Franke, Patrick: Vitamin D3-Analogon / -Cyclodextrin-Kavitate - Herstellung, Charakterisierung und In-vitro-Liberation aus Dermatika -

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Kapitel 4. Experimenteller Teil

4.1. Substanzen

Substanzen

Hersteller

Aceton

Merck, Darmstadt

Acetonitril

Riedel-de Haen, Hannover

Advantan®-Creme

Schering AG, Berlin

Advantan®-Fettsalbe

Schering AG, Berlin

Advantan®-Lösung

Schering AG, Berlin

Advantan®-Salbe

Schering AG, Berlin

Bienenwachs

Astor-Stag SA, Eupen, Belgien

Calcitriol-Analogon

Schering AG, Berlin

Carbopol® 980

Goodrich, Neuss

Carboxyethyl-beta-cyclodextrin

Cyclolab, Budapest, Ungarn

beta-Cyclodextrin

Wacker Chemie AG, München

beta-Cyclodextrin-Polymer (highly soluble)

Cyclolab, Budapest, Ungarn

Dickflüssiges Paraffin

Parafluid, Hamburg

Diethylether

Merck, Darmstadt

Diisopropyladipat

Dragocco, Holzminden

1.8-Dimethyl-beta-cyclodextrin (Dimeb)

Wacker Chemie AG, München

Dinatriumhydrogenphosphat

Merck, Darmstadt

Dioxan

Merck, Darmstadt

Ethanol

Merck, Darmstadt

Ethylacetat

Merck, Darmstadt

Glycerolmonostearat

Henkel, Düsseldorf

Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin

Wacker Chemie AG, München

Isopropylmyristat (IPM)

Merck, Darmstadt


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Substanzen

Bezugsquelle

Kaliumdihydrogenphosphat

Merck, Darmstadt

Lipoid S 100, Sojalecithin

Lipoid GmbH. Ludwigshafen

Maltosyl-beta-Cyclodextrin

Ensuiko Sugar Ref. Co., Ltd., Yokohama, Japan

Methanol

Riedel-de Haen, Hannover

Methylprednisolonaceponat (MPA)

Schering AG, Berlin

mikrokristallines Wachs

Astor-Stag SA, Eupen, Belgien

mittelkettige Triglyceride (Miglyol® 812)

Hüls AG, Witten

Natriumazid

Riedel-de Haen, Hannover

Natriumchlorid

Merck, Darmstadt

Natriumhydroxid

Merck, Darmstadt

n-Heptan

Merck, Darmstadt

Plastibase®

Caelo, Hilden

Polyoxyethylen-2-stearylalkohol (Brij® 72)

ICE, Essen

Polyvinylpyrrolidon (PVP) Kollidon® 12 PF

BASF, Ludwigshafen

Propylenglycol

Merck, Darmstadt

Psorcutan®

Leo, Kopenhagen, Dänemark

Rinderserumalbumin

Serva, Heidelberg

Silikonöl AK 350

Wacker Chemie AG, München

Softisan® 649

Hüls, AG, Witten

Sojaöl AK 350

Wacker Chemie AG, München

Toluol

Merck, Darmstadt

Weißes Vaselin

Esso AG, Hamburg

Alle verwendeten Chemikalien und Stoffe haben entweder Arzneibuchqualität oder entsprechen den Anforderungen von Prüfspezifikationen der Schering AG Berlin.


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4.2. Geräte

Geräte

Bezugsquelle

Ultrazentrifuge

Heraeus Sepatech GmbH, Osterode

IKA TER 2 Temperierbad/Magnetrührer

IKA Labortechnik, Staufen

Telesystem 605 EM/FT 200

H+P Labortechnik GmbH, München

500 MHz-Spektrometer, Typ AMX 500

Bruker, Karlsruhe

Lichtmikroskop Zeiss Axioplan mit installierter THMS 600 Heizkammer

Carl Zeiss, Oberkochen

Thermoanalytisches System TA 8000 mit Meß-Modul DSC 820 und Datenstation TAS 810

Mettler, Gießen

beta-Szintillator, Betaszint BF 5000/300

Berthold, Wildbad

Durchflußwasserbad Typ 001 3292

Haake, Karlsruhe

Sonorex Super Ultraschallbad RK 103H

Bandelin Elec., Berlin

Rüttelapparatur SM

unbekannt

Colora Gefrierschrank UF 85-300 S

Colora Meßtechnik GmbH, Lorch

Gefriertrocknungsanlage Lyosystem GT3

Leybold-Heraeus, Köln

Submicron Particle Sizer, Autodilute, Model 370 (PCS)

Nicomb PSS, Santa Barbara, USA

Rotavapor®-R

Fa. Büchi, Flawil, Schweiz

Millipore “high press filter holder“

Millipore Corporation, Milford, USA

IKA Rührgerät RW 20 DZM mit Flächen- bzw. Flügelrührer

IKA Labortechnik, Staufen

Celluloseacetat-Filter

Sartorius®, Göttingen

Polycarbonat-Filter

Nucleopore®, Costar, Tübingen

Isokratisches HPLC-Komponentensystem

siehe 4.3.10

NMR-Spektrometer AMX 500

Bruker, Karlsruhe

Rotationsviskosimeter

Rheomat 115 Thermostat Rheotherm 115 Rheoanalyser Meßsystem MS 114 EDV-System, Software SWR 37

Fa. Mettler, Schwerzenbach, Schweiz


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Für die In-vitro-Liberationsuntersuchungen gelangten zwei Franz-Diffusionszellsysteme des Herstellers Crown Glass Co. Inc. (Sommerville, NJ, USA) zum Einsatz. Die Apparaturen unterscheiden sich vorrangig in ihren Dimensionen ( siehe ).

Tabelle 12: Franz-Diffusionszellsysteme

Apparatur 1

Apparatur 2

Diffusionszelltyp

Franz-Zelle FDC-400 Improved flat ground

Franz-Zelle FDC-400 Improved flat ground

Membrandurchmesser

9 mm

25 mm

Membranfläche

0,64 cm²

4,9 cm²

Probenmenge

ca. 300 mg

ca. 400 mg

Schichtdicke (Probe)

0,4-0,7 cm

~1 mm

Volumen des Akzeptors

4 ml

18,5 ml

Versuchsaufbau

9 Franz-Zellen / Konsole

6 Franz-Zellen / Konsole

4.3. Methoden

4.3.1. Herstellung wässeriger Lösungen des Calcitriol-Analogon (CA) mit Cyclodextrinen

Zur Herstellung der wässerigen Lösungen vom CA mit Dimeb bzw. G2-beta-CD wurden 3,0 g (cong 1%) bzw. 3,6 g (cong 1,2%) Cyclodextrin in einen Jodzahlkolben mit Schliff eingewogen und in 300 ml gereinigtem Wasser im Ultraschallbad -zur besseren Benetzung- gelöst. Sodann wurden jeweils 15,0 mg CA-Substanz unter Rühren mittels Magnetrührer den Lösungen zugegeben. Anschließend wurde mit Hilfe einer Rüttelapparatur agitiert bis klare Lösungen entstanden.


100

4.3.2. Herstellung von Liposomen

Zur Herstellung der Liposomen wurden 35 g Sojalecithin Lipoid S 100 bei 60°C mit 200 ml Ethanol (96 %) in einem 2 L-Rundkolben zur Lösung gebracht. Anschließend wurde die Lipoidlösung mittels Rotationsverdampfer bei 60°C auf dem Wasserbad zu einem Film, der sich an der Wandung des Kolbens niederschlug, eingeengt. Der Film wurde in ca. 300 ml gereinigtem Wasser dispergiert. Die Suspension wurde 6 x über Polycarbonat-Filter (s.u.) mit einem Millipore “high press filter holder“ extrudiert:

Porendurchmesser

Preßdruck

1,0 µm

2 MPa

0,6 µm

< 2 MPa

0,4 µm

< 2 MPa

0,2 µm

6 MPa

0,1 µm

8 MPa

0,05 µm

6 Mpa

Der mittlere Vesikeldurchmesser und die relative Standardabweichung der Liposomengrößenverteilung wurde mit Hilfe der Photonen-Korrelations-Spektroskopie (PCS), einem Verfahren der quasielastischen Lichtstreuung, gemessen. Daraus resultierte eine mittlere Vesikelgröße von 68 nm (Vk:23,9 %). Zuletzt erfolgte die Abfüllung der kolloid-dispersen Lösung über einen sterilen Druckfilter (0,2 µm Celluloseacetat) in 100 ml-Glasvials.

Zur Beladung der Liposomen wurden 5,0 mg CA in einen Jodzahlkolben eingewogen. Nach Zugabe von 100 ml wässeriger Liposomendispersion (10 % Lipidanteil) wurde 24 h mittels Magnetrührer gerührt.

4.3.3. Herstellung fester Kavitate

Die Herstellung der Kavitate mit nativem beta-CD durch Kopräzipitation wurde in Anlehnung an die Herstellung des Einschlusses von Vitamin D3 in beta-CD nach [ siehe ] durchgeführt. Dafür wurden 20 ml Ethanol (60 %) in einem Jodzahlkolben auf 60°C erwärmt. Darin wurden 50 mg (cong0,1 mmol) CA unter Rühren vollständig gelöst. 600 mg (cong0,53 mmol) beta-Cylcodextrin wurden zugefügt und mittels Magnetrührer bis zum Entstehen einer klaren Lösung gerührt.


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Die Kühlung der Lösung verlief nach folgendem Gradienten (schematische Darstellung):

Die Ausbeute an getrocknetem Kopräzipitat bei diesem Verfahren betrug ca. 70-80 %, nach Filtration des gefällten Produktes (Nutsche). Das Produkt wurde über Phosphorpentoxid im Exsikkator getrocknet und mehrmals mit 1 ml Aceton gewaschen. Die Aufbewahrung erfolgte in Glasvials bei 6-8°C unter Lichtausschluß.

Für die weiteren eingesetzten Cyclodextrine ( siehe ) gelangte die Knetmethode zur Anwendung. Eine definierte Menge an Cyclodextrin wurde in einem Porzellanmörser vorgelegt und mit dem jeweiligen Lösungsmittel angefeuchtet (ca. 0,2-0,5 ml), so daß eine pastöse Masse entstand. Eine stöchiometrische Menge CA wurde hinzugegeben und mittels Pistill eingearbeitet. Es wurde geknetet, bis die Beschaffenheit der Masse weiteres Kneten nicht mehr zuließ oder die Masse trocken war. Im Falle von CE-beta-CD und HP-beta-CD(1) und HP-beta-CD(2) war ein Nachfeuchten notwendig, um eine gleichmäßige Durchmischung zu erhalten. In die Untersuchungen gelangte nur HP-beta-CD(2). Die Produkte wurden im Mörser über Phosphorpentoxid im Vakuum mindestens 12 h getrocknet. Anschließend wurde mehrmals mit 1 ml gekühltem Ether gewaschen. Die Lagerung erfolgte in Glasvials bei 6-8°C unter Lichtausschluß.

Tabelle 13: Herstellungsverfahren zur Bildung fester Kavitate

Cyclodextrin-menge

Wirkstoff-menge

Lösungs-mittel

Knet-dauer

Beschaffen-heit

Literat. Bezug

Dimeb

1,042 g (0,8 mmol)

0,1974 g (0,4 mmol)

Ethanol 96%

20 min.

klebrig, honigartig

[ siehe ]

CE-beta-CD

0,5103 g (0,4 mmol)

0,0995 g (0,2 mmol)

Methanol

10 min.

klebrig, hart

[ siehe ]

G2-beta-CD

1,2185 g (0,8 mmol)

0,199 g (0,4 mmol)

Ethanol 96%

5 min.

pulvrig

[ siehe ]

beta-CD-Polymer

0,8656 g (ca. 0,2 mmol)

0,100 g (0,2 mmol)

Ethanol 96%

5 min.

klebrig, fest

[ siehe ]

HP-beta-CD(1)

0,3091 g (0,2 mmol)

0,099 g (0,1 mmol)

Wasser

2 min.

hart

[ siehe ]

HP-beta-CD(2)

0,3011 g (0,2 mmol)

0,049 g (0,1 mmol)

Methanol/ Wasser 1:1

2 min.

hart

[ siehe ]


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Als weiteres Verfahren für die Präparation von G2-beta-CD-Kavitaten diente die Methode nach Koizumi et al. [ siehe ]. Dazu wurden 0,225 g (cong0,15 mmol) G2-beta-CD und 0,075 g (cong0,15 mmol) CA zu 1 ml Wasser gegeben und die Mischung bei 30°C während 24 h mittels Magnetrührer gerührt. Die Mischung wurde unter Druck (N2) durch einen Polycarbonat-Filter (0,2 µm) filtriert, anschließend 12 h im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet und unter Lichtausschluß bei 6-8°C in Glasvials gelagert.

Zur Herstellung von Dimeb-Kavitaten wurde darüber hinaus die Lyophilisationsmethode herangezogen [ siehe ]. Dazu wurden 3,93 g (cong2,98 mmol) Dimeb in 100 ml gereinigtem Wasser unter Verwendung eines Ultraschallbades gelöst. Anschließend erfolgte die Zugabe von 0,209 g (cong0,42 mmol) CA unter Agitation (48 h Schütteln mittels Rüttelapparatur) bis zum Erreichen der maximalen Löslichkeit. Die Dispersion wurde filtriert und das Filtrat in einer Metallkruke bei -79°C in einem Gefrierschrank eingefroren. Die Lyophilisation erfolgte 24 h mittels Gefriertrocknungsanlage Lyosystem GT3. Es resultierte ein lockeres Produkt, das sich leicht aus der Kruke entnehmen ließ. Nach mehrmaligem Waschen mit jeweils 1 ml gekühltem Ether erfolgte die Lagerung in Glasvials bei 6-8°C.

4.3.4. Herstellung physikalischer Mischungen

Die physikalischen Mischungen der sechs Cyclodextrine mit CA wurden für Freisetzungsversuche im analogen molaren Verhältnis, entsprechend den jeweiligen Kavitaten durch fünfminütiges Verreiben der Substanzen im Mörser mittels Pistill hergestellt. Für DSC-Untersuchungen wurden Arzneistoff und Cyclodextrin im Aluminiumtiegel übereinander geschichtet und mit einem Stempel angedrückt.

4.3.5. Beschichtung der Cuprophan-Membran mit Silikonöl

Zur Beschichtung der Cuprophan-Membran mit Silikonöl für die In-vitro-Freisetzungsversuche mit Hydrogelen wurde zunächst eine 2%ige Lösung von Silikonöl (AK 350) in Diethylether hergestellt. Die trockene Cuprophan-Membran wurde für ca. 5 Sekunden in diese Lösung getaucht und anschließend zum Abdampfen des Ethers ausgebreitet, bevor sie auf die Rezeptorkammer aufgespannt wurde.


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4.3.6. Herstellung der halbfesten Zubereitungen

Alle verwendeten Verum- und Placebo-Salben auf der Grundlage von Vaselin, Plastibase oder Triglyceriden wurden nach folgendem Prinzip hergestellt: Die verwendeten Hilfsstoffe bzw. Grundlagen wurden in Stahlkruken eingewogen und bei 60-70°C im Paraffinbad klargeschmolzen. Anschließend wurde die Fettschmelze unter Rühren (ca. 90 Upm) mittels elektrischem Rührwerkzeug (Flächenrührer) kaltgerührt.

Für die Verumansätze bis 100 g dienten Fantaschalen mit Pistill zur Herstellung. Die für die Verumkonzentration erforderliche Menge an Arzneistoff bzw. Kavitat wurde vorgelegt und in kleiner Menge Placebo suspendiert (Stammverreibung). Anschließend wurde die weitere Grundlage in kleinen Anteilen in die Gesamtmenge eingearbeitet.

Die Herstellungsverfahren wurden durch makroskopische und mikroskopische Beurteilung der Produkte auf Qualität geprüft. Die Lagerung erfolgte bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß in 50 g Kruken (Fa. Aponorm).

Die Herstellung der verschiedenen Polyacrylatgele ist in siehe schematisch dargestellt.

Abb. 40: Hydrogelherstellung


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Dazu wurden 1,8 g vorneutralisiertes Carbopol 980 (380 g Methanol + 30 g NaOH-Plätzchen + 100 g Carbopol 980) nach Aufstreuen und Benetzung in die (jeweils 300 g) vorbereiteten Lösungen von CA + Cyclodextrin ( siehe , 4.3.1), Propylenglycol / Wasser (5:95) oder der Liposomendispersion ( siehe , 4.3.2) mittels elektrischen Flügelrührers eingerührt (ca. 120 Upm). Nach Auflösen des Gelbildners wurde 30 min unter Verwendung eines Flächenrührers homogenisiert (ca. 90 Upm), um ein gleichmäßiges Gelgerüst zu erhalten. Die Hydrogele wurden im Lichtmikroskop auf Gleichmäßigkeit des Gelgerüsts geprüft, indem auf Nichtvorhandensein ungelöster Polyacrylsäure geprüft wurde.

Die Herstellung der Liposomen-Hydrogele erforderte energischere Agitation (ca. 400 Upm) beim Auflösen und Homogenisieren von vorneutralisiertem Carbopol 980. Durch Anwesenheit der kolloid-dispersen Lipidphase (10%) war die Ausrichtung der Gelstruktur aufgrund mangelnder Benetzung und Lösung der Polyacrylsäure sonst nicht möglich. Dies hatte eine verstärkte Bildung von Luftblasen zur Folge, die sich im Vakuum entfernen ließen. Die Aufbewahrung erfolgte bei Raumtemperatur unter Lichtausschluß in 50 g Kruken (Fa. Aponorm).

4.3.7. In-vitro-Liberationsuntersuchungen

Als In-vitro-Liberationsapparatur diente das Diffusionszellsystem nach Franz [41] in einer Konsole mit Rührvorrichtungen (Apparaturen 1 und 2, siehe ). Die Akzeptorphase, auf 32°C ± 0,5 temperiert, wurde blasenfrei in das Zellkompartiment eingefüllt und bei 600 Upm mit Hilfe eines Rührmagneten durchmischt. Das zu prüfende Dermatikum wurde in die offene Donatorvorrichtung der Zelle gebracht, indem die Prüfsubstanz auf die zuvor ca. 15 min mit Akzeptormedium getränkte Membran appliziert wurde. Dazu wurde eine aus Edelstahl angefertigte Schablone auf die auf eine Teflon®-Platte ausgebreitete Membran gelegt und mit Probe beladen. Anschließend konnte die präparierte Membran mittels Pinzette zwischen Donator- und Akzeptorvorrichtung positioniert werden. Die Probenentnahmen von jeweils 1 ml Akzeptorphase mittels Einmalspritze (Pharma-Plast, DK-Rodby) erfolgten über den Gesamtzeitraum von 6 h nach 30, 60, 120, 180, 240, (300) und 360 min. Das Akzeptorkompartiment wurde anschließend mit der jeweils aliquoten Menge des Akzeptormediums aufgefüllt.


105

Die mittels RP-HPLC ( siehe , 4.3.10) bestimmten Gehalte [µg/ml] wurden für die Darstellung der Freisetzungskurven der Arzeistoffe gegen die Wurzel aus der Zeit herangezogen [ siehe ]. Die Berechnung der tatsächlich freigesetzten Menge an Arzneistoff pro Zeiteinheit erfolgte kumulativ unter Berücksichtigung der Verdünnung durch die Probenentnahme mittels siehe .

Die Werte für die Plots wurden aus drei bzw. sechs separaten Diffusionszellen gemittelt sowie Standardabweichungen berechnet. Die Auswertung erfolgte durch lineare Regression nach der Methode der kleinsten Quadrate des linearen Teils der Liberationskurve. Die Dokumentation und Umrechnung der gemessenen Flächenwerte erfolgte mit Hilfe der Software Access*Chrom und anschließender Dokumentation und Auswertung mit Microsoft Excel Version 5.0.

Gleichung 9

,

Qt : pro Zeitspanne freigesetzte Arzneistoffmenge

Rt: im gesamten Prüfvolumen vorhandene Arzneistoffmenge

Vo: Gesamtvolumen

Vp: Probenvolumen

at: Gesamtmenge an freigesetztem Arzneistoff zum Zeitpunkt t

4.3.8. Untersuchungen an Maushaut

Permeationsstudien mit tierischer Membran erfolgten unter Verwendung von intakter und gestrippter Bauchhaut (20fach mit Tesafilm®, Beiersdorf, Hamburg) haarloser Mäuse (Balb/c, nu/nu, Bomholtgard, Dänemark, 4-5 Wochen alt, weiblich) in Analogie ebenfalls mittels Franz-Diffusionszellsystems (vgl. Abschnitt 4.2). 3H-Methylprednisolonaceponat (3H-MPA) wurde als 0,1 %ige Lösung, 0,1 %ige Salbe und 0,1 %ige Fettsalbe in einer Flächendosierung von 5 mg pro cm2 Haut appliziert (n=6 oder n=8). Der Zeitverlauf der Radioaktivität, die in das Akzeptormedium von 3,7 ml BSA-Puffer<3> (pH 7,4), bestehend aus 0,041 M Dinatriumhydrogenphosphat, 0,026 M Kaliumdihydrogenphosphat, 0,154 M Natriumchlorid, 0,015 M Natriumazid und 0,1 % (w/v) Rinderserumalbumin, permeierte, wurde mit einem beta-Szintillator gemessen. 10 ml Atomlicht (NEN, Boston) wurden zu Aliquots von 0,05 ml Akzeptorfluid zugegeben. Die Probenentnahmen von jeweils 50 µl


106

erfolgten über den Gesamtzeitraum von sechs Stunden nach 30, 60, 75, 120, 180, 240 und 360 Minuten. Das entnommene Probenvolumen wurde jeweils durch BSA-Puffer ersetzt. Die erhobenen Daten wurden für die Darstellung der Freisetzungsprofile von 3H-MPA [%] gegen die Wurzel aus der Zeit herangezogen.

Am Ende des Experiments wurde der verbleibende Arzneistoff von der Hautoberfläche durch Abtupfen mit 5 Wattestäbchen entfernt. Im Falle der intakten Haut wurde das Stratum corneum mit 10 Tesafilmstreifen (s.o) entfernt.

Die Wattestäbchen und Tesafilmstreifen (5 Vials zu je 2 Abrissen) wurden mit je 10 ml TE Lösung (Toluol/Dioxan/Ethylacetat = 2:1:1, V/V) extrahiert und Aliquots von 0,1 ml (Wattepads) und 1 ml (Tesafilmstreifen) in 10 ml Atomlicht vermessen. Die Resthaut wurde in kleine Stücke zerschnitten und in 5 ml TE Lösung ebenfalls extrahiert.

Die Werte für die Plots wurden aus sechs oder acht separaten Diffusionszellen gemittelt sowie Standardabweichungen berechnet.

4.3.9. In-vivo-Untersuchungen

Die Placebo- und Verumformulierungen für das CA sowie die Psorcutan®-Grundlage wurden frisch hergestellt und innerhalb von 14 Tagen verwendet. Als Referenz dienten der Wirkstoff in Ethanol / Isopropylmyristat (95:5) sowie die kommerziell erhältliche Psorcutan®-Salbe.

Die Untersuchungen wurden am Rücken männlicher haarloser Mäuse (C3H hr/hr, Bomholtgaard, Dänemark) durchgeführt (Körpergewicht: 21 bis 25 g). Die Mäuse trugen keine Halskrausen. An 11 aufeinanderfolgenden Tagen wurden 60 µl der jeweiligen Formulierung auf ca. 20 cm2 Rückenhaut aufgetragen und leicht einmassiert. Die Haut der in Einzelkäfigen gehaltenen Mäuse wurde nicht okkludiert. Die täglich applizierte Flächendosis des Wirkstoffs (0,005 %, 3 µg/20 cm2/Tag) war bei allen Versuchen konstant.

24 Stunden nach der letzten Behandlung wurden Hautbiopsien zur histomorphometrischen Untersuchung mittels Mikroskop entnommen. Die Werte für die Plots wurden aus jeweils sechs Hautbiopsien gemittelt sowie Standardabweichungen berechnet.


107

4.3.10. Gehaltsbestimmungen

Die quantitative Erfassung der Arzneistoffe erfolgte mittels Umkehrphasen-Chromatographie (RP-HPLC) und UV-Detektion. Dazu wurde ein Komponentensystem benutzt. Durch Flächenvergleich nach der Methode des externen Standards wurden die Konzentrationen der Arzneistoffe berechnet.

Die HPLC-Anlage besteht aus:

Die verwendeten Parameter für die Bestimmung von Methylprednisolonaceponat waren:

  • Stationäre Phase:

Polygosil 60 C18, 5 µm, 250 mm × 4,0 mm (Optilab, Berlin)

  • Mobile Phase:

Methanol / Wasser (7:3, V/V)

  • Durchflußrate:

2,0 ml/min

  • Injektionsvolumen:

20 µl

  • Detektionswellenlänge:

242 nm

  • Temperatur:

Raumtemperatur

Die verwendeten Parameter für die Bestimmung des Calcitriol-Analogon waren:

  • Stationäre Phase:

Hypersil MOS, 3 µm, 250 mm×4,0 mm (Optilab, Berlin)

  • Mobile Phase:

Acetonitril / Wasser (1:1, V/V)

  • Durchflußrate:

1,0 ml/min

  • Injektionsvolumen:

100 µl

  • Detektionswellenlänge:

264 nm

  • Temperatur:

10°C

Zur Gehaltsbestimmung im Rahmen von In-vitro-Untersuchungen wurde die entnommene Akzeptorphase direkt in das HPLC-System eingespritzt. Der externe Standard wurde im gleichen Lösemittel gelöst.


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Zur Gehaltsbestimmung vom CA in Salben wurden ca. 1 g Probe in 50 ml Jodzahlkolben gefüllt, mit 15 ml Heptan versetzt und mit 35,0 ml Methanol / Wasser (7:3, V/V) extrahiert (30 min Schütteln). Anschließend wurde der Jodzahlkolben bei 6°C mindenstens 1 h stehen gelassen, da somit eine bessere Phasentrennung erfolgte. 1 ml aus der Methanol / Wasser-Phase wurde bei 10000 Upm 3 min in einer Ultrazentrifuge zur Abtrennung der Fettphase zentrifugiert. Die klare Lösung wurde anschließend mittels RP-HPLC untersucht. Der externe Standard wurde in Methanol / Wasser (7:3, V/V) gelöst. siehe zeigt ein typisches Chromatogramm von CA in einer bei 25°C 6 Monate gelagerten V-Rezeptur.

Abb. 41: Chromatogramm von CA (V-Rezeptur): a) CA, b) Prävitamin

4.3.11. Differential Scanning Calorimetrie (DSC)

Die thermoanalytischen Untersuchungen wurden als DSC-Messungen im Thermoanalytischen System TA 8000 bei hoher Empfindlichkeit durchgeführt. Die Thermogramme der Präparationen der CA / beta-Cyclodextrin-Systeme wurden im Bereich von 20 bis 140°C in kalt verschweißten und anschließend 1 mm Durchmesser durchlochten Alutiegeln bei einer Heizrate von 10 K/min aufgenommen. Als Spülgas diente Stickstoff (50 ml/min). Als Probenmenge kamen jeweils ca. 5 mg Substanz zur Einwaage.


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4.3.12. Licht- und Thermomikroskopie

Die Durchführung der thermomikroskopischen Untersuchungen erfolgte mit dem Lichtmikroskop Zeiss Axioplan mit installierter THMS 600 Heizkammer. Die Präparationen der CA / Cyclodextrin-Systeme wurden in Paraffin auf einem Objektträger aufgeschlemmt und bei einer Heizrate von 10 K/min im Bereich von 25 bis 140°C in 200facher Vergrößerung mittels Videokamara aufgezeichnet.

4.3.13. Phasenlöslichkeitsuntersuchungen

Die zur Sättigung des Wasservolumens von 10 ml erforderliche Menge an CA in Anwesenheit von Cyclodextrinen wurde anhand der Ergebnisse von Vorversuchen abgeschätzt. Durchschnittlich etwa dreimal soviel Prüfsubstanz wie die geschätzte Menge wurde in Reagenzgläser mit Schliff eingefüllt und mit 10 ml unterschiedlich konzentrierter Cyclodextrin-Lösungen befüllt. Die Gefäße wurden verschlossen und 24 h lang bei 25°C agitiert. Dazu diente ein Magnetrührer-Wasserbad-Telesystem 605 EM/FT 200. Nach Filtration der Suspensionen durch einen Membranfilter (0,45 µm) wurde der Gehalt an CA mittels RP-HPLC bestimmt.

4.3.14. 1H-NMR-Spektroskopie

Die 1H-NMR-Untersuchungen wurden mit einem 500 MHz-Spektrometer, Typ AMX 500 durchgeführt. Die frisch präparierten Kavitate wurden in verschiedenen Lösungsversuchen in 0,5 ml des Lösungsmittels gelöst bzw. dispergiert. Alle Spektren wurden mit einem BB Invers-Probenkopf (5 mm) bei 300 K mit Lösemittelunterdrückung durch Vorsättigung der entsprechenden Signale aufgenommen. Für die NOESY- und ROESY-Spektren wurden die Meßdaten vor der Fouriertransformation mit Sineball-Funktionen multipliziert und nach der Transformation nicht symmetrisiert, bei den COSY-Spektren wurden sie anschließend symmetrisiert.


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4.3.15. Rheologische Untersuchungen

Für rheologische Untersuchungen diente ein Rotationsviskosimeter, welches sich aus folgenden Komponenten zusammensetzte:

Prinzip der Methode:

Ein sich in der Probe befindender Meßkörper wird durch einen Elektromotor angetrieben. Das von der Probe auf den Meßkörper ausgeübte Bremsmoment wird im Meßkopf des Rheomats gemessen. Die in der Probe herrschende Schergeschwindigkeit ist eine Funktion der Drehzahl des Meßkörpers und die Schubspannung eine Funktion des Bremsmoments. Aus diesen beiden Größen läßt sich die Viskosität bzw. das Fließverhalten der Probe ableiten.

Durchführung:

30 Minuten vor Arbeitsbeginn wurden der Thermostat (25 ± 0,2°C) und Rheoanalyser und das EDV-System eingeschaltet. Zunächst wurde der Meßkörper in das Meßbecheroberteil eingeführt. Anschließend wurde das Meßbecheroberteil von unten mit Probe gefüllt, wobei gleichzeitig der Meßkörper langsam herausgezogen wurde, bis der Meßbecher zur Hälfte gefüllt war. Oberteil, Unterteil und Dichtungsgummi wurden zusammengeschraubt und von unten in die Temperierkammer mittels Überwurfmutter arretiert. Die Probe wurde auf 25 ± 0,2°C temperiert (ca. 30 min). Anschließend wurde die Probe mit steigender Schergeschwindigkeit (Meßrampe: D= 0 bis 1006 s-1 / 180 sec) unterworfen. Zur Aufnahme der Meßkurven sowie zur Auswertung diente die Software SWR 37, Fa. Contraves.

Auswertung:

Für die Berechnung der Viskosität wurden max. 30 Meßpunkte verwendet, wobei nur der untere Teil der Aufwärtskure der Auswertung diente (20 bis 600 s-1 ). Als Regressionsmodell wurde nach Methode der kleinsten Quadrate die Gleichung nach Ostwald ( siehe ) als Berechnungsgrundlage herangezogen.


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4.3.16. Statistische Prüfverfahren

Eine Signifikanzprüfung von Meßpunkten erfolgte nach Prüfung auf Varianzhomogenität und Normalverteilung mittels t-Test nach Student und wurde mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit (P) von 1 % bzw. 5 % durchgeführt [ siehe ].


Fußnoten:
<3>

es liegen “sink-Bedingungen“ vor


[Titelseite] [Abkürzungsverzeichnis] [1] [2] [3] [4] [5] [Bibliographie] [Danksagung] [Lebenslauf]

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