Vitamin D₃-Analogon / -Cyclodextrin-Kavitate - Herstellung, Charakterisierung und In-vitro-Liberation aus Dermatika -

Zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I

der Humboldt-Universität zu Berlin, Institut für Pharmazie

von Patrick Franke geb. am 25. Dezember 1967 in Berlin

Präsident der Humbold-Universität zu Berlin Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekanin Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Dr. V. Bonacic-Koutecký

Gutachter:
1. Prof. Dr. S. Keipert
2. Prof. Dr. K.-H. Frömming
3. Prof. Dr. M. Gloor

eingereicht am 25. November 1997

Tag der mündlichen Prüfung: 17. April 1998

Abstract

The aim of the present work was to study the possibility of forming cavitates of a new Vitamin D3 analogue in native -cyclodextrin, dimethyl--cyclodextrin, -cyclodextrin-polymer, maltosyl--cyclodextrin, hydroxypropyl--cyclodextrin and carboxyethyl--cyclodextrin and to characterize the resulting adducts as regards their composition and properties. Furthermore, in vitro and in vivo studies will be conducted to examine the influence of the -cyclodextrins in view to retardation effects after incorporation in ointments chosen for the treatment of psoriasis. The solid inclusions are produced with the kneading method or by co-precipitation, depending on the type of cyclodextrin. Phase-solubility diagrams will be drawn and complex stability constants calculated. The formation of associates with the cyclodextrins leads to a substantial improvement of the solubility of the drug. DSC studies are used to characterize the solid associates. The presence of -cyclodextrins leads to a reduction of the release rate of the active substance in vitro, especially in the case of native -cyclodextrin. A much reduced effect with regard to epidermal hyperplasia of nude mice is also demonstrable in vivo. The findings are discussed within the framework of the question of retardation and better tolerance as regards skin irritation, systemic side effects and local efficacy of the Vitamin D3 analogue.

Keywords:
Vitamin D3 analogue, -cyclodextrin, In vitro release, In vivo studies

Zusammenfassung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Evaluierung der Möglichkeit der Bildung von Einschlußverbindungen eines neuen Vitamin D3 Analogon mit nativem -Cyclodextrin, Dimethyl--Cyclodextrin, -Cyclodextrin-Polymer, Maltosyl--Cyclodextrin, Hydroxypropyl--Cyclodextrin und Carboxyethyl--Cyclodextrin. Die resultierenden Addukte wurden im Hinblick auf Zusammensetzung und Eigenschaften charakterisiert. Weiterhin wurden in vitro und in vivo Untersuchungen durchgeführt, um den Einfluß von -Cyclodextrinen, vor allem im Hinblick auf Retardierungseffekte, nach Einarbeitung in Salben für die Indikation Psoriasis zu interpretieren. Die Herstellung der festen Kavitate erfolgte in Abhängigkeit vom Cyclodextrin-Typ mittels Knetmethode oder Kopräzipitation. Die Assoziatbildung mit -Cyclodextrinen in Lösung führte zu einer deutlichen Verbesserung der Löslichkeit des Vitamin D3 Analogon. Zur Ermittlung von Löslichkeitsisothermen wurden von den Systemen Phasenlöslichkeitsdiagramme aufgenommen sowie Komplexstabilitätskonstanten berechnet. Zur Charakterisierung der festen dienten DSC-Untersuchungen. Die Anwesenheit von -Cyclodextrinen führte zu einer Reduktion der Freisetzungsrate der aktiven Verbindung in vitro, besonders im Falle von nativem -Cyclodextrin. Auch ein deutlich reduzierter Effekt im Hinblick auf die Epidermishyperplasie von Nacktmäusen ist in vivo demonstrierbar. Die Ergebnisse werden im Rahmen der Fragestellung eines Retardierungseffektes sowie einer besseren Hautverträglichkeit, systemischen Nebenwirkungen und lokaler Effektivität des neuen Vitamin D3 Analogon diskutiert.

Schlagwörter:
Vitamin D3 Analogon, -Cyclodextrin, In vitro Freisetzung, In vivo Studien

Inhaltsverzeichnis
Titelseite	Vitamin D3-Analogon / -Cyclodextrin-Kavitate - Herstellung, Charakterisierung und In-vitro-Liberation aus Dermatika -
Abkürzungsverzeichnis	ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
1	Einleitung
1.1.	Dermale Applikation von Arzneistoffen
1.2.	Cyclodextrine in Dermatika
1.3.	Vitamin D-Analoga und Psoriasis
1.4.	Problemstellung
2	Untersuchungen und Ergebnisse
2.1.	Substanzen
2.1.1.	Methylprednisolonaceponat
2.1.2.	Calcitriol-Analogon
2.1.3.	Cyclodextrine
2.1.3.1.	Allgemeines
2.1.3.2.	Verwendete Cyclodextrine
2.1.3.3.	Herstellung von Kavitaten
2.1.3.4.	Charakterisierung von Kavitaten
2.2.	Liberation von Steroiden aus halbfesten Arzneiformen
2.2.1.	In-vitro-Liberation
2.2.2.	Diffusionskinetik
2.2.3.	Verteilungskoeffizient Vehikel / Akzeptormedium
2.2.4.	Versuchsdurchführung
2.2.5.	Ergebnisse und Diskussion
2.2.5.1.	Membranvarianten
2.2.5.2.	Vehikelvarianten
2.2.5.3.	In vitro-Permeation durch Maushaut
2.2.5.4.	Zusammenfassung
2.3.	Einschlußverbindungen des Vitamin-D3-Analogon mit -Cyclodextrin-Derivaten
2.3.1.	Theoretische Betrachtungen zum Vitamin-D3-Analogon / -Cyclodextrin-Assoziat
2.3.2.	Untersuchungen
2.3.3.	Ergebnisse und Diskussion
2.3.3.1.	Herstellung der Kavitate
2.3.3.2.	Charakterisierung der Calcitriol-Analogon / -Cyclodextrin-Assoziate
2.3.3.2.1.	Phasenlöslichkeitsdiagramme
2.3.3.2.2.	Berechnung der Komplexstabilitätskonstanten
2.3.3.2.3.	Gehaltsbestimmung
2.3.3.2.4.	Differential Scanning Calorimetrie
2.3.3.2.5.	Thermomikroskopie
2.3.3.2.6.	1H-NMR-Spekroskopie
2.3.4.	Resümee
2.4.	-Cyclodextrin-Kavitate in Dermatika
2.4.1.	Versuchsdurchführung
2.4.2.	Formulierungen
2.4.3.	In-vitro-Liberation
2.4.3.1.	Salben auf Kohlenwasserstoffbasis
2.4.3.1.1.	Dimeb
2.4.3.1.2.	Weitere Cyclodextrin-Derivate
2.4.3.2.	Hydrogele auf Polyacrylatbasis
2.4.3.3.	Hydrogele mit Liposomen
2.4.4.	In-vivo-Studien am Tiermodell
2.4.4.1.	Ergebnisse
2.4.4.2.	Vergleich der In-vitro- / In-vivo-Daten
2.4.5.	Stabilitätsuntersuchungen
3	Zusammenfassung
4	Experimenteller Teil
4.1.	Substanzen
4.2.	Geräte
4.3.	Methoden
4.3.1.	Herstellung wässeriger Lösungen des Calcitriol-Analogon (CA) mit Cyclodextrinen
4.3.2.	Herstellung von Liposomen
4.3.3.	Herstellung fester Kavitate
4.3.4.	Herstellung physikalischer Mischungen
4.3.5.	Beschichtung der Cuprophan-Membran mit Silikonöl
4.3.6.	Herstellung der halbfesten Zubereitungen
4.3.7.	In-vitro-Liberationsuntersuchungen
4.3.8.	Untersuchungen an Maushaut
4.3.9.	In-vivo-Untersuchungen
4.3.10.	Gehaltsbestimmungen
4.3.11.	Differential Scanning Calorimetrie (DSC)
4.3.12.	Licht- und Thermomikroskopie
4.3.13.	Phasenlöslichkeitsuntersuchungen
4.3.14.	1H-NMR-Spektroskopie
4.3.15.	Rheologische Untersuchungen
4.3.16.	Statistische Prüfverfahren
5	Tabellenanhang
Bibliographie	Literatur
Danksagung
Lebenslauf

Tabellenverzeichnis
Tabelle 1:	Pharmazeutisch relevante -Cyclodextrine
Tabelle 2:	Ausgewählte -Cyclodextrine für CA-Einschlüsse
Tabelle 3:	Charakteristika der Membranen
Tabelle 4:	Freisetzungsraten von MPA durch synthetische Membranen in Abhängigkeit von Imprägnierung und Akzeptormedium
Tabelle 5:	Freisetzungsraten von MPA durch die Cuprophan-Membran, imprägniert mit Methanol / Phosphatpuffer (1:1, V/V) aus Advantan-Fettsalbe, -Salbe, und -Creme
Tabelle 6:	Rheologische Daten von Advantan-Fettsalbe, -Salbe und -Creme
Tabelle 7:	Komplexstabilitätskonstanten (K) der verschiedenen Komplexe in wässeriger Lösung
Tabelle 8:	Gehalt an CA und molare Verhältnisse
Tabelle 9:	Zusammensetzungen der Testvehikel
Tabelle 10:	Freisetzungsraten aus der Triglycerid-Kohlenwasserstoffgrundlage (TK)
Tabelle 11:	Freisetzungsraten aus einer Kohlenwasserstoffgrundlage (V)
Tabelle 12:	Franz-Diffusionszellsysteme
Tabelle 13:	Herstellungsverfahren zur Bildung fester Kavitate

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1:	Schematischer Aufbau des Stratum corneum nach Barry []
Abb. 2:	Liberationsmodell nach Loth []
Abb. 3:	Drehscheibenzelle nach Moll / Bender []
Abb. 4:	Schematische Darstellung der statischen Franz-Diffusionszelle FDC-400
Abb. 5:	Strukturformel von Methylprednisolonaceponat (MPA)
Abb. 6:	Strukturformel des Calcitriol-Analogons (CA): Isopropyl (5Z,7E,22E) - (1S,3R,24R) -1,3,24-Trihydroxy-9,10-secocholesta-5,7,10(19),22-tetraene-25-carboxylat
Abb. 7:	Schematische Darstellung eines Cycodextrin-Moleküls mit Lokalisation der Hydroxygruppen
Abb. 8:	Kristallstruktur eines -Cyclodextrins (Seiten- und Vorderansicht) mit dem umgebenden Kristallwasser []
Abb. 9:	In-vitro-Freisetzung von Methylprednisolonaceponat (MPA) aus Advantan®-Fettsalbe durch verschiedene Membranen unter Verwendung von Methanol / Phosphatpuffer sowohl als Akzeptormedium als auch zur Imprägnierung, n=3, R2>0,99
Abb. 10:	In-vitro-Freisetzung von Methylprednisolonaceponat (MPA) aus Advantan®-Fettsalbe. Imprägnierung: mit Klammern, Akzeptor-medium: ohne Klammern. (PVP): 5%ige Lsg. Polyvinylpyrrolidon, (PhP/PG): Phosphatpuffer / Propylenglycol, (MeOH/PhP): Methanol/ Phosphatpuffer
Abb. 11:	In-vitro-Freisetzung von Methylprednisolonaceponat (MPA) aus Advantan-Fettsalbe durch die Polycarbonat -und Cuprophan-Membran sowie ohne Membran, (Imprägnierung in Klammern, Akzeptormedium ohne Klammern), Isopropylmyristat (IPM), Methanol/Phosphatpuffer (MeOH/PhP)
Abb. 12:	In-vitro-Freisetzungsprofile von MPA aus Advantan-Fettsalbe, -Salbe, und -Creme durch die Cuprophan-Membran unter Verwendung von Methanol / Phosphatpuffer sowohl als Akzeptormedium als auch zur Imprägnierung, n=6, P=0,05, R2>0,99
Abb. 13:	In-vitro-Freisetzungsprofile (intakte Maushaut) von 3H-Methylprednisolon-aceponat (3H-MPA) aus Advantan-Fettsalbe, -Salbe und Lösung, BSA-Puffer als Akzeptormedium
Abb. 14:	In-vitro-Freisetzungsprofile (gestrippte Maushaut) von 3H-Methylprednisolonaceponat (3H-MPA) aus Advantan-Fettsalbe, -Salbe und Lösung, BSA-Puffer als Akzeptormedium
Abb. 15:	Calcitriol-Analogon: GRID-Interaktionsfelder unter Verwendung einer aliphatischen Hydroxylprobe (dunkel gezeichnet) und einer Ethersauerstoffprobe (hell gezeichnet)
Abb. 16:	Calcitriol-Analogon: GRID-Interaktionsfelder unter Verwendung einer Methylprobe (hell)
Abb. 17:	-CD: GRID-Interaktionsfelder unter Verwendung einer aliphatischen Hydroxylprobe (dunkel gezeichnet) und einer Methylprobe (hell gezeichnet)
Abb. 18:	Phasenlöslichkeitsdiagramm des Calcitriol-Analogon in wässeriger -CD-Lösung (pH=6,5) bei 25°C
Abb. 19:	Phasenlöslichkeitsdiagramm des Calcitriol-Analogon in wässeriger Dimeb-Lösung (pH=6,5) bei 25°C
Abb. 20:	Phasenlöslichkeitsdiagramm des Calcitriol-Analogon in wässeriger G2--CD-Lösung (pH=6,5) bei 25°C
Abb. 21:	Phasenlöslichkeitsdiagramm des Calcitriol-Analogon in wässeriger -CD-Polymer-Lösung (pH=6,5) bei 25°C
Abb. 22:	DSC-Thermogramme von CA / -CD-Systemen, a) reines CA, b) physikalische Mischung (1:7), c) Kopräzipitat (gewaschen), d) -CD-Referenz
Abb. 23:	DSC-Thermogramme von CA / Dimeb-Systemen, a) reines CA, b) physikalische Mischung (1:2), c) Knetprodukt (ungewaschen), d) Knetprodukt (gewaschen), e) Dimeb-Referenz
Abb. 24:	DSC-Thermogramme von CA / G2--CD-Systemen a) reines CA, b) physikalische Mischung (1:5), c) Knetprodukt (ungewaschen), d) Knetprodukt (gewaschen), e) G2--CD-Referenz
Abb. 25:	DSC-Thermogramme von CA / -Cyclodextrin-Polymer-Systemen (1:2), a) reines CA, b) physikalische Mischung, c) Knetprodukt (ungewaschen), d) Knetprodukt (gewaschen), e) -CD-Polymer-Referenz
Abb. 26:	DSC-Thermogramme von CA / CE--CD-Systemen, a) reines CA, b) physikalische Mischung, c) Knetprodukt (ungewaschen), d) Knetprodukt (gewaschen), e) CE--CD-Referenz
Abb. 27:	DSC-Thermogramme von CA / HP--CD-Systemen, a) reines CA, b) physikalische Mischung, c) Knetprodukt (ungewaschen), d) Knetprodukt (gewaschen), e) HP--CD-Referenz
Abb. 28:	Thermomikroskopische Aufnahmen der physikalischen Mischung aus CA und -CD
Abb. 29:	Thermomikroskopische Aufnahmen des CA / -CD-Kopräzipitats
Abb. 30:	Freisetzungsprofile von CA / Dimeb-Systemen aus einer Trigycerid-Kohlenwasserstoff-Grundlage in Methanol / Wasser bei 32°C (n=6, P=0,01)
Abb. 31:	Freisetzungsprofile von verschiedenen CA / -Cyclodextrin-Systemen aus einer Trigycerid-Kohlenwasserstoff-Grundlage in Methanol / Wasser bei 32°C (n=6, P<0,01)
Abb. 32:	Freisetzungsprofil eines CA / -CD-Systems gegenüber reinem CA und einer physikalischen Mischung aus einer Kohlenwasserstoff-Grundlage (V) in Methanol / Wasser bei 32°C (n=6, P<0,01)
Abb. 33:	Freisetzungsprofile der Systeme CA / Dimeb und CA / G2--CD gegenüber reinem CA aus Hydrogelen in Methanol / Wasser bei 32°C (n=6, P<0,01)
Abb. 34:	Epidermis-Hyperplasie
Abb. 35:	Epidermis-Hyperplasie, Verum- abzüglich Placebowirkung
Abb. 36:	Serumcalciumkonzentration
Abb. 37:	Serumcalciumkonzentration, Verum- minus Placebowirkung
Abb. 38:	Prävitamin des CA
Abb. 49:	Stabilität von CA in TK-Formulierungen bei 25°C und 40°C
Abb. 40:	Hydrogelherstellung
Abb. 41:	Chromatogramm von CA (V-Rezeptur): a) CA, b) Prävitamin

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