Hanay, Christiane: Optimierung von Kupplungsverfahren für die Peptidsegmentkondensation

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Kapitel 2. Uroniumsalze für die Peptidsegmentkondensation

2.1. Epimerisierung bei Anwendung von bekannten Uroniumsalzen

Um Ansatzpunkte für optimierte Kupplungssysteme unter Verwendung von Uroniumsalzen zu finden, wurden systematisierende Untersuchungen hinsichtlich des Epimerisierungsgrades bei Anwendung einiger repräsentativer Vertreter der Uronium- und Phosphoniumsalze zur Segmentkondensation durchgeführt. Für diese Untersuchungen wählten wir das Modellsystem Z -Gly-L/DAla-Leu-O Bn nach IZUMIYA [ 73 ] aus. Nach Untersuchungen von BENOITON [ 21 ] und MIYAZAWA [ 74 ] ist in diesem System Alanin am C-Terminus der Carboxykomponente des Modells vergleichbar epimerisierungssensitiv wie Valin.

Die Bestimmung des Anteils an LDL -Isomer wurde mittels HPLC durchgeführt ( Abb. 5 ).

Abb. 5: HPLC -Profil der Trennung von H-Gly-L/DAla-Leu-OH

Unter Verwendung verschiedener Kupplungsreagenzien in Gegenwart von 2 Äq. DIEA wurde Epimerisierung in jedem Fall gefunden ( Tab. 1 ).


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Tab. 1: Epimerisierung am Modellpeptid H-Gly-Ala-Leu-OH bei Anwendung verschiedener Kupplungsreagenzien




Anteil an LDL -Isomer in (%)

TBTU

TBPyU

HAPyU TOPPipU

TNTU

PyBOP

( Abb. 3 , 3aiu)

( Abb. 3 , 3aiv)

( Abb. 3 , 3bkv)

( Abb. 3 , 3ciw)

( Abb. 3 , 3eiu)

( Abb. 3 , 4akv)

[ 20 ]

[ 51 ]

[ 22 , 56 ]

[ 51 ]

[ 20 ]

[ 75 ]

2,8

2,6

1,9

4,9

18,6

2,4

Die Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit, daß nach Möglichkeiten zur Unterdrückung der Epimerisierung gesucht werden muß. Ein erster Ansatzpunkt dazu wäre die Änderung der Uroniumstruktur.

2.2. Modifikation der Uroniumstruktur

Anknüpfend an die Verwendung der hochreaktiven Fmoc -Aminosäurefluoride [ 76 ] (Kapitel Kondensationsreagenzien ) erschien eine Kupplung via Peptidsegmentfluorid als interessanter Ansatz. Eine Änderung der Uroniumstruktur ( Abb. 3 , 3) mit der Einführung von F- als Abgangsgruppe würde zur in situ Bildung eines aktivierten Peptidsegmentfluorids als reaktives Intermediat im Aktivierungsschritt führen.

Mit diesem Hintergrund wurde von uns parallel zu Untersuchungen von CARPINO [ 76 , 77 ] eine neue Klasse von Kupplungsreagenzien, die Fluoroformamidiniumsalze, entwickelt [ 78 ]. Die Synthese des Bipyrrolidinofluoroformamidiniumhexafluorophosphates ( Abb. 6 , 6b) bzw. Bipiperidinofluoroformamidiniumhexafluorophosphates erfolgte aus den korrespondierenden Chloroformamidiniumhexafluorophosphaten [ 20 , 50 , 79 ] ( Abb. 6 , 6a).

Abb. 6: Reaktion der Chloro- zu den Fluoroformamidiniumsalzen am Beispiel von Bipyrrolidinofluoroformamidiniumhexafluorophosphat (6b)


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Die nach der Umsetzung mit trockenem KF in Acetonitril als Endprodukte isolierten Fluoroformamidiniumhexafluorophosphate sind kristalline Verbindungen, die an der Luft über längere Zeit stabil sind. Die Charakterisierung der synthetisierten Fluoroformamidiniumhexafluorophosphate erfolgte mittels ES-MS , 1H- und 13C- NMR -Spektroskopie.

Die Bestimmung der Epimerisierung bei der Kupplung von Z -Gly-Ala-OH an H-Leu-O Bn mit Bipyrrolidinofluoroformamidiniumhexafluorophosphat bzw. Bipiperidinofluoroformamidiniumhexafluorophosphat in DMF in Gegenwart von 2 Äq. DIEA ergab Anteile des LDL -Isomers von jeweils 35 % ( HPLC ). Bei IR -spektroskopischen Untersuchungen in DCM konnte bei der Aktivierung nur das 5(4H)-Oxazolon (nyC=O: 1828 cm-1) beobachtet werden und nicht, wie erhofft, das Dipeptidfluorid. Aus diesem Grund erwiesen sich diese Fluoroformamidiniumhexafluorophosphate als ungeeignet für die Peptidsegmentkondensation. Analoge Ergebnisse ( LDL -Isomer 32 %, HPLC ) wurden bei Anwendung der auf gleichem Weg hergestellten zyklischen Verbindung 1,3-Dimethyl-2-fluoroimidazolidiniumhexafluorophosphat erhalten.


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