Hanay, Christiane: Optimierung von Kupplungsverfahren für die Peptidsegmentkondensation

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Kapitel 5. Peptidsegmentkondensation unter Verwendung von Pyridin-poly(hydrogenfluorid)

Wie mit den vorangegangenen Untersuchungen gezeigt wurde, birgt die Aktivierung von Peptidsegmenten in Gegenwart von Base generell die Gefahr der Epimerisierung. Dies erklärt, warum eine basenfreie Aktivierung, wie die Carbodiimid-Methode, die bislang effektivste Variante zur Unterdrückung der Epimerisierung im Verlauf der Peptidsegmentkondensation darstellt. Eine alternative Kupplungsmethode wäre die Ausnutzung der Säurefluoridaktivierung im Hinblick auf die Verwendung polarerer Lösungsmittelsysteme. Es ist bekannt, daß geschützte Aminosäurefluoride effiziente Acylierungsmittel für die schrittweise Peptidsynthese darstellen [ 70 ]. Ein besonderer Vorteil ist, daß die Kupplung auch ohne Anwesenheit von Base durchgeführt werden kann [ 72 ]. Das heißt, daß HF als relativ schwache Säure nur eine teilweise Protonierung von Aminokomponenten während der Peptidbindungsbildung bewirkt.

Deshalb erschien es erfolgversprechend, eine Methode auch zur Herstellung geschützter Peptidsegmentfluoride zu entwickeln, um diese nachfolgend zur Kupplung einzusetzen.

5.1. Modelluntersuchungen zur in situ Synthese und Kupplung von Peptidsegmentfluoriden

Die von CARPINO [ 70 ] entwickelte Methode zur Synthese von Fmoc -Aminosäurefluoriden mittels Cyanurfluorid in DCM ließ sich in modifizierter Weise zur in situ Herstellung von Z -Gly-Ala-F anwenden (Hydrolyse von zwei Fluoratomen des Cyanurfluorids, siehe Experimenteller Teil). Dabei wurde aber mittels IR intermediär Oxazolonbildung beobachtet. Somit kann aufgrund des anwesenden Pyridins die Gefahr der Epimerisierung bestehen. Es ist nicht gelungen, das gebildete Dipeptidfluorid zu isolieren, um dieses, wie die geschützten Aminosäurefluoride, direkt zur Kupplung einzusetzen.

Kürzlich wurde von KADUK [ 98 ] die Herstellung Nalpha-geschützter Aminosäurefluoride mit Diethylaminoschwefeltrifluorid ( DAST ) beschrieben. Der besondere Vorteil dieser Technik gegenüber der Verwendung von Cyanurfluorid besteht in der einfacheren Aufarbeitung, da bei der Anwendung von DAST nur wasserlösliches Material als Nebenprodukt gebildet wird, welches sich durch Extraktion mit Eiswasser einfach aus dem Reaktionsgemisch entfernen läßt [ 99 ]. Die Tatsache, daß zur Fluoridherstellung mittels DAST keine Base


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benötigt wird, ließ diese Methode zunächst als geeignet zur Herstellung von Peptidfluoriden erscheinen. Indes zeigten IR -spektroskopische Studien, daß sich nach Einwirkung von 1,2 Äq. DAST auf Z -Gly-Ala-OH in DCM zwar Dipeptidfluorid bildet, nach ca. 15 min jedoch deutlich das Entstehen von Oxazolon (nyC=O: 1828 cm-1) unter gleichzeitiger Abnahme der FC=O Schwingungsbande des Dipeptidfluorids (nyC=O: 1847 cm-1) [ 70 ] zu erkennen war. Auch nach einer Reduzierung der Menge an eingesetztem DAST (0,33 Äq. ) entsteht im o.g. Zeitraum aus dem Säurefluorid Oxazolon. Demzufolge bildet sich bei der Aktivierung mittels DAST im unpolaren Lösungsmittel Peptidoxazolon. Damit ist diese Methode gegenüber der Aktivierung mittels Carbodiimid/ HOBt im unpolaren Lösungsmittel von Nachteil, bei der sich der korrespondierende Aktivester bildet.

In Analogie zu sauren Additiven, wie HOAt und HOBt , könnte man sich eine Bildung von Säurefluorid aus dem Oxazolon via Carbodiimid-vermittelte Oxazolonbildung und nachfolgende Addition von HF vorstellen.

Als Modell wurde die Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH gewählt. Als HF-enthaltendes Reagenz wurde ein in der Vergangenheit vielfach als Fluorierungsreagenz angewendeter Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplex (Gleichung 3, 28) eingesetzt, der eine Stabilität bis zu 55°C besitzt und ca. 9 Äq. HF auf 1 Äq. Pyridin (70 % HF, 30 % Pyridin) enthält [ 100 ].

Unmittelbar nach Zugabe des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplexes (5-facher Überschuß HF) zum vorgebildeten Oxazolon (Gleichung 3, 12), das durch Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH 7 mit DIC (1 Äq. ) in DCM erhalten wurde, konnte mit Hilfe der IR -Spektroskopie die Bildung des korrespondierenden Dipeptidfluorids 29 beobachtet werden (Gleichung 3, Abb. 27 ). Das Entstehen von Z -Gly-Ala-F wurde außerdem mit Hilfe der 1H- NMR -Spektroskopie bestätigt (siehe Tab. 17 Anhang). Die IR -spektroskopischen


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Untersuchungen zeigten eine Stabilität des Dipeptidfluorids in DCM über einen Zeitraum von mehr als 1 h ohne erkennbare Bildung von Oxazolon.

Abb. 27: Bildung von Z -Gly-Ala-F via Oxazolon durch Addition des HF-Additivs sowie Kupplung des Dipeptidfluorids mit H-Leu- pNA ( IR )

Die Verfolgung der [2+1]-Kupplung mit 1 Äq. H-Leu- pNA (Gleichung 3, 30) in DCM in Gegenwart von 1 Äq. BSA als Silylierungsreagenz zeigte das vollständige Verschwinden der IR -Schwingungsbande des Peptidfluorids bei nyC=O: 1847 cm-1 innerhalb von 2 min ( Abb. 27 ). Der Zusatz von BSA diente dabei der Verringerung der Basizität der Aminokomponente sowie dem Abfangen der bei der Reaktion freiwerdenden HF unter Bildung von Trimethylsilylfluorid. Kürzlich wurde die Beschleunigung der Acylierung von Aminofunktionen mit sterisch gehinderten Fmoc -Aminosäurefluoriden durch vorherige Behandlung mit Silylierungsreagenzien wie BSA beschrieben [ 76 , 101 ]. Das gewünschte Tripeptid Z -Gly-Ala-Leu- pNA (Gleichung 3, 31) bildete sich in hoher Ausbeute mit einem LDL -Isomergehalt von nur 0,3 % ( HPLC ) ( Abb. 28 , Tab. 9 ).


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Abb. 28: HPLC -Profil von Z -Gly-Ala-Leu- pNA verunreinigt mit 0,3 % LDL -Isomer aus der Reaktion von Z -Gly-Ala-F ( DIC / 5 Äq. HF-Komplex) mit H-Leu- pNA / 1 Äq. BSA in DCM

Der geringe Anteil der LDL -Isomer-Bildung konnte unter Verwendung der Methode von KUSOMOTO [ 102 ] bestätigt werden. Dabei wurde das Tripeptid in Gegenwart von DCl hydrolysiert sowie nachfolgend die Aminosäuren unter Bildung der N-Trifluoracetylisopropylester derivatisiert. Die Bestimmung des D-Alanin-Gehaltes erfolgte mittels GC-MS -Analyse mit einer chiralen Phase.

Im Gegensatz dazu wurde für die DCC -Aktivierung in DMF unter vergleichbaren Reaktionsbedingungen eine nur langsame Oxazolonbildung mittels 1H- NMR gefunden. Innerhalb von 60 min wurden nur ca. 30 % Oxazolon beobachtet. Dieses Ergebnis korreliert mit bereits von HUDSON [ 45 ] beschriebenen geringen Geschwindigkeiten von Carbodiimid-Aktivierungen in polaren Lösungsmitteln. Wurde die Reaktion in Gegenwart des HF-Pyridin-Komplexes (5-facher Überschuß) durchgeführt, war weder eine Beschleunigung der Oxazolonbildung noch die Bildung von Peptidfluorid zu beobachten (1H- NMR ). Die Ursache dafür beruht möglicherweise auf der Fähigkeit von DMF , HF-Moleküle zu binden, da HF in dipolar aprotischen Lösungsmitteln als schwache Säure (pKa = 15±2 in DMSO [ 103 ]) fungiert.

Um Peptidfluoride effizient in polareren Lösungsmitteln zu kuppeln, wurde die Fluoridbildung in DCM und die anschließende Kupplung in DCM / DMF (1:1) durchgeführt. Unter Berücksichtigung der oben angegebenen Reaktionsbedingungen der Z -Gly-Ala-F-Herstellung (1 Äq. DIC , 5 Äq. HF-Pyridin) erfolgte die anschließende Aminolyse mit H-Leu- pNA / 1 Äq. BSA in DCM / DMF mit hoher Reaktionsgeschwindigkeit ( IR ). Das


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Tripeptid wurde in 92 %iger Ausbeute mit einem Enantiomerengehalt von nur 0,5 % erhalten ( Tab. 9 ).

Im Fall der hier durchgeführten Modelluntersuchungen führte die Peptidaktivierung mit DIC /Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplex zu hohen Kupplungsausbeuten mit geringer Epimerisierung. Vergleichbare Ergebnisse sind unter analogen Reaktionsbedingungen mittels Carbodiimid/ HOBt - oder HOAt -Aktivierung unter Bildung und anschließender Kupplung der korrespondierenden OBt - und OAt -Ester erhalten worden ( Tab. 9 ). Bei dieser neuen Methode wird ein einfaches und preiswertes Reagenz anstelle komplexer und kostenaufwendiger organischer Additive, wie HOBt und HOAt , verwendet. In diesem Zusammenhang ist anzumerken, daß die Säurefluoride in ihren Kupplungseigenschaften den Aktivestern ähnlich sind, jedoch eine höhere Effektivität besitzen [ 76 , 104 ].

Zum Vergleich wurde das Z -Gly-Ala-Oxazolon ohne Zusatz eines Additives unter analogen Bedingungen mit H-Leu- pNA / 1 Äq. BSA gekuppelt ( DCM / DMF = 1:1). Die Aminolyse des Oxazolons verlief im Gegensatz zu den Reaktionen von Säurefluorid und Aktivestern ausgesprochen langsam und unter Verlust der chiralen Integrität ( Tab. 9 ) [siehe auch 28 , 31 , 59 ].

Um den Einfluß eines polareren Lösungsmittelsystems auf das in DCM vorgebildete Dipeptidfluorid (5 Äq. HF-Komplex) zu untersuchen, wurde DMF zugefügt (1:1). Die IR -spektroskopische Beobachtung zeigte nur geringe Oxazolonbildung nach 5 min, ein deutlicher Hinweis darauf, daß Peptidfluoride relativ stabil in solchen Systemen sind. Kein Anstieg der Epimerisierung wurde gefunden im Fall der Behandlung des vorgebildeten Dipeptidfluorids mit DMF ( DCM / DMF =1:1) für 1 min, direkt vor der Kupplung mit H-Leu- pNA / 1 Äq. BSA gelöst in DMF . Innerhalb von 2 min war die Reaktion des vorhandenen Peptidfluorids abgeschlossen ( IR ). Aufgrund der beibehaltenen sauren Reaktionsbedingungen (Gegenwart von HF) verlief die weitere Reaktion des verbliebenen Oxazolons ohne Epimerisierung ( HPLC ). Die Ergebnisse in Tab. 9 zeigen, daß die nach 30 min gefundene Umsatzsteigerung im Vergleich zu der nach 2 min gebildeten Menge Tripeptid (primärer Umsatz durch Fluorid) nur noch gering ist. Die niedrigeren Kupplungsausbeuten in DCM / DMF gegenüber den Reaktionen in DCM werden demnach durch die partielle Bildung von Oxazolon verursacht, das eine geringe Reaktivität besitzt.


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Tab. 9: Einfluß von HF-Pyridin auf das Ausmaß der Stereomutation und Kupplungsausbeute während der Synthese von Z -Gly-Ala-Leu- pNA unter verschiedenen Aktivierungsbedingungen

Aktivierungsbedingungen

LDL / Ausbeute

(mol-%)

LDL

GC-MS

(mol-%)


Kupplungszeit



2 min

5 min

30 min

120 min


Fluoridbildung in DCM

(5 Äq. HF-Pyr ); Kupplung an Leu- pNA / BSA in DCM

0,3 / 97




0,3

(1,5 Äq. HF-Pyr ); Kupplung an Leu- pNA / BSA in DCM

0,7 / 99





(1,5 Äq. HF-Pyr ); Kupplung an Leu- pNA in DCM

1,0 / 98





(5 Äq. HF-Pyr ); Kupplung an Leu- pNA / BSA in DCM / DMF (1:1)

0,5 / 92





OAt -Esterbildung in DCM

Kupplung an Leu- pNA / BSA in DCM / DMF (1:1)

2,0 / 95

2,2 / 99




OBt -Esterbildung in DCM

Kupplung an Leu- pNA / BSA in DCM / DMF (1:1)

0,6 / 99





Oxazolonbildung in DCM

Kupplung an Leu- pNA / BSA in DCM / DMF (1:1)

3,6 / 11

9,3 / 15


21,6 / 32


Fluoridbildung in DCM (5 Äq. HF-Pyr )/ Addition von DMF (1:1, 1 min); Kupplung in DCM / DMF (1:2)

0,2 / 60

0,2 / 62

0,3 / 74



Prinzipiell können geschützte Peptidfluoride im unpolaren Lösungsmittel unter sauren Reaktionsbedingungen durch Zugabe von HF zum Oxazolon synthetisiert werden. Die Kupplung der Peptidfluoride läßt sich ohne signifikante Epimerisierung auch in polareren Lösungsmittelsystemen durchführen.

5.2. Verringerung der Epimerisierung durch Zusatz des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Additivs zur Kupplung mit Uroniumsalzen

Es ist von großem praktischen Interesse, geschützte Peptidsegmentfluoride in polaren Systemen, wie z.B. DMF , herzustellen. Dieses Ziel läßt sich jedoch nicht mit Hilfe der Carbodiimid-Technik erreichen. Andererseits konnte hier festgestellt werden, daß sich die Reaktion im Fall von Uroniumsalz-Kupplungen auch in Gegenwart des Pyridin-


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poly(hydrogenfluorid)-Komplexes durchführen läßt, wobei die gesamte Menge der verfügbaren HF als ein effektiver Puffer wirken kann.

Bei Anwendung von TBPyU zu ”Eintopfreaktionen“ in Gegenwart von 2 Äq. DIEA ohne und mit Zusatz von 5 Äq. des HF-Additivs wurde in beiden Fällen innerhalb von 30 min nur geringe Stereomutation gefunden. Deshalb wurde in den folgenden Untersuchungen mit einer Voraktivierung gearbeitet, um Epimerisierung zu provozieren und die Verhältnisse bei langsamen Segmentkupplungen zu simulieren.

Tatsächlich bewirkte die Gegenwart des 5-fachen Überschusses HF-Komplex im Verlauf der HAPyU -Aktivierung in DMF unter Addition von 2 Äq. DIEA für eine Voraktivierungszeit von 60 s eine starke Senkung der Epimerisierung um mehr als 25 % ( Tab. 10 ). Die beobachtete etwas geringere Reaktionsgeschwindigkeit im Vergleich zur Reaktion ohne Zusatz des HF-Additivs ist wahrscheinlich mit einer zumindest partiellen Protonierung der Aminokomponente durch HF zu begründen. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Additiv ausgezeichnet zur Unterdrückung der Stereomutation im Verlauf langsamer Peptidsegmentaktivierungen mit Uroniumsalzen geeignet ist. Dies initiierte weitere Untersuchungen zur Optimierung der Menge und der Natur der zugesetzten Base. Im Fall der Voraktivierung für 60 s mit HAPyU in Gegenwart von nur 1 Äq. DIEA konnte die gefundene Menge LDL -Isomer von 3 % durch Anwesenheit von 5 Äq. HF-Additiv auf 2 % gesenkt werden ( Tab. 10 ). Eine noch stärkere Unterdrückung der Epimerisierung (0,6 %) konnte durch die Anwesenheit von 10 Äq. des HF-Komplexes erreicht werden.

Wie in jüngsten Untersuchungen berichtet, verläuft die Aktivierung durch Uroniumsalze auch in Gegenwart von tertiären Aminen, die eine geringere Basizität als DIEA besitzen. Entsprechend CARPINO und EL-FAHAM [ 22 ] können mit Collidin als Base effiziente Kupplungsergebnisse erreicht werden, allerdings kann der Zusatz von nur 1 Äq. der schwächeren Base zu unvollständigen Kupplungen führen. Im Gegensatz dazu zeigten unsere Ergebnisse, daß bei der Aktivierung mit HAPyU / 1 Äq. Collidin in Gegenwart des HF-Additivs durchaus vollständige Aktivierungen erzielt werden können. Sowohl Collidin wie auch NMM wurden im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Obwohl NMM (pKa (H2O): 7,38) im Vergleich zu DIEA (pKa (H2O): 10) eine geringere Basizität aufweist [ 22 ], wurde in früheren Untersuchungen ein höherer Grad der Epimerisierung beobachtet [ 60 ], was hier bestätigt werden konnte. In Anwesenheit von 5 Äq. HF-Komplex konnte dieser Effekt, wie in Tab. 10 gezeigt, etwas reduziert werden. Demgegenüber wurden bei Einsatz von Collidin


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in Verbindung mit dem HF-Additiv unerwartet gute Ergebnisse erhalten. Tatsächlich ergaben Zusätze von 5 oder 10 Äq. des HF-Pyridin-Komplexes im Verlauf der Aktivierung mit HAPyU in Gegenwart von Collidin (1 Äq. , 60 s Voraktivierung) hohe Kupplungsausbeuten und praktisch keine Epimerisierung ( HPLC , GC-MS ) ( Tab. 10 ). Nach CARPINO und EL-FAHAM [ 22 ] besitzt Collidin (pKa (H2O): 7,43) zwar eine ähnliche Basizität wie NMM , jedoch wird nur für ersteres eine ausgeprägte sterische Hinderung gegenüber des Angriffs am C-H von Oxazolon oder Aktivester erwartet, woraus eine Verringerung der Epimerisierung resultiert.

Tab. 10: Einfluß des HF-Pyridin-Additivs und der Base auf die Stereomutation und Kupplungsausbeute während der Synthese von Z -Gly-Ala-Leu- pNA in DMF via HAPyU -Aktivierung mit einer Voraktivierungszeit von 60 s

Base

( Äq. )

HF-Komplex

( Äq. )

LDL / Ausbeute

(mol-%)

LDL

GC-MS

(mol-%)



Kupplungszeit




10 s

30 s

60 s

5 min

30 min

60 min


DIEA (2)

-

31,6 / 99







DIEA (2)

5

4,8 / 75

4,9 / 84

4,8 / 88

4,5 / 97

4,4 / 100



DIEA (1)

-

2,7 / 90

3,2 / 99






DIEA (1)

5


2,4 / 79

2,6 / 84

2,4 / 94

2,3 / 100



DIEA (1)

10




0,6 / 61

0,5 / 81


0,4

NMM (1)

-

3,9 / 78


6,3 / 93


7,1 / 100



NMM (1)

5





3,1 / 88



Collidin (1)

-



0,3 / 71


0,6 / 96

0,7 / 100

0,8

Collidin (1)

5





0,4 / 81

0,5 / 87

0,6

Collidin (1)

10





0,3 / 77

0,3 / 82

0,5

Die Untersuchungen zeigten, daß Kombinationen aus HAPyU / 1 Äq. DIEA / 10 Äq. Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplex oder HAPyU / 1 Äq. Collidin/ 5 oder 10 Äq. Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplex in Zusammenhang mit einer Voraktivierungszeit von 60 s - um Epimerisierung zu provozieren - günstige Bedingungen für eine epimerisierungsarme Segmentkondensation liefern. Besonders bemerkenswert ist dabei die Tatsache, daß trotz


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der Anwesenheit eines sauren Additivs hohe Aktivierungsraten erreicht wurden, unter Einsatz einer geringeren Menge tertiären Amins als normalerweise zur Uroniumsalz-Aktivierung verwendet wird. Um vollständige Umsätze zu sichern, war es jedoch notwendig, mit längeren Kupplungszeiten zu arbeiten.

5.3. Nebenreaktionen bei Verwendung des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Additivs

Saure Reaktionsbedingungen bergen die Gefahr der vorzeitigen Abspaltung sensitiver Seitenkettenschutzgruppen trifunktioneller Aminosäuren, wie z.B. Trityl- oder tert.-Butyl-Gruppen ( BOC , tert.-Butylester, tert.-Butylether). Infolge der hohen Konzentration an HF, die bei Addition der verschiedenen Mengen des HF-Pyridin-Komplexes während der beschriebenen Reaktionen vorliegt, erwies es sich als notwendig, die Trityl- und BOC -Abspaltung unter den Bedingungen der Kupplungsreaktionen zu untersuchen, um die Grenzen der Anwendbarkeit des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplexes zu bestimmen.

Tatsächlich wurde bei der Verwendung von 5 Äq. HF-Komplex in DCM eine Abspaltung der Trityl-Seitenkettenschutzgruppe von Fmoc -Cys( Trt )-OH oder Fmoc -Asn( Trt )-OH von ca. 2 % bzw. 0,2 % mittels HPLC -Analyse beobachtet ( Tab. 11 ).

Tab. 11: Ausmaß der Trityl- und BOC -Seitenkettenschutzgruppen-Abspaltung (%) nach Addition verschiedener sensitiver Aminosäuren zu HF-enthaltenden Lösungsmitteln (0,1 M)


Fmoc -Cys( Trt )-OH

Fmoc -Asn( Trt )-OH

Fmoc -Lys( BOC )-OH


1,5 Äq.

HF-Pyr

5 Äq.

HF-Pyr

1,5 Äq.

HF-Pyr

5 Äq.

HF-Pyr

10 Äq.

HF-Pyr

1,5 Äq.

HF-Pyr

5 Äq.

HF-Pyr

10 Äq.

HF-Pyr

Zeit

DCM

5 min

30 min

0,6

1,6

2,3

0,1

0,15

0,1

0,16


1,2

3,3



DMF

5 min

30 min

< 0,1

< 0,1

0,04

0,22

< 0,1

< 0,1

0,1

0,12

0,16

0,19

0,26

Die Abspaltung der BOC -Gruppe von Fmoc -Lys( BOC )-OH erreichte unter analogen Bedingungen ca. 3 %. Derartige Nebenreaktionen ließen sich im Fall von


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Fmoc -Lys( BOC )-OH durch Verwendung von nur 1,5 Äq. des HF-Pyridin-Komplexes auf 1 % reduzieren ( Tab. 11 ). In diesem Zusammenhang konnte bewiesen werden, daß die Kupplung in Gegenwart dieses reduzierten Betrags des HF-Additivs durchaus zu guten Ergebnissen führt. So ermöglichte die Reaktion von Z -Gly-Ala-F (1,5 Äq. HF-Komplex) mit H-Leu- pNA / 1 Äq. BSA in DCM den vollständigen Umsatz (99 %) unter Bildung von nur 0,7 % des LDL -Isomers ( Tab. 9 ). Das Ausmaß der LDL -Isomer-Bildung in Abwesenheit von BSA betrug 1 % ( Tab. 9 ). Das heißt, daß die beobachtete höhere Epimerisierung im Vergleich zur Verwendung von 5 Äq. des HF-Komplexes zur Fluoridbildung vermutlich auf die ungenügende Pufferung der Aminokomponente zurückzuführen ist.

Von besonderer Bedeutung für den Einsatz des HF-Additivs im Verlauf der Uroniumsalz-Aktivierung ist die Tatsache, daß die Gefahr der säurekatalysierten Abspaltung von Seitenkettenschutzgruppen in DMF vernachlässigbar gering ist. Dementsprechend blieben die Werte der Trityl- und BOC -Abspaltung dieser drei Aminosäuren im Fall der Behandlung mit 1,5 Äq. des HF-Komplexes unterhalb 0,2 % ( HPLC ) ( Tab. 11 ). Bei Verwendung von 5 oder 10 Äq. des HF-Additivs stieg der Grad der Abspaltung nicht über 0,3 %. In kritischen Fällen kann anstelle des Trityl-Derivates von Fmoc -Cys-OH das korrespondierende säurestabile (S-tert.-Butylthio)-Cystein eingesetzt werden.

5.4. Übertragung der HAPyU / HF-Komplex-Kupplungsmethode auf die Segmentkondensation von ACP (65-74)

Um die Anwendbarkeit der HAPyU / HF-Komplex Methode auf die Segmentkondensation längerer Peptide zu untersuchen, wurde eine Partialsequenz des Acyl Carrier Proteins ACP (65-74) als Modell gewählt. Dieses Peptid wurde neben anderen Verfahren [ 75 , 105 , 106 ] erfolgreich mittels SPPS unter Anwendung der Fmoc -Aminosäurefluoride am Tenta Gel S PHB Harz [ 71 ] synthetisiert. Im folgenden soll der Segmentkupplungsprozeß entsprechend Gleichung 4 untersucht werden, um

1.) den Einfluß des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplexes auf den Umsatz der [4+6]-Kupplung von ACP (65-74) (Gleichung 4, 34) sowie

2.) den Einfluß des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplexes auf das Ausmaß der Stereomutation am C-terminalen Alanin der Fmoc -geschützten Carboxylkomponente festzustellen.


58

Der N-terminale Teil 32 des Peptides 34 (Gleichung 4) wurde manuell unter Anwendung der schrittweisen Methode am o-Chlortritylharz synthetisiert. Die Beladung des Harzes mit Fmoc -Ala-OH erfolgte mittels einer epimerisierungsfreien Anesterungstechnik über das Carboxylat [ 107 ]. Die darauffolgenden Kupplungen von Fmoc -Ala-OH, Fmoc -Gln( Trt )-OH sowie Fmoc -Val-OH wurden unter Verwendung von HBTU (1 Äq. ) als Kupplungsreagenz in Gegenwart von DIEA (2 Äq. ) in Analogie zu Standardsyntheseprotokollen durchgeführt. Die Abspaltung des Tetrapeptides vom Harz erfolgte mit einer Mischung aus DCM /Essigsäure/ THF (8:1:1) [ 107 , 108 ]. Die Synthese der C-terminalen Sequenz (Gleichung 4, 33) wurde am Applied Biosystem 433 A Peptidsynthesizer im Fast MOC-Cycle mit HBTU (1 Äq. ) in Gegenwart von DIEA (1 Äq. ) am Sieber Amidharz [ 109 ] durchgeführt. Hintergrund des Einsatzes dieses Harzes war die Möglichkeit der extrem schwach sauren Abspaltung (1 % TFA ), um säurelabile Seitenschutzgruppen, wie Trityl- und tert.-Butyl-Gruppen, zu schützen. Die beiden Segmente wurden nach der Synthese mittels HPLC und ES-MS charakterisiert.

Der Einfluß des HF-Additivs auf den genannten Kupplungsprozeß (Gleichung 4) wurde in Analogie zu den in Kapitel Verringerung der Epimerisierung durch Zusatz des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Additivs zur Kupplung mit Uroniumsalzen beschriebenen Experimenten untersucht. Dazu wurde die Carboxylkomponente

a) ohne Zusatz des HF-Komplexes und

b) in Anwesenheit des 10-fachen Überschusses HF-Komplex

mit HAPyU (1 Äq. ) in DMF in Gegenwart von 1 Äq. DIEA 60 s voraktiviert und mit einer Mischung aus Aminokomponente (1 Äq. )/ DIEA (1 Äq. ) in DMF umgesetzt. Die Behandlung von 33 mit Base diente dabei der Freisetzung des TFA -Salzes der Aminofunktion. Wie


59

aus Abb. 29 deutlich wird, wurde nach einer Kupplungszeit von 21 h eine etwas geringere Kupplungsausbeute bei der Reaktion in Anwesenheit des HF-Komplexes festgestellt.

Abb. 29: HPLC -Profile der Umsätze der Reaktionen a) und b) zur Synthese von ACP (65-74) nach 21 h

Nach Schutzgruppenabspaltung und Isolierung der nach a) und b) synthetisierten Rohpeptide wurden diese mittels HPLC und ES-MS charakterisiert ( Abb. 30 ).

Abb. 30: Massenspektren der ungeschützten Peptide aus den Segmentkupplungsprozessen a) und b) zur Synthese von ACP (65-74)


60

Die GC-MS Epimerisierungsuntersuchungen erbrachten das Ergebnis, daß durch Zusatz des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplexes der Anteil an D-Alanin von 1,6 % ± 0,2 % auf 0,5 % ± 0,1 % verringert wurde. Damit konnte gezeigt werden, daß sich die Modelluntersuchungen zur Verwendung des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplexes als Methode zur Senkung der Epimerisierung auf die Synthese eines längeren Peptides übertragen ließen.

5.5. Bedeutung der Kupplung in Gegenwart des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplexes

Anhand der Modelluntersuchungen wurde gezeigt, daß die in situ Bildung von Peptidsegmentfluoriden unter sauren Reaktionsbedingungen via Carbodiimid-vermittelter Oxazolonbildung und anschließender Addition von Pyridin-poly(hydrogenfluorid) im unpolaren Lösungsmittel zu erreichen ist. Die erhaltenen Peptidfluoride sind effiziente Acylierungsmittel, die hohe Umsätze mit sehr geringer Epimerisierung gewährleisten. Der Zusatz polarerer Lösungsmittel zur Verbesserung der Löslichkeit, wie DMF , zum Peptidfluorid in DCM bewirkt eine partielle Umwandlung zum Oxazolon. Dessen Aminolyse erfolgt infolge der sauren Reaktionsbedingungen ohne Verlust der chiralen Integrität. Die mit DIC /HF erhaltenen Ergebnisse waren vergleichbar zu jenen mittels Carbodiimid/ HOBt oder HOAt -Aktivierung.

Der bemerkenswerte Vorteil des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Additivs besteht in seiner Fähigkeit, die anwesende Base abzufangen, die zur Aktivierung von Carboxylgruppen mit Uroniumsalzen notwendig ist. Im Ergebnis verliefen Kupplungen unter Verwendung der Kombinationen von (i) HAPyU / 1 Äq. DIEA / 10 Äq. HF-Komplex und (ii) HAPyU / 1 Äq. Collidin/ 5 oder 10 Äq. HF-Komplex unter nahezu vollständiger Vermeidung der Stereomutation. Dabei zeigte sich in DMF eine ausreichende Stabilität säurelabiler Seitenkettenschutzgruppen.


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