Hanay, Christiane: Optimierung von Kupplungsverfahren für die Peptidsegmentkondensation

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Kapitel 1. Einleitung und Problemstellung

1.1. Bedeutung und Stand der Entwicklung der Peptidsynthese

Polypeptide spielen strukturell und funktionell eine Schlüsselrolle in der Biochemie, Pharmakologie und Neurobiologie. Für ihre Bereitstellung ergibt sich die Notwendigkeit der Entwicklung von schnellen, effizienten und zuverlässigen Methoden zur chemischen Synthese. Damit können die Strukturen von neu isolierten Wirkstoffen mit Peptidstruktur, wie Hormone, Neuropeptide, Antibiotika u.a., bestätigt und diese in größerem Maßstab für weitere Untersuchungen bereitgestellt werden. Die daraus folgende größere Verfügbarkeit synthetischer Analoga verschiedener Sequenzen ist Voraussetzung für Struktur-Aktivitäts-Studien an Peptidwirkstoffen. Die nach verschiedenen Prinzipien durchgeführten Modifikationen der Struktur von Peptidwirkstoffen dienen u.a. der Verlängerung bzw. Verstärkung der biologischen Wirkung (z.B. Stabilisierung gegen enzymatischen Abbau, Kettenverkürzung ohne Wirkungsverlust im Hinblick auf ökonomische Aspekte) [ 2 ].

Die meisten Polypeptide sind heute mit Hilfe der Festphasensynthese unter Verwendung des Urethanschutzes routinemäßig synthetisierbar. Die chemische Synthese von Proteinen dagegen ist, bis auf wenige Ausnahmen, noch stark limitiert. Entsprechend dem gegenwärtigen Entwicklungsstand kann das Problem der chemischen Proteinsynthese aufgrund der Akkumulation von Nebenprodukten bei Anwendung der Festphasensynthesetechnik nicht gelöst werden. Eine Möglichkeit, diese Schwierigkeiten zu umgehen, bietet die Kondensation von Peptidsegmenten. Voraussetzung dafür ist jedoch die Verfügbarkeit effektiver Segmentkondensationsmethoden. Zwar wurden dafür gute Kupplungsmethoden in unpolaren Lösungsmitteln beschrieben, jedoch besitzen geschützte Peptidsegmente hierin nur eine geringe Löslichkeit. Aufgrund dessen ist der Übergang zu polaren Lösungsmitteln erforderlich, wofür jedoch bisher keine geeigneten epimerisierungsarmen Kupplungsmethoden existieren.

1.2. Prinzip der Peptidsynthese

Die Bildung einer Peptidbindung zwischen zwei Aminosäuren erfolgt in der Regel durch die Aktivierung der Carboxylkomponente und dem nachfolgenden nukleophilen Angriff der Aminokomponente. Dazu muß das elektrophile Potential der Carboxylfunktion durch Einführung elektronenziehender Substituenten (-I, -M) erhöht werden. Die prinzipiell ebenso mögliche Aktivierung der Aminokomponente findet geringe praktische Anwendung,


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da mit der Einführung von elektronenschiebenden Substituenten, die die Nukleophilie des Amino-Stickstoffs erhöhen (z.B. tert.-Butylgruppe) gleichzeitig die Acylierungsgeschwindigkeit infolge erhöhter sterischer Hinderung gesenkt wird.

Für einen eindeutigen Verlauf der Peptidsynthese ist es notwendig, alle funktionellen Gruppen, die nicht am Peptidknüpfungsschritt beteiligt werden sollen, temporär zu blockieren. Weiterhin benötigen Aminosäuren, die nicht teilnehmende, reaktive Drittfunktionen besitzen, zwangsläufig einen selektiven, reversiblen Schutz. Die Peptidsynthese ist demnach ein Mehrstufenprozeß, der die Darstellung partiell geschützter Aminosäuren, die Aktivierung und Kupplung sowie die selektive Deblockierung beinhaltet. Da die Teilschritte des Peptidaufbaus von unerwünschten Nebenreaktionen begleitet sein können, ist im allgemeinen eine Reinigung der Zwischen- und Endprodukte erforderlich. Obwohl die biosynthetische Peptidsynthese vom N- zum C-Terminus erfolgt und diese Strategie lediglich den Schutz einer alpha-Aminogruppe erfordert, wird die chemische Kettenverlängerung in der Regel vom C- zum N-Terminus durchgeführt. Hauptgrund dafür ist die Gefahr der Stereomutation während der Kupplung von N in C-Richtung [ 3 ].

Zwei grundsätzliche Methoden werden für die Synthese von Peptiden angewendet: die schrittweise Kettenverlängerung, die die Aktivierung von urethangeschützten Aminosäuren beinhaltet und die Segmentkondensation, bei der als aktivierte Komponenten geschützte Peptidsequenzen eingesetzt werden.

1.2.1. Schrittweiser Aufbau der Peptidkette

Konventionelle Verfahren zum schrittweisen Kettenaufbau der Zielsequenz werden in Lösung unter Reinigung und Charakterisierung der vollgeschützten Zwischenprodukte auf jeder Stufe durchgeführt. Aufgrund der abnehmenden Löslichkeit der wachsenden Peptidkette ist diese Methode im allgemeinen auf die Synthese kürzerer Peptide beschränkt. Methoden zum schrittweisen Aufbau eines Peptides in Lösung ohne Isolierung von Zwischenprodukten, bei denen Reaktionsnebenprodukte und Reagenzienüberschüsse durch Extraktion, Zentrifugation, Fällung und Filtration entfernt werden, sind in verschiedenen Arbeitskreisen entwickelt worden (Repetitive Excess Mixed Anhydride Method [ 4 ], N-Carbonsäureanhydrid/N-Thiocarbonsäureanhydrid-Methode [ 5 ], Pentafluorphenylester-Methode [ 6 ], Fmoc -Amino-Acid-Chloride-Solution-Technique [ 7 ], Fmoc -Amino-Acid-Fluoride-Solution-Technique [ 8 ]).


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Das Prinzip der 1962 von MERRIFIELD [ 9 ] eingeführten Festphasensynthese ( SPPS ) besteht in der kovalenten Verknüpfung der wachsenden Peptidkette an einen unlöslichen polymeren Träger und dem schrittweisen Aufbau des Peptides vom C- zum N-Terminus mittels aufeinanderfolgender Kupplungs- und Abspaltzyklen. Der entscheidende Vorteil liegt darin, daß Überschüsse an Reagenzien und Nebenprodukte durch einfache Wasch- und Filterprozesse vom polymergebundenen Peptid abgetrennt werden können, womit eine Automatisierung der Synthese vereinfacht wird. Nach Abschluß der Synthese wird das Peptid vom Träger abgespalten, gereinigt und charakterisiert. Voraussetzung für die Herstellung einheitlicher Produkte ist, daß jede Teilreaktion eindeutig und quantitativ verläuft. Durch auftretende Nebenreaktionen, z.B. Abspaltung der Schutzgruppen trifunktioneller Aminosäuren und Weiterreaktion der Drittfunktion, Stereomutation, Umlagerungen und Ringschlüsse kann es zur Verringerung der Ausbeute kommen. Die Bildung von Rumpf- und Fehlsequenzen bei unvollständigen Umsätzen, die dem gewünschten Produkt nahe verwandt sind und sich deshalb schwierig abtrennen lassen sowie der vorzeitige Kettenabbruch durch konformationsabhängige Effekte, wie die Ausbildung von beta-Faltblattstrukturen, sind Probleme, die bislang nicht vollständig überwunden werden konnten [ 2 ].

Alternativ zur Synthese an der festen Phase wurden lösliche polymere Träger vorgeschlagen, wobei im Verlauf der Synthese die Abtrennung niedermolekularer Reagenzien durch Ultrafiltration bzw. durch Kristallisation des gewünschten Peptidpolymers erreicht wird. Obwohl der als Flüssigphasenmethode [ 10 ] bezeichnete Syntheseweg eine bessere analytische Kontrolle erlaubt, wirken sich die schlechtere Automatisierbarkeit, der Zeitaufwand und die verringerte Löslichkeit des Polymers mit wachsender Peptidkette als nachteilig aus [ 2 ].

1.2.2. Segmentkondensation

Aufgrund der mitunter großen Schwierigkeiten, homogene Produkte bei der schrittweisen Peptidsynthese zu erhalten und der Tatsache, daß sich eng verwandte Nebenprodukte bei zunehmender Kettenlänge des Peptides nur schwer vom Zielprodukt trennen lassen, ist für die effiziente Synthese langkettiger Peptide die Segmentkondensation von Vorteil. Dabei werden zunächst unabhängig voneinander geschützte Peptidsegmente mittlerer Länge synthetisiert, gereinigt und anschließend zum Zielpeptid verknüpft. Hierbei auftretende


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Verunreinigungen unterscheiden sich vom Zielmolekül durch mindestens eine Segmenteinheit und lassen sich somit einfacher entfernen. Generell läßt sich die Kupplung der Segmente konventionell in Lösung oder an der festen Phase durchführen. Dabei können auch die Segmente sowohl in Lösung als auch an der festen Phase synthetisiert werden. Bei der konvergenten Festphasensynthese werden die geschützten Peptidsegmente mittels Festphasensynthese hergestellt, gereinigt und am festen Träger zur Zielsequenz vereinigt [ 11 - 13 ].

Ausbeute, Reinheit der Zielsequenz und Epimerisierungsgrad im Verlauf der Segmentkondensation werden durch verschiedene Parameter beeinflußt: z.B. die geeignete Einteilung des Zielpeptides in Segmente, die Art des Lösungsmittels, die Kupplungsmethode, die Reaktionszeit und gegebenenfalls die Wahl des polymeren Trägers [ 12 , 14 ].

Das Problem der häufig geringen Löslichkeit von geschützten Peptidsegmenten, abhängig von Kettenlänge, Aminosäuresequenz und Wahl der Seitenkettenschutzgruppen, ist hauptsächlich auf die Aggregation der Peptidketten (im Bereich von 4-18 Aminosäureresten) zu beta-Faltblattstrukturen infolge inter- und intramolekularer Wasserstoffbrückenbindungen zurückzuführen [ 15 , 16 ]. Um die Peptide in Lösung zu bringen, ist die Brechung der beta-Faltblattstrukturen notwendig. Dies kann durch den Wechsel des Lösungsmittels zwischen DCM , DMF , DMA , NMP und DMSO oder den Einsatz gemischter Lösungsmittelsysteme, wie NMP / DMSO , THF / TCM , THF / DCM , HFIP / TCM oder HFIP / DCM , erreicht werden [ 17 ]. Auch Zusätze von chaotropen Salzen (z.B. LiCl, LiBr, KSCN, NaClO4) sowie von Ethylencarbonat oder Harnstoffen zu aprotischen Lösungsmitteln werden eingesetzt, um die Löslichkeit der Segmente durch Zerstören der Wasserstoffbrückenbindungen zu erhöhen [ 18 , 19 ].

Für eine Segmentkondensation in unpolaren Lösungsmitteln ist die Carbodiimid/Additiv-Kupplung eine geeignete Methode. Die Löslichkeit geschützter Peptidsegmente in unpolaren Lösungsmitteln sinkt jedoch mit steigender Anzahl der Peptidbindungen. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit des Übergangs zu polareren Lösungsmitteln. Hier ist aber die Durchführung der Segmentkondensation, insbesondere die Aktivierung, problematisch. Bei Verwendung von Uroniumsalzen zur Segmentkondensation in polaren Lösungsmitteln kann eine schnelle Aktivierung zwar erreicht werden, jedoch wurde dabei Stereomutation beobachtet [ 20 - 22 ].


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1.3. Problem und Mechanismen der Epimerisierung

Da Peptide Substanzen mit chiralen Zentren sind, ist die Konfiguration der zur Synthese eingesetzten Verbindungen von großer Bedeutung. Insbesondere sind die C-terminalen Aminosäuren geschützter Peptidsegmente im Verlauf der Aktivierungs- und Kupplungsschritte vom Verlust der chiralen Integrität betroffen, der als überwiegend basenkatalysierte Nebenreaktion auftritt. Dabei werden zwei unterschiedliche Wege der Epimerisierung diskutiert.

Bei der ”direkten Protonenabstraktion“ bzw. ”direkten Enolisierung“ führt die erhöhte CH-Azidität in Abhängigkeit des elektronenziehenden Effektes der aktivierenden Gruppe X, der beta-Substituenten R, der katalysierenden Base und des Lösungsmittels zur Deprotonierung des alpha-Kohlenstoffatoms. Das sich häufig durch Mesomerie stabilisierende resultierende Carbanion kann nun auch unter Änderung der Konfiguration reprotoniert werden [ 23 - 26 ] ( Abb. 1 ).

Abb. 1: Epimerisierung durch direkte Protonenabstraktion (nach [ 23 ])

Eine weitere Möglichkeit der Stereomutation besteht in der Deprotonierung während der Aktivierung gebildeter 5(4H)-Oxazolone (formal 2-Oxazolin-5-one, ”optisch labile“ Azlactone, Abb. 2 , 2). Dabei wird durch stark elektronenziehende Substituenten X das C-Atom der Carboxyfunktion positiviert, wodurch der intramolekulare nukleophile Angriff des Carbonyl-Sauerstoff-Atoms begünstigt wird. Ist der Amino-Stickstoff des aktivierten Restes durch N-Acylgruppen oder mit einer Peptidkette acyliert, wird die Zyklisierung zum Oxazolon erleichtert ( Abb. 2 , 1a). Außerdem hängt die Oxazolonbildung von der Basizität des Mediums, der Natur der zur Aktivierung eingesetzten Base, der Art des Lösungsmittels und von der Reaktionstemperatur ab. Die Abspaltung des Amidprotons durch eine Base


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führt zum Amid-Anion ( Abb. 2 , 1b), durch dessen nukleophilen Sauerstoff der Ringschluß zum Oxazolon erfolgt [ 24 , 27 ]. Dieses kann nach Wasserstoff-Abstraktion über eine anionische pseudoaromatische Zwischenstufe ( Abb. 2 , 2a) (quasiionische Zwischenstufe [ 28 ]) in einem basenkatalysierten Gleichgewicht die beiden stereoisomeren Formen L (2b) und D (2c) bilden, die anschließend durch die Aminokomponente geöffnet werden können.

Abb. 2: Oxazolon-Mechanismus (nach [ 29 ])

Geschützte Peptidsegmente reagieren im Verlauf der Aktivierung unter Zyklisierung zu 5(4H)-Oxazolonen [ 30 ]. Die erhöhte baseninduzierte Labilität des 4-H Protons wird hierbei als Hauptursache der resultierenden Epimerisierung angesehen. Das steht im Gegensatz zur Aktivierung urethangeschützter Aminosäuren, bei der zwar auch Oxazolon gebildet wird, dieses aber wegen der erschwerten Protonenabstraktion eine höhere chirale Stabilität besitzt [ 31 ].

Neben der Epimerisierung durch Bildung von Oxazolon wurde von GRIEHL et al. [ 32 ] z.B. für eine Carbodiimid-vermittelte [2+1]-Segmentkondensation gefunden, daß auch die Bildung des LDL -Isomers (aus LL+L) direkt aus dem O-Acylisoharnstoff eine wesentliche Rolle spielt, die nach BODANSZKY [ 33 ] auf einen intramolekularen Protonenabstraktions-Mechanismus zurückzuführen ist.


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1.4. Kondensationsreagenzien

Trotz vieler Untersuchungen konnte bisher keine allgemein anwendbare Technik für die Kupplung von Peptidsegmenten ohne Verlust der chiralen Integrität am aktivierten Carboxylrest entwickelt werden. Die zuerst von SHEEHAN und HESS [ 34 ] entwickelte Carbodiimid-Kupplung wird gegenwärtig bevorzugt unter Zusatz von Additiven zur Segmentkondensation angewendet. Diese Reaktionen verlaufen über die intermediäre Bildung des korrespondierenden Aktivesters. Der 1966 von WEYGAND [ 35 ] entdeckte epimerisierungssenkende Effekt von HONSu im Verlauf von DCC -Kupplungen stellte eine echte Alternative zur damals meist verwendeten Azidmethode [ 36 ] bei Segmentkondensationen dar. Jedoch besitzt diese Variante den Nachteil, daß es durch eine interne Konkurrenzreaktion zwischen DCC und HONSu zur Bildung eines unerwünschten Nebenproduktes Succinimido-oxycarbonyl-beta-alanin-N-hydroxysuccinimidester kommt, was einen unkontrollierten beta-Alanineinbau in die Peptidkette zur Folge hat [ 37 , 38 ]. Aus diesem Grund wird das dem HONSu strukturell verwandte, von FUJINO [ 39 ] vorgeschlagene HONB als Additiv bei DCC -Kupplungen bevorzugt, das die Bildung von Produkten in hoher Ausbeute mit geringer Epimerisierung erlaubt (siehe z.B. Synthese von LH-RH [ 29 ]). Im Vergleich zur Verwendung von HONSu oder HONB als Additiv bei Carbodiimid-Kupplungen ist das von KÖNIG und GEIGER [ 40 , 41 ] eingeführte HOBt hinsichtlich der Aminolysegeschwindigkeit des korrespondierenden Aktivesters, der Reaktionsausbeute sowie der Unterdrückung der Epimerisierung überlegen, wie an verschiedenen Modellen zur Segmentkondensation in Lösung und an der festen Phase gezeigt wurde [ 14 , 42 - 44 ]. In unpolaren Lösungsmitteln, wie z.B. Dichlormethan, verläuft die Kupplung via Carbodiimide in Gegenwart von Additiven, wie HOBt , ohne Stereomutation [ 21 , 40 ]. Jedoch erweist sich infolge der eingeschränkten Löslichkeit geschützter Peptide in unpolaren Lösungsmitteln (Kapitel Segmentkondensation ) der Übergang zu polareren Medien, wie z.B. DMF , als notwendig. Hier verläuft aber die Aktivierung via Carbodiimid langsam [ 45 , 46 ], und es kann zum Verlust der chiralen Integrität kommen [ 21 , 41 ]. Eine Verringerung der Epimerisierung von DCC / EDC -Kupplungen in DMF als Lösungsmittel kann z.B. durch den Einsatz von Lewis-Säuren erreicht werden, wobei sich CuCl2 am besten bewährt hat [ 42 , 43 ]. Da in vielen Fällen durch den Zusatz von CuCl2 im Vergleich zur Addition von HOBt eine entscheidende Verringerung der Epimerisierung (unter 0,1 %) zwar erzielt, aber gleichzeitig unbefriedigende Ausbeuten gefunden wurden, wurde von MIYAZAWA [ 47 ] eine simultane


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Addition von HOBt und CuCl2 vorgeschlagen. Im Ergebnis der Modellkupplung von Z -Gly-Val-OH an H-Val-O Me _ Tos OH in Gegenwart von TEA (zur Neutralisation) via EDC konnten die besten Bedingungen hinsichtlich Umsatz und Epimerisierung bei Einsatz eines Verhältnisses von 2 Äq. HOBt und 0,1 Äq. CuCl2 erhalten werden, wobei HOBt als epimerisierungssenkendes Additiv durch die intermediäre Bildung des korrespondierenden OBt -Esters fungiert und CuCl2 unterstützend die Basizität des Mediums herabsetzt [ 29 ]. Der epimerisierungssenkende Effekt einer simultanen Addition von HOBt und CuCl2 konnte von HAVER und SMITH [ 48 ] auf eine Segmentkondensation am Harz via Phosphonium- und Uroniumsalze übertragen werden.

Mittlerweile haben sich alternativ zur Carbodiimid/Additiv-Kupplung, insbesondere für die SPPS urethangeschützter Aminosäuren, eine Vielzahl neu entwickelter Kupplungsreagenzien zur in situ Bildung von Aktivestern auf der Grundlage der Phosphonium- (z.B. BOP , Abb. 3 , 4aku) [ 49 ] und Uroniumstruktur (z.B. TBTU , Abb. 3 , 3aiu) [ 20 , 50 ] etabliert, die sich im Harnstoffteil (Tetramethyl ( TBTU ), Pyrrolidinyl ( TBPyU , Abb. 3 , 3aiv), Piperidinyl ( TBPipU , Abb. 3 , 3aiw) [ 51 ]), in der Natur der Abgangsgruppe ( OBt , OPy [ 51 ], OAt [ 52 ], ONSu [ 20 ], ONB [ 20 ]) und in der Art des Gegenions (BF4-, PF6-) unterscheiden und für deren Anwendung der Zusatz einer Base essentiell ist ( Abb. 3 ) (Überblick siehe [ 53 ]).

Abb. 3: Kondensationsreagenzien auf der Grundlage der Uronium (3)- und Phosphoniumstruktur (4)


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Die Uroniumsalze HBTU ( Abb. 3 , 3aku) und HATU ( Abb. 3 , 3bku) kristallisieren im festen Zustand als Guanidinium-N-Oxid-Salze im Gegensatz zur vorher angenommenen Uroniumstruktur [ 54 ]. Kürzlich konnte von HENKLEIN [ 55 ] neben HBTU und HATU auch für die Pyrrolidinanaloga HBPyU ( Abb. 3 , 3akv) und HAPyU ( Abb. 3 , 3bkv) [ 22 , 56 ] das Vorliegen der Guanidiniumstruktur nicht nur im kristallinen Zustand sondern auch in Lösung nachgewiesen werden ( Abb. 4: ).

Abb. 4: Uronium- (5a) und Guanidiniumstruktur (5b) von HAPyU

Vergleichende Untersuchungen zum Einsatz ausgewählter Reagenzien zur Segmentkondensation in Lösung und an der festen Phase wurden u.a. von KNEIB-CORDONIER et al. [ 57 ] mit der Synthese von Human Gastrin I mittels BOP / HOBt und DCC / HOBt , von NOKIHARA [ 58 ] bei einer Segmentkupplung des Atrialen natriuretischen Faktors mit BOP vorgenommen. BENOITON [ 21 , 59 , 60 ] fand auf der Grundlage von Modellstudien, daß DCC / HOBt (in DCM , DMF ) in vielen Fällen zu geringerer Epimerisierung führt als BOP / HOBt und HBTU / HOBt .

Im Gegensatz zur Carbodiimid-Kupplung erlaubt die Verwendung von Uroniumsalzen eine schnelle Aktivierung in polaren Lösungsmitteln [ 50 , 61 ]. Jedoch wurde auch hier eine beträchtliche Epimerisierung im Verlauf von Segmentkupplungen beobachtet [ 21 , 48 ]. Keine entscheidenden Unterschiede im Grad der Epimerisierung wurden beim Vergleich der Kupplung via BOP / HOBt und HBTU / HOBt in DMF gefunden [ 21 ], jedoch ist die Anwendung von BOP von Nachteil, da während der Reaktion kanzerogene Nebenprodukte, wie Hexamethylphosphorsäuretriamid, gebildet werden. Mit den von CARPINO eingeführten, hoch reaktiven OAt -Uroniumsalzen wurde an verschiedenen Segmentkupplungen in Lösung [ 22 , 52 ] und am Harz [ 62 ] ebenfalls Epimerisierung detektiert, wenngleich sie im Vergleich zu den entsprechenden OBt -Reagenzien deutlich gesenkt wurde. Der Verlust der chiralen Integrität in diesen Fällen ist auf die intermediäre Bildung des 5(4H)-Oxazolons zurückzuführen [ 3 , 21 ] (Kapitel Problem und Mechanismen der Epimerisierung ). Das Ausmaß der Stereomutation kann durch die Verwendung einer geringeren Menge des für die Aktivierung essentiellen


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tertiären Amins und durch die Addition bestimmter N-Hydroxyverbindungen, wie z.B. HOBt , verringert werden [ 60 ]. Letzteres beschleunigt die Bildung des intermediären Aktivesters, der ohne Verlust der chiralen Integrität kuppelt. Zusätzlich bewirken diese sauren Additive eine Verminderung des nachteiligen Einflusses der tertiären Base [ 45 ]. Das Ausmaß der Stereomutation kann auch durch die Verwendung sterisch gehinderter tertiärer Amine, wie z.B. Collidin, verringert werden [ 22 ].

Neue Kupplungsreagenzien für die Peptidsegmentkondensation auf der Basis der Uroniumstruktur und Phosphoniumstruktur sowie Phosphate und Sulfonate wurden kürzlich von GRIEHL [ 63 ] anhand von Modelluntersuchungen hinsichtlich Umsatz, Epimerisierungsgrad und Reaktivität mit den konventionell verfügbaren Reagenzien verglichen. Bei Anwendung dieser Reagenzien in DMF wurde jedoch beträchtliche Epimerisierung beobachtet. Es ist somit ungeklärt, inwieweit sie eine praktikable Alternative zu derzeit in der Segmentkondensation angewendeten Kupplungsmethoden darstellen.

Als Alternative zur Kupplung mit Uroniumsalzen wurde von BENOITON gefunden, daß sich optisch reine ONSu -Ester via Mischanhydrid herstellen lassen [ 59 , 64 ]. Bereits ANDERSON [ 65 ] beschrieb den epimerisierungssenkenden Einfluß von HONSu bei der Kupplung von Peptidsegmenten durch Mischanhydride. Dabei sind die Wahl des Chlorameisensäureesters, das Einhalten einer bestimmten Temperatur und Aktivierungszeit zur Bildung des Mischanhydrids, die Natur der tertiären Base und das Lösungsmittel von entscheidender Bedeutung, um einen optimalen Verlauf der Mischanhydridsynthese mit möglichst geringer Epimerisierung und ohne Nebenreaktionen, wie die Urethanbildung, zu gewährleisten [ 66 , 67 ]. Diese Methode ist auf die Anwendung in unpolaren Lösungsmitteln beschränkt, da in DMF mehr Epimerisierung gefunden [ 66 - 68 ] und Nebenreaktionen von DMF mit Chlorameisensäureestern beschrieben wurden [ 69 ].

Die kürzlich eingeführten Fmoc -Aminosäurefluoride gelten als effiziente Aktivierungsspezies für die Peptidsynthese in Lösung und an der festen Phase (mit Ausnahme von Arg und His) [ 70 , 71 ]. Besonders geeignet erwiesen sie sich für die Kupplung aufeinanderfolgender sterisch gehinderter Reste, wie alpha,alpha-Dialkylaminosäuren [ 71 ]. Interessant bei der Verwendung geschützter Aminosäurefluoride ist, daß sie keine Hilfsbase zum Binden der HF im Kupplungsschritt benötigen [ 72 ]. Bisher gibt es keine Untersuchungen zur Anwendung der Säurefluoridaktivierung in der Peptidsegmentkondensation.

Die Entwicklung von epimerisierungsarmen Kupplungsmethoden für die Peptidsegmentkondensation in polaren Lösungsmitteln setzt das Verständnis der Ursachen der


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Epimerisierung voraus. Dazu notwendige systematische, vergleichende Studien der einzelnen Kupplungsmethoden in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen wurden bisher nicht publiziert. Es wurden lediglich verschiedene Kupplungsverfahren an unterschiedlichen Segmenten erprobt und diskutiert, ohne daß sie in vergleichenden Untersuchungen gewertet worden sind.

1.5. Ziel der Arbeit

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung neuer sowie die Analyse und Optimierung bestehender Kupplungsmethoden, um eine epimerisierungsarme Peptidsegmentkondensation zu gewährleisten. Ausgangspunkt soll dabei die Anwendung der Uroniumsalz-Methode bilden. Die Kenntnis der dabei auftretenden epimerisierungsinduzierenden Intermediärprodukte soll zu Möglichkeiten der Unterdrückung der Stereomutation führen. Diese Strategie erfordert die Untersuchung der folgenden Teilaufgaben:

Die Untersuchungen sollen sich auf Derivate beschränken, die als Aktivesterkomponenten OBt , OAt , ONSu und ONB enthalten ( Abb. 3 ). Uroniumsalze mit OBt als Abgangsgruppe sind bewährte Kupplungsreagenzien besonders für die schrittweise Peptidsynthese. Eine höhere Effektivität hinsichtlich der Kupplungsausbeute und der Vermeidung von Nebenreaktionen zeigen die neueren OAt -Derivate. Von Interesse sind außerdem die entsprechenden ONSu - und ONB -Derivate, da sich für erstere gemäß den Untersuchungen von BENOITON [ 59 , 64 ] der gebildete korrespondierende Aktivester epimerisierungsfrei kuppeln läßt.

Ausgehend von der Kenntnis der Zusammenhänge zwischen aktivierten Spezies und Epimerisierung sollen weiterhin untersucht werden:


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