Hanay, Christiane: Optimierung von Kupplungsverfahren für die Peptidsegmentkondensation

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Kapitel 7. Experimenteller Teil

7.1. Chemikalien

Z -Gly-Ala-OH, H-Val-O Bn _HCl und H-Leu- pNA wurden von der Firma Bachem Inc. bezogen. DIEA , NMM , Collidin, Piperidin, Cyanurfluorid und DAST wurden von der Firma Fluka gekauft und wie alle hier nicht explizit erwähnten Reagenzien ohne weitere Reinigung eingesetzt. Benzylamin von Fluka wurde über Molekularsieb (3 Å) aufbewahrt. Des weiteren wurde DCC der Firma Riedel DE HAËN AG sowie DIC und HOBt ebenfalls von Fluka verwendet. Das HOAt wurde von Millipore bezogen. HONB und HONSu von Ferak Berlin wurden vor der Verwendung aus Isopropanol umkristallisiert. TBTU , TBPyU , TBPipU und TOPPipU wurden nach Methoden von KNORR et al. [ 20 ] bzw. HENKLEIN et al. [ 51 ] synthetisiert. HAPyU wurde entsprechend der Methode von CARPINO und EL-FAHAM [ 22 ] synthetisiert. TNTU , o-Cl- Trt -Harz und Sieber-Amidharz wurden von Novabiochem bezogen. ClCOONB wurde nach der von HENKLEIN [ 95 ] beschriebenen Prozedur hergestellt. DMF und Acetonitril (aufbewahrt über Molekularsieb 3 Å) wurden von Baker sowie THF , Essigester, THF und der Chlorameisensäureisobutylester von Merck erhalten. DCM der Firma Baker wurde vor Gebrauch über P4O10 und anschließend über Na2CO3 destilliert und dann über Molekularsieb (3 Å) aufbewahrt. Die deuterierten Lösungsmittel (CD2Cl2, DMF -d7, CDCl3, CD3CN), Bipyrrolidinoharnstoff, Bipiperidinoharnstoff, Mesitylencarbonsäure, Oxalylchlorid, BSA , SbCl5, HPF6 und der Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplex wurden von der Firma Aldrich bezogen. Bipyrrolidinochloroformamidiniumhexachloroantimonat wurde von Prof. L. A. Carpino, University of Massachusetts, USA, zur Verfügung gestellt.

7.2. Analytische Methoden

Die FTIR-Untersuchungen wurden an einem Nicolet Impact 400 Instrument durchgeführt. Kinetische Messungen wurden generell aus der Reaktionslösung unter Verwendung einer NaCl-Küvette vorgenommen. Feste Stoffe bzw. während der Reaktion kristallisierte Verbindungen wurden als KBr-Preßling vermessen.

Für die Durchführung der 1H- und 13C- NMR -Experimente stand ein Varian Gemini 200 Gerät zur Verfügung. Das TOCSY -1H- NMR -Experiment wurde an einem Bruker 600 Spektrometer durchgeführt. Für die Tieftemperatur-13C- NMR -Untersuchungen kam ein Bruker 300 Gerät zur Anwendung. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm relativ zu


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Tetramethylsilan angegeben. Als interne Referenz wurden folgende Lösungsmittelsignale verwendet: für 1H- NMR DMF -d7: 2,91 ppm (CH3), CD2Cl2: 5,31 ppm (CH2), CDCl3: 7,26 ppm (CH); für 13C- NMR DMF -d7: 162,5 ppm (CHO), CD2Cl2: 53,7 ppm (CH2), CDCl3: 77,7 ppm (CH). Zur Kennzeichnung der Multiplizität der 1H-Signale wurden die folgenden Abkürzungen verwendet: s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), quart (Quartett), quin (Quintett), hept (Heptett), dd (Dublett vom Dublett), m (Multiplett). Kinetische 1H- NMR -Messungen zum Aktivester/Oxazolon-Gleichgewicht wurden nach folgendem Zeitplan durchgeführt: 0,5, 5, 15, 30, 60, 120, 180, 240, 300, 360, 420 min und 16 h. Dabei wurde für die Identifizierung von eingesetztem Dipeptid, Oxazolon und Aktivester in der Reaktionsmischung die charakteristische Tieffeldverschiebung des CH2-Dupletts von Glycin herangezogen (siehe Tab. 17 Anhang). Durch Summierung der Integrale der CH2-Singuletts der Z -Schutzgruppen als Referenz wurde der Anteil der verschiedenen Komponenten im Reaktionsgemisch quantifiziert. Die Bestimmung der Halbwertzeit der Mesitylencarbonsäure-Aktivderivate erfolgte mittels 1H- NMR aus dem Integral der CH2-Signale von Ausgangsstoff (Benzylamin) und Reaktionsprodukt (N(2,4,6-Trimethylbenzoyl)benzylamid). Es wurde die Zeit ermittelt, in der die Konzentration von Benzylamin auf 50 % gesunken war (Summe von Ausgangsstoff und Reaktionsprodukt entspricht 100 %).

Die HPLC -Untersuchungen erfolgten, wenn nicht explizit erwähnt, unter Verwendung einer Vydac C 18 4×200 mm Säule des Typs 218 TPS415 an einem Merck-Hitachi Instrument mit einem L4250 UV-VIS Detektor bei 220 nm, D6000 Interface, LC Organizer, Pumpe A L6200, Pumpe B L6000 sowie unter Einsatz eines AS4000 Autosamplers. Die Bedingungen für die Epimerisierungsuntersuchungen waren: Flußrate 1 ml/min, mobile Phase: Laufmittel A H2O: TFA = 1000:1, Laufmittel B H2O:CH3CN: TFA = 200:800:1.

Die Epimerisierungsuntersuchungen mit Hilfe der GC-MS -Technik wurden an einem GC-Quadrupol-MS Gerät (Fisons Trio 1000) unter Verwendung einer chiralen Chirasil-Val-Säule (30m, 0,32 mm i.d., Machery Nagel) durchgeführt. Die Hydrolyse der geschützten Tripeptide erfolgte in 6 N DCl/D2O für 24 h bei 110°C. Danach wurden die Aminosäuren in die entsprechenden N-Trifluoracetylisopropylester überführt. Die Aufnahme der Massenspektren erfolgte im ”Selective-Ion-Mode“ (SIM).

Für die ES-MS -Untersuchungen der Modellpeptide und Kondensationsreagenzien kam ein TSQ 700, Finnigan MAT 95 Gerät zur Anwendung (Spritzeninfusion 2 µl/min Acetonitril, Acetonitril/Wasser/Essigsäure oder Methanol/Wasser).


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Für die dünnschichtchromatographische Verfolgung von Reaktionen wurde mit Kieselgel beschichtetes Glas der Firma Merck verwendet.

Die Elementaranalysen wurden an einem LECO CHNS 932 Gerät durchgeführt.

Zur Bestimmung der Schmelzpunkte kam ein Heiztisch Rapido VEB Wägetechnik PHMK zur Anwendung (Schmelzpunkte sind nicht korrigiert).

7.3. Synthese von Kondensationsreagenzien

Fluoroformamidiniumsalze (Kapitel Modifikation der Uroniumstruktur )

0,1 mol N,N-disubstituierter Harnstoff wurden in 50 ml trockenem DCM vorgelegt und langsam unter Rühren 0,095 mol Oxalylchlorid bei Raumtemperatur addiert. Anschließend wurde die Reaktionsmischung 2-3 h unter Rückfluß bei 40°C gehalten. Nach Zusatz von 150 ml trockenem Diethylether wurde das ausgefallene kristalline Produkt abgetrennt, nochmals mit Diethylether gewaschen und kurz im Vakuum getrocknet [ 20 ].

Aufgrund der hygroskopischen Eigenschaften der so erhaltenen N,N-disubstituierten Chloroformamidiniumchloride erfolgte sofort die Reaktion zu den N,N-disubstituierten Chloroformamidiniumhexafluorophosphaten [ 20 , 50 , 79 , 80 , 110 ] durch Umsetzung von 0,075 mol der Chlorosalze in 100 ml trockenem Acetonitril mit 0,075 mol KPF6 bei Raumtemperatur. Nach ca. 15 h wurde das entstandene KCl abfiltriert, das Filtrat am Vakuumrotationsverdampfer bis zur Hälfte eingeengt und die Produkte mit Diethylether gefällt, filtriert, gewaschen und über P4O10 im Vakuum getrocknet.

Die Umsetzung zu den Fluoroformamidiniumsalzen erfolgte nach der auch von CARPINO angegebenen Methode [ 77 ]. 0,02 mol der Chloroformamidiniumhexafluorophosphate wurden in 30 ml trockenem Acetonitril gelöst und 0,02 mol KF (bei 130°C vorgetrocknet) bei Raumtemperatur portionsweise unter Rühren addiert. Nach 15 h wurde das KCl abgetrennt und die verbliebene Lösung bis auf wenige Milliliter eingeengt. Durch Zutropfen von Diethylether wurden die N,N-disubstituierten Fluoroformamidiniumhexafluorophosphate gefällt, danach filtriert, mit Diethylether gewaschen und aus Acetonitril/Diethylether umkristallisiert.


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Bipyrrolidinochloroformamidiniumhexafluorophosphat

C9H16N2ClF6P (332,7)

1H- NMR (ppm, CDCl3): 2,0 (m, 8, 4CH2); 3,82 (m, 8, 4CH2N)

13C- NMR (ppm, CDCl3): 25,1 (4CH2); 54,3 (4CH2N); 151,8 (C+-Cl)

Bipyrrolidinofluoroformamidiniumhexafluorophosphat ( Abb. 6 , 6b)

C9H16N2F7P (316,2)

weiße Kristalle Ausbeute: 90 % Fp.: 124-127°C

1H- NMR (ppm, CDCl3): 2,0 (m, 8, 4CH2); 3,83 (m, 8, 4CH2N)

13C- NMR (ppm, CDCl3): 23,6+25,7 (4CH2); 49,0+50,2 (4CH2N); 150,0+153,6 (C+-F); Verunreinigung (Pyr)2C+-Cl

ES-MS (pos. Mode): ber.: 171,2 [M]+; gef.: 171,1 [M]+; Verunreinigung (Pyr)2C+-Cl : ber.: 187,7 [M]+; gef.: 187,0 [M]+

Bipiperidinochloroformamidiniumhexafluorophosphat

C11H20N2ClF6P (360,7)

1H- NMR (ppm, CDCl3): 1,68 (m, 4, 2CH2); 1,74 (m, 8, 4CH2); 3,69 (m, 8, 4CH2N)

13C- NMR (ppm, CDCl3): 22,7 (2CH2); 25,5 (4CH2); 54,2 (4CH2N); 155,8 (C+-Cl)

Bipiperidinofluoroformamidiniumhexafluorophosphat

C11H20N2F7P (344,3)

weiße Nadeln Ausbeute: 80 % Fp.: 138-140°C

1H- NMR (ppm, CDCl3): 1,68 (m, 4, 2CH2); 1,76 (m, 8, 4CH2); 3,56 (m, 8, 4CH2N); Rest (Pip)2C+-Cl : 3,5 %

13C- NMR (ppm, CDCl3): 22,6 (2CH2); 24,8 (4CH2); 49,4 (4CH2N); 152,0+155,7 (C+-F)

ES-MS (pos. Mode): ber.: 199,3 [M]+; gef.: 198,9 [M]+; geringe Verunreinigung (Pip)2C+-Cl : ber.: 215,7 [M]+; gef.: 214,9 [M]+


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1,3-Dimethyl-2-chloroimidazolidiniumhexafluorophosphat

C5H10N2ClF6P (278,6)

ES-MS (pos. Mode): ber.: 133,6 [M]+; gef.: 133,0 [M]+

1,3-Dimethyl-2-fluoroimidazolidiniumhexafluorophosphat

C5H10N2F7P (262,1)

weiße Kristalle Ausbeute: 92 % Fp.: 148-150°C

1H- NMR (ppm, CD3CN): 2,0 (6, 2CH3); 3,76 (t, 4, 2CH2)

13C- NMR (ppm, CD3CN): 25,1 (2CH3); 55,4 (2CH2); 151,2 (C+-F)

ES-MS (pos. Mode): ber.: 117,1 [M]+; gef.: 117,0 [M]+

1-(1-Pyrrolidinyl-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylen)pyrrolidinium-hexachloroantimonat-N-Oxid (Kapitel Mesitylencarbonsäure-Aktivierung als Modell zum Nachweis der O-Acyluroniumverbindung , Abb. 12 , 19b)

C14H19ON6Cl6Sb (621,8)

Die Synthese wurde in Analogie zur HAPyU -Herstellung durchgeführt [ 22 ]. 5 mmol Bipyrrolidinochloroformamidiniumhexachloroantimonat wurden in 40 ml Acetonitril vorgelegt und bei 15°C unter Stickstoffatmosphäre 4,55 mmol K OAt portionsweise addiert. Die Reaktionsmischung wurde 42 h bei Raumtemperatur gerührt, das entstandene KCl abgetrennt und die Lösung am Rotationsverdampfer bis zur beginnenden Kristallisation eingeengt. Nach Lagerung bei -18°C über Nacht wurde das Kristallisat abfiltriert und aus Acetonitril/Ethanol umkristallisiert.

gelbweiße Nadeln Ausbeute: 78 % Fp.: 162-164°C

1H- NMR (ppm, DMF -d7): 1,9-2,4 (m, 8, 4CH2); 3,5-4,3 (m, 8, 4CH2N); 8,08 (dd, 1, CH); 8,59 (d, 1, CH); 8,91 (d, 1, CH)

13C- NMR (ppm, DMF -d7): 25,0+26,6 (4CH2); 52,3+53,6 (4CH2N); 124,8; 128,5; 149,8 (3xCH); 127,4; 143,4 (2x Cq ); 145,8 (C+)

ES-MS (pos. Mode (Py)2C+- OAt ): ber.: 287,3 [M]+; gef.: 287,3 [M]+; (neg. Mode) ber.: 334,5 [SbCl6-]; 263,6 [SbCl4-]; 228,1 [SbCl3-]; gef.: 334,8; 262,9; 226,9

Bipyrrolidinochloroformamidiniumhexachloroantimonat

C9H16N2Cl7Sb (522,2)

1H- NMR (ppm, CD2Cl2/CD3CN 7:1): 2,06 (m, 8, 4CH2); 3,83 (m, 8, 4CH2N)

13C- NMR (ppm, CD2Cl2/CD3CN 7:1): 25,5 (4CH2); 55,2 (4CH2N); 152,5 (C+-Cl)


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7.4. Synthese von Mesitylencarbonsäurederivaten

Die 13C- NMR -Daten zur Charakterisierung der Mesitylencarbonsäurederivate sind in den Tab. 12 - Tab. 15 im Anhang enthalten.

Mesitylencarbonsäurechlorid [ 82 ] (Kapitel Mesitylencarbonsäure-Aktivierung als Modell zum Nachweis der O-Acyluroniumverbindung )

C10H11OCl (182,6)

2,4,6-Trimethylbenzoesäure (0,122 mol) und Thionylchlorid (0,244 mol) wurden unter Stickstoffatmosphäre 5 h unter Rückfluß gekocht. Die Destillation der Reaktionsmischung unter N2 im Ölpumpenvakuum lieferte eine farblose Flüssigkeit mit einem Siedepunkt von 71°C (1 mbar) ([ 82 ]: 87°C (2 mm Hg)).

Ausbeute: 62 %

IR (NaCl-Küvette, 0,4 M DCM -Lösung): 1789,8 cm-1 (COCl)

1H- NMR (ppm, CDCl3): 2,31 (s, 3, CH3); 2,4 (s, 6, 2CH3); 6,9 (s, 2, 2CHarom)

Bipyrrolidino[(mesitylcarbonyl)oxy]uroniumhexachloroantimonat (Kapitel Mesitylencarbonsäure-Aktivierung als Modell zum Nachweis der O-Acyluroniumverbindung , Abb. 9 )

C19H27O2N2Cl6Sb (649,9)

Die Synthese erfolgte in modifizierter Weise nach TEICHMANN [ 83 ]. Zu einer Lösung aus 2,4,6-Trimethylbenzoylchlorid (10 mmol) und Bipyrrolidinoharnstoff (10 mmol) in trockenem DCM (20 ml) wurden bei -20°C unter N2 tropfenweise 10 ml einer 1 M Lösung von SbCl5 (10 mmol) in wasserfreiem DCM addiert (in einem Zeitraum von 15 min). Die Reaktionsmischung wurde 24 h bei Raumtemperatur unter N2 gerührt und danach bis etwa zur Hälfte im Vakuum eingeengt. Nach Abkühlung auf -18°C bildete sich ein Kristallisat, das abfiltriert, mit trockenem Diethylether gewaschen (3x) und im Vakuum getrocknet wurde.

gelbe Nadeln Ausbeute: 30 % Fp.: 83-85°C

IR (KBr): 1773 cm-1 (O=COC+); 1659 cm-1 (C=N+); 1608 cm-1; 1452 cm-1

1H- NMR (ppm, CD2Cl2): 1,91-2,2 (m, 8, 4CH2); 2,32 (s, 3, CH3); 2,52 (s, 6, 2CH3); 3,52-3,85 (m, 8, 4CH2N); 7,03 (s, 2, 2CHarom); 20 % Verunreinigung durch Mesitylencarbonsäure berechnet durch Vergleich mit delta=6,89 (s, 2, 2CHarom) (Kapitel Mesitylencarbonsäure-Aktivierung als Modell zum Nachweis der O-Acyluroniumverbindung , Abb. 10 )

Mesitylencarbonsäure: 1H- NMR (ppm, CDCl3): 2,30 (s, 3, CH3); 2,42 (s, 6, 2CH3); 6,89 (s, 2, 2CHarom)


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Mesitylencarbonsäure- OAt -Ester (Kapitel Nachweis und Reaktivität der O-Acyluroniumverbindung , Abb. 8 , 18)

C15H14O2N4 (282,3)

HOAt (2,5 mmol) wurde mit DIEA (2,5 mmol) in 13 ml trockenem DCM gelöst und anschließend bei Raumtemperatur Mesitylencarbonsäurechlorid (2,75 mmol) unter N2 zugetropft. Die Reaktionsmischung wurde 3 h gerührt und mittels DC unter Verwendung von Essigester/ n-Hexan (6:4) verfolgt. Nach Addition von 13 ml DCM wurde die Reaktionslösung nacheinander je zweimal mit jeweils 15 ml 10 % KHSO4-, 10 % NaHCO3- und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet, im Vakuum eingeengt und das Rohprodukt aus DCM / n-Hexan umkristallisiert.

weiße Kristalle Ausbeute: 81 % Fp.: 162-163°C


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IR (KBr): 1797,6 cm-1; 1785,9 cm-1 (C=O); 1609,1 cm-1

1H- NMR (ppm, CD2Cl2): 2,36 (s, 3, CH3); 2,61 (s, 6, 2CH3); 7,04 (s, 2, 2CHarom); 7,47 (dd, 1, CHoat); 8,46 (d, 1, CHoat); 8,76 (d, 1, CHoat)

Elementaranalyse für C15H14O2N4:

ber.: C: 63,83 %; H: 4,96 %; O: 11,35 %; N: 19,86 %

gef.: C: 63,92 %; H: 4,91 %; O: 11,03 %; N: 19,09 %

HPLC -Bedingungen: Shimadzu HPLC System; SPD10AV UV-VIS Detektor lambda=220 nm, LC8A Pumpen, SCL10A Controller; Säulentyp: Vydac 218 TP10415 4×200 mm; Flußrate 2,0 ml/min; isokratisch; mobile Phase: A H2O: TFA = 1000:2, B H2O:CH3CN: TFA = 100:500:1; Mesitylencarbonsäure- OAt -Ester gelöst in DCM , DMF oder hergestellt mit HAPyU in Gegenwart von Collidin tR : 30 min; tR (Mesitylencarbonsäure): 2,9 min; tR (Bipyrrolidinoharnstoff): 1,2 min

N(2,4,6-Trimethylbenzoyl)benzylamid [ 111 ] (Kapitel Reaktivität der Aktivderivate der Mesitylencarbonsäure , Abb. 14 , 20)

C17H19ON (253,3)

5 mmol Benzylamin und 5 mmol Triethylamin wurden in 30 ml trockenem DCM vorgelegt und 5,5 mmol Mesitylencarbonsäurechlorid tropfenweise bei Raumtemperatur unter Rühren addiert. Nach 3 h wurde die Reaktionslösung auf 100 ml mit DCM verdünnt und nacheinander mit 1 N HCl, 1 M NaHCO3- und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Anschließend wurde über MgSO4 getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Rohprodukt aus CH2Cl2/ n-Hexan umkristallisiert.

weiße Kristalle Ausbeute: 89 % Fp.:137-139°C

IR (KBr): 1630,4 cm-1 (CONH)

1H- NMR (ppm, CD2Cl2): 2,2 (s, 6, 2CH3); 2,29 (s, 3, CH3); 4,5 (d, 2, CH2); 6,8 (s, 2, 2CHarom); 7,23-7,4 (m, 5, 5xCHphenyl)

Benzylamin: 1H- NMR (ppm, CD2Cl2): 1,35 (s, 2, NH2); 3,85 (s, 2, CH2), 7,28-7,39 (m, 5, 5xCHphenyl)

Collidiniumhexafluorophosphatsalz als Referenz für die 13C- NMR Untersuchungen (Anhang Tab. 13 - Tab. 15 )

C8H12NF6P (267,2)

3 mmol Collidin wurden in 3 ml THF gelöst und 3 mmol (442,2 µl) HPF6 (60 % in H2O) addiert. Dabei erwärmte sich das Reaktionsgemisch. Es wurde 5 min gerührt, Molsieb (4 Å) zugegeben und mit weiteren 12 ml THF verdünnt. Das Reaktionsgemisch wurde 10 min stehen gelassen, das Molsieb abfiltriert und das Lösungsmittel am Vakuumrotationsverdampfer abgetrennt. Danach wurde 1 ml Benzol zugegeben, wiederum im Vakuum eingeengt und dieser Prozeß 5x wiederholt. Der entstandene Feststoff wurde mit Diethylether gewaschen, abfiltriert und im Vakuum getrocknet.

weißer Feststoff Ausbeute: 77 % Fp.: 125°C

Elementaranalyse für C8H12NF6P:

ber.: C: 35,96 %; H: 4,49 %; N: 5,24 %

gef.: C: 34,66 %; H: 4,22 %; N: 5,12 %

1H- NMR (ppm, CD2Cl2): 2,55 (s, 3, CH3); 2,72 (s, 6, 2CH3); 7,36 (s, 2, 2CHarom)

Collidin: 1H- NMR (ppm, CD2Cl2): 2,23 (s, 3, CH3); 2,41 (s, 6, 2CH3), 6,78 (s, 2, 2CHarom)

7.5. Kinetische Untersuchungen an Mesitylencarbonsäurederivaten

Reaktion von Mesitylencarbonsäurechlorid mit Bipyrrolidinoharnstoff und SbCl5 (Kapitel Mesitylencarbonsäure-Aktivierung als Modell zum Nachweis der O-Acyluroniumverbindung )

0,24 mmol Mesitylencarbonsäurechlorid und 0,24 mmol Bipyrrolidinoharnstoff wurden in 600 µl CD2Cl2 in einem NMR -Röhrchen vorgelegt. Die Lösung wurde auf unter -50°C gekühlt und unmittelbar nach Addition von 0,24 mmol (30,41 µl) SbCl5 mit der 13C- NMR -Tieftemperatur-Messung begonnen (Temperatur im Spektrometer -50°C). Nach Aufnahme des 1. Spektrums wurde die Temperatur im Spektrometer langsam erhöht, wobei


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Messungen bei -5°C und 20°C durchgeführt wurden (13C- NMR -Daten Tab. 12 siehe Anhang).

Aktivierung von Mesitylencarbonsäure mit HAPyU in Gegenwart von Collidin (Kapitel Mesitylencarbonsäure-Aktivierung als Modell zum Nachweis der O-Acyluroniumverbindung )

0,24 mmol Mesitylencarbonsäure wurden zusammen mit 0,24 mmol HAPyU bzw. des SbCl6-Analogons von HAPyU ( Abb. 12 , 19b) in einem NMR -Röhrchen in 600 µl CD2Cl2 suspendiert und auf unter -50°C gekühlt. Unmittelbar nach der Addition von 0,24 mmol Collidin wurde das 13C- NMR -Spektrum bei -50°C aufgenommen. Die Temperatur im Spektrometer wurde erhöht und Messungen bei -5°C und 20°C durchgeführt. Die in den Tab. 13 - Tab. 14 (siehe Anhang) aufgeführten Substanzen wurden zum Vergleich bei den angegebenen Temperaturen gemessen.

Die analoge Aktivierung wurde zuvor bei Raumtemperatur mittels IR und 13C- NMR untersucht, wobei Messungen 2,5; 10; 20; 40; 60 und 120 min nach der Addition von Collidin durchgeführt wurden (13C- NMR -Daten Tab. 15 siehe Anhang).

Reaktivitätsuntersuchungen zu Mesitylencarbonsäureaktivderivaten mittels 1H- NMR ( Tab. 2 , Kapitel Reaktivität der Aktivderivate der Mesitylencarbonsäure )

0,28 mmol isoliertes Bipyrrolidino[(mesitylcarbonyl)oxy]uroniumhexachloroantimonat bzw. Mesitylencarbonsäure- OAt -Ester (synthetisiert wie in Kapitel Synthese von Mesitylencarbonsäurederivaten beschrieben) wurden in 700 µl CD2Cl2 gelöst und in ein NMR -Röhrchen überführt. Sofort nach Zugabe von 0,28 mmol Benzylamin und 0,28 mmol DIEA bei RT wurde mit den 1H- NMR -Kinetik-Messungen (im Abstand von 20 s) begonnen (Bestimmung der Reaktivitäten siehe Kapitel Analytische Methoden ).

7.6. Kinetische Untersuchungen zur Aktivierung von Peptidsegmenten

Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH mit Fluoroformamidiniumsalzen (Kapitel Modifikation der Uroniumstruktur )

Z -Gly-Ala-OH (0,1 mmol) wurde zusammen mit Bipyrrolidinofluoroformamidiniumhexafluorophosphat (0,1 mmol) in 1 ml DCM suspendiert und nach Addition von DIEA (0,2 mmol) bei RT wurden IR -Messungen im Zeitraum von 2 bis 240 min durchgeführt.


73

Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH mit Uroniumsalzen (Kapitel Aktivierung mit Uroniumsalzen im unpolaren Lösungsmittel , Aktivierung mit Uroniumsalzen im polaren Lösungsmittel )

DIEA (0,2 mmol) wurde zu einer Mischung aus Z -Gly-Ala-OH (0,1 mmol) und Aktivierungsreagenz (0,1 mmol) in 1 ml DCM bei RT zugefügt. Anschließend wurden IR -Messungen unter Verwendung von TBTU , TBPyU , HAPyU und TNTU wiederholt im Zeitraum von 2 bis 180 min durchgeführt. Die Aktivierung mit TBTU wurde in Gegenwart von weniger DIEA (0,1 mmol) bzw. unter zusätzlicher Addition von 1 Äq. HOBt wiederholt. Dazu wurden 3 Messungen innerhalb einer Periode von 30 min aufgenommen.

1H- NMR -Studien bei RT im polaren Reaktionsmedium mit TBTU , TBPyU , HAPyU und TNTU wurden in einer 0,23 M DMF -d7-Lösung entsprechend dem in Kapitel 7.2. genannten Zeitprogramm durchgeführt. Aus den Integralintensitäten der aktivierten Spezies der ersten beiden Messungen (0,5; 5 min) konnte die Information über die Geschwindigkeit der Aktivierung erhalten werden (siehe Tab. 3 ). IR , 1H- NMR und 13C- NMR -Daten der Intermediate bzw. Referenzsubstanzen sind in den Tab. 16 - Tab. 18 bzw. Tab. 19 (siehe Anhang) zusammengefaßt.

Reaktion von Z -Gly-Ala-Oxazolon mit N-Hydroxyverbindungen (Kapitel Untersuchungen zur Ringöffnung des Oxazolons )

Z -Gly-Ala-OH (0,1 mmol) wurde für 10 min in 1 ml DCM bei RT mit DCC (0,11 mmol) unter Bildung des Oxazolons behandelt. Nach Filtration des DCU wurde die N-Hydroxyverbindung ( HOAt , HOBt oder HONB ) (0,1 mmol) addiert. Vier IR -Messungen wurden innerhalb von 60 min durchgeführt. Im Fall von HOBt und HOAt bildete sich ein Niederschlag der unlöslichen Aktivester, während im Fall von HONB der Ester in Lösung blieb.

Für die 1H- NMR -Analyse wurde bei RT eine Lösung von DCC in 0,6 ml CD2Cl2 zum Dipeptid, suspendiert in 0,2 ml CD2Cl2, addiert. Nach Abtrennung des DCU wurde die Lösung mit 0,5 ml DMF -d7 verdünnt, um ein Referenz-Oxazolon-Spektrum im polaren Medium zu erhalten. Die N-Hydroxyverbindung (0,1 mmol) wurde in 0,5 ml DMF -d7 gelöst. Die HOBt -Lösung wurde über 3 Å Molekularsieb einige Stunden stehen gelassen, um jeglichen Überschuß H2O zu entfernen. Die Lösung mit der N-Hydroxyverbindung wurde jeweils zur Oxazolon-Lösung hinzugefügt (Verhältnis CD2Cl2/ DMF -d7 = 1:1,3), und die Reaktion wurde mittels 1H- NMR -Analyse entsprechend dem angegebenen Zeitprogramm (Kapitel 7.2.) verfolgt. Um das Aktivester/Oxazolon-Verhältnis zu ermitteln, wurden die Integralintensitäten der Messungen bis zu 60 min berechnet.


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Die Reaktion des Oxazolons mit HOBt in CD2Cl2/ DMF -d7 bei RT wurde in Zusammenhang mit einem TOCSY -1H- NMR -Experiment wiederholt, um die Gegenwart des N-Acylisomers des OBt -Esters in der Reaktionsmischung abzusichern (siehe Abb. 18 Kapitel Untersuchungen zur Ringöffnung des Oxazolons ).

Reaktion des Z -Gly-Ala-Oxazolons mit N-Hydroxyverbindung/ DIEA -Mischungen (Kapitel Untersuchungen zur Ringöffnung des Oxazolons )

Das Oxazolon wurde bei RT in einer 0,1 M DCM -Lösung mit einer Mischung aus N-Hydroxyverbindung (0,1 mmol)/ DIEA (0,1 mmol) behandelt. Die IR -Messungen wurden im Zeitraum von 2 bis 180 min durchgeführt. Im Fall der HOBt / DIEA -Addition wurde der gebildete Niederschlag des OBt -Esters nach 40 min isoliert.

Um die Reaktion im polaren Lösungsmittel bei RT mittels 1H- NMR zu verfolgen, wurde eine Mischung aus Additiv/ DIEA in 0,5 ml DMF -d7 zum Oxazolon, gelöst in CD2Cl2/ DMF -d7, addiert (die HOBt / DIEA -Lösung wurde zuvor über Molekularsieb getrocknet). Das Aktivester/Oxazolon-Verhältnis wurde wiederum von den ersten 5 Spektren bestimmt.

Addition von DIEA zu den Z -Gly-Ala-Aktivestern (Kapitel Untersuchungen zur Ringöffnung des Oxazolons )

In DCM wurde dieses Experiment nur mit dem ONB -Ester durchgeführt ( OBt - und OAt -Ester in DCM schwer löslich). Das Oxazolon, synthetisiert in einer 0,1 M DCM -Lösung nach der bereits beschriebenen Methode, wurde mit HONB (0,1 mmol) bei RT behandelt und anschließend ein IR -Spektrum des Startaktivesters aufgenommen. Nach der Addition von DIEA (0,1 mmol) wurden weitere IR -Messungen im Bereich von 2 bis 60 min durchgeführt.

Für die Beobachtung der analogen Reaktion bei RT in DMF mit dem OBt -Ester wurde das HOBt (0,1 mmol) zum Oxazolon in 0,8 ml DCM addiert und das Reaktionsgemisch für 10 min gerührt. Der OBt -Ester wurde abfiltriert, in 0,7 ml DMF -d7 aufgenommen und eine 1H- NMR -Analyse des Start- OBt -Esters durchgeführt. In den Fällen des OAt - und ONB -Esters wurden diese, wie oben bereits beschrieben, in CD2Cl2/ DMF -d7 synthetisiert. Dabei wurde zur Bildung des ONB -Esters eine längere Zeit benötigt (60 min). Nach Addition von DIEA (0,1 mmol) wurden die entsprechenden 1H- NMR -Kinetikanalysen durchgeführt.


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Reaktion des Z -Gly-Ala-Oxazolons mit einem doppelten Überschuß HOBt / DIEA (Kapitel Untersuchungen zur Ringöffnung des Oxazolons )

Das wie oben beschrieben synthetisierte und in CD2Cl2/ DMF -d7 gelöste Oxazolon wurde bei RT mit einer Mischung aus HOBt (0,22 mmol)/ DIEA (0,2 mmol) in DMF -d7 (getrocknet über Molekularsieb) behandelt. Das OBt -Ester/Oxazolon-Verhältnis wurde von den ersten 5 1H- NMR -Spektren bestimmt.

Addition eines Überschusses HOBt zum Z -Gly-Ala- OBt -Ester (Kapitel Untersuchungen zur Ringöffnung des Oxazolons )

Das wie oben beschrieben in CD2Cl2 hergestellte Oxazolon wurde bei RT unter Verwendung von 1,2 Äq. HOBt in den OBt -Ester überführt. Zu dieser Lösung wurden sukzessive weitere 0,7 Äq. HOBt addiert, die in 1 ml DMF -d7 gelöst waren. Die Reaktionen wurden mittels 1H- NMR -Analyse verfolgt.

Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH mit ClCOOiBu / N-Hydroxyverbindung (Weg 1) (Kapitel Aktivierung mit Chlorameisensäureestern unter Zusatz von N-Hydroxyverbindungen )

Z -Gly-Ala-OH (0,5 mmol) wurde zum Mischanhydrid mit Hilfe von Chlorameisensäureisobutylester (0,5 mmol)/ NMM (0,5 mmol) bei -13°C in 2 ml THF 5 min lang aktiviert. Nach der Abtrennung des NMM -Hydrochlorids wurde eine Mischung der N-Hydroxyverbindung ( HONSu oder HONB ; 0,75 mmol) und NMM (0,25 mmol) in 2 ml THF addiert und anschließend die IR -Analyse im Zeitraum von 5 bis 30 min durchgeführt.

Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH mit ClCOOBt (Weg 2) (Kapitel Aktivierung mit Chlorameisensäureaktivestern )

Chlorocarbonyloxybenzotriazol ( Abb. 26 , 27):

C7H4O2N3Cl (197,6)

Zu einer Lösung von 0,2 mol Phosgen in 100 ml CH2Cl2/Toluol (1:1) bei 10°C wurden 0,1 mol fein gemörsertes K OBt portionsweise innerhalb 1 h zugesetzt und das Reaktionsgemisch danach bei RT gerührt. Anschließend wurde überschüssiges Phosgen abdestilliert, der ausgefallene Feststoff filtriert und mit 60 ml Toluol gewaschen. Die verbleibende Lösung wurde im Vakuum eingeengt und der Feststoff aus Diethylether/ n-Hexan umkristallisiert.

weiße Kristalle Ausbeute: 80 % Fp.: 127-128°C

ES-MS in CH3OH für CH3OCO OBt (C8H7O3N3): ber.: 194,2 [M+H]+; gef.: 193,9 [M+H]+


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13C- NMR (ppm, CD2Cl2): 115,6; 116,2; 128,5; 133,5; 134,5; 143,7 (4xCH + 2x Cq ); 151,2 (OCOCl)

IR (KBr): 1806 cm-1 (OCOCl); 1754 cm-1

Ohne weitere Reinigung wurde dieses Rohprodukt zur in situ Aktivierung verwendet:

Z -Gly-Ala-OH (0,5 mmol) wurde mit ClCOOBt (0,5 mmol) und NMM (0,5 mmol) bei -13°C in 2 ml THF zur Reaktion gebracht. IR -Messungen wurden im Bereich von 5 bis 60 min durchgeführt.

Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH mittels Cyanurfluorid (Kapitel Modelluntersuchungen zur in situ Synthese und Kupplung von Peptidsegmentfluoriden )

Zu einer Mischung aus 0,1 mmol Pyridin und 0,2 mmol H2O in 1 ml DCM wurde eine Lösung von Cyanurfluorid (0,1 mmol) in 100 µl DCM hinzugefügt mit dem Ziel, 2 der 3 Fluoratome des Cyanurfluorids zu hydrolysieren. Diese Mischung wurde bei RT zu 0,1 mmol Z -Gly-Ala-OH in 300 µl DCM addiert und die Fluoridbildung IR -spektroskopisch 60 min verfolgt.

Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH mittels DAST (Kapitel Modelluntersuchungen zur in situ Synthese und Kupplung von Peptidsegmentfluoriden )

Z -Gly-Ala-OH (0,1 mmol) wurde in 1 ml DCM suspendiert und mit 0,12 bzw. 0,033 mmol DAST bei RT behandelt. Die IR -Analyse erfolgte im Zeitraum von 8-35 min.

Bildung von Z -Gly-Ala-F mittels DIC / Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplex (Kapitel Modelluntersuchungen zur in situ Synthese und Kupplung von Peptidsegmentfluoriden , Gleichung 3)

Z -Gly-Ala-OH (0,1 mmol) in 0,6 ml DCM wurde mit DIC (0,1 mmol) unter Bildung des Oxazolons behandelt. Nach Verdünnung mit 0,4 ml Dioxan wurde der Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplex (5 Äq. , 14 µl) bei RT addiert und das Ausmaß der Dipeptidfluoridbildung IR - und 1H- NMR -spektroskopisch im Zeitraum von 2 bis 120 min bestimmt.

In einem zweiten Experiment mit dem Ziel, die Reaktion des Peptidfluorids mittels IR zu verfolgen, wurde bei RT eine Mischung aus H-Leu- pNA (0,1 mmol), BSA (0,1 mmol) in 0,4 ml DCM zum zuvor gebildeten Dipeptidfluorid addiert. Diese Reaktion wurde wiederholt, jedoch unter Addition von H-Leu- pNA / BSA in 1 ml DMF . Danach wurde die Bildung von Oxazolon nach Addition von 1 ml DMF zum zuvor gebildeten Peptidfluorid mittels IR verfolgt.

Schließlich wurde die DCC -Aktivierung (0,11 mmol) bei RT in 1 ml DMF -d7 in Gegenwart des HF-Pyridin-Komplexes (14 oder 28 µl) mittels 1H- NMR für 60 min verfolgt.


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7.7. Modellpeptide für Epimerisierungsuntersuchungen

7.7.1. H-Gly-L/DAla-Leu-OH (Referenz)

C11H21N3O4 (259,3)

Die Synthese der Tripeptide Z -Gly-LAla-Leu-O Bn und Z -Gly-DAla-Leu-O Bn zur Referenz wurde nach der Methode von IZUMIYA [ 73 ] durchgeführt. Dabei wurden zu 0,3 mmol Z -Gly-LAla-OH bzw. Z -Gly-DAla-OH in 2 ml THF bei -15°C 0,3 mmol Chlorameisensäureisobutylester getropft, die Mischung 12 min bei der Temperatur belassen und anschließend nacheinander 0,3 mmol H-Leu-O Bn _ Tos OH in 2 ml THF und 0,3 mmol NMM zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 2 h bei -15°C und 15 h bei RT gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rückstand in Essigester gelöst, nacheinander mit 5 %iger NaHSO4-, 5 %iger NaHCO3- und 20 %iger NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet, eingeengt und mit Diethylether/ n-Hexan verrieben. Die erhaltenen Tripeptide wurden in 90 %iger Essigsäure katalytisch (Palladiumschwarz) für 7 h hydriert. Nach Abtrennen des Katalysators und Entfernen der Essigsäure im Vakuum wurden die Peptide mit Diethylether/ n-Hexan gefällt.

ES-MS : H-Gly-LAla-Leu-OH: ber.: 260,3 [M+H]+; gef.: 260,2 [M+H]+

H-Gly-DAla-Leu-OH: ber.: 260,3 [M+H]+; gef.: 260,3 [M+H]+

Zur Bestimmung der Empfindlichkeit wurden LLL - und LDL -Isomer des Peptides, gelöst in Laufmittel A, in verschiedenen Mengenverhältnissen (Anteil LDL -Isomer 10; 5; 1; 0,8; 0,5; 0,2 %) vermischt und mittels HPLC analysiert. Der 0,2 %ige LDL -Isomeranteil konnte nachgewiesen werden.

HPLC -Gradientensystem zur Bestimmung der Epimerisierung: linearer Gradient; 0-40 % B in 40 min; tR (H-Gly-LAla-Leu-OH): 12,9 min; tR (H-Gly-DAla-Leu-OH): 17,4 min

7.7.2. H-Gly-L/DVal-Val-O Bn

BOC -Gly-Val-OH wurde entsprechend der etwas modifizierten Methode von BENOITON synthetisiert [ 21 ]:

BOC -Gly- ONSu

C11H16O6N2 (272,3)

BOC -Gly-OH (0,05 mol) und HONSu (0,055 mol) wurden in 250 ml Essigester fast vollständig gelöst und die Lösung auf -10°C gekühlt. DCC (0,055 mol) wurde in 60 ml


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Essigester trüb gelöst, ebenfalls auf -10°C gekühlt und portionsweise zu obiger Mischung addiert. Es wurde 30 min bei -10°C und 16 h bei RT gerührt und die Reaktion mittels DC unter Verwendung von Essigester/ n-Hexan (9:1) verfolgt. Nach der Abtrennung des DCU wurde das Lösungsmittel etwas im Vakuum abdestilliert und anschließend bei ca. 10°C restlicher Harnstoff ausgefroren. Die verbleibende Lösung wurde vollständig eingeengt und der gebildete Feststoff aus Isopropanol umkristallisiert.

weiße Kristalle Ausbeute: 88 % Fp.: 163-164°C

BOC -Gly-LVal-OH/ BOC -Gly-DVal-OH

C12H22O5N2 (274,3)

L- bzw. D-Val (0,02 mol) wurden in Triton B (0,022 mol, 40 %ige methanolische Lösung) gelöst, das Methanol im Vakuum abgetrennt, der Rückstand zweimal in DMF aufgenommen und wieder eingeengt, um restliches Methanol abzuziehen. Zur verbleibenden kristallinen Masse wurden 25 ml DMF addiert, die Mischung auf 0°C gekühlt und portionsweise BOC -Gly- ONSu (0,01 mol) hinzugefügt. Nach Addition von weiteren 10 ml DMF wurde 30 min bei 0°C und 16 h bei RT gerührt. Das DMF wurde vollständig am Vakuumrotationsverdampfer abdestilliert und der Rückstand in 5 %iger NaHCO3-Lösung aufgenommen. Es wurde dreimal mit Essigester gewaschen und die wäßrige Phase anschließend mit 20 %iger NaHSO4-Lösung auf pH=3 angesäuert. Nach der Extraktion dieser Lösung mit Essigester (3x) wurden die vereinigten Extrakte mit H2O gewaschen, über MgSO4 getrocknet und zu einem Öl einrotiert. Nach Verreiben mit n-Hexan und Abkühlung auf -18°C bildeten sich weiße Kristalle.

Ausbeute: BOC -Gly-LVal-OH: 72 % Fp.: 107-108°C;

BOC -Gly-DVal-OH: 55 % Fp.: 106-107°C

HPLC -Gradientensystem: linearer Gradient; 10-100 % B in 45 min;

tR ( BOC -Gly-LVal-OH): 14,0 min; tR ( BOC -Gly-DVal-OH): 14,0 min

ES-MS : BOC -Gly-LVal-OH: ber.: 274,3 [M]+; gef.: 273,2 [M]+

H-Gly-LVal-Val-O Bn / H-Gly-DVal-Val-O Bn (Referenz)

C19H29O4N3 (363,5)

BOC -Gly-LVal-OH bzw. BOC -Gly-DVal-OH (0,5 mmol) in 5 ml DCM wurde mit einer Mischung aus DCC (0,5 mmol) und HOBt (0,5 mmol) aktiviert. Nach 3 min wurde H-Val-O Bn _HCl (0,5 mmol) und DIEA (0,5 mmol) gelöst in 5 ml DCM addiert. Die


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Reaktionsmischung wurde 16 h gerührt, der DCU abgetrennt, nacheinander je 3x mit 5 %iger NaHSO4-, 5 %iger NaHCO3-Lösung und H2O gewaschen, über Na2SO4 getrocknet, im Vakuum eingeengt und mit n-Hexan verrieben. Die Abspaltung der BOC -Gruppe wurde mit 1,5 ml TFA für 30 min durchgeführt.

H-Gly-LVal-Val-O Bn und H-Gly-DVal-Val-O Bn in DMF wurden in verschiedenen Mengenverhältnissen (Anteil LDL -Peptid 5; 1; 0,5; 0,2 %) vermischt und mittels HPLC analysiert. Der 0,2 %ige LDL -Isomeranteil konnte nachgewiesen werden.

Um die Ausbeute an Tripeptid während der einzelnen Reaktionen mittels HPLC bestimmen zu können, wurde die Methode zuvor geeicht. Dazu wurden von der Aminokomponente H-Val-O Bn _HCl und vom Reaktionsprodukt H-Gly-L/DVal-Val-O Bn Lösungen verschiedener Konzentrationen (0,003 mmol; 0,00225 mmol; 0,0015 mmol; 0,00075 mmol; 0,0003 mmol in je 1 ml Laufmittel B) mit HPLC analysiert und die Peakflächen mit der Konzentration ins Verhältnis gesetzt. Die dabei erhaltenen Verhältnisse wurden später verwendet, um aus den HPLC -Peakflächen die Konzentrationen zu bestimmen. Die Ausbeute wurde daraus nach der Formel

Ausbeute = cReaktionsprodukt / (cAusgangsstoff + cReaktionsprodukt) berechnet.

HPLC -Gradientensystem zur Bestimmung der Epimerisierung: linearer Gradient; 10-60 % B in 25 min; tR (H-Gly-LVal-Val-O Bn ): 18,8 min; tR (H-Gly-DVal-Val-O Bn ): 20,1 min; tR (H-Val-O Bn _HCl): 13,8 min; Keine Nebenprodukte wurden beobachtet.

7.7.3. Z -Gly-L/DAla-Leu- pNA (Referenz)

C25H31O7N5 (513,6)

Z -Gly-LAla-OH bzw. Z -Gly-DAla-OH (0,1 mmol) wurde zusammen mit TBTU (0,1 mmol) in 1 ml DMF gelöst und mit H-Leu- pNA (0,1 mmol) unter Zusatz von DIEA (0,2 mmol) umgesetzt. Nach 10 min wurde das DMF im Vakuum entfernt und die Reaktionsprodukte wie oben beschrieben aufgearbeitet.

Für die Ermittlung der Ausbeuten mittels HPLC wurde die Eichung in Analogie zum oben genannten Verfahren mit unterschiedlich konzentrierten Lösungen von H-Leu- pNA und Z -Gly-L/DAla-Leu- pNA (0,005 mmol; 0,00375 mmol; 0,0025 mmol; 0,00125 mmol; 0,0005 mmol in je 1 ml Laufmittel B) vorgenommen.

HPLC -Gradientensystem zur Bestimmung der Epimerisierung: linearer Gradient; 25-60 % B in 60 min; tR ( Z -Gly-LAla-Leu- pNA ): 43,5 min; tR ( Z -Gly-DAla-Leu- pNA ): 42,2 min; tR (H-Leu- pNA ): 8,0 min


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7.8. Epimerisierungsuntersuchungen

Epimerisierung während der Synthese von Z -Gly-Ala-Leu-O Bn mittels bekannter und neuer modifizierter Kupplungsreagenzien (Kapitel Epimerisierung bei Anwendung von bekannten Uroniumsalzen , Modifikation der Uroniumstruktur )

0,3 mmol Z -Gly-LAla-OH und 0,3 mmol H-Leu-O Bn _ Tos OH wurden mit 0,33 mmol Kupplungsreagenz in 1 ml DMF gelöst und nach Zugabe von 0,9 mmol DIEA bei RT 100 min gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum erfolgte die Aufarbeitung, katalytische Hydrierung und HPLC -Analyse analog zu den oben genannten Bedingungen (Kapitel Modellpeptide für Epimerisierungsuntersuchungen ).

Epimerisierung der BOC -Gly-Val-Aktivester

Zur Untersuchung der Stereomutation der Aktivester am Modell BOC -Gly-LVal-Val-O Bn wurde bei RT eine Mischung aus BOC -Gly-Val-OH (0,3 mmol) und DCC (0,33 mmol) in 400 µl DCM 10 min lang gerührt, um das Oxazolon zu erhalten. Nach der Abtrennung des DCU und der Addition der N-Hydroxyverbindung (0,3 mmol) wurde die Lösung mit 500 µl DMF verdünnt (Verhältnis DCM / DMF = 1:1,3). Bei einer Vorinkubationszeit von 60 s wurde DIEA (0,3 mmol) addiert. Im Fall des ONB -Esters wurde eine längere Bildungszeit verwendet (5 min in DCM , nach Verdünnung mit DMF 16 h) (Kapitel Epimerisierung der Aktivester ).

Eine Mischung aus H-Val-O Bn _HCl (0,3 mmol) und DIEA (0,3 mmol) in 600 µl DMF wurde danach zur Aktivesterlösung hinzugefügt.

Wurde die Reaktion ohne Vorinkubation aber in Gegenwart von Base durchgeführt, wurden 0,6 mmol DIEA zusammen mit der Aminokomponente addiert (Kapitel Epimerisierung bei Anwendung der Uroniumsalze ).

Für die Abspaltung der BOC -Gruppe wurden 10 µl Aliquote in je 100 µl TFA überführt und die Lösungen für 30 min stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und jeweils 1 ml Eluant B für die HPLC -Analyse (Bedingungen Kapitel Modellpeptide für Epimerisierungsuntersuchungen ) addiert.

Epimerisierung bei Anwendung der Uroniumsalze (Kapitel Epimerisierung bei Anwendung der Uroniumsalze )

DIEA (0,09 mmol) wurde bei RT zu einer Mischung bestehend aus BOC -Gly-Val-OH (0,03 mmol), Kupplungsreagenz (0,03 mmol) und H-Val-O Bn _HCl (0,03 mmol) in 50 µl DMF addiert, und 10 µl Aliquote der Lösung wurden wie oben beschrieben behandelt.

Zur Untersuchung des Einflusses der Voraktivierung wurde eine Mischung aus BOC -Gly-Val-OH und Uroniumsalz gelöst in 40 µl DMF mit 2 Äq. DIEA (0,06 mmol) bei RT 60 s lang behandelt. H-Val-O Bn _HCl und 1 Äq. DIEA (0,03 mmol) in 60 µl DMF


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wurden danach hinzugefügt, 10 µl Aliquote wie oben beschrieben weiterverarbeitet und chromatographiert (Kapitel Modellpeptide für Epimerisierungsuntersuchungen ).

Epimerisierung während der Mischanhydridsynthese (Kapitel Mischanhydridsynthese )

Zur Untersuchung der Menge an LDL -Isomer bei der Mischanhydridsynthese entsprechend Weg 1 ( Abb. 24 ) wurde das Mischanhydrid von BOC -Gly-Val-OH (0,3 mmol) innerhalb einer Bildungszeit von 5 min mit Chlorameisensäureisobutylester (0,3 mmol)/ NMM (0,3 mmol) bei -13°C in 1 ml Essigester synthetisiert. Durch Addition der N-Hydroxyverbindung (0,45 mmol)/ NMM (0,15 mmol) in 2 ml Essigester wurden die Aktivester erhalten. Nach 2 h Rühren wurde eine Mischung aus H-Val-O Bn _HCl (0,3 mmol)/ NMM (0,3 mmol) in 1 ml Essigester addiert und 40 µl Proben in je 100 µl TFA zur BOC -Abspaltung überführt. Die HPLC -Bedingungen waren identisch zu den in Kapitel Modellpeptide für Epimerisierungsuntersuchungen beschriebenen.

Bei Durchführung der Synthese entsprechend Weg 2 ( Abb. 25 ) wurde der Aktivester bei -13°C in 3 ml Essigester unter Verwendung von ClCOOBt (0,3 mmol)/ NMM (0,3 mmol) hergestellt. Die Mischung wurde 30 min gerührt und anschließend die Kupplung wie oben beschrieben durchgeführt.

Epimerisierung von Peptidfluoriden (Kapitel Modelluntersuchungen zur in situ Synthese und Kupplung von Peptidsegmentfluoriden , Tab. 9 )

Die Säurefluoridbildung, die am Modell Z -Gly-Ala-Leu- pNA ( HPLC -Bedingungen Kapitel Modellpeptide für Epimerisierungsuntersuchungen ) untersucht wurde, erfolgte durch Aktivierung von 0,1 mmol Dipeptid in 1 ml DCM mit 0,1 mmol DIC unter Zusatz von 5 oder 1,5 Äq. Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplex bei RT für 5 min (5 Äq. HF) bzw. 15 min (1,5 Äq. HF). Anschließend wurde die Aminolyse durch Addition von Leu- pNA (0,1 mmol)/ BSA (0,1 mmol) gelöst in 1 ml DCM oder 1 ml DMF durchgeführt.

Im Fall der DMF -Addition (1 ml) während des Aktivierungsschrittes wurde die Aminolyse 1 min nachdem das DMF addiert wurde gestartet.

Vergleichsreaktionen der OAt - und OBt -Ester wurden durchgeführt durch Aktivesterbildung in 1 ml DCM (je 0,1 mmol: Dipeptid, DIC , HOAt oder HOBt ) bei RT innerhalb von 5 min und anschließender Kupplung mit äquimolaren Mengen Leu- pNA / BSA in 1 ml DMF .

100 bzw. 150 µl Aliquote (0,005 mmol) wurden in je 1 ml Laufmittel B für die HPLC -Analyse überführt.


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Epimerisierung bei der Kupplung durch Uroniumsalz/ Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplex (Kapitel Verringerung der Epimerisierung durch Zusatz des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Additivs zur Kupplung mit Uroniumsalzen )

Zur Untersuchung des Einflusses des HF-Komplexes zu ”Eintopfreaktionen“ wurde zu einer Mischung aus Z -Gly-Ala-OH (0,1 mmol), TBPyU (0,1 mmol), H-Leu- pNA (0,1 mmol) in 2 ml DMF ohne und mit Zusatz von 5 Äq. HF-Komplex bei RT DIEA (0,2 mmol) addiert und anschließend 100 µl (0,005 mmol) Aliquote in 1 ml Laufmittel B für die HPLC -Analyse überführt.

Bei Durchführung der Reaktionen mit Voraktivierung wurde DIEA (1 oder 2 Äq. ) zu einer Mischung aus Z -Gly-Ala-OH (0,1 mmol), HAPyU (0,1 mmol), HF-Pyridin (5 oder 10 Äq. = 14 oder 28 µl) in 2 ml DMF bei RT für eine Voraktivierungsperiode von 60 s addiert. Nach der Addition von H-Leu- pNA (0,1 mmol) in 1 ml DMF wurden 150 µl Aliquote (0,005 mmol) in 1 ml Laufmittel B für die HPLC -Analyse überführt. Bei Verwendung der anderen Basen wurde je 1 Äq. NMM oder Collidin zusammen mit 5 oder 10 Äq. HF-Pyridin eingesetzt. Zum Vergleich wurden die Reaktionen auch ohne Zusatz von HF-Pyridin durchgeführt.

Seitenkettenschutzgruppen-Abspaltung bei Verwendung des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Additivs (Kapitel Nebenreaktionen bei Verwendung des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Additivs )

Zur Untersuchung der Trityl- und BOC -Abspaltung wurden bei RT Fmoc -Aminosäuren (0,1 mmol) zu Lösungen von je 1 ml DCM oder DMF addiert, die 1,5, 5 oder 10 Äq. des HF-Pyridin-Komplexes enthielten. 20 µl Aliquote wurden in je 1 ml Acetonitril überführt.

HPLC -Bedingungen: linearer Gradient; 10-100 % B in 45 min; Fluß 1 ml/min; tR ( Fmoc -Cys( Trt )-OH): 40,5 min und tR ( Fmoc -Cys-OH): 25,9 min;

tR ( Fmoc -Asn( Trt )-OH): 37,0 min und tR ( Fmoc -Asn-OH): 25,8 min;

tR ( Fmoc -Lys( BOC )-OH): 30,6 min und tR ( Fmoc -Lys-OH): 19,1 min.

Das Ausmaß der Seitenkettenschutzgruppenabspaltung wurde durch Vergleich der ungeschützten und der geschützten Aminosäure bestimmt.


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7.9. Segmentkondensation von ACP (65-74) mit HAPyU / Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplex (Kapitel Übertragung der HAPyU/ HF-Komplex-Kupplungsmethode auf die Segmentkondensation von ACP(65-74) )

Schrittweise Festphasensynthese von Fmoc -Val-Gln( Trt )-Ala-Ala-OH (Gleichung 4, 32) am o-Cl- Trt -Harz

C50H53O8N5 (852,0)

Für die Verankerung von Fmoc -Ala-OH am o-Cl- Trt -Harz (Novabiochem, 1,6 mmol/g) [ 107 ] wurden 2 g Harz, 2,4 mmol Fmoc -Ala-OH und 6 mmol DIEA in 20 ml trockenem DCM bei RT 1 h gerührt. Danach wurden 6 ml Methanol und 6 mmol DIEA addiert, 15 min gerührt und zuletzt das filtrierte beladene Harz nacheinander mit DMF , DCM , Isopropanol und Diethylether gewaschen und getrocknet. Zur Bestimmung der Beladung wurden 10 mg Harz mit 1 ml 20 %iger Piperidin/ DMF -Lösung versetzt, 15 min gerührt, ein Aliquot (100 µl) mit 1 ml 20 %iger Piperidin/ DMF -Lösung verdünnt und davon wiederum ein Aliquot (100 µl) in 1 ml 20 %ige Piperidin/ DMF -Lösung überführt. Nach Bestimmung der Extinktion bei 301 nm ergab sich aus dem Lambert-Beerschen-Gesetz die erreichte Beladung von 0,6 mmol/g.

Die Kupplungen von Fmoc -Ala-OH, Fmoc -Gln( Trt )-OH, Fmoc -Val-OH erfolgten manuell in Analogie zu Standardsyntheseprotokollen unter Verwendung von jeweils 3,6 mmol Aminosäure, 3,6 mmol HBTU und 7,2 mmol DIEA in 0,3 M DMF -Lösungen bei RT . Alle Kupplungen wurden doppelt durchgeführt, wobei die Kupplungzeiten 30 min betrugen. Die Deblockierung der Fmoc -Gruppe erfolgte nach jedem Kupplungsschritt mit 20 %iger Piperidin/ DMF -Lösung (3 und 7 min). Die Vollständigkeit der Kupplungen wurde qualitativ mittels Ninhydrintest verfolgt [ 112 ].

Das Peptidharz wurde bei RT 30 min mit einem Gemisch aus DCM /Essigsäure/ THF = 8:1:1 gespalten, das Harz anschließend abfiltriert und mit DCM gewaschen. Das Filtrat wurde mit einem Überschuß n-Hexan versetzt, im Vakuum eingeengt, nochmals n-Hexan hinzugefügt und nach dem Einengen auf ca. 2 ml das Rohpeptid mit Diethylether gefällt. Nach Zusatz von Dioxan wurde das Peptid lyophilisiert, um restliche Essigsäure zu entfernen. Die Ausbeute betrug 95 %, bezogen auf die erreichte Harzbeladung.

HPLC -Bedingungen: Shimadzu HPLC System; SPD10A UV-VIS Detektor lambda=220 nm, LC10AS Pumpen, CBM10A Controller, Säulentyp: Vydac 218 TP10415 4×200 mm; Flußrate: 1,0 ml/min; mobile Phase: A H2O: TFA = 1000:1, B CH3CN 100 %; linearer Gradient; 10-100 % B in 45 min; tR ( Fmoc -Val-Gln( Trt )-Ala-Ala-OH): 30 min


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ES-MS : ber.: 853,0 [M+H]+; gef.: 853,1 [M+H]+; 875,2 [M+Na]+; 891,2 [M+K]+

Schrittweise Festphasensynthese von H-Ile-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ile-Asn( Trt )-Gly-NH2 (Gleichung 4, 33) am Sieber-Amidharz

C58H78O10N8 (1047,3)

Die Synthese der C-terminalen Sequenz erfolgte mit einem Applied Biosystem 433 A Peptidsynthesizer am Sieber-Amidharz (Novabiochem, 0,37 mmol/g) [ 109 ] in Analogie zu Standardsyntheseprotokollen. Unter Verwendung von 800 mg Harz (0,296 mmol) wurden die Fmoc -Aminosäuren (1 mmol) bei RT mit HBTU (1 mmol) in Gegenwart von DIEA (1 mmol) bei einer Konzentration von 0,45 M in DMF doppelt gekuppelt (2x30 min). Die Deblockierung der Fmoc -Gruppen erfolgte mit 20 %iger Piperidin/ DMF -Lösung für 7 min.

Die Abspaltung des Sieber-Harzes wurde mit 20 ml einer Lösung aus 1 % TFA in DCM für 30 min bei RT durchgeführt, das Harz abfiltriert und mit DCM gewaschen. Das Filtrat wurde mit n-Hexan versetzt, im Vakuum eingeengt, das Rohpeptid mit Diethylether gefällt und aus Dioxan lyophilisiert.

Ausbeute: 52 % bezogen auf die Harzbeladung

HPLC -Gradientensystem: Bedingungen wie oben; mobile Phase: A H2O: TFA = 1000:1, B CH3CN 100 %; linearer Gradient; 10-100 % B in 45 min;

tR (H-Ile-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ile-Asn( Trt )-Gly-NH2): 26 min

ES-MS : ber.: 1048,3 [M+H]+; gef.: 1047,9 [M+H]+; 1069,7 [M+Na]+

Kupplung von Fmoc -Val-Gln( Trt )-Ala-Ala-OH an H-Ile-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ile-Asn( Trt )-Gly-NH2 (Gleichung 4)

C108H129O17N13 (1881,3)

In Analogie zu den Kupplungen in Kapitel Epimerisierungsuntersuchungen wurde bei RT DIEA (0,035 mmol) zu einer Mischung aus Fmoc -Val-Gln( Trt )-Ala-Ala-OH (0,035 mmol), HAPyU (0,035 mmol) und a) ohne, b) mit 10 Äq. Pyridin-poly(hydrogenfluorid) (0,35 mmol = 9,8 µl) in 700 µl DMF für eine Voraktivierungszeit von 60 s addiert. Anschließend wurde H-Ile-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ile-Asn( Trt )-Gly-NH2 (0,035 mmol)/ DIEA (0,035 mmol) in 500 µl DMF zugefügt und 21 h gerührt.


85

Umsätze der Reaktionen nach 21 h (Kapitel Übertragung der HAPyU/ HF-Komplex-Kupplungsmethode auf die Segmentkondensation von ACP(65-74) , Abb. 29 ): HPLC -Gradientensystem: Bedingungen wie oben; mobile Phase: A H2O: TFA = 1000:1, B CH3CN 100 %; linearer Gradient; 10-100 % B in 45 min, anschließend 10 min bei 100 % B; tR ( Fmoc -Val-Gln( Trt )-Ala-Ala-Ile-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Ile-Asn( Trt )-Gly-NH2): 45 min; tR ( Fmoc -Val-Gln( Trt )-Ala-Ala-OH): 30 min; Reaktionsausbeute a) 82 %, b) 69 %

Das DMF wurde im Vakuum abgetrennt, das Rohpeptid mit Diethylether gefällt und auf der Fritte nacheinander mit 5 %iger NaHSO4-, 5 %iger NaHCO3-, gesättigter Na2CO3 und 20 %iger NaCl-Lösung gewaschen und getrocknet. Die Abspaltung der Fmoc -Gruppe erfolgte mit 2 ml Piperidin für 15 min. Danach wurde das Peptid mit Diethylether gefällt, getrocknet und die Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen in 5 ml 95 % TFA /H2O/ 3 % Triisopropylsilan für 90 min durchgeführt. Die Lösung wurde im Vakuum eingeengt, zweimal Heptan addiert, erneut eingeengt, das Peptid mit Diethylether gefällt und schließlich aus 10 % Essigsäure/H2O lyophilisiert.

C47H75O15N13 (1062,2)

HPLC -Bedingungen wie oben, tR (H-Val-Gln-Ala-Ala-Ile-Asp-Tyr-Ile-Asn-Gly-NH2): 12 min

ES-MS (Kapitel Übertragung der HAPyU/ HF-Komplex-Kupplungsmethode auf die Segmentkondensation von ACP(65-74) , Abb. 30 ):

a) ber.: 1063,2 [M+H]+; gef.: 1062,8 [M+H]+; 1085,0 [M+Na]+; 550,8 [M+K]2+

b) ber.: 1063,2 [M+H]+; gef.: 1062,9 [M+H]+; 1085,1 [M+Na]+; 551,1 [M+K]2+

in beiden Fällen weiterer Peak bei 388,3 [M+H]+ entspricht Val-Gln-Ala-Ala

Der gebildete Anteil D-Ala aus den Reaktionen a) und b) wurde mittels GC-MS bestimmt.


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