Hanay, Christiane: Optimierung von Kupplungsverfahren für die Peptidsegmentkondensation

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Kapitel 4. Mischanhydridsynthese

Mischanhydride sind hinsichtlich der Umwandlung zum Oxazolon weniger reaktiv als die O-Acyluroniumion-Intermediate, die während der Aktivierung mit Uroniumsalzen auftreten. Im Fall der Mischanhydrid-Bildung durch Chlorameisensäureester führt die Freisetzung einer starken Säure (HCl) zur vollständigen Neutralisation der anwesenden Base.

Tatsächlich wurde eine erfolgreiche Synthese stereochemisch reiner ONSu -Ester via Mischanhydrid von BENOITON et al. [ 59 , 64 ] beschrieben. Mit diesen wird die Kupplung kürzerer Segmente unter Bildung optisch einheitlicher Peptide ermöglicht. Weitgehend unbeachtet blieb jedoch bei BENOITON’s Untersuchungen die Frage nach der Oxazolonbildung.

4.1. Aktivierung mit Chlorameisensäureestern unter Zusatz von N-Hydroxyverbindungen

BENOITON’s [ 64 ] Methode beinhaltet die Reaktion einer geschützten Peptidsäure ( Abb. 24 , 7) mit einem Chlorameisensäurealkylester 21a in Gegenwart eines tertiären Amins ( NMM ) unter Entstehung des gemischten Carbonsäure-Kohlensäure-Anhydrids 22a. Das Anhydrid reagiert mit HONSu 23 unter Abspaltung von CO2 und dem entsprechenden Alkohol zum Aktivester 24. Dessen weitere Reaktion mit der Aminokomponente 25 führt zum Peptid 26 (Weg 1, Abb. 24 ) [ 68 ].

Abb. 24: Peptidkupplung via Mischanhydridsynthese (Weg 1)


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Dementsprechend erfolgte die Bildung des Z -Gly-Ala-Mischanhydrids gemäß BENOITON’s Methode (Weg 1) mit 21a in THF bei -13°C unter Verwendung von 1 Äq. NMM innerhalb einer Bildungszeit von 5 min. Nach anschließender Addition von 1,5 Äq. HONSu / 0,5 Äq. NMM zeigten die IR -spektroskopischen Untersuchungen eine schnelle Bildung des ONSu -Esters (innerhalb von 5 min), erkennbar am Entstehen der charakteristischen CO-Schwingungsbande der Esterbindung bei nyCO: 1816 cm-1 ( Tab. 16 siehe Anhang).

Da für HONSu Nebenreaktionen beschrieben worden sind (beta-Alaninbildung [ 37 , 38 ], siehe Kapitel Kondensationsreagenzien ), wurde im Rahmen der Studien die Verwendung von HONB als alternatives Additiv untersucht und eine vergleichbar schnelle Aktivesterbildung gefunden. Sowohl im Fall von HONSu als auch mit HONB war weder restliches Mischanhydrid anwesend noch wurde Oxazolonbildung beobachtet.

Im Fall der Kupplung von H-Val-O Bn an die BOC -Gly-Val- ONSu - oder ONB -Ester bei Raumtemperatur, welche gemäß Weg 1 in Essigester hergestellt worden sind, wurde in Übereinstimmung zu obigen Ergebnissen mittels RP-HPLC eine sehr geringe Stereomutation (unter 0,5 %) beobachtet ( Tab. 7 ).

Tab. 7: Einfluß der entsprechend dem Syntheseweg in Abb. 24 durchgeführten Mischanhydrid-Reaktionen auf die Stereomutation und Kupplungsausbeute während der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn


LDL / Ausbeute (mol-%)

Kupplungszeit

21a/ HONSu

21a/ HONB

5 min

30 min

60 min

0,2 / 28

0,3 / 73

0,3 / 85

0 / 28

0,2 / 74

0,3 / 85

Folglich konnte mit diesen Untersuchungen gezeigt werden, daß auch ONB -Ester, die via Chlorameisensäurealkylester entsprechend der Methode von BENOITON [ 64 ] erhalten wurden, ebenso effektiv zur Segmentkupplung eingesetzt werden können wie die ONSu -Ester, jedoch unter Vermeidung der für diese beschriebenen Nebenreaktionen [ 37 , 38 ].


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4.2. Aktivierung mit Chlorameisensäureaktivestern

Statt Anwendung von Chlorameisensäurealkylestern [ 94 ] wurde der aktivierte Chlorameisensäure- ONB -Ester ( ClCOONB ) ( Abb. 25 , 21b) [ 95 ] in ähnlicher Weise zur Bildung von instabilem Carbonsäure-Kohlensäure-Mischanhydrid 22b [ 96 , 97 ] verwendet. 22b geht dann im Verlauf einer ”Einschritt“-Reaktion unter Verlust von CO2 in den korrespondierenden ONB -Ester 24 über (Weg 2, Abb. 25 ).

Abb. 25: Peptidkupplung via Chlorameisensäureaktivester (Weg 2)

Unter Berücksichtigung der höheren Reaktivität des OBt - gegenüber dem ONB -Ester wurden die Untersuchungen mit dem analogen, dafür neu entwickelten Chlorameisensäure- OBt -Ester ( ClCOOBt ) als eine Vorstufe des hoch reaktiven OBt -Esters durchgeführt.

Die Herstellung des Chlorameisensäure- OBt -Esters ( Abb. 26 , 27) wurde durch Umsetzung von Phosgen mit K OBt in DCM /Toluol als Lösungsmittel unter Einhaltung einer Reaktionstemperatur von 10°C durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde durch seine IR -Carbonylfrequenz bei 1806 cm-1 (zum Vergleich ClCOONB nyOCOCl: 1819 cm-1, 1736 cm-1) sowie mittels 13C- NMR -Analyse charakterisiert.

Abb. 26: Synthese von Chlorocarbonyloxybenzotriazol (27)

Tatsächlich erfolgte die Reaktion von ClCOOBt 27 mit Z -Gly-Ala-OH in THF in Gegenwart von NMM (1 Äq. ) bei -13°C unter Bildung des korrespondierenden Aktivesters ohne signifikante Oxazolonbildung ( IR ) (Weg 2). In Übereinstimmung dazu steht der geringe


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Enantiomerengehalt von nur 0,6 %, der nach Voraktivierung von BOC -Gly-Val-OH mit ClCOOBt in Gegenwart von 1 Äq. NMM für 30 min und anschließender Kupplung an H-Val-O Bn erhalten wurde ( HPLC ) ( Tab. 8 ).

Tab. 8: Einfluß der entsprechend dem Syntheseweg in Abb. 25 durchgeführten Mischanhydrid-Reaktion mittels ClCOOBt auf die Stereomutation und Kupplungsausbeute während der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn


LDL / Ausbeute (mol-%)

Kupplungszeit

ClCOOBt / NMM

5 min

30 min

60 min

0,4 / 82

0,5 / 86

0,6 / 87

4.3. Schlußfolgerung zur Anwendbarkeit der Mischanhydridsynthese zur Segmentkondensation

Die Ergebnisse zeigen, daß Peptid- ONB -Ester, die durch Mischanhydridsynthese ohne Oxazolonbildung während der Aktivierung hergestellt worden sind, unter fast vollständiger Vermeidung der Stereomutation gekuppelt werden können. Dies ist auch von BENOITON [ 59 , 64 ] für die korrespondierenden ONSu -Ester gefunden worden. Vorteilhaft bei der Aktivierung über Mischanhydride mittels Chlorameisensäureester ist die effektive Neutralisation der Base durch die freiwerdende HCl. Mit der Entwicklung des Chlorocarbonyloxybenzotriazols als neues Kupplungsreagenz konnte eine verbesserte, einfachere Synthesemethode, ebenfalls ohne signifikante Oxazolonbildung, erhalten werden, um Peptidsegmente mit sehr geringer Stereomutation zu kuppeln.


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