Hanay, Christiane: Optimierung von Kupplungsverfahren für die Peptidsegmentkondensation

Humboldt-Universität zu Berlin


Dissertation
Optimierung von Kupplungsverfahren für die Peptidsegmentkondensation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
( Dr. rer. nat.)
im Fach Chemie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin


von Diplomchemikerin Christiane Hanay

geb. am 13. September 1967 in Mühlhausen/Thür.

Dekanin in der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. V. Bonac^ic´-Koutecký

Gutachter:
Gutachter:
1. Prof. Dr. Hans-Werner Abraham
2. Prof. Dr. Michael Bienert
3. Prof. Dr. Jürgen Liebscher

eingereicht: 27. März 1998

Datum der Promotion: 29. Juli 1998

Abstract

Loss of chiral integrity at the activated carboxyl residue during peptide segment condensation by means of uronium salts is caused by the formation of oxazolone in the presence of the tertiary amine which is necessary for activation of carboxylic group. During activation of a protected peptide in the presence of 2 equivalents of tertiary amine the position of the active ester/oxazolone equilibrium is dependent on the nature of the leaving group of the uronium salt with an increasing oxazolone content in the order HONB<<HOBt<HOAt. Segment coupling by means of uronium salts result in an extent of stereomutation which is directly opposite to the extent of oxazolone formation. This unexpected order is caused by the presence of decreasing amounts of the free N-hydroxy component neutralizing the base, and differing rates of formation and aminolysis of intermediate active esters. Alternative activation procedures are discussed with regard to reduction of stereomutation: the preparation of active esters through mixed anhydrides by use of alkyl chloroformates followed by addition of HONB or by use of the new reagent chlorocarbonyloxybenzotriazole. A new efficient coupling method resulted from the use of peptide acid fluorides prepared by addition of pyridin-poly(hydrogenfluoride) to pre-formed peptide oxazolone, or the addition of this HF-pyridine complex to couplings via uronium salts, suppressing the base-catalyzed stereomutation. For the first time, direct evidence of the O-acyluronium salt assumed to be the first step during activation via uronium salts was found by means of low temperature 13C NMR measurements of the activation of the sterical hindered mesitoic acid with the 7-aza-oxybenzotriazolyl derivative HAPyU.

Zusammenfassung

Der Verlust der chiralen Integrität am aktivierten Carboxylrest im Verlauf der Peptidsegmentkondensation mit Uroniumsalzen wird durch die Bildung von Oxazolon in Gegenwart des zur Aktivierung der Carboxylgruppe notwendigen tertiären Amins verursacht. Während der Aktivierung geschützter Peptidsegmente in Gegenwart von 2 Äq. des tertiären Amins ändert sich die Lage des Aktivester/Oxazolon-Gleichgewichtes in Abhängigkeit von der Natur der Abgangsgruppe im Uroniumsalz mit steigendem Oxazolongehalt in der Reihenfolge HONB<<HOBt<HOAt. Bei Segmentkupplungen mittels Uroniumsalzen wurde ein Ausmaß der Stereomutation direkt entgegengesetzt zur Menge an Oxazolon gefunden. Für diese unerwartete Reihenfolge sind der sinkende Anteil an freier N-Hydroxyverbindung zur Neutralisation der benötigten Base und unterschiedliche Geschwindigkeiten der Bildung und Aminolyse des intermediären Aktivesters verantwortlich. Hinsichtlich der Verringerung der Stereomutation werden alternative Aktivierungsmethoden diskutiert, wie die Herstellung von Aktivestern über Mischanhydride durch Verwendung von Chlorameisensäurealkylestern und Zusatz von HONB oder die Verwendung des neuen Reagenzes Chlorocarbonyloxybenzotriazol. Eine neue effiziente Kupplungsmethode besteht in der Verwendung von Peptidsäurefluoriden, hergestellt durch Zusatz von Pyridin-poly(hydrogenfluorid) zum zuvor gebildeten Peptidoxazolon oder in dem Zusatz dieses HF-Additivs bei der Uroniumsalzkupplung zur Unterdrückung der basenkatalysierten Stereomutation. Außerdem wurde hier erstmalig die bisher als erster Schritt der Aktivierung mit Uroniumsalzen angenommene O-Acyluroniumverbindung am Modell der Aktivierung der sterisch gehinderten Mesitylencarbonsäure mit dem 7-Aza-benzotriazolyl-Reagenz HAPyU mittels 13C-NMR-Tieftemperatur-Untersuchungen direkt nachgewiesen.


Seiten: [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [54] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [85] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [I] [II] [III] [IV] [V] [VI] [VII] [VIII] [IX] [X] [XI]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteOptimierung von Kupplungsverfahren für die Peptidsegmentkondensation
Abkürzungsverzeichnis Verwendete Abkürzungen
1 Einleitung und Problemstellung
1.1.Bedeutung und Stand der Entwicklung der Peptidsynthese
1.2.Prinzip der Peptidsynthese
1.2.1.Schrittweiser Aufbau der Peptidkette
1.2.2.Segmentkondensation
1.3.Problem und Mechanismen der Epimerisierung
1.4.Kondensationsreagenzien
1.5.Ziel der Arbeit
2 Uroniumsalze für die Peptidsegmentkondensation
2.1.Epimerisierung bei Anwendung von bekannten Uroniumsalzen
2.2.Modifikation der Uroniumstruktur
3 Untersuchungen zum Mechanismus der Reaktionen mit Uroniumsalzen
3.1.Nachweis und Reaktivität der O-Acyluroniumverbindung
3.1.1.Mesitylencarbonsäure-Aktivierung als Modell zum Nachweis der O-Acyluroniumverbindung
3.1.2.Reaktivität der Aktivderivate der Mesitylencarbonsäure
3.2.Bildung von Oxazolon und Aktivester im Verlauf der Aktivierung von Peptidsegmenten mit Uroniumsalzen
3.2.1.Aktivierung mit Uroniumsalzen im unpolaren Lösungsmittel
3.2.2.Aktivierung mit Uroniumsalzen im polaren Lösungsmittel
3.2.3.Untersuchungen zur Ringöffnung des Oxazolons
3.3.Einfluß des Aktivester/Oxazolon-Gleichgewichtes auf das Ausmaß der Stereomutation
3.3.1.Epimerisierung der Aktivester
3.3.2.Epimerisierung bei Anwendung der Uroniumsalze
3.3.3.Schlußfolgerungen
4 Mischanhydridsynthese
4.1.Aktivierung mit Chlorameisensäureestern unter Zusatz von N-Hydroxyverbindungen
4.2.Aktivierung mit Chlorameisensäureaktivestern
4.3.Schlußfolgerung zur Anwendbarkeit der Mischanhydridsynthese zur Segmentkondensation
5 Peptidsegmentkondensation unter Verwendung von Pyridin-poly(hydrogenfluorid)
5.1.Modelluntersuchungen zur in situ Synthese und Kupplung von Peptidsegmentfluoriden
5.2.Verringerung der Epimerisierung durch Zusatz des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Additivs zur Kupplung mit Uroniumsalzen
5.3.Nebenreaktionen bei Verwendung des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Additivs
5.4.Übertragung der HAPyU / HF-Komplex-Kupplungsmethode auf die Segmentkondensation von ACP (65-74)
5.5.Bedeutung der Kupplung in Gegenwart des Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplexes
6 Zusammenfassung der Ergebnisse
7 Experimenteller Teil
7.1.Chemikalien
7.2.Analytische Methoden
7.3.Synthese von Kondensationsreagenzien
7.4.Synthese von Mesitylencarbonsäurederivaten
7.5.Kinetische Untersuchungen an Mesitylencarbonsäurederivaten
7.6.Kinetische Untersuchungen zur Aktivierung von Peptidsegmenten
7.7.Modellpeptide für Epimerisierungsuntersuchungen
7.7.1.H-Gly-L/DAla-Leu-OH (Referenz)
7.7.2.H-Gly-L/DVal-Val-O Bn
7.7.3. Z -Gly-L/DAla-Leu- pNA (Referenz)
7.8.Epimerisierungsuntersuchungen
7.9.Segmentkondensation von ACP (65-74) mit HAPyU / Pyridin-poly(hydrogenfluorid)-Komplex (Kapitel Übertragung der HAPyU/ HF-Komplex-Kupplungsmethode auf die Segmentkondensation von ACP(65-74) )
Bibliographie 8. Literaturverzeichnis
Anhang A 9. Anhang
Selbständigkeitserklärung
Danksagung
Lebenslauf

Tabellenverzeichnis

Tab. 1: Epimerisierung am Modellpeptid H-Gly-Ala-Leu-OH bei Anwendung verschiedener Kupplungsreagenzien
Tab. 2: Vergleich der Reaktivitäten (bei gleicher Konzentration der Reaktionspartner 1:1) des Mesitylencarbonsäure-O-Acyluroniumintermediates und - OAt -Esters bei der Reaktion mit Benzylamin in CD2Cl2 (0,4 M) mit Hilfe der 1H- NMR -Spektroskopie. Gemessen wurde die Zeit, in der die Hälfte des Ausgangsstoffes reagiert war (t½).
Tab. 3: Anteile an gebildetem Z -Gly-Ala-Aktivester und -Oxazolon bei der Aktivierung mit Uroniumsalzen in DMF -d7 unter verschiedenen Bedingungen (1H- NMR )
Tab. 4: LDL -Isomerbildung während der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn in DCM / DMF unter Verwendung verschiedener Aktivester ( DCC /Additiv), die mit 1 Äq. DIEA für 60 s vorinkubiert worden sind
Tab. 5: Verhältnis von überschüssiger Base zur Menge an Oxazolon in Abhängigkeit vom Aktivester/Oxazolon-Gleichgewicht ( Tab. 3 ) bei der Dipeptid-Aktivierung in DMF in Gegenwart von 2 Äq. DIEA
Tab. 6: Ausmaß der Stereomutation während der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn via Uroniumsalz-Aktivierung nach einer Voraktivierungszeit von 60 s
Tab. 7: Einfluß der entsprechend dem Syntheseweg in Abb. 24 durchgeführten Mischanhydrid-Reaktionen auf die Stereomutation und Kupplungsausbeute während der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn
Tab. 8: Einfluß der entsprechend dem Syntheseweg in Abb. 25 durchgeführten Mischanhydrid-Reaktion mittels ClCOOBt auf die Stereomutation und Kupplungsausbeute während der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn
Tab. 9: Einfluß von HF-Pyridin auf das Ausmaß der Stereomutation und Kupplungsausbeute während der Synthese von Z -Gly-Ala-Leu- pNA unter verschiedenen Aktivierungsbedingungen
Tab. 10: Einfluß des HF-Pyridin-Additivs und der Base auf die Stereomutation und Kupplungsausbeute während der Synthese von Z -Gly-Ala-Leu- pNA in DMF via HAPyU -Aktivierung mit einer Voraktivierungszeit von 60 s
Tab. 11: Ausmaß der Trityl- und BOC -Seitenkettenschutzgruppen-Abspaltung (%) nach Addition verschiedener sensitiver Aminosäuren zu HF-enthaltenden Lösungsmitteln (0,1 M)
Tab. 12: 13C-chemische Verschiebungen in ppm der Reaktion von Mesitylencarbonsäurechlorid mit Bipyrrolidinoharnstoff und SbCl5 bei -50°C, -5°C und 20°C, gemessen in CD2Cl2 (0,4 M), und Signale von Vergleichsspektren
Tab. 13: 13C-chemische Verschiebungen in ppm der Aktivierung von Mesitylencarbonsäure mit HAPyU in Gegenwart von Collidin bei -50°C, -5°C und 20°C, gemessen in CD2Cl2 (0,4 M), und Signale von Vergleichsspektren
Tab. 14: 13C-chemische Verschiebungen in ppm der Aktivierung von Mesitylencarbonsäure mit 1-(1-Pyrrolidinyl-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylen)pyrrolidiniumhexachloroantimonat-N-Oxid ( Abb. 12 , 19b, Kapitel Mesitylencarbonsäure-Aktivierung als Modell zum Nachweis der O-Acyluroniumverbindung ) in Gegenwart von 1 Äq. Collidin bei -50°C, -5°C und 20°C, gemessen in CD2Cl2 (0,4 M), (siehe Abb. 13 ) und 19b/Collidin zum Vergleich
Tab. 15: 13C-chemische Verschiebungen in ppm der Aktivierung von Mesitylencarbonsäure mit HAPyU in Gegenwart von Collidin bei Raumtemperatur, gemessen in CD2Cl2 (0,4 M)
Tab. 16: IR -Absorptionsbanden in cm-1 der Z -Gly-Ala-Aktivspezies, zusammengestellt aus den kinetischen Messungen
Tab. 17: 1H- NMR -spektroskopische Daten der Z -Gly-Ala-Aktivspezies, die während der verschiedenen kinetischen Messungen auftreten, aufgenommen in CD2Cl2/ DMF -d7, die chemischen Verschiebungen sind in ppm zusammen mit der Linienform und der Nummer der Protonen angegeben
Tab. 18: 13C- NMR chemische Verschiebungen in ppm der Z -Gly-Ala-Aktivspezies bei verschiedenen kinetischen Messungen, aufgenommen in CD2Cl2/ DMF -d7
Tab. 19: 1H- NMR und 13C- NMR chemische Verschiebungen in ppm verschiedener Referenzverbindungen, die im Verlauf der Aktivierungsreaktionen verwendet wurden

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Epimerisierung durch direkte Protonenabstraktion (nach [ 23 ])
Abb. 2: Oxazolon-Mechanismus (nach [ 29 ])
Abb. 3: Kondensationsreagenzien auf der Grundlage der Uronium (3)- und Phosphoniumstruktur (4)
Abb. 4: Uronium- (5a) und Guanidiniumstruktur (5b) von HAPyU
Abb. 5: HPLC -Profil der Trennung von H-Gly-L/DAla-Leu-OH
Abb. 6: Reaktion der Chloro- zu den Fluoroformamidiniumsalzen am Beispiel von Bipyrrolidinofluoroformamidiniumhexafluorophosphat (6b)
Abb. 7: Vorgeschlagener Mechanismus der Aktivierung von Peptidsegmenten durch Uroniumsalze
Abb. 8: Mesitylencarbonsäure-Aktivierung unter Verwendung von HAPyU
Abb. 9: Synthese von Bipyrrolidino[(mesitylcarbonyl)oxy]uroniumhexachloroantimonat
Abb. 10: 1H- NMR -Analyse des entsprechend Syntheseweg in Abb. 9 dargestellten Bipyrrolidino[(mesitylcarbonyl)oxy]uroniumhexachloroantimonats
Abb. 11: 13C- NMR -chemische Verschiebungen in ppm von Bipyrrolidino[(mesitylcarbonyl)oxy]uroniumhexafluorophosphat aus der Aktivierung von Mesitylencarbonsäure mit HAPyU in Gegenwart von Collidin in CD2Cl2 bei -50°C
Abb. 12: Synthese von 1-(1-Pyrrolidinyl-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylen)pyrrolidiniumhexachloroantimonat-N-Oxid (SbCl6-Analogon von HAPyU ) (19b)
Abb. 13: 13C- NMR -Tieftemperaturuntersuchungen bei -50°C, -5°C und 20°C der Aktivierung von Mesitylencarbonsäure mit 1-(1-Pyrrolidinyl-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridin-1-ylmethylen)pyrrolidiniumhexachloroantimonat-N-Oxid (19b) in Gegenwart von Collidin in CD2Cl2
Abb. 14: Modellreaktion zur Untersuchung der Reaktivität der Mesitylencarbonsäure-Aktivderivate
Abb. 15: Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH mit TBTU in Gegenwart von 2 Äq. DIEA in DCM ( IR )
Abb. 16: Aktivierung von Z -Gly-Ala-OH mit TBTU in Gegenwart von 2 Äq. DIEA in DMF -d7 (1H- NMR )
Abb. 17: Verhältnis der nach 5 min gebildeten Z -Gly-Ala-Aktivspezies unter verschiedenen Aktivierungsbedingungen (erhalten durch Integration des CH2-Dupletts von Glycin aus 1H- NMR -Kinetikanalysen in CD2Cl2/ DMF -d7)
Abb. 18: Wesentliche Crosspeaks der alpha- und beta-Protonen innerhalb der Gruppierung NH-CH-CH3, ermittelt durch ein TOCSY -1H- NMR -Experiment der Reaktion von Z -Gly-Ala-Oxazolon mit HOBt in DCM / DMF . In der Reaktionsmischung wurden 5 Verbindungen gefunden: OBt -Ester (69 %), Oxazolon (8 %), Dipeptidsäure (7 %), vermutlich N-Acyl- OBt -Ester (14 %), nicht bekannte Verbindung (3 %). (siehe auch Tab. 17 Anhang)
Abb. 19: Ausmaß der Z -Gly-Ala- ONB -Esterbildung unter verschiedenen Bedingungen (erhalten durch Integration des CH2-Dupletts von Glycin aus 1H- NMR -Kinetikanalysen in CD2Cl2/ DMF -d7)
Abb. 20: HPLC -Profil der Trennung von H-Gly-L/DVal-Val-O Bn
Abb. 21: Ausmaß der Stereomutation nach einer Kupplungszeit von 5 min während der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn unter Verwendung verschiedener Aktivester ( DCC /Additiv) in DCM / DMF ohne Zusatz von Base
Abb. 22: LDL -Isomerbildung während der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn unter Verwendung verschiedener Uroniumsalze zu ”Eintopfreaktionen“ nach einer Reaktionszeit von 60 s
Abb. 23: Ausmaß der LDL -Isomerbildung nach 60 s aus der Synthese von H-Gly-Val-Val-O Bn unter Verwendung verschiedener Aktivester, die mittels DCC /Additiv ( DCM ) synthetisiert und in Gegenwart von 1 Äq. DIEA ohne Vorinkubation in DCM / DMF gekuppelt wurden
Abb. 24: Peptidkupplung via Mischanhydridsynthese (Weg 1)
Abb. 25: Peptidkupplung via Chlorameisensäureaktivester (Weg 2)
Abb. 26: Synthese von Chlorocarbonyloxybenzotriazol (27)
Abb. 27: Bildung von Z -Gly-Ala-F via Oxazolon durch Addition des HF-Additivs sowie Kupplung des Dipeptidfluorids mit H-Leu- pNA ( IR )
Abb. 28: HPLC -Profil von Z -Gly-Ala-Leu- pNA verunreinigt mit 0,3 % LDL -Isomer aus der Reaktion von Z -Gly-Ala-F ( DIC / 5 Äq. HF-Komplex) mit H-Leu- pNA / 1 Äq. BSA in DCM
Abb. 29: HPLC -Profile der Umsätze der Reaktionen a) und b) zur Synthese von ACP (65-74) nach 21 h
Abb. 30: Massenspektren der ungeschützten Peptide aus den Segmentkupplungsprozessen a) und b) zur Synthese von ACP (65-74)

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