vivo-Untersuchungen

Die Placebo- und Verumformulierungen für das CA sowie die Psorcutan^®-Grundlage wurden frisch hergestellt und innerhalb von 14 Tagen verwendet. Als Referenz dienten der Wirkstoff in Ethanol / Isopropylmyristat (95:5) sowie die kommerziell erhältliche Psorcutan^®-Salbe.

Die Untersuchungen wurden am Rücken männlicher haarloser Mäuse (C₃H hr/hr, Bomholtgaard, Dänemark) durchgeführt (Körpergewicht: 21 bis 25 g). Die Mäuse trugen keine Halskrausen. An 11 aufeinanderfolgenden Tagen wurden 60 µl der jeweiligen Formulierung auf ca. 20 cm² Rückenhaut aufgetragen und leicht einmassiert. Die Haut der in Einzelkäfigen gehaltenen Mäuse wurde nicht okkludiert. Die täglich applizierte Flächendosis des Wirkstoffs (0,005 %, 3 µg/20 cm²/Tag) war bei allen Versuchen konstant.

24 Stunden nach der letzten Behandlung wurden Hautbiopsien zur histomorphometrischen Untersuchung mittels Mikroskop entnommen. Die Werte für die Plots wurden aus jeweils sechs Hautbiopsien gemittelt sowie Standardabweichungen berechnet.

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4.3.10. Gehaltsbestimmungen

Die quantitative Erfassung der Arzneistoffe erfolgte mittels Umkehrphasen-Chromatographie (RP-HPLC) und UV-Detektion. Dazu wurde ein Komponentensystem benutzt. Durch Flächenvergleich nach der Methode des externen Standards wurden die Konzentrationen der Arzneistoffe berechnet.

Die HPLC-Anlage besteht aus:

• HPLC Pumpe SDS 400 (Applied Biosystems Inc., Foster City, USA),
• Autosampler Waters WISP 712 (Millipore Corporation, Milford, USA)
• UV/VIS-Detektor abi 783A (Applied Biosystems Inc., Foster City, USA)
• Software Access*Chrom (Perkin Elmer Nelson Systems Inc., Cupertino, USA)
• Degasser (Optilab, Berlin)

Die verwendeten Parameter für die Bestimmung von Methylprednisolonaceponat waren:

Stationäre Phase:	Polygosil 60 C18, 5 µm, 250 mm × 4,0 mm (Optilab, Berlin)
Mobile Phase:	Methanol / Wasser (7:3, V/V)
Durchflußrate:	2,0 ml/min
Injektionsvolumen:	20 µl
Detektionswellenlänge:	242 nm
Temperatur:	Raumtemperatur

Die verwendeten Parameter für die Bestimmung des Calcitriol-Analogon waren:

Stationäre Phase:	Hypersil MOS, 3 µm, 250 mm×4,0 mm (Optilab, Berlin)
Mobile Phase:	Acetonitril / Wasser (1:1, V/V)
Durchflußrate:	1,0 ml/min
Injektionsvolumen:	100 µl
Detektionswellenlänge:	264 nm
Temperatur:	10°C

Zur Gehaltsbestimmung im Rahmen von In-vitro-Untersuchungen wurde die entnommene Akzeptorphase direkt in das HPLC-System eingespritzt. Der externe Standard wurde im gleichen Lösemittel gelöst.

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Abb. 41: Chromatogramm von CA (V-Rezeptur): a) CA, b) Prävitamin

4.3.11. Differential Scanning Calorimetrie (DSC)

Die thermoanalytischen Untersuchungen wurden als DSC-Messungen im Thermoanalytischen System TA 8000 bei hoher Empfindlichkeit durchgeführt. Die Thermogramme der Präparationen der CA / -Cyclodextrin-Systeme wurden im Bereich von 20 bis 140°C in kalt verschweißten und anschließend 1 mm Durchmesser durchlochten Alutiegeln bei einer Heizrate von 10 K/min aufgenommen. Als Spülgas diente Stickstoff (50 ml/min). Als Probenmenge kamen jeweils ca. 5 mg Substanz zur Einwaage.

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4.3.12. Licht- und Thermomikroskopie

Die Durchführung der thermomikroskopischen Untersuchungen erfolgte mit dem Lichtmikroskop Zeiss Axioplan mit installierter THMS 600 Heizkammer. Die Präparationen der CA / Cyclodextrin-Systeme wurden in Paraffin auf einem Objektträger aufgeschlemmt und bei einer Heizrate von 10 K/min im Bereich von 25 bis 140°C in 200facher Vergrößerung mittels Videokamara aufgezeichnet.

4.3.13. Phasenlöslichkeitsuntersuchungen

Die zur Sättigung des Wasservolumens von 10 ml erforderliche Menge an CA in Anwesenheit von Cyclodextrinen wurde anhand der Ergebnisse von Vorversuchen abgeschätzt. Durchschnittlich etwa dreimal soviel Prüfsubstanz wie die geschätzte Menge wurde in Reagenzgläser mit Schliff eingefüllt und mit 10 ml unterschiedlich konzentrierter Cyclodextrin-Lösungen befüllt. Die Gefäße wurden verschlossen und 24 h lang bei 25°C agitiert. Dazu diente ein Magnetrührer-Wasserbad-Telesystem 605 EM/FT 200. Nach Filtration der Suspensionen durch einen Membranfilter (0,45 µm) wurde der Gehalt an CA mittels RP-HPLC bestimmt.

4.3.14. ¹H-NMR-Spektroskopie

Die ¹H-NMR-Untersuchungen wurden mit einem 500 MHz-Spektrometer, Typ AMX 500 durchgeführt. Die frisch präparierten Kavitate wurden in verschiedenen Lösungsversuchen in 0,5 ml des Lösungsmittels gelöst bzw. dispergiert. Alle Spektren wurden mit einem BB Invers-Probenkopf (5 mm) bei 300 K mit Lösemittelunterdrückung durch Vorsättigung der entsprechenden Signale aufgenommen. Für die NOESY- und ROESY-Spektren wurden die Meßdaten vor der Fouriertransformation mit Sineball-Funktionen multipliziert und nach der Transformation nicht symmetrisiert, bei den COSY-Spektren wurden sie anschließend symmetrisiert.

110

4.3.15. Rheologische Untersuchungen

Für rheologische Untersuchungen diente ein Rotationsviskosimeter, welches sich aus folgenden Komponenten zusammensetzte:

• Rheomat 115
• Thermostat Rheotherm 115
• Rheoanalyser
• Meßsystem MS 114
• EDV-System, Software SWR 37

Prinzip der Methode:

Ein sich in der Probe befindender Meßkörper wird durch einen Elektromotor angetrieben. Das von der Probe auf den Meßkörper ausgeübte Bremsmoment wird im Meßkopf des Rheomats gemessen. Die in der Probe herrschende Schergeschwindigkeit ist eine Funktion der Drehzahl des Meßkörpers und die Schubspannung eine Funktion des Bremsmoments. Aus diesen beiden Größen läßt sich die Viskosität bzw. das Fließverhalten der Probe ableiten.

Durchführung:

30 Minuten vor Arbeitsbeginn wurden der Thermostat (25 ± 0,2°C) und Rheoanalyser und das EDV-System eingeschaltet. Zunächst wurde der Meßkörper in das Meßbecheroberteil eingeführt. Anschließend wurde das Meßbecheroberteil von unten mit Probe gefüllt, wobei gleichzeitig der Meßkörper langsam herausgezogen wurde, bis der Meßbecher zur Hälfte gefüllt war. Oberteil, Unterteil und Dichtungsgummi wurden zusammengeschraubt und von unten in die Temperierkammer mittels Überwurfmutter arretiert. Die Probe wurde auf 25 ± 0,2°C temperiert (ca. 30 min). Anschließend wurde die Probe mit steigender Schergeschwindigkeit (Meßrampe: D= 0 bis 1006 s^-1 / 180 sec) unterworfen. Zur Aufnahme der Meßkurven sowie zur Auswertung diente die Software SWR 37, Fa. Contraves.

Auswertung:

Für die Berechnung der Viskosität wurden max. 30 Meßpunkte verwendet, wobei nur der untere Teil der Aufwärtskure der Auswertung diente (20 bis 600 s^-1 ). Als Regressionsmodell wurde nach Methode der kleinsten Quadrate die Gleichung nach Ostwald ( ) als Berechnungsgrundlage herangezogen.

111

4.3.16. Statistische Prüfverfahren

Eine Signifikanzprüfung von Meßpunkten erfolgte nach Prüfung auf Varianzhomogenität und Normalverteilung mittels t-Test nach Student und wurde mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit (P) von 1 % bzw. 5 % durchgeführt [ ].

Fußnoten:
<3>	es liegen “sink-Bedingungen“ vor

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