Hanay, Christiane: Optimierung von Kupplungsverfahren für die Peptidsegmentkondensation

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Kapitel 3. Untersuchungen zum Mechanismus der Reaktionen mit Uroniumsalzen

Der Verlust der chiralen Integrität bei Einsatz bekannter Uroniumsalze und modifizierter Reagenzien zur Segmentkupplung erforderte Untersuchungen zum Mechanismus der Aktivierung, um die Ursachen der Epimerisierung zu klären.

Der Verlauf der Aktivierung via Uroniumsalze wurde bereits in der Literatur diskutiert [ 50 , 60 , 80 ] ( Abb. 7 ):

Abb. 7: Vorgeschlagener Mechanismus der Aktivierung von Peptidsegmenten durch Uroniumsalze

Durch Angriff des Carboxylats ( Abb. 7 , 8) am positiv geladenen C-Atom der Uroniumverbindung 5 bildet sich ein tetraedrischer Übergangszustand 9, aus dem durch gleichzeitiges Austreten des Anions der N-Hydroxyverbindung 11 ein O-Acyluroniumkation 10 entsteht. Dieses reagiert durch basenkatalysierte Abspaltung des Amidprotons und nachfolgenden Ringschluß zum Oxazolon 12. Das Oxazolon wird durch Angriff des Anions der N-Hydroxyverbindung 11 zum korrespondierenden Aktivester 13 bzw. 14 geöffnet.


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3.1. Nachweis und Reaktivität der O-Acyluroniumverbindung

Als erster Schritt der Aktivierung wird die Bildung der O-Acyluroniumverbindung als ein vermutlich kurzlebiger Zwischenzustand angenommen. HOEPRICH [ 81 ] lieferte einen indirekten Nachweis der O-Acyluroniumstruktur, indem er bei der Aktivierung von zweifach 18O-markiertem Fmoc -Glycin mit HBTU / DIEA das 18O-Isotop im entstehenden Tetramethylharnstoff nachweisen konnte. Kürzlich wurde von COSTE [ 82 ] anhand von 31P- NMR -Messungen der direkte Nachweis einer sich intermediär bildenden Acyloxyphosphoniumstruktur bei der Aktivierung der sterisch gehinderten Mesitylencarbonsäure mit Phosphoniumsalzen, wie PyCloP ( Abb. 3 , 4kv mit X=Cl) [ 79 ] und PyBOP , erbracht. Bei Übertragung dieser Untersuchungen auf urethangeschützte Aminosäuren konnte er indes nur die Bildung des Tripyrrolidinophosphinoxids ohne Intermediatbildung beobachten. Vergleichbare Untersuchungen zur Aktivierung mit Uroniumsalzen waren bislang nicht bekannt, sind aber zum Verständnis des Reaktionsmechanismus von Bedeutung. Daher soll hier ebenfalls das Modell der Mesitylencarbonsäure ausgenutzt werden. Im Gegensatz zur Peptidaktivierung kann bei Aktivierung der Mesitylencarbonsäure 15 mit Uroniumsalzen keine Oxazolonbildung erfolgen, sondern eine auftretende O-Acyluroniumverbindung 17 reagiert unmittelbar mit OAt - 11 zum Aktivester 18, wie in Abb. 8 am Beispiel der Aktivierung mit HAPyU 5 dargestellt.

Abb. 8: Mesitylencarbonsäure-Aktivierung unter Verwendung von HAPyU


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3.1.1. Mesitylencarbonsäure-Aktivierung als Modell zum Nachweis der O-Acyluroniumverbindung

Als Referenz für mechanistische Untersuchungen der Aktivierung von Mesitylencarbonsäure mit HAPyU wurde das O-Acyluroniumintermediat in Analogie zu TEICHMANN [ 83 ] hergestellt ( Abb. 9 ).

Abb. 9: Synthese von Bipyrrolidino[(mesitylcarbonyl)oxy]uroniumhexachloroantimonat

Das entstehende Bipyrrolidino[(mesitylcarbonyl)oxy]uroniumhexachloroantimonat wurde anhand der Carbonyl-Schwingungsbande (nyOCOC+: 1773 cm-1) sowie mittels 1H- und 13C- NMR -Spektroskopie (1H: siehe Abb. 10 , 13C: deltaC+: 153,2 ppm und Tab. 12 Anhang) charakterisiert.

Abb. 10: 1H- NMR -Analyse des entsprechend Syntheseweg in Abb. 9 dargestellten Bipyrrolidino[(mesitylcarbonyl)oxy]uroniumhexachloroantimonats

Die Aktivierung der Mesitylencarbonsäure ( Abb. 8 , 15) mit HAPyU 5 in Gegenwart von 1 Äq. Collidin 16 in CD2Cl2 wurde mittels 13C- NMR verfolgt. Bei Raumtemperatur erfolgte innerhalb von 2 min die ausschließliche Bildung des OAt -Esters 18 (13C- NMR -Daten siehe


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Tab. 15 Anhang), dessen Identifizierung durch Vergleich mit auf unabhängigem Weg hergestelltem Aktivester durchgeführt wurde. Signale der O-Acyluroniumverbindung konnten nicht beobachtet werden.

Um eine Herabsetzung der Reaktionsgeschwindigkeit zu erreichen und damit die Möglichkeit der Beobachtung des Intermediates zu verbessern, wurden NMR -Untersuchungen im Temperaturbereich zwischen -50°C und Raumtemperatur durchgeführt. Als geeignete Methode bot sich die 13C- NMR an, da sich die 1H-Signale im Bereich der aromatischen CH-Protonen (Intermediat, OAt -Ester), der Methylprotonen (Intermediat, OAt -Ester, Collidin, Mesitylencarbonsäure) und Harnstoffmethylenprotonen (Intermediat, protonierter Harnstoff) überlagern.

Zum Vergleich wurde zunächst die Reaktion von Mesitylencarbonsäurechlorid mit Bipyrrolidinoharnstoff unter Zusatz von SbCl5 ( Abb. 9 ) in CD2Cl2 bei tiefen Temperaturen verfolgt (-50°C, -5°C, 20°C) (13C- NMR -Daten siehe Tab. 12 Anhang). Neben der als Hauptprodukt entstandenen O-Acyluroniumverbindung wurde bei -50°C im 13C- NMR -Spektrum noch restliches Säurechlorid identifiziert, welches nach Temperaturerhöhung auf -5°C fast vollständig zum Intermediat reagiert hatte. Mit der Erhöhung der Temperatur konnte eine geringfügige Verschiebung der Linienpositionen im 13C- NMR -Spektrum zu tieferem Feld beobachtet werden.

Die Aktivierung von Mesitylencarbonsäure mit HAPyU / 1 Äq. Collidin in CD2Cl2 im Temperaturbereich zwischen -50°C und 20°C zeigte die sofortige Bildung des Intermediates bei -50°C im Vergleich zur sofortigen Bildung des Aktivesters bei Raumtemperatur (13C- NMR -chemische Verschiebungen siehe Tab. 13 Anhang, Abb. 11 ).

Abb. 11: 13C- NMR -chemische Verschiebungen in ppm von Bipyrrolidino[(mesitylcarbonyl)oxy]uroniumhexafluorophosphat aus der Aktivierung von Mesitylencarbonsäure mit HAPyU in Gegenwart von Collidin in CD2Cl2 bei -50°C


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Die Reaktionsmischung bei -50°C enthielt außerdem einen Anteil bereits gebildeten OAt -Esters. Infolge der verschiedenen Komponenten im Reaktionsgemisch war die eindeutige Verfolgung der Reaktion der O-Acyluroniumverbindung erschwert. Jedoch war anhand der Peakhöhen deutlich erkennbar, daß sich nach einer Temperaturerhöhung auf -5°C der Anteil an Intermediat erheblich verringerte, während nach Aufheizen auf Raumtemperatur nur noch OAt -Ester in der Reaktionsmischung beobachtet werden konnte.

Zur Bestätigung der Ergebnisse wurde im Rahmen der Arbeiten das SbCl6-Analogon des HAPyU 1-(1-Pyrrolidinyl-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylen)pyrrolidiniumhexachloroantimonat-N-Oxid ( Abb. 12 , 19b) synthetisiert, um einen direkten Vergleich zur Standardreaktion, der Reaktion von Mesitylencarbonsäurechlorid mit Bipyrrolidinoharnstoff in Gegenwart von SbCl5 ( Abb. 9 ), in Abhängigkeit der Temperatur herzustellen und damit die Identifizierung mittels 13C- NMR zu erleichtern. Die Synthese gelang in Analogie zur HAPyU -Herstellung [ 22 ] durch Umsetzung von Bipyrrolidinochloroformamidiniumhexachloroantimonat ( Abb. 12 , 19a) mit K OAt in Acetonitril. Die Charakterisierung der Verbindung wurde mittels 1H- und 13C- NMR sowie ES-MS durchgeführt.

Abb. 12: Synthese von 1-(1-Pyrrolidinyl-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylen)pyrrolidiniumhexachloroantimonat-N-Oxid (SbCl6-Analogon von HAPyU ) (19b)

Der Einsatz des SbCl6-Analogons von HAPyU anstelle von HAPyU zur Aktivierung bei erniedrigter Temperatur resultierte in einem besser zu verfolgenden Reaktionsverlauf. Dabei beobachteten wir das Vorliegen der O-Acyluroniumverbindung bei -50°C, mit abnehmender Intensität bei -5°C unter gleichzeitiger Bildung des korrespondierenden OAt -Esters, der bei Raumtemperatur ausschließlich gefunden wurde ( Abb. 13 , Tab. 14 Anhang) [ 84 ].


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Abb. 13: 13C- NMR -Tieftemperaturuntersuchungen bei -50°C, -5°C und 20°C der Aktivierung von Mesitylencarbonsäure mit 1-(1-Pyrrolidinyl-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylen)pyrrolidiniumhexachloroantimonat-N-Oxid (19b) in Gegenwart von Collidin in CD2Cl2

Am Modell der Mesitylencarbonsäure konnte erstmalig auch für Uroniumsalze direkt nachgewiesen werden, daß sich eine instabile O-Acyluroniumsalz-Zwischenstufe als erster Schritt im Verlauf der Carboxyaktivierung bildet. Dieses Intermediat kann unter Freisetzung von Harnstoff zu Oxazolon, Aktivester und durch Angriff der Aminokomponente zum Peptid reagieren.

Nach Abschluß dieser Arbeiten wurden von HENKLEIN [ 85 ] die vorliegenden Ergebnisse zur Bildung der O-Acyluroniumverbindung am Modell der Aktivierung der Pivalinsäure mit Hilfe von 1H- NMR -Experimenten bestätigt.


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3.1.2. Reaktivität der Aktivderivate der Mesitylencarbonsäure

Im folgenden wurden vergleichende Reaktivitätsuntersuchungen anhand der Aminolyse der Mesitylencarbonsäure-Aktivderivate mit Benzylamin in CD2Cl2 bei Raumtemperatur durchgeführt ( Abb. 14 ).

Abb. 14: Modellreaktion zur Untersuchung der Reaktivität der Mesitylencarbonsäure-Aktivderivate

Das als Endprodukt entstehende N(2,4,6-Trimethylbenzoyl)benzylamid ( Abb. 14 , 20), notwendig als Referenz, wurde aus der Umsetzung von Benzylamin mit Mesitylencarbonsäurechlorid in Gegenwart von Triethylamin in DCM erhalten und mittels IR (nyCONH: 1630 cm-1) und 1H- NMR charakterisiert.

Die Ermittlung der Halbwertzeiten t½ erfolgte durch kinetische 1H- NMR -Untersuchungen anhand der Abnahme des CH2-Singuletts von Benzylamin bei deltaCH2: 3,85 ppm und der korrespondierenden Zunahme des CH2-Dupletts von N(2,4,6-Trimethylbenzoyl)benzylamid bei deltaCH2: 4,5 ppm.

Tab. 2: Vergleich der Reaktivitäten (bei gleicher Konzentration der Reaktionspartner 1:1) des Mesitylencarbonsäure-O-Acyluroniumintermediates und - OAt -Esters bei der Reaktion mit Benzylamin in CD2Cl2 (0,4 M) mit Hilfe der 1H- NMR -Spektroskopie. Gemessen wurde die Zeit, in der die Hälfte des Ausgangsstoffes reagiert war (t½).

Aktivderivat

Base zur Aminolyse (1 Äq. )

t½

Mesit(Py)2+ SbCl6-

Mesit-OAt-Ester

DIEA

DIEA

< 1 min 45 s

6 min 40 s

Die Ergebnisse zeigten die höhere Reaktivität des O-Acyluroniumderivates (hergestellt entsprechend Syntheseweg Abb. 9 ) im Vergleich zum OAt -Ester ( Tab. 2 ).


29

3.2. Bildung von Oxazolon und Aktivester im Verlauf der Aktivierung von Peptidsegmenten mit Uroniumsalzen

Um den Einfluß der reaktiven Spezies Aktivester und Oxazolon auf die Epimerisierung im Verlauf der Segmentkondensation mit Uroniumsalzen zu verifizieren, wurde die Aktivierung in Abwesenheit der Aminokomponente in Abhängigkeit der Lösungsmittelpolarität, des zugefügten tertiären Amins und der zusätzlichen Anwesenheit von N-Hydroxyverbindungen, wie HOBt , studiert.

Wie von STEINAUER et al. [ 60 ] für den Fall der Phosphoniumsalze ( BOP ) zur Segmentkondensation beschrieben, resultiert die Verwendung von polaren Lösungsmitteln, wie DMF , anstelle von vergleichsweise unpolaren Medien, wie DCM , in einer Erhöhung der Epimerisierung. Generell werden zur Kupplung mit Uroniumsalzen 2 Äq. Base verwendet. Dabei dient ein Äquivalent der Überführung der Säure 7 (siehe Abb. 7 ) in das Carboxylation 8 und das zweite zum Abfangen der bei der Reaktion entstehenden N-Hydroxyverbindung. Eine Senkung der Epimerisierung kann erreicht werden, wenn nur 1 Äq. Base zur Aktivierung verwendet wird. Jedoch wurden von STEINAUER et al. unter diesen Bedingungen geringere Kupplungsausbeuten beobachtet. Des weiteren ist eine Reduzierung der Stereomutation nach Addition von HOBt zur BOP vermittelten Segmentkupplung beschrieben worden [ 45 , 60 ].

Ausgehend von diesen Befunden wurden kinetische Untersuchungen zur Aktivierung mit Hilfe der IR - und NMR -Spektroskopie unter Verwendung von Z -Gly-Ala-OH als Modellpeptid durchgeführt.

3.2.1. Aktivierung mit Uroniumsalzen im unpolaren Lösungsmittel

Im allgemeinen wird in unpolareren Lösungsmitteln geringere Epimerisierung gefunden. Um die Verhältnisse für Uroniumsalze zu beschreiben, wurden repräsentative Vertreter mit unterschiedlichen Abgangsgruppen, wie TBTU , TBPyU , HAPyU und TNTU untersucht.

Im Fall der Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH mit TBTU in DCM in Gegenwart von 2 Äq. DIEA bei Raumtemperatur wurde mittels IR beobachtet, daß sich innerhalb weniger Sekunden das Oxazolon bildete. Eine sich in erster Stufe der Aktivierung bildende O-Acyluroniumverbindung wurde erwartungsgemäß nicht beobachtet, in Übereinstimmung mit den Untersuchungen in Kapitel Mesitylencarbonsäure-Aktivierung als Modell zum Nachweis der O-Acyluroniumverbindung , bei denen selbst unter Verwendung der sterisch


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gehinderten Mesitylencarbonsäure das O-Acyluroniumintermediat bei Raumtemperatur nicht nachweisbar war. Die Öffnung des Oxazolons und Weiterreaktion zum korrespondierenden OBt -Ester erfolgte sehr langsam. Nach der ersten Stunde wurde keine signifikante OBt -Esterbildung beobachtet. Wie aus Abb. 15 hervorgeht, ist der Übergang vom Oxazolon zum OBt -Ester an der Verringerung der Intensität der CO-Schwingungsbande des Oxazolons bei nyC=O: 1828 cm-1 [ 31 , 82 ] und dem simultanen Anwachsen der OBt -Ester-Bande bei nyC=O: 1810 cm-1 [ 40 , 82 , 86 ] erkennbar. Die Charakterisierung erfolgte außerdem mittels 1H- und 13C- NMR (siehe Tab. 16 Tab. 18 Tab. 18 Anhang).

Abb. 15: Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH mit TBTU in Gegenwart von 2 Äq. DIEA in DCM ( IR )

In Analogie wurde bei Verwendung anderer OBt -enthaltender Uroniumsalze, wie TBPyU , dieselbe Geschwindigkeit der Öffnung des Oxazolons zum OBt -Ester beobachtet. Ähnlich wurde bei Anwendung des von CARPINO [ 22 , 56 ] entwickelten Azabenzotriazol-Derivates HAPyU zur Aktivierung nach einer Beobachtungszeit von 6 h nur Oxazolon gefunden ( IR ). Daraus folgt, daß eine Segmentkupplung mit TBTU / TBPyU oder HAPyU in DCM unter Zusatz von 2 Äq. Base in erster Linie via Oxazolon verläuft, wobei die Reaktivität des Oxazolons im Vergleich zum Aktivester gering ist (siehe Kapitel Modelluntersuchungen zur in situ Synthese und Kupplung von Peptidsegmentfluoriden ). Wurde die Menge an zugesetztem DIEA zur Aktivierung mit TBTU auf nur 1 Äq. DIEA reduziert, war die Umwandlung zum OBt -Ester bereits nach 17 min beendet. Ebenso bewirkte die Addition


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von 1 Äq. freiem HOBt in Gegenwart von 2 Äq. DIEA zur TBTU -Aktivierung eine beschleunigte OBt -Esterbildung (innerhalb von 20 min) [ 87 ].

Im Gegensatz zu den Geschwindigkeiten der OBt - und OAt -Esterbildung resultierte die Aktivierung mit TNTU in DCM in Gegenwart von 2 Äq. DIEA in der Bildung des korrespondierenden ONB -Esters innerhalb von 2 min ( IR ).

3.2.2. Aktivierung mit Uroniumsalzen im polaren Lösungsmittel

Der Übergang zu polareren Reaktionsmedien ist, wie in Kapitel Prinzip der Peptidsynthese aufgezeigt, für die Kupplung von Peptidsegmenten wünschenswert. In diesem Zusammenhang wurde die Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH in DMF mittels 1H- NMR -Spektroskopie untersucht.

Im Gegensatz zur Reaktion in DCM bildete sich bei der Aktivierung in DMF in Gegenwart von 2 Äq. DIEA sofort eine Mischung aus Oxazolon und Aktivester ( Abb. 16 , Tab. 3 ). Weder für TBTU noch für HAPyU änderte sich das eingestellte Aktivester/Oxazolon-Verhältnis signifikant nach 30 s. Offenbar handelt es sich hier um ein Gleichgewicht, das sich zwischen beiden Aktivkomponenten eingestellt hat [ 88 ].

Abb. 16: Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH mit TBTU in Gegenwart von 2 Äq. DIEA in DMF -d7 (1H- NMR )


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Tab. 3: Anteile an gebildetem Z -Gly-Ala-Aktivester und -Oxazolon bei der Aktivierung mit Uroniumsalzen in DMF -d7 unter verschiedenen Bedingungen (1H- NMR )

Aktivierungsbedingungen

Zeit (min)

Aktivester (mol-%)

Oxazolon (mol-%)

TBTU + 1 Äq. DIEA

0,5

5

72

79

28

21

TBTU + 2 Äq. DIEA

0,5

5

63

70

37

30

TBTU + HOBt + 2 Äq. DIEA

0,5

5

74

79

26

21

TBTU + HOBt + 3 Äq. DIEA

0,5

5

71

74

29

26

HAPyU + 2 Äq. DIEA

0,5

5

34

33

66

67

HAPyU + HOAt + 2 Äq. DIEA

0,5

5

52

53

48

47

TNTU + 2 Äq. DIEA

0,5

5

79

97

21

3

Der Zusatz von weniger DIEA (1 Äq. ) zur Aktivierung in DMF wie auch die Addition von 1 Äq. N-Hydroxyverbindung ( HOBt oder HOAt ) resultierte in einer Verschiebung des Aktivester/Oxazolon-Verhältnisses zugunsten des Aktivesters (1H- NMR ).

Das Aktivester/Oxazolon-Verhältnis in DMF änderte sich in Richtung geringerer Oxazolonanteile von 1:1,9 mit HAPyU und 1:0,6 mit TBTU zu 1:0,3 für TNTU . Im Fall von TNTU war die Aktivesterbildung langsamer als mit TBTU und HAPyU , erreichte aber nach 5 min ein konstantes Verhältnis, nahezu vollständig auf der Seite des Aktivesters.

Bei Verwendung von Uroniumsalzen zur Peptidsegmentkupplung tritt generell Peptidoxazolon in Gegenwart von Base auf, was zur Stereomutation führt.


33

3.2.3. Untersuchungen zur Ringöffnung des Oxazolons

Wie aus diesen Untersuchungen deutlich wird, entsteht das Oxazolon im Verlauf der Aktivierung via Uroniumsalze in Abwesenheit der Aminokomponente nicht als kurzlebiger Übergangszustand, sondern vielmehr befindet es sich im Gleichgewicht mit dem korrespondierenden Aktivester. Um die Lage des Gleichgewichtes zwischen Aktivester und Oxazolon in Abhängigkeit von Lösungsmittel und Baseneinfluß zu verifizieren, wurde hier in Modellstudien die Ringöffnung des vorgebildeten Oxazolons in Gegenwart verschiedener N-Hydroxyverbindungen ( HOBt , HOAt , HONB ) untersucht.

Aktivester/Oxazolon-Gleichgewicht

Wurde das Oxazolon mit 1 Äq. HOBt in DCM ohne Zusatz von Base behandelt, bildete sich der korrespondierende OBt -Ester sehr schnell in weniger als 2 min ( IR ). Eine verbleibende Schulter bei 1828 cm-1 im IR -Spektrum zeigte, daß außer dem OBt -Ester noch ein geringer Anteil Oxazolon nach 60 min in der Reaktionsmischung verblieb. Dies steht im Widerspruch zu jüngsten Ergebnissen von BENOITON, der eine vollständige Bildung des OBt -Esters innerhalb von 10 min nach Behandlung des Z -Gly-Val-Oxazolons mit HOBt in CHCl3 beschrieb [ 59 ]. Wurde dagegen anstelle von HOBt eine Mischung aus HOBt / DIEA (1:1) zum Oxazolon in DCM addiert, konnte kein Aktivester im Zeitraum von 30 min beobachtet werden ( IR ). Dies befindet sich in Übereinstimmung zur Aktivierung mit TBTU , die zu einer nur langsamen OBt -Esterbildung in DCM führte.

Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Zugabe von HOAt erhalten. Die Bildung des korrespondierenden OAt -Esters erfolgte innerhalb von 2 min ( IR ). Jedoch wurde in diesem Fall im unpolaren Lösungsmittel ein höherer Oxazolonanteil im Vergleich zur Addition von HOBt beobachtet. Wenn das Oxazolon mit einer Mischung aus HOAt / DIEA (1:1) in DCM behandelt wurde, konnte innerhalb von 2 h kein OAt -Ester gefunden werden ( IR ).

Im Gegensatz zur langsamen Reaktion des Oxazolons mit HOBt oder HOAt in Gegenwart von DIEA erfolgte die Ringöffnung nach Addition von sowohl HONB als auch HONB / DIEA zum Oxazolon in DCM in beiden Fällen sehr schnell ( IR ). In Gegenwart des tertiären Amins wurde nur ein sehr geringer Anteil des Oxazolons beobachtet, ein deutlicher Hinweis auf die nahezu vollständige ONB -Esterbildung.

Um die Reaktion des Oxazolons mit HOBt im polaren Reaktionsmedium zu untersuchen, wurde das in DCM synthetisierte Oxazolon mit DMF im Verhältnis von 1:1,3 verdünnt.


34

30 s nach Addition von 1 Äq. HOBt zum Oxazolon wurde ein OBt -Ester/Oxazolon-Verhältnis von 1:0,2 mittels 1H- NMR -Spektroskopie beobachtet ( Abb. 17 ), das für mindestens 60 min konstant blieb.

Abb. 17: Verhältnis der nach 5 min gebildeten Z -Gly-Ala-Aktivspezies unter verschiedenen Aktivierungsbedingungen (erhalten durch Integration des CH2-Dupletts von Glycin aus 1H- NMR -Kinetikanalysen in CD2Cl2/ DMF -d7)

Zusätzlich zur O-Acylform des Aktivesters konnte in DCM / DMF der NMR -Nachweis für die Gegenwart eines geringen Anteils (\|[ap ]\| 14 %) des korrespondierenden N-Acylisomers [ 40 , 59 , 86 , 89 , 90 ] erbracht werden (siehe Abb. 18 und Tab. 17 Anhang). Die hier angegebenen Verhältnisse beinhalten die Summe beider Formen des Aktivesters relativ zur Menge des Oxazolons.


35

Abb. 18: Wesentliche Crosspeaks der alpha- und beta-Protonen innerhalb der Gruppierung NH-CH-CH3, ermittelt durch ein TOCSY -1H- NMR -Experiment der Reaktion von Z -Gly-Ala-Oxazolon mit HOBt in DCM / DMF . In der Reaktionsmischung wurden 5 Verbindungen gefunden: OBt -Ester (69 %), Oxazolon (8 %), Dipeptidsäure (7 %), vermutlich N-Acyl- OBt -Ester (14 %), nicht bekannte Verbindung (3 %). (siehe auch Tab. 17 Anhang)

Außer den Aktivkomponenten wurde entsprechend der 1H- NMR -Analyse ein Anteil von ca. 10 % Ausgangspeptid beobachtet, der sich im Verlauf der Reaktion erhöhte. Da jedoch das Verhältnis der Aktivspezies innerhalb des gesamten Beobachtungszeitraums konstant blieb, wurde davon ausgegangen, daß das Vorhandensein der Dipeptidsäure mit einer teilweisen Hydrolyse insbesondere des Aktivesters zu begründen ist. Die Anwesenheit der Dipeptidsäure in der Reaktionsmischung wurde daher in den folgenden Diskussionen vernachlässigt.

Unter analogen Reaktionsbedingungen, jedoch in Gegenwart von 1 Äq. DIEA ( HOBt / DIEA =1:1), wurde ein OBt -Ester/Oxazolon-Verhältnis von 1:1,4 beobachtet, das ebenfalls innerhalb von 60 min konstant blieb ( Abb. 17 ). Offensichtlich führt die Anwesenheit von DIEA zur Verschiebung des OBt -Ester/Oxazolon-Verhältnisses zugunsten des Oxazolons.

Eine weitere Verschiebung des OBt -Ester/Oxazolon-Verhältnisses konnte durch die Behandlung des Oxazolons ( DCM / DMF =1:1,3) mit einem doppelten Überschuß HOBt / DIEA (1:1) erreicht werden. Nach 30 s wurde ein OBt -Ester/Oxazolon-Verhältnis von 1:0,6 beobachtet (1H- NMR ).

Um zu untersuchen, inwieweit ein oxazolonfreies System durch Erhöhung der HOBt -Konzentration in Abwesenheit von Base realisiert werden kann, wurde eine Aktivester/Oxazolon-Mischung (1:0,09), die vorerst in DCM unter Verwendung von 1,2 Äq. HOBt synthetisiert wurde, mit zusätzlichen 0,7 Äq. HOBt in DMF behandelt. Es wurde keine signifikante Änderung des Aktivester/Oxazolon-Verhältnisses beobachtet (1H- NMR ), also kann die Oxazolonbildung in DCM / DMF (1:1,3) so nicht vollständig vermieden werden. Nachteilig bei Verwendung von HOBt -Überschüssen ist außerdem eine Verringerung des Umsatzes infolge einer Protonierung der freien Aminofunktion [ 46 ].


36

Um das Gleichgewicht in DMF von der Seite des Aktivesters zu erreichen, wurde 1 Äq. DIEA zum zuvor in DCM gebildeten OBt -Ester hinzugefügt. Das nach 30 s eingestellte OBt -Ester/Oxazolon-Verhältnis von 1:1,3 ist in Übereinstimmung zum Verhältnis aus der Reaktion des Oxazolons mit HOBt / DIEA (1H- NMR ) ( Abb. 17 ). Die Ergebnisse zeigen, daß der Gleichgewichtszustand aus beiden Richtungen, sowohl von der Seite des Aktivesters als auch von der Seite des Oxazolons, erreicht werden konnte.

In DCM / DMF (1:1,3) wurde mit HOAt (1 Äq. ) nach 5 min ein OAt -Ester/Oxazolon-Verhältnis von 1:0,4 erhalten, im Vergleich zu 1:0,2 im Fall von HOBt (1H- NMR ) ( Abb. 17 ). Das Verhältnis blieb für mindestens 60 min konstant. Die Behandlung des Oxazolons mit einer Mischung aus HOAt / DIEA (1:1) bewirkte eine Verschiebung des Verhältnisses zu 1:3,4 (1H- NMR ). Eine ähnliche Position des OAt -Ester/Oxazolon-Gleichgewichtes konnte ebenfalls von der Seite des Aktivesters durch Addition von 1 Äq. DIEA erreicht werden.

Dagegen verlief die ONB -Esterbildung in DCM / DMF (1:1,3) nach Addition von HONB (1 Äq. ) zum Oxazolon sehr langsam (1H- NMR ) ( Abb. 19 ). Das ONB -Ester/Oxazolon-Verhältnis erhöhte sich von 1:3,2 nach 30 s zu 1:0,05 nach 60 min. Der Zusatz von HONB / DIEA führte zur Bildung eines Aktivester/Oxazolon-Verhältnisses von 1:0,1 nach 30 s, das sich nach 60 min auf 1:0,02 erhöhte ( Abb. 19 ) (1H- NMR ). Damit wurde gezeigt, daß sich in Gegenwart von Base das Oxazolon nahezu vollständig in den ONB -Ester umwandelt, im Gegensatz zur Ringöffnung des Oxazolons durch HOBt oder HOAt unter analogen Reaktionsbedingungen.


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Abb. 19: Ausmaß der Z -Gly-Ala- ONB -Esterbildung unter verschiedenen Bedingungen (erhalten durch Integration des CH2-Dupletts von Glycin aus 1H- NMR -Kinetikanalysen in CD2Cl2/ DMF -d7)

Folglich wird durch die schnelle Reaktion des Oxazolons in DCM mit HOBt , HOAt oder HONB die Annahme einer säurekatalysierten Oxazolonringöffnung bestätigt. Gleichermaßen erklärt sich die Tatsache, daß die zusätzliche Anwesenheit von Base zu verminderten Ringöffnungen im Fall von HOBt und HOAt führt. Die noch effektive Ringöffnung im Fall der HONB -Addition in DCM in Gegenwart von Base ist vermutlich auf die höhere Basizität von HONB gegenüber HOBt oder HOAt zurückzuführen, unter der Annahme, daß der pKa-Wert von HONB dem von HONSu (6,09) ähnlich ist und damit höher liegt als die pKa-Werte von HOBt (4,6) oder HOAt (3,47) [ 91 , 92 ]. Im Gegensatz dazu verlief die Ringöffnung in DMF in Gegenwart von Base schnell. Jedoch kann die beschleunigte Reaktion von HONB durch Addition von Base unter der Annahme einer säurekatalysierten Oxazolonringöffnung nicht erklärt werden. Im Fall von HOBt oder HOAt liegen noch kompliziertere Verhältnisse vor, da unterschiedliche Spezies (O- oder N-Acylform [ 40 , 86 , 89 ] von OBt oder OAt ) in der Reaktionsmischung auftreten können, deren pKa-Werte nicht bekannt sind.

Bei Zusatz des tertiären Amins (1 Äq. ) zum zuvor gebildeten ONB -Ester wurde in DCM eine nur sehr geringe Oxazolonbildung beobachtet ( IR ). In DCM / DMF (1:1,3) konnte innerhalb von 60 min keine Bildung von Oxazolon gefunden werden (1H- NMR ) ( Abb. 19 ). Wenn diese Ergebnisse allgemeingültig sind und die Oxazolonbildung in Gegenwart von Base vermieden werden kann, ergibt sich daraus ein interessanter Ansatzpunkt für die Entwicklung einer epimerisierungsfreien Segmentkondensation auf der Basis des ONB -Esters.


38

3.3. Einfluß des Aktivester/Oxazolon-Gleichgewichtes auf das Ausmaß der Stereomutation

Anhand der in Kapitel Epimerisierung bei Anwendung von bekannten Uroniumsalzen dargestellten Modelluntersuchungen wurde die Menge an LDL -Isomer bei Anwendung der verschiedenen Uroniumsalze bereits untersucht. Um den Einfluß des Aktivester/Oxazolon-Gleichgewichtes auf das Ausmaß der Stereomutation unter den verschiedenen Bedingungen zu verifizieren, wurden mit einem zweiten Modellpeptid Untersuchungen durchgeführt (Gleichung 2):

Die Bestimmung der Epimerisierung und der Ausbeute in Abhängigkeit der Reaktionszeit erfolgte mittels HPLC ( Abb. 20 ).

Abb. 20: HPLC -Profil der Trennung von H-Gly-L/DVal-Val-O Bn

3.3.1. Epimerisierung der Aktivester

Im Vorfeld der Untersuchungen zu den Uroniumsalzen, die über die in situ Bildung von Aktivestern reagieren, wurden die Aktivester selbst hinsichtlich ihrer Epimerisierungstendenz untersucht. Sie wurden via DCC /Additiv in DCM gebildet und danach in DCM / DMF zur Kupplung eingesetzt.

In Abwesenheit des tertiären Amins verlief die Kupplung der Aktivester mit geringer Epimerisierung ( Abb. 21 ). Die Kupplung des ONB -Esters war im Vergleich zu den Fällen der OAt - und OBt -Ester sehr langsam. Die Kupplungsausbeuten unter Verwendung des OAt -Esters lagen fast 20 % höher als die des korrespondierenden OBt -Esters.


39

Abb. 21: Ausmaß der Stereomutation nach einer Kupplungszeit von 5 min während der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn unter Verwendung verschiedener Aktivester ( DCC /Additiv) in DCM / DMF ohne Zusatz von Base

Um die Bedingungen während einer langsamen Kupplung mittels Uroniumsalzen zu simulieren, wie z.B. das Vorhandensein aktivierter Spezies in Gegenwart von Base, und um Epimerisierung im Modellsystem hervorzurufen, wurden die verschiedenen zuvor gebildeten Aktivester für eine Vorinkubationszeit von 60 s vor Addition der Aminokomponente mit 1 Äq. DIEA behandelt ( Tab. 4 ).

Tab. 4: LDL -Isomerbildung während der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn in DCM / DMF unter Verwendung verschiedener Aktivester ( DCC /Additiv), die mit 1 Äq. DIEA für 60 s vorinkubiert worden sind

Kupplungszeit

OBt -Ester

LDL / Ausbeute

(mol-%)

OAt -Ester

LDL / Ausbeute

(mol-%)

ONB -Ester

LDL / Ausbeute

(mol-%)

10 s

31,0 / 66

18,9 / 85

- / 2

30 s

32,9 / 80

20,0 / 87

- / 6

60 s

33,6 / 84

20,1 / 87

- / 9

5 min

34,2 / 85

20,2 / 87

0,4 / 31

30 min

34,3 / 85

20,3 / 88

1,5 / 72

60 min

34,3 / 86

20,5 / 89

2,6 / 81

Die Einstellung des Aktivester/Oxazolon-Gleichgewichtes ist entsprechend den 1H- NMR -Untersuchungen innerhalb dieser Zeit abgeschlossen. Der gebildete Oxazolonanteil im


40

Gleichgewicht stieg in der Reihenfolge ONB -Ester<< OBt -Ester< OAt -Ester ( Tab. 3 , Abb. 17 ), wohingegen ein Anstieg der Stereomutation in der Reihenfolge ONB -Ester<< OAt -Ester< OBt -Ester zu beobachten war ( Tab. 4 ). Obwohl eine höhere Epimerisierung im Fall des höheren Oxazolongehaltes zu erwarten wäre, wurde ein geringerer Anteil LDL -Isomer mit dem OAt -Ester als mit dem OBt -Ester erhalten. Das kann mit der Tatsache zusammenhängen, daß sich zu gleicher Zeit ein größerer Anteil freies HOAt in der Reaktionsmischung befindet, der einen effektiveren Pufferungseffekt bewirkt. Wenn der ONB -Ester in Gegenwart von Base gekuppelt wurde, ist die beobachtete geringe Stereomutation in Übereinstimmung mit dem niedrigen Oxazolongehalt. Die gleiche Reihenfolge der Kupplungsausbeuten ONB -Ester< OBt -Ester< OAt -Ester wurde erhalten wie ohne Anwesenheit des tertiären Amins, aber die Anwesenheit von Base hat eine Beschleunigung der Acylierung der Aktivester zur Folge.

3.3.2. Epimerisierung bei Anwendung der Uroniumsalze

Um die Epimerisierung der korrespondierenden Uroniumsalze und der Aktivester zu vergleichen, wurden die Uroniumsalze zunächst zu ”Eintopfreaktionen“ in DMF in Gegenwart von DIEA (2 Äq. zur Aktivierung, 1 Äq. zum Freisetzen der Aminokomponente) eingesetzt. Im Gegensatz zur Reihenfolge der Aktivester stieg der gefundene Anteil LDL -Isomer in der Reihenfolge HAPyU < TBPyU / TBTU < TNTU ( Abb. 22 ), in Bestätigung der Resultate am Modell Z -Gly-Ala-Leu-O Bn ( Tab. 1 Kapitel Epimerisierung bei Anwendung von bekannten Uroniumsalzen ) [ 93 ].

Abb. 22: LDL -Isomerbildung während der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn unter Verwendung verschiedener Uroniumsalze zu ”Eintopfreaktionen“ nach einer Reaktionszeit von 60 s


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Da sich das Gleichgewicht in Richtung des ONB -Esters im Verlauf der TNTU -Kupplung verschiebt, ist gleichzeitig weniger freies HONB vorhanden, was zu einem geringeren Pufferungseffekt und folglich zu einem höherem Überschuß an freiem DIEA führt ( Tab. 5 ).

Tab. 5: Verhältnis von überschüssiger Base zur Menge an Oxazolon in Abhängigkeit vom Aktivester/Oxazolon-Gleichgewicht ( Tab. 3 ) bei der Dipeptid-Aktivierung in DMF in Gegenwart von 2 Äq. DIEA

Menge des Uroniumsalzes/ geschützten Dipeptides

Menge des Aktivesters

( Äq. )

Menge des Oxazolons

( Äq. )

Menge an freier

N-Hydroxy-verbindung ( Äq. )

Menge an DIEA

( Äq. )

resultierender Überschuß DIEA

( Äq. )

1 Äq. TNTU

0,8

0,2

0,2

0,8

0,6

1 Äq. HAPyU

0,3

0,7

0,7

0,3

-

1 Äq. TBTU

0,6

0,4

0,4

0,6

0,2

Das Ausmaß der Epimerisierung wird jedoch nicht allein durch die Lage des Aktivester/Oxazolon-Gleichgewichtes bestimmt, sondern auch durch die Geschwindigkeit der Aktivesterbildung und Aminolyse. Die langsamere Bildung des ONB -Esters sowie seine geringe Aminolysegeschwindigkeit im Vergleich zu der des OAt - und OBt -Esters führt zu einer verlängerten Verweilzeit des Oxazolons in Gegenwart überschüssiger Base. Im Gegensatz dazu wird im Fall von HAPyU die Base nahezu durch freies HOAt neutralisiert, was zu minimaler Stereomutation führt ( Tab. 5 ). Zusätzlich verläuft infolge der hohen Aminolysegeschwindigkeit des OAt -Esters und der schnellen Oxazolonringöffnung durch HOAt die Kupplung viel schneller und mit geringer Stereomutation.

Ein größerer Verlust der Konfiguration wurde im Fall einer Voraktivierungszeit von 60 s (zur Simulation der Verhältnisse bei langsamen Kupplungen, Vergleich mit Situation der vorgebildeten Aktivester) beobachtet, aufgrund der erhöhten Oxazolonbildung in Gegenwart von Base. Wie in Tab. 6 aufgezeigt, stieg die Epimerisierung in der Richtung TNTU < HAPyU < TBTU / TBPyU . Bei Verwendung von 2 Äq. DIEA ist der Puffereffekt des freien HOAt nicht ausreichend, um die Epimerisierung im Verlauf der HAPyU -Kupplung mit Voraktivierung zu vermeiden. Die Unterschiede in der Epimerisierung bei Anwendung von HAPyU und TBTU / TBPyU werden auch beeinflußt durch die höhere Aminolysegeschwindigkeit des OAt -Esters relativ zu den OBt -Analoga.


42

Tab. 6: Ausmaß der Stereomutation während der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn via Uroniumsalz-Aktivierung nach einer Voraktivierungszeit von 60 s

Kupplungs-zeit

TBTU

LDL / Ausbeute (mol-%)

TBPyU

LDL / Ausbeute

(mol-%)

HAPyU

LDL / Ausbeute

(mol-%)

TNTU

LDL / Ausbeute

(mol-%)

10 s

31,0 / 79

30,9 / 96

17,6 / 100

14,8 / 2

30 s

32,3 / 97

31,1 / 100


14,3 / 5

60 s

32,3 / 100



16,7 / 11

5 min




16,6 / 41

30 min




16,5 / 90

60 min




16,9 / 99

Die Verwendung von Uroniumsalzen mit unterschiedlichem Harnstoffteil ( TBTU , TBPyU , TBPipU ) ergab ein ähnliches Ausmaß der Stereomutation, wohingegen von CARPINO und EL-FAHAM [ 22 ] mit HAPyU etwas bessere Ergebnisse als mit HATU gefunden wurden. Wenn die zuvor gebildeten OBt - oder OAt -Ester in Gegenwart von 1 Äq. DIEA ohne Vorinkubation gekuppelt wurden ( Abb. 23 ), war das Ausmaß der Bildung an LDL -Isomer ähnlich der beobachteten Menge im Fall der korrespondierenden Uroniumsalze in ”Eintopfreaktionen“.

Abb. 23: Ausmaß der LDL -Isomerbildung nach 60 s aus der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn unter Verwendung verschiedener Aktivester, die mittels DCC /Additiv ( DCM ) synthetisiert und in Gegenwart von 1 Äq. DIEA ohne Vorinkubation in DCM / DMF gekuppelt wurden


43

Vermutlich reagiert bei der Kupplung mit Uroniumsalzen die im ersten Schritt der Aktivierung entstehende O-Acyluroniumverbindung aufgrund ihrer hohen Reaktivität (Kapitel Reaktivität der Aktivderivate der Mesitylencarbonsäure ) sehr schnell zum Oxazolon. Damit dürfte sowohl die Bildung als auch der Zerfall des Intermediates so schnell verlaufen, daß dessen Beitrag zur Gesamtumsetzung der Reaktion bei den hier durchgeführten Untersuchungen zur Kupplung von Peptidsegmenten nicht nachweisbar war.

3.3.3. Schlußfolgerungen

Wie aus den hier dargestellten Modelluntersuchungen deutlich wurde, führt im Verlauf der Segmentkondensation eine schnelle Aktivierung oder die Anwesenheit eines hohen Anteils an Oxazolon während der Aktivierung nicht zwangsläufig zu einem hohen Grad der Epimerisierung. Ausschlaggebender sind die Geschwindigkeiten der Oxazolonringöffnung und der Aminolyse des Aktivesters sowie die Pufferung der anwesenden Base. Es wurde gezeigt, daß sich mit Uroniumsalzen unter den Bedingungen einer schnellen Ringöffnung des Oxazolons und einer schnellen Aminolyse hohe Kupplungsausbeuten mit geringer Epimerisierung erreichen lassen, wie im Fall der Kupplung mit HAPyU . Jedoch kann die Stereomutation nicht vollständig vermieden werden. Eine effektivere Abpufferung der Base durch saure Additive könnte noch geringere Epimerisierung erwarten lassen.

Ein wesentlicher Schritt zur Optimierung der Uroniumsalzkupplung war der Nachweis eines Aktivester/Oxazolon-Gleichgewichtes bei der Aktivierung von Peptidsegmenten unter Entstehung hoch reaktiver Ester, das in Gegenwart der erforderlichen Base für die Epimerisierung verantwortlich ist. Im Fall der Bildung des weniger reaktiven ONB -Esters mit TNTU verschiebt sich das Gleichgewicht zwar nahezu vollständig zum Aktivester, jedoch ist die Bildung des Aktivesters in Gegenwart von Base relativ langsam, woraus ebenfalls Epimerisierung resultiert. Die Darstellung des ONB -Esters im polaren Lösungsmittel ohne Zusatz von Base ist ein Ansatzpunkt, die Aktivierung ohne Oxazolonbildung und folglich die Segmentkupplung ohne Stereomutation zu ermöglichen.


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