Lüders, Christian: Entwicklung von Analysenverfahren und Referenzmaterialien für die Bestimmung von Phenolen in umweltrelevanten Matrices

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Kapitel 3. Untersuchungstechniken in der Phenolanalytik

Die Analysenverfahren beschreiben Probenahme, Probenvorbereitung und analytische Gehaltsbestimmung. Durch die Probenahme soll eine entsprechend der analytischen Aufgabenstellung repräsentative Probe bereitgestellt werden. Obwohl in diesem Verfahrensabschnitt in der Regel der größte Beitrag zur Gesamtunsicherheit entsteht, wird in dieser Arbeit darauf nicht vertiefend eingegangen. Für verschiedene Matrices und Zielstellungen sind DIN-Verfahren vorgeschrieben<26>.

Für die Bestimmung von Phenolen in der Matrix Boden existiert bisher noch kein analytisches Normverfahren. Für die Bestimmung von Chlorphenolen ist jedoch bereits ein ISO-Standard-Verfahren vorgeschlagen worden<27>. Das Verfahren basiert auf der Ultraschallextraktion von Chlorphenolen aus Böden, Derivatisierung der Analyte zu den entsprechenden Acetaten und Bestimmung mit Gaschromatographie und Elektronen-Einfangdetektion (GC-ECD). Die Grenzwerte, die von der EPA für phenolische Einzelverbindungen vorgegeben wurden, liegen bei 10 µg/L für Abwasser und 0,3 bis 1 mg/kg für Boden.

Ein älterer ISO-Vorschlag<28> beschreibt die Bestimmung der Phenole aus der EPA-Prioritätenliste in Boden durch Soxhletextraktion mit einem Gemisch aus Dichlormethan/ Aceton und anschließender GC-FID Detektion.

Der Grenzwert für die maximal zulässige Konzentration der Summe aller phenolischen Verbindungen in Trinkwasser beträgt in der EU<29> 0,5 µg/L. Für die Angabe von Phenolgehalten in Wasser wird in mehreren Ländern der Phenolindex<30> eingesetzt, der die Summe aller Analyte erfaßt. Da sich die verschiedenen phenolischen Verbindungen in ihrer Toxizität und Persistenz stark unterscheiden, ist die Bestimmung der Einzelverbindungen von großer Bedeutung.

In Anlehnung an die Verfahren der EPA<31>,<32> wurden Normvorschläge unterbreitet<33>,<34>,<35>. Die EPA-Methoden beschreiben die gaschromatographische Bestimmung von Phenolen mit Flammen-Ionisations-Detektor (FID) oder ECD (Derivatisierung) nach Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Dichlormethan. In der EPA-Testmethode 604 werden dabei 14 Phenole aus der EPA-Prioritätenliste ausgewählt. In den DIN-Entwürfen wurde die Auswahl an phenolischen Verbindungen noch erweitert (darunter auch um 4 Alkylphenole).


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Um diese genormten Analysenverfahren bezüglich Selektivität, Spezifität, Empfindlichkeit, Zeit- und Kostenaufwand sowie Lösungsmittelverbrauch zu verbessern, wird weltweit intensiv geforscht. Besondere Aufmerksamkeit wurde dabei den Bereichen der Probenextraktion sowie den Analysentechniken der HPLC und GC mit diversen Detektionsprinzipien und den Kopplungstechniken zur MS gewidmet.

In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Analysentechniken unter besonderer Beachtung der Kapillarelektrophorese miteinander verglichen, um die Leistungsfähigkeit der Techniken für die Analytik von Phenolen zu beurteilen.

3.1. Extraktionstechniken

Extraktionstechniken haben das Ziel, Analyte vollständig und unzersetzt aus der Matrix zu entfernen. Zur Extraktion von Phenolderivaten aus flüssigen Matrices eignen sich die Techniken der Flüssig-Flüssig-Extraktion, Festphasenextraktion (SPE) und Festphasenmikroextraktion (SPME).

Bei der SPE werden die Analyte von der Matrix nach den chromatographischen Prinzipien von Adsorption und Desorption getrennt. Dabei wird mit Kartuschen gearbeitet, die mit Material gefüllt sind, das dem von analytischen HPLC-Säulen entspricht (siehe Kapitel 3.2.1 ), sich von diesem jedoch durch wesentlich größere Partikeldurchmesser unterscheidet. Je nach Polarität des SPE-Materials werden entweder Analyte oder Matrixbestandteile adsorbiert. Es gibt zahlreiche SPE-Materialien mit unterschiedlichen Eigenschaften und Selektivitäten bezüglich der Analyten. Für die Abtrennung der Analyte aus der Matrix Wasser<36> ist die SPE<37> sehr gut geeignet. Die Analyte werden auf dem Trägermaterial adsorbiert, während die Matrix eluiert. Dabei werden die Analyte angereichert. Durch Wechsel des Lösungsmittels werden danach die Analyte vom Trägermaterial eluiert. Die Vorteile der SPE<38> sind geringer Lösungsmittelverbrauch, einfache Automatisierbarkeit der Technik und ihre Selektivität, wobei letztere bei komplexen Matrixproben häufig zur Analytabtrennung alleine nicht ausreicht (Reinigung der Probenlösung (Clean-Up) erforderlich).

Die SPME<39> ist eine miniaturisierte Variante der SPE und kann zur Extraktion von Analyten<40> aus Wasser eingesetzt werden. Sie ist besonders gut für Gemische geeignet, die anschließend mit der GC getrennt werden, da die SPME-Fasern direkt in den Injektor des


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Gaschromatographen eingebracht werden können, wo die Analyte dann durch thermische Desorption auf die Säule gegeben werden. Die Fasern bestehen aus einem Fused-Silica Material, das mit einer hochtemperaturstabilen Schicht (z.B. Polydimethylsiloxan) belegt ist (ähnlich der stationären Phasen der GC-Säulen, siehe Kapitel 3.2.2 ). Wird die Faser in die Analytlösung getaucht, adsorbieren die gelösten Analyte an der Faser. Diese Technik arbeitet lösungsmittelfrei und ist gut automatisierbar. Während bei der SPE das gesamte Probenvolumen extrahiert werden kann, stellt sich bei der SPME stets ein Verteilungsgleichgewicht der Analyte zwischen Adsorbens und Probe ein. Aufgrund unterschiedlicher Verteilungskoeffizienten der Analyte müssen in Abhängigkeit der gewählten SPME-Parameter die Wiederfindungsraten gesondert bestimmt werden.

Bei der Extraktion fester Matrices wie Boden und Sediment werden verschiedene Extraktionstechniken eingesetzt.

Sind die Analyte thermisch stabil, können Heißextraktionsverfahren eingesetzt werden. Hierzu zählen die Soxhletextraktion, die Mikrowellenextraktion und die Beschleunigte Lösemittelextraktion (ASE, © Firma Dionex).

Die Soxhletextraktion als eine klassische Standardtechnik zur Extraktion von festen Matrices ist Bestandteil vieler Normverfahren. Die Probe wird dabei mit dem Lösungsmittel unter Rückfluß extrahiert. Da diese Technik mit Extraktionszeiten von 4 bis 12 Stunden und mehr sehr zeitaufwendig ist und außerdem viel Lösungsmittel verbraucht, werden alternative Extraktionsverfahren bevorzugt, wenn damit vergleichbare Ergebnisse erzielt werden können.

Die Mikrowellenextraktion<41> benötigt im Vergleich zur Soxhletextraktion weniger Lösungsmittel und Zeit. Durch die Mikrowellen wird die Probe gleichmäßig von innen und außen erwärmt, so daß die Extraktion besonders effizient ist. Bei der Extraktion von Sedimenten wurden im Vergleich zur Soxhletextraktion höhere Wiederfindungsraten bei geringerer Standardabweichung gefunden<42>. Bei Matrices, wie Boden mit hohem Huminstoffanteil, sind die Extraktionsausbeuten jedoch oft unzureichend, da die Analyte an der Matrix adsorbieren. Zudem können Huminstoffe durch die Mikrowellenenergie freigesetzt und zerstört werden, so daß die nachfolgende Analytik durch mitextrahierte Matrixbestandteile behindert wird, und eine Reinigung der Probenlösung (Clean-Up)


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erforderlich ist. Teilweise werden die Analyte durch die Mikrowellenenergie auch selber zersetzt, wodurch Minderbefunde auftreten können.

Bei der ASE werden die Proben in druckfeste Extraktionskartuschen eingefüllt, anschließend mit Lösungsmittel gefüllt und unter erhöhten Temperatur- und Druckwerten extrahiert. Im Vergleich zur Soxhletextraktion werden oft sogar höhere Wiederfindungsraten bei gleicher Standardabweichung gefunden. Die ASE hat gegenüber der Soxhletextraktion einen wesentlich geringeren Lösungsmittelverbrauch bei deutlich kürzeren Analysenzeiten und gleicher Extraktionsausbeute<43>. Ursache dafür ist die höhere Diffusionsgeschwindigkeit der Analyte sowie das bessere Lösungsvermögen der Extraktionsmittel unter den gegebenen Druck- und Temperaturwerten. Werden die Analyte durch die hohen Temperaturen oder Drücke nicht zerstört, ist die ASE für feste Matrices wie Boden oder Holz die Technik der Wahl.

Bei der Ultraschallextraktion wird die Probe bei Raumtemperatur extrahiert. Dies ist besonders bei thermolabilen und leicht verdampfbaren Analyten unumgänglich3. Im Vergleich zur Soxhletextraktion ist der Bedarf an Lösungsmittel und Zeit ebenfalls wesentlich geringer. Die Extraktion polarer und basischer Verbindungen ist mit der Ultraschallextraktion jedoch problematisch, da diese Verbindungen leicht an der Matrix adsorbieren und die Extraktionsausbeuten zu gering sind. Daher ist die Ultraschallextraktion zur Extraktion phenolischer Verbindungen weniger gut geeignet.


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3.2. Instrumentelle Analysenverfahren

Die Bestimmung der Konzentration an phenolischen Verbindungen in einer Matrix kann summarisch erfolgen (Summenparameter). Ein Beispiel hierfür ist ein DIN-Normverfahren zur Bestimmung von Phenolen in der Matrix Wasser (Phenolindex30). Die Phenole werden mit einem Reagenz (4-Aminoantipyrin) derivatisiert und über eine charakteristische Wellenlänge des Derivatisierungsproduktes mit einem Photometer bestimmt.

Die Verfahren zur Bestimmung von Summenparametern sind relativ anfällig gegen Querstörungen durch andere, chemisch ähnliche Substanzen. Da außerdem nicht alle Analyte gleich toxikologisch und ökologisch relevant sind, werden substanzspezifische Trenn- und Nachweistechniken benötigt.

Bei der Phenolanalytik sind die chromatographischen Trenntechniken der HPLC und GC vorherrschend. Gegenwärtig wird aber auch die Kapillarelektrophorese wegen ihrer hohen Trennleistung eingesetzt. Im folgenden werden diese Trenntechniken in Verbindung mit verschiedenen Detektionsprinzipien bezogen auf die Phenolanalytik beschrieben. Dabei werden die Leistungsmöglichkeiten der eingesetzten Techniken anhand eigener Untersuchungen dokumentiert. Für die kapillarelektrophoretische Trenntechnik der Micellaren Elektrokinetischen Chromatographie wurden die Micellbildungsprozesse anhand von Oberflächenspannungsmessungen untersucht.

3.2.1. HPLC

Die Techniken der Hochleistungs Flüssigchromatographie (”High Performance Liquid Chromatography“, HPLC) sind für die Trennung von polaren und thermolabilen Verbindungen weit verbreitet. Ziel der Optimierung einer Trennung ist die Verbesserung der Auflösung bei möglichst kurzer Analysenzeit. Die Auflösung ist von der Selektivität und Trennleistung des chromatographischen Systems abhängig. Die Selektivität kann durch Veränderung der Eigenschaften der mobilen und stationären Phasen (z.B. Polarität, pH-Wert, Hydrophobizität, Partikelgröße, Porenvolumen) beeinflußt werden<44>,<45>.

Typische analytische Säulen sind zwischen 60 und 300 mm lang und haben einen Innendurchmesser zwischen 2 und 4 mm. Die Trennung wird thermostatisiert bei einem Druck zwischen 50 und 250 bar durchgeführt.


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Bei der Flüssigchromatographie wird unter anderem je nach Polarität der stationären Phase zwischen Normalphasen- (NP) und Umkehrphasen- (RP) Chromatographie unterschieden. Bei der NP-Chromatographie wird als stationäre Phase hochporöses Material mit großer spezifischer Oberfläche, oft Kieselgel (SiO2) oder Aluminiumoxid (Al2O3), verwendet (Adsorptionschromatographie). Um die Trenneigenschaften weiter zu modifizieren, können diese Materialien durch Einbringen von funktionellen Gruppen (z.B. NO2-, NH3-) verändert werden. Die Analyte werden durch unterschiedlich starke Adsorption an die stationäre Phase getrennt. Als mobile Phase werden apolare Lösungsmittel wie aliphatische Kohlenwasserstoffe (z.B. n-Hexan) eingesetzt.

Bei der Umkehrphasen-Chromatographie wird die Polarität der stationären Phase durch chemische Anbindung einer apolaren Verbindung an das Füllmaterial umgekehrt. Am weitesten verbreitet ist die sogenannte ODS-Phase (von octadecyl silica) auf Kieselgelbasis. Bei diesem Material wird durch Reaktion mit Alkyldimethylchlorsilan eine lange apolare C-18 Alkylgruppe chemisch an das Kieselgel gebunden. Kommerziell sind aber auch Materialien mit anderer Alkylkettenlänge erhältlich. Die Analyte werden in diesem System durch unterschiedliche Verteilungsgleichgewichte basierend auf verschiedenen Hydrophobizitäten zwischen stationärer und mobiler Phase getrennt (Verteilungschromatographie). Als mobile Phase werden polare Lösungsmittel wie Methanol, Acetonitril und Wasser verwendet.

Die Retentionszeiten der Analyte unterscheiden sich normalerweise so stark voneinander, daß die Analyse eines komplexen Gemisches innerhalb realistischer Analysenzeiten nicht möglich ist. Der gebräuchlichste Weg zur Beeinflussung der Retentionszeiten der Analyte ist die zeitlich programmierte Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase (Lösungsmittelgradienten). Dabei ändert sich vor allem die Polarität des Lösungsmittelgemisches und somit die Löslichkeit der Analyte in der mobilen Phase, wodurch sich die Retentionszeiten verkürzen. Die Trenneigenschaften des Systems können durch Zusatz von Additiven zu den Lösungsmitteln der mobilen Phase beeinflußt werden, indem beispielsweise der pH-Wert verändert wird. Bei der Variation der Zusammensetzung der mobilen Phase muß jedoch darauf geachtet werden, daß die Detektion nicht gestört wird. So können bei der massenspektrometrischen Analyse keine unverdampfbaren Puffer eingesetzt werden, da ihre Rückstände die Einlaßsysteme verstopfen (siehe Kapitel 0 ).


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Bei der Analytik von phenolischen Verbindungen ist der Einsatz von RP-Trennsäulen weit verbreitet. Säulen mit C-18 Material liefern dabei die besten Trennungen. Neben ihrer Robustheit ist die weite Verbreitung der RP-Chromatographie<46>,<47>,<48> unter anderem darauf zurückzuführen, daß die Analyte aus flüssigen polaren Matrices<49> auf das Trennsystem aufgegeben werden können. Im Bereich der Umweltanalytik<50> ist dies vor allem für die Matrix Wasser<51>,<52> von zentraler Bedeutung und beispielsweise bei GC-Techniken häufig (siehe Kapitel 3.2.2 ) nicht möglich.

Auf RP-Phasen werden die Analyte wegen ihrer unterschiedlichen Hydrophobizität getrennt. So werden z.B. Phenole mit apolaren Alkylketten unterschiedlicher Länge sehr leistungsstark separiert. Je höher dabei der Alkylanteil eines Analyten ist, desto stärker kann er mit der stationären Phase der RP-Säule wechselwirken, und desto länger wird seine Retentionszeit. Die Trennleistung des RP-Materials für verschiedene Stellungsisomere der Alkylphenole ist hingegen nicht so hoch, da sie sich in ihrer Hydrophobizität nicht wesentlich unterscheiden.

Phenole lassen sich auch mit der NP-Chromatographie trennen. Dabei ändern sich jedoch im Vergleich zu der RP-Chromatographie die Selektivitäten. Da die Analyte in diesem Fall durch unterschiedlich starke Adsorption an die stationäre Phase getrennt werden, sind Eigenschaften wie Polarität und Geometrie für die Trennung entscheidend. Deshalb ist die NP-Chromatographie für die Trennung von Stellungsisomeren (z.B. 3,4-Dimethylphenol und 3,5-Dimethylphenol) besonders gut geeignet. Die Hydrophobizität der Analyte hat auf die Trennung mit der NP-Chromatographie hingegen nur wenig Einfluß, so daß die Alkylphenole unterschiedlicher Kettenlänge, die sich auf RP-Material gut trennen lassen, hier nur schlecht aufgelöst werden.

Die Analyte können in apolaren Matrices auf das Trennsystem aufgegeben werden. Dies ist vorteilhaft, wenn solche Matrices aus Extraktionen der Probenvorbereitung vorliegen. In diesem Fall müssen die Analyte nicht erst wie bei der RP-Chromatographie in eine polare Phase überführt werden, bevor sie analysiert werden können.

Da die untersuchten phenolischen Verbindungen sich in ihren physikochemischen Eigenschaften stark unterscheiden, muß die Trennung sowohl bei der NP- als auch bei der RP-Chromatographie mit einem Lösungsmittelgradienten erfolgen. Die Fließgeschwindigkeit des Laufmittels beträgt zwischen 100 und 1000 µL/min.


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Der Nachweis von Phenolen erfolgt vorherrschend UV-vis-spektrometrisch oder elektrochemisch<53>,<54>. Die elektrochemische Detektion ist dabei oft die empfindlichere der beiden Techniken. Mit der Entwicklung der Multielektroden-Array-Detektoren können sogar Aussagen über die Abhängigkeit des Potentials von der Struktur des Analyten gemacht werden. Des weiteren ist auch der Einsatz von Infrarot-<55>, Fluoreszenz-<56>, Leitfähigkeits- und Brechungsindex-Detektoren möglich.

Bei Einsatz eines Dioden-Array-Detektors (DAD) liefert die UV-vis-Detektion neben der Retentionszeit als zusätzliche Information noch das Spektrum des Analyten, so daß dieser Detektor in der Praxis häufig eingesetzt wird.

Anhand der DAD-Spektren lassen sich Spektrenbibliotheken aufbauen. Bei der Untersuchung unbekannter Analyte können die Analytspektren mit den Bibliotheksspektren verglichen werden, und so hilfreiche Aussagen bei der Charakterisierung liefern.

Phenole absorbieren Licht im Wellenlängenbereich von 200 bis 400 nm (pi-pi*-Übergänge).

In Abbildung 1 ist das UV-vis-Spektrum von ionischem Pentachlorphenol dargestellt. In dem Spektrum sind drei charakteristische Absorptionsmaxima zu erkennen, deren intensivstes bei 219 nm liegt. Anhand der Maxima kann die optimale Wellenlänge für die Bestimmung der Analyte ausgewählt werden. Normalerweise wird die Wellenlänge mit der stärksten Absorption gewählt, um die höchste Empfindlichkeit zu erzielen.

Abbildung 1: UV-vis-Spektrum von ionischem Pentachlorphenol

Zur Differenzierung chromatographisch ungetrennter Substanzen können auch andere Wellenlängen genutzt werden.


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Beim Spektrenvergleich ist darauf zu achten, daß die gleichen Analytspezies untersucht werden. Ändert sich beispielsweise der pH-Wert des Eluenten, kann bei der Detektion auch eine andere Analytspezies (deprotoniert/ protoniert) vorliegen.

In Abbildung 2 ist das UV-vis-Spektrum von neutralem Pentachlorphenol dargestellt. In der neutralen Spezies verändern sich durch Verschiebung der an der Absorption beteiligten Energieniveaus die Maxima des UV-vis-Spektrums. Das Maximum der ionischen Spezies bei 256 nm in Abbildung 1 ist in der neutralen Spezies in Abbildung 2 zu 236 nm verschoben. Dadurch wird der Vergleich der Spektren erschwert. In Spektrenbibliotheken sollten daher möglichst beide Analytspezies zu finden sein.

Abbildung 2: UV-vis-Spektrum von neutralem Pentachlorphenol

3.2.1.1. HPLC-MS

Unter den verschiedenen HPLC-Detektoren nimmt die Massenspektrometrie wegen ihrer Universalität<57> eine besondere Stellung ein<58>,<59>. Sie ist einerseits empfindlich und selektiv, andererseits ist sie auch in der Lage, Molekulargewichts- und Strukturaussagen zu liefern. Die Selektivität ermöglicht es in vielen Fällen sogar, chromatographisch unvollständig getrennte Komponenten massenspektrometrisch aufzulösen und quantitativ zu erfassen.

Die normalen Arbeitsbedingungen eines Massenspektrometers (Hochvakuum, hohe Temperatur, niedrige Flußrate) sind denen der HPLC diametral entgegengesetzt (flüssige Phase, hoher Druck, relativ niedrige Temperaturen). Wegen dieser Gegensätzlichkeit der Bedingungen ist es erst seit kurzer Zeit gelungen, effektive und robuste Kopplungstechniken


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zu entwickeln<60>. Die gebräuchlichsten von ihnen sind ”Particle Beam“, Thermospray46, ”Atmospheric Pressure Chemical Ionization“ (APCI) und ”Electrospray Ionization“ (ESI).

Jede dieser Interfacetechniken hat ihre eigene Charakteristik und ihren speziellen Einsatzbereich. Mit der geeigneten HPLC-MS Konfiguration ist so die Analyse von kleinen unpolaren, großen polaren bzw. von leichter und schwerer verdampfbaren Molekülen möglich. Geeignete Interface sind für Massenspektrometer unterschiedlicher Trenntechniken verfügbar. Am häufigsten werden routinemäßig die kleinen, robusten, preisgünstigen und leicht zu bedienenden Quadrupol-Massenspektrometer und Ionenfallengeräte eingesetzt.

In der vorliegenden Arbeit stand ein doppelfokussierendes Sektorfeld-Massenspektrometer zur Verfügung. Dabei werden die mit einer Spannung von 4000 V beschleunigten Ionen in einem Magnetfeld entsprechend ihres Masse/ Ladung (m/z) Verhältnisses getrennt und mit einem zusätzlichen elektrischen Sektorfeld bezüglich ihrer Energiedispersion fokussiert. Das so erreichte Auflösungsvermögen von 60.000 (bei praktischer HPLC-MS Messung von bis zu 15.000) ermöglicht die Differenzierung von Isonukliden und in vielen Fällen eine sichere Identifizierung der Substanz über ihre Elementarzusammensetzung. Doppelfokussierende Geräte können wie mehrfach hintereinandergeschaltete Massenspektrometer (MS/MS) zur Untersuchung des Fragmentierungsverhaltens und damit zur Strukturaufklärung der Substanzen eingesetzt werden. Ein bekanntes Fragmentierungsverhalten ist im umgekehrten Fall eine extrem selektive Nachweismethode, die sowohl in der Pharmaforschung als auch in der Umweltanalytik verstärkt Eingang findet.

Für die HPLC-MS Kopplung standen die zu den ”Atmospheric Pressure Ionization“ (API) zählenden Techniken der ”Electrospray Ionization“ (ESI) und ”Atmospheric Pressure Chemical Ionisation“ (APCI) zur Verfügung. Sie sind empfindlich, selektiv, robust, erfassen ein breites Substanzspektrum und werden deshalb auch in der Umweltanalytik verstärkt eingesetzt.

Die Ionisierung mit ”Electrospray Ionization“ (ESI) basiert auf der Überführung von in der flüssigen Phase vorgebildeten Ionen in die Gasphase<61>. Das ESI-Interface (siehe Abbildung 3) besteht aus einer feinen Kapillare und einer Reihe von Skimmerblenden. Die durch die Kapillare strömende flüssige Phase (z.B. HPLC-Eluat) wird durch eine am Ende der Kapillare angelegte Hochspannung mit Unterstützung eines Gasflusses (Sheath-Gas, in der Regel Stickstoff) in geladene Tröpfchen versprüht.


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Im weiteren Prozeß der Lösungsmittelverdampfung verkleinert sich der Tropfenradius, wodurch sich die Feldstärke bis zu einer kritischen Größe erhöht, der Tropfen platzt (Coulomb-Explosion) und die Analytionen so in die Gasphase übergehen.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der ESI-Technik

Bei kleineren Molekülen (bis zu etwa 1000 Dalton) entstehen vorwiegend einfach geladene [M+H]+ bzw. [M-H]- Ionen. Einige Substanzklassen neigen zur Adduktbildung mit in der Lösung vorhandenen Ionen, so daß statt der protonierten bzw. deprotonierten Quasimolekülionen Addukte mit Ammonium-, Natrium- oder Kaliumionen auftreten. Wegen der ”sanften“ Ionisierung ist die Fragmentierung gewöhnlich gering bzw. kaum vorhanden.

Moleküle mit Massen bis zu 200.000 Dalton oder mehreren funktionellen Gruppen bilden in der Regel eine Reihe von mehrfach geladenen Ionen aus deren Verteilung ein Molekulargewichtsprofil mit hoher Genauigkeit berechnet werden kann. Diese Eigenschaft hat die ESI besonders für die Analytik von Peptiden und Nucleotiden interessant gemacht.

Die ESI ist (wie auch die unten beschriebene APCI) anfällig gegenüber verunreinigende und die Transferkapillare verstopfende Belege, weswegen die Verwendung salzhaltiger Puffer in der HPLC stark eingeschränkt ist. Gegenüber der in Abbildung 3 gezeigten axialen Anordnung des Spraykopfes zur ersten Skimmerblende (wie sie auch im benutzten Gerät Verwendung fand) sind ”Off-Axis“- Systeme bezüglich salzhaltiger Lösungen robuster.


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Wegen der notwendigen Vorbildung der Ionen in der flüssigen Phase eignet sich die ESI besonders für polare bis ionische Substanzen. Dabei sind der pKs-Wert der Substanz und der pH-Wert der Lösung, sowie für die Emission der Ionen in die Gasphase deren Solvatationsenergie von Bedeutung.

Viele phenolische Verbindungen liegen bei den üblichen pH-Werten der HPLC (pH < 9) in neutraler Form vor. Deshalb wurden bisher auch nur Substanzen mit relativ kleinem pKs-Wert (wie z.B. Nitrophenole), die in den Eluenten dissoziiert vorliegen, mit der HPLC-ESI-Kopplung detektiert. Substanzen wie Alkylphenole liegen bei diesen pH-Werten als neutrale Spezies vor. Da sie keine fremden Ladungsträger anlagern und erst im alkalischen Bereich dissoziieren, konnten sie bisher mit der ESI-Technik nicht detektiert werden. Bei alkalischen Eluenten können die handelsüblichen HPLC-Säulen nicht eingesetzt werden, da sie durch Zersetzung der stationären Phasen zerstört werden.

Durch Einsatz einer speziellen HPLC-Säule, auf der auch alkalische Eluenten benutzt werden können, wurde in dieser Arbeit auch die Messung der Alkylphenole mit der HPLC-ESI-MS ermöglicht (siehe Kapitel 0 ).

Die ”Atmospheric Pressure Chemical Ionization“ (APCI) ist der ESI-Technik sehr ähnlich. Die Ionisation erfolgt ebenfalls unter Atmosphärendruck, auch der Übergang der Ionen durch das Linsensystem in das Massenspektrometer folgt dem selben Prinzip. Die Ionisationsbedingungen sind jedoch härter als bei der ESI-Technik, so daß auch die Ionisation weniger polarer Verbindungen gelingt. Da bei der APCI in der Regel keine mehrfach geladenen Ionen entstehen, eignet sich diese Technik nicht für die Messung von Substanzen mit hohem Molekulargewicht. Der Unterschied zwischen den beiden Ionisationstechniken besteht darin, daß bei der APCI keine Hochspannung an der Einlaßkapillare anliegt, sondern daß das Eluat durch verschiedene Gasflüsse (Sheath- und Auxiliary- (Aux-) Gas) zerstäubt, fokussiert und anschließend mit einem Heizer (dem sogenannten Vaporizer) verdampft wird (siehe Abbildung 4 ).

Im Austrittsbereich des so entstehenden Gasstroms ist eine Metallnadel (Corona) angebracht, an der eine Hochspannung (ca. 2,5 bis 3,0 kV) angelegt ist. Gelangen die Lösungsmittelmoleküle in den Bereich der Hochspannung, bildet sich ein Reaktionsplasma nach dem Prinzip der Chemischen Ionisation. Ist der Energieunterschied zwischen Analyten


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und Reaktandionen groß genug, werden die Analyte z.B. durch Protonentransfer oder Adduktbildung in der Gasphase ionisiert.

Abbildung 4: Schematische Darstellung der APCI-Technik

Die Ionisationsausbeute der APCI wird durch Vaporizertemperatur sowie Sheath- und Aux-Gasdruck beeinflußt, die deshalb für das jeweilige Analysenproblem optimiert werden müssen.


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3.2.1.2. HPLC-NMR

Die Kernmagnetische Resonanzspektrometrie (NMR) ist ein etabliertes Analysenprinzip zur Strukturaufklärung und Identifizierung organischer Substanzen. Sie wird zunehmend auch für quantitative Problemstellungen eingesetzt. Für die Analytik komplexer Gemische<62> sind der NMR, bedingt durch die Vielzahl der Signale, jedoch Grenzen gesetzt<63>. Deshalb ist es sinnvoll, die NMR als Hochleistungsdetektor<64> mit der HPLC zu koppeln<65>,<66>. Gegenüber anderen Detektionstechniken wie UV-vis oder MS ermöglicht die NMR-Detektion über charakteristische Werte der chemischen Verschiebung und Kopplungskonstanten beispielsweise die Zuordnung von Strukturisomeren.

In der Bioanalytik<67> wurde die HPLC-NMR bereits erfolgreich bei komplizierten Analysenproblemen eingesetzt (z.B. in den Matrices Urin<68>, Blutplasma<69>, Wein). In der Umweltanalytik<70> gibt es bedingt durch die hohen Nachweisgrenzen der NMR für Analyte in komplexen Matrices bisher nur wenige Applikationen.

Die Kopplung der HPLC an das NMR-Spektrometer erfolgt zum einen mit einer sogenannten ”Peak-Sampling-Unit“, mit der einzelne Fraktionen gesammelt werden können. Sie werden dann in den Probenkopf des NMR-Spektrometers überführt und können dort bei angehaltenem Fluß vermessen werden (stopped-flow Messung). Erfolgt die Messung dagegen im Durchfluß, entspricht dieses Vorgehen (on-flow Messung<71>,<72>) den anderen on-line Kopplungstechniken.

Für optimale Ergebnisse müssen die unterschiedlichen Parameter der HPLC und der NMR aneinander angepaßt werden. Durch die hohen Nachweisgrenzen der NMR muß eine möglichst hohe Probenmenge auf die HPLC-Säule aufgegeben werden, so daß ausreichend Substanz in den NMR-Probenkopf gelangt. Außerdem muß die Flußrate der HPLC extrem niedrig eingestellt werden, damit die Analyte möglichst lange Zeit im Probenkopf der NMR zur Messung verweilen. Das Eluat sollte durch Einsatz deuterierter Lösungsmittel möglichst wenig störende NMR-Signale erzeugen. Das NMR-Spektrometer muß Techniken zur Unterdrückung der Lösungsmittelstörsignale bereitstellen. Dies ist besonders schwierig beim Einsatz von Lösungsmittelgradienten bei der HPLC-Trennung.

In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Leistungsfähigkeit der NMR zur Identifizierung und Quantifizierung von Strukturisomeren einiger Phenole genutzt werden kann, um als Referenzverfahren für die anderen Analysentechniken hilfreiche Aussagen zu liefern.


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3.2.2. GC

Die Gaschromatographie (GC) ist die am weitesten verbreitete Trenntechnik für Gemische aus unzersetzt verdampfbaren organischen Substanzen<73>. Die im Injektor verdampften Gemische werden mit dem Trägergas (mobile Phase) durch eine mit der stationären Phase belegte Trennsäule transportiert. Durch die unterschiedlichen Verteilungskoeffizienten der Analyte zwischen der mobilen und stationären Phase (Verteilungschromatographie) können die Komponenten des Gemisches am Säulenende zeitlich getrennt detektiert werden. Die in der Gaschromatographie vorhandene große Vielfalt an Injektorsystemen, mobilen und stationären Phasen, Säulen (Materialien, Säulenlängen und -durchmesser) und Detektoren erlaubt eine optimale Anpassung an viele analytische Aufgabenstellungen.

Die gaschromatographische Analyse von Phenolen<74>,<75>,<76> wird auch in verschiedenen Normverfahren eingesetzt (siehe Kapitel 0 ). Wegen der Polarität der Substanzen ist die Trennung jedoch problematisch (es entstehen z.B. Peakverbreiterungen). Deshalb werden die Analyte oft mit Derivatisierungsmitteln umgesetzt, da die Derivate flüchtiger und apolarer als die Ausgangssubstanzen sind und sich effizienter trennen lassen.

Für die Detektion werden Techniken mit unterschiedlicher Selektivität, Spezifität und Nachweisgrenze (z.B. FID, NPD, ECD) eingesetzt. Der Flammen-Ionisations-Detektor (FID) eignet sich beispielsweise gut zur Messung von Substanzen, die C-H-Bindungen enthalten (z.B. MKW). Die Analyte werden in einer Wasserstoffflamme verbrannt, wobei Ionen gebildet werden, die dann an einem Kollektor detektiert werden. Mit dem FID lassen sich Analyte im Konzentrationsbereich zwischen 0,1 und 10 mg/L bestimmen.

Der Stickstoff-Phosphor-Detektor (NPD) und der Elektronen-Einfang-Detektor (ECD) eignen sich zur selektiven Substanzdetektion. Der Mechanismus des NPD basiert auf der Substanzverbrennung in einem Plasma, wobei anschließend nur die Analyten, die Stickstoff- und Phosphoratome enthalten, ionisiert und mit einem Kollektor detektiert werden. Die Analyte lassen sich so selektiv in einem Konzentrationsbereich von 1 bis 10 µg/L bestimmen. Der Mechanismus des ECD beruht auf der Messung von Elektronen, die von einer Strahlungsquelle emittiert werden (63Nickel-Folie) und im Detektor einen Strom erzeugen. Gelangen elektronegative Substanzen in den Detektor, fällt der Strom ab, da von den Analyten Elektronen eingefangen werden. Der Stromabfall wird gemessen und in ein Signal umgewandelt. Mit dem ECD lassen sich beispielsweise für halogenhaltige Substanzen (wie chlorierte Phenole) Bestimmungsgrenzen im Bereich von 0,1 und 10 µg/L erreichen.


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Bei der Analytik von Chlorphenolen wird er wegen der niedrigen Nachweisgrenze auch im DIN-Normverfahren (für die Matrix Wasser) eingesetzt.

Die GC-MS Kopplung übertrifft alle anderen spezifischen GC-Detektoren in Bezug auf Einsatzbreite, Identifizierungsvermögen und Strukturaussage (vgl. Kapitel 0 ).

Zur Kopplung an die GC lassen sich Quadrupolgeräte, Ion-Trap-Massenspektrometer und hochauflösende Sektorfeldgeräte einsetzen. Im ”Single Ion Recording“- (SIR-) Modus zählt das Massenspektrometer zu den empfindlichsten Detektoren. In der Laborpraxis sind Quadrupol- und Ion-Trap-Massenspektrometer als Detektoren für die Gaschromatographie am weitesten verbreitet. Sie haben sich durch Robustheit und geringe Größe bewährt und bieten mit der dazugehörigen Software oft komfortable Spektrenbibliotheken, womit die Identifizierung der Substanzen stark erleichtert wird.

Quadrupolgeräte arbeiten in der Regel mit Einheitsauflösung bei einem Massenbereich von ca. 1000 Dalton. In Gegensatz zu Massenspektrometern mit nur einem Quadrupol (”Single Stage“ Geräte), können durch Hintereinanderschalten von mehreren Quadrupolen auch Fragmentierungen untersucht werden (MSn). Die Untersuchung von Fragmentierungsreaktionen liefert wertvolle Strukturinformationen über die Analyten. Sind diese Prozesse bekannt, lassen sie sich für einen hochspezifischen Nachweis der Analyte nutzen.

Ion-Trap-Geräte sind eine besonders kompakte Art der Massenspektrometer. Durch eine mittlere Ringelektrode, die zwei hemisphärische Elektroden trennt, werden einzelne Ionen auf geschlossenen Bahnen elektrisch festgehalten und können ebenfalls gezielt weiter fragmentiert werden (MSn).

Erfordert das Analysenproblem z.B. wegen der Vielzahl möglicher Querstörungen eine höhere Massenauflösung als die Einheitsauflösung der Quadrupolgeräte, kann der Gaschromatograph an ein hochauflösendes Sektorfeld-Massenspektrometer gekoppelt werden. Für komplexe Matrixproben<77>,<78> und Vielkomponentgemische<79>,<80> ist die GC-MS wegen ihrer hohen Trennleistung und Empfindlichkeit sowie ihrer Strukturaussagefähigkeit und der damit möglichen Identifizierung der Substanzen die Technik der Wahl.


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3.2.3. Kapillarelektrophorese

Die Kapillarelektrophorese (CE)<81> ist eine Trenntechnik, die auf der Mobilität von Ionen im elektrischen Feld beruht. Ionen mit unterschiedlicher Größe, Form und differierenden Masse-/ Ladungsverhältnissen haben im elektrischen Feld verschiedene Migrationszeiten und können so getrennt werden. Die Kapillaren haben Innendurchmesser von 25 bis 100 µm bei einer Länge zwischen 0,2 und 2 Meter. Das angelegte Potential liegt in der Regel zwischen 20 und 30 kV. Das Probenvolumen (zwischen 1 und 50 nL) wird hydrostatisch oder elektrisch auf die Kapillare aufgegeben und am anderen Ende mit den in der HPLC gebräuchlichen Detektoren (UV-vis, Fluoreszenzdetektion<82>, elektrochemische Detektion, MS) nachgewiesen.

Für das Verständnis der heute beim Einsatz der Kapillarelektrophorese auftretenden Anforderungen an die Methodenentwicklung sind im folgenden einige wichtige historische Entwicklungsschritte<83> dargestellt. Die CE basiert auf elektrophoretischen Prozessen, deren Untersuchung Ende des vorigen Jahrhunderts begann. Die Elektrophorese ist als differentielle Bewegung geladener Teilchen (Ionen) im Elektrolyt innerhalb eines elektrischen Feldes definiert. Einer ihrer Grundsteine ist die 1897 formulierte Kohlrausch-Funktion, welche die Reihenfolge der elektrophoretischen Wanderung von Ionen beschreibt<84>. Als Trenntechnik wurde die Elektrophorese von Tiselius<85> 1930 eingeführt. Er untersuchte die Trennung von Proteinen, wofür er 1948 den Nobelpreis erhielt. Die Effizienz der elektrophoretischen Trennung ist durch wärmebedingte Diffusion und Konvektion begrenzt. Die klassische Flachbett-Elektrophorese wird deshalb in antikonvektiven Medien wie Polyacrylamid durchgeführt. Die angelegte Spannung darf wegen der Wärmeentwicklung nicht zu hoch gewählt werden, weshalb Analysenzeiten von mehreren Stunden oft nicht zu vermeiden sind. Diesen Problemen konnte durch den Einsatz von Kapillaren<86> an Stelle des Flachbettes begegnet werden - es entstand die sogenannte Kapillarelektrophorese. In den 70er Jahren wurden Kapillaren mit gleichmäßigen Innendurchmessern unter 500 µm entwickelt und in der CE eingesetzt<87>,<88>. Bei diesen Kapillaren konnte aufgrund des kleinen Innendurchmessers und damit des relativ großen Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen der störende Einfluß der thermisch induzierten Konvektion verringert werden. Da zudem der Abtransport der entstehenden Wärme bei Kapillaren durch entsprechende Kühlung gewährleistet ist, konnten nun hohe Feldstärken


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eingesetzt werden. Damit ermöglicht die CE im Vergleich zur klassischen Elektrophorese sehr kurze Analysenzeiten. Die hohe Trennleistung, kombiniert mit kurzer Analysenzeit, führte zur raschen Verbreitung der CE in der medizinischen und pharmazeutischen Analytik.

Der Einsatz von Quarzkapillaren (Innendurchmesser unter 100 µm) ermöglicht die heute weit verbreitete on-line UV-Detektion<89>, da Quarz im unteren UV-Bereich transparent ist. Ein weiterer Fortschritt war die Entwicklung der laserinduzierten Fluoreszenz. Gassmann et al.<90> konnten damit Analyte im Attomol-Bereich (10-18 mol/L) nachweisen. Olivares et al.<91> gelang 1987 die Kopplung der CE an die Massenspektrometrie. 1988 zeigten Kuhr und Yeung<92> die Möglichkeiten der indirekten Detektion auf, mit der die Messung von UV- und fluoreszenzinaktiven Verbindungen ermöglicht wurde. Terabe et al.<93> ermöglichten 1984 die Trennung neutraler Moleküle durch Kombination chromatographischer Trennprinzipien mit der Kapillarelektrophorese (Micellare Elektrokinetische Chromatographie, MEKC). Ende der 80er Jahre wurden die ersten kommerziellen CE-Geräte entwickelt. In den 90er Jahren begann die Applikations- und Methodenentwicklung<94>,<95> in den Vordergrund der Forschung zu treten. Heutige CE-Analysen sind in vergleichsweise kurzer Zeit mit hohem Trennvermögen und niedrigen stoffmengenbezogenen Nachweisgrenzen bei geringem Lösungsmittelverbrauch durchzuführen. Ein entscheidender Nachteil der CE sind jedoch die hohen konzentrationsbezogenen Nachweisgrenzen.

Die wärmebedingte Diffusion und Konvektion, die gleichzeitige Trennung von ionischen und neutralen Analyten sowie die komplexe Methodenentwicklung (zahlreiche Analysenparameter) ermöglichen einerseits diverse Einsatzfelder für die Analytik, sind andererseits jedoch auch heute noch die grundlegenden Probleme der CE. Wegen ihrer Vorzüge wird die CE auch für die Umweltanalytik zunehmend eingesetzt<96>,<97>,<98> obwohl hier die Anzahl der Applikationen<99>,<100>,<101> noch immer sehr beschränkt ist. Das liegt vor allem daran, daß Techniken zur Trennung von ionischen und neutralen Verbindungen entwickelt wurden, und die hohen konzentrationsbezogenen Nachweisgrenzen durch effektive Anreicherungstechniken ausgeglichen werden können.

Da das entwickelte CE-Verfahren (”Direktes-MEKC-Stacking“, siehe Kapitel 4.2.4.2 ) einen Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit bildet, wird im folgenden auf die relevanten Grundlagen, Probleme und Techniken eingegangen. Um Aussagen über den Einfluß organischer Modifier auf den Micellbildungsmechanismus im MEKC-Elektrolyten treffen zu können, wurden vertiefende Untersuchungen durchgeführt (siehe Kapitel 3.2.3.3).


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3.2.3.1. Meßprinzipien der Kapillarelektrophorese

Das in dieser Arbeit verwendete System (HP3D-CE, Hewlett-Packard<102>) besteht aus zwei Elektrolytgefäßen, thermostatisierter Kapillare, Dioden-Array-Detektor (DAD), Hochspannungs-versorgung und thermostatisiertem Autosampler. Der Aufbau dieser Apparatur ist in Abbildung 5 dargestellt. Die Kapillare überbrückt die beiden Elektrolytgefäße, zwischen denen eine Hoch-spannung (-30 kV bis +30 kV) angelegt wird. Die Probe wird bei positiver Potentialdifferenz am anodischen Ende auf die mit Elektrolyt gefüllte Kapillare aufgegeben, wobei das dortige Elektrolytgefäß gegen das Probengefäß ausgetauscht wird und die Kapillare in das Probengefäß eintaucht.

Abbildung 5: Schematische Darstellung des Kapillarelektrophorese-Systems

Die Probenaufgabe kann durch Anlegen eines Druckes oder eines elektrischen Feldes erfolgen. Das Elektrolytreservoir dient dem Austausch des Elektrolyten in den Meßgefäßen.

Die an der Meßapparatur angelegte Hochspannung bewirkt die elektrophoretische Wanderung der ionischen Analyte in der Kapillare. Der elektrophoretische Trennprozeß basiert auf unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten ny der Ionen im elektrischen Feld E (Gleichung 1).

Gleichung 1

ny = µe E

 

ny = elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit

 

µe = elektrophoretische Mobilität

 

E = elektrische Feldstärke


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Die elektrische Feldstärke E ist eine Funktion der zwischen den Probengefäßen angelegten Spannung und der Kapillarlänge. Die Wanderungsgeschwindigkeit ny ist mit der Feldstärke E über die elektrophoretische Mobilität µe, einer stoffspezifischen Konstante, verknüpft. Die Konstante µe eines Ions ist in einem Medium bei konstantem pH-Wert definiert.

Die elektrophoretische Mobilität läßt sich durch die auf den ionischen Analyten einwirkenden Kräfte beschreiben. Auf den Analyten wirkt zum einen die beschleunigende elektrische Kraft FE. Sie wird durch das Produkt aus effektiver Ionenladung und elektrischer Feldstärke beschrieben ( Gleichung 2 ).

Gleichung 2

FE = z F E

 

z = effektive Ionenladung

 

F = Faradaykonstante

Die effektive Ionenladung beschreibt dabei die absolute Ionenladung, abzüglich des Ladungsanteils der entgegengesetzt geladenen Moleküle in der Umgebung (Debye-Hückel Theorie).

Durch die Reibungskraft FR wird der Analyt dagegen gebremst. Die Reibungskraft läßt sich angenähert durch das Stokessche Gesetz beschreiben ( Gleichung 3 ).

Gleichung 3

FR = 6 pi eta r ny

 

eta = Viskosität des Lösungsmittels

 

r = Stokesscher Ionenradius

Da diese Kräfte im Gleichgewicht stehen (stationärer Zustand), ist ihr Quotient proportional zur Wanderungsgeschwindigkeit ny des Analyten. Daraus folgt mit Gleichung 1 auch die Proportionalität zu der elektrophoretischen Mobilität µe ( leichung 4 ).

Gleichung 4

µe ~ FE/FR

Es ergibt sich mit Gleichung 2 und Gleichung 3 für die elektrophoretische Mobilität:

Gleichung 5

µe = z F / (6 pi eta r)

Kleine Moleküle mit hoher Ladungsdichte haben nach Gleichung 5 eine höhere elektrophoretische Mobilität als große mit niedriger Ladung.


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Wird nun zwischen den Elektrolytgefäßen über die Kapillare eine Spannung angelegt, werden Analyte mit unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilitäten wegen ihrer ungleichen Wanderungsgeschwindigkeiten getrennt.

Der Migration der Analyte ist immer ein Elektroosmotischer Fluß (EOF) überlagert. Dieser trägt nicht zur Trennung der Substanzen bei, ist aber an ihrem Transport durch die Kapillare beteiligt. Die Größe des Elektroosmotischen Flusses hängt vom pH-Wert des Elektrolyten und der Ladungsverteilung in der Nähe der Kapillaroberfläche ab. Die Oberflächeneigenschaften der Kapillare werden auch durch organische Additive wie Methanol oder Acetonitril verändert. Durch Anlagerung an die Kapillarwand kann so die Oberflächenladung abgeschirmt werden.

In dieser Arbeit wurden Quarzkapillaren eingesetzt. Sie tragen bei pH-Werten > 3 durch Dissoziation der Silanolgruppen negative Ladungen an der Oberfläche. Durch Anlagerung der entsprechenden Gegenionen des Elektrolyten an der Kapillaroberfläche bildet sich eine Doppelschicht aus, die aus einer statischen und einer beweglichen diffusen Schicht besteht ( Abbildung 6 ).

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Ladungsverteilung an der Oberfläche einer Quarzkapillare


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Wird parallel zur Oberfläche ein elektrisches Feld angelegt, wandern darin die Gegenionen der mobilen Schicht und ziehen die gesamte Flüssigkeit in der Kapillare in Richtung Kathode mit sich.

Das sich so ausbildende Strömungsprofil ist im Gegensatz zu dem hydrodynamischer Flüsse (laminar oder parabolisch) stempelförmig und extrem flach. Dies führt zu einer wesentlich geringeren Bandenverbreiterung als ein hydrodynamisches Strömungsprofil, das stark vom Kapillarradius und der Strömungsgeschwindigkeit abhängig ist.

Die Größe des Elektroosmotischen Flusses wird vereinfacht durch Gleichung 6 und Gleichung 7 beschrieben (vgl. Gleichung 1 ).

Gleichung 6

µEOF = (epsilon zeta/eta) E

Gleichung 7

nyEOF = epsilon zeta/eta

 

µEOF = EOF-Mobilität

 

nyEOF = EOF-Geschwindigkeit

 

epsilon = Dielektrizitätskonstante des Elektrolyten

 

zeta = Zeta-Potential

 

eta = Viskosität des Elektrolyten

Dabei beschreibt das Zeta-Potential die Potentialdifferenz der Doppelschicht, die sich zwischen der Kapillaroberfläche und der angrenzenden Flüssigkeit ausbildet.

Da die Oberflächenladung der Kapillare stark pH- abhängig ist, ändert sich der Elektroosmotische Fluß mit dem pH-Wert des Elektrolyten. Mit steigendem Protonierungsgrad der Silanolgruppen (niedrigerem pH-Wert) wird er beispielsweise langsamer, da das Zeta-Potential kleiner wird. Auch andere Elektrolytzusätze beeinflussen das Zeta-Potential und damit den Elektroosmotischen Fluß. Bei steigender Elektrolytkonzentration nimmt die Geschwindigkeit des Elektroosmotischen Flusses ebenfalls ab. Da bereits minimale pH-Wert- Änderungen den Elektroosmotischen Fluß verändern, sind standardisierte Spül- und Konditionierungszeiten der Kapillare für reproduzierbares Arbeiten erforderlich.

Ist der Elektroosmotische Fluß schnell genug, werden nicht nur Kationen, sondern auch neutrale Moleküle und Anionen mit entgegengesetzter Wanderungsrichtung im elektrischen Feld durch die Kapillare transportiert und können in derselben Messung analysiert werden. Da der Elektroosmotische Fluß in Richtung Kathode ausgerichtet ist, befindet sich in der CE-Apparatur an diesem Kapillarende auch das Detektionsfenster. Bei der in dieser Arbeit


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verwendeten Apparatur wurde ein Dioden-Array-Detektor (DAD) benutzt. Die Detektion erfolgt in der Kapillare.

Um die Nachweisgrenzen zu senken, können spezielle Kapillaren eingesetzt werden. Bei diesen sogenannten ”Bubble-Cell“-Kapillaren ist die Innenseite beim Detektionsfenster durch eine besondere Säurebehandlung blasenähnlich aufgeweitet. Die optische Weglänge des Detektorstrahls durch die Analytlösung ist dadurch größer und die Nachweisgrenze um ca. den Faktor 3 niedriger als in Normalkapillaren.

Für reproduzierbares Arbeiten ist es wichtig, die Hochspannung konstant zu halten sowie die Kapillare zu thermostatisieren und mit dem Elektrolyt zu konditionieren. Ferner muß die Reproduzierbarkeit der Probeninjektion gewährleistet sein.

3.2.3.2. Kapillarzonenelektrophorese

Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) ist die am weitesten verbreitete Technik der CE. Die Anwendungsgebiete umfassen die Analyse von Aminosäuren, Peptiden, Enantiomeren und vielen ionischen Spezies wie z.B. Amine, Phenole und Sulfonsäuren.

Das Trennprinzip der CZE ist in Abbildung 7 dargestellt. Die Analyte befinden sich nach der Probenaufgabe (t = 0) am Anfang der Quarzkapillare. Nach Anlegen der Hochspannung beginnt die Trennung der Analyten, die auf den unterschiedlichen Migrationszeiten im elektrischen Feld beruht. Unter Ausnutzung des Elektroosmotischen Flusses gelingt mit der CZE die Trennung von anionischen und kationischen Spezies. Anionische Analyte können im Fall der in Abbildung 7 dargestellten Verhältnisse detektiert werden, wenn ihre Mobilität kleiner als die des EOF ist. So werden sie durch den EOF in Richtung Detektor (Kathode) transportiert. Für die Detektion schneller Analyten muß die Polarität der Trennspannung umgekehrt werden. Neutrale Moleküle werden nicht separiert und wandern mit der Geschwindigkeit des EOF durch die Kapillare.

Den größten Einfluß auf die Selektivität der Trennung haben Änderungen der Elektrolytkonzentration und -zusammensetzung sowie die Variation des pH-Wertes. Deshalb ist es wichtig, daß der Elektrolyt für das jeweilige Trennproblem optimiert wird. Zahlreiche Additive wie Methanol, Acetonitril, Cyclodextrine, etc. beeinflussen in komplexer Form (z.B. Einfluß auf Kapillaroberfläche, Viskosität und Leitfähigkeit des Elektrolyten) die


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Trenneigenschaften des Systems und bieten somit weitreichende Möglichkeiten zur Variation und Optimierung des Elektrolyten.

Abbildung 7: Schematische Darstellung des Trennprinzips von der CZE

3.2.3.3. Micellare Elektrokinetische Chromatographie

Bei der Micellaren Elektrokinetischen Chromatographie (MEKC) wird dem Elektrolyt ein Tensid in Konzentrationsbereichen oberhalb der sogenannten Kritischen Micellaren Konzentration (CMC, siehe unten) zugesetzt, so daß sich Micellen ausbilden. Das ionische Tensid Natriumdodecylsulfat (SDS) ist wegen hoher Wasserlöslichkeit, niedriger CMC (ca. 8 mmol/L in Wasser), geringer UV-Absorption und niedriger Kosten besonders weit verbreitet. Die Analyte werden durch unterschiedliche Aufenthaltswahrscheinlichkeiten - bedingt durch die Verteilungskoeffizienten - in der wäßrigen bzw. micellaren Phase des Elektrolyten getrennt.

Oberflächenaktive Moleküle (Tenside) setzen sich aus einem hydrophilen und hydrophoben Teil zusammen. Als Beispiel wird das in dieser Arbeit verwendete anionische Tensid Natriumdodecylsulfat (SDS) betrachtet. Beim SDS besteht der hydrophile Teil aus der


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anionischen Sulfatgruppe, die Kopf genannt wird. Die lange Alkylkette ist der hydrophobe Teil des Tensids und wird als Schwanz bezeichnet. Durch den hydrophilen Kopf ist SDS in Wasser löslich. Die SDS-Moleküle sind als Monomere gelöst. Jedoch bereits bei kleinen Tensidkonzentrationen kommt es zu einer abrupten Änderung der physikochemischen Eigenschaften der Lösung. Bei dieser kritischen Konzentration (”Critical Micelle Concentration“, CMC) bilden die Tensidmoleküle Konglomerate (Micellen)<103>. Für SDS liegt diese Konzentration in Wasser bei ca. 8 mmol/L, bei wäßrigen Elektrolytlösungen wird sie auf 3 mmol/L herabgesetzt<104>.

Die Bildungsgeschwindigkeit der Micellen<105> liegt im Bereich von Millisekunden.<106> Die Micellen stehen mit den Monomeren im Gleichgewicht.

Dieses Gleichgewicht läßt sich durch das Massenwirkungsgesetz beschreiben ( Gleichung 8 ):

Gleichung 8

S: Tensid-Monomer

M: Micelle der Aggregationszahl n

Kn: Micellbildungskonstante (ca. 10-3 s)

Oberhalb der CMC stehen die Tensidmoleküle in den Micellen im dynamischen Assoziations-/ Dissoziations- Gleichgewicht mit Monomeren in Lösung. Die Gleichgewichtskonstante liegt dabei im Bereich von 10-5 s. Der Austausch zwischen Monomeren in Lösung und den an einer Micelle beteiligten Moleküle erfolgt um zwei Größenordnungen schneller als Bildung und Zerfall der Micellen. Diese Gleichgewichtskonstanten sind stark temperaturabhängig. Bei ionischen Tensiden wie SDS steigt beispielsweise die CMC bei höheren Temperaturen.

Die Tensidmonomer-Konzentration in der wäßrigen Phase bleibt konstant bei der CMC, unabhängig von der Gesamtkonzentration des Tensids. Form und Größe der entstehenden Micellen werden durch die Struktur der Monomere und die Gesamtkonzentration des Tensids beeinflußt.

Es bilden sich zweidimensionale Strukturen wie lamellenartige oder sphärische Körper und dreidimensionale Strukturen wie Diskus und Kugel. Je höher die Tensidkonzentration ist, desto höher sind auch die Aggregationszahlen der Micellen. Dreidimensionale Strukturen


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bilden sich bevorzugt bei hohen Konzentrationen. Die Aggregationszahlen der Micellen folgen der statistischen Normalverteilung um die thermodynamisch stabilste Micelle.<107> Die Größenverteilung der Micellen ist in wäßriger Lösung jedoch sehr schmal. Für SDS-Micellen beträgt die Anzahl der Monomere, die eine Micelle bilden, ungefähr 70.

Wird in der Kapillarelektrophorese ein Elektrolyt mit Tensidanteil eingesetzt, ist bei geladenen Analyten der elektrophoretischen Migration ein chromatographischer Prozeß überlagert ( Abbildung 8 ). Mit der Micellaren Elektrokinetischen Chromatographie (MEKC) gelingt auch die Trennung neutraler Substanzen. Da Neutralteilchen nicht elektrophoretisch wandern, ist für deren Trennung nur das Verteilungsgleichgewicht zwischen Micellen und wäßriger Phase maßgeblich.

Abbildung 8: Schematische Darstellung des Trennprinzips der MEKC

Je nach Hydrophobizität wechselwirken die Analyte unterschiedlich stark mit der micellaren Phase des Elektrolyten.

Aufgrund ihrer negativen Ladung ist die Mobilität der SDS-Micellen (µMic) dem Elektroosmotischen Fluß entgegengerichtet. Ist die EOF-Mobilität (µEOF) größer als die der Micellen, werden sie mit dem Elektroosmotischen Fluß in Richtung Kathode durch die Kapillare bewegt. Die Nettomobilität der Micelle (µnet) ergibt sich aus der vektoriellen Summe der Mobilitäten des EOF und der Micellen.


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Je stärker der Analyt mit der Micelle in Wechselwirkung tritt, desto länger wird seine Migrationszeit, da er mit der Micelle gegen den Elektroosmotischen Fluß transportiert wird. Je hydrophiler eine Substanz ist, desto stärker tritt sie mit der wäßrigen Phase in Wechselwirkung und hat eine entsprechend kürzere Migrationszeit. Bei ionischen Analyten ist der so resultierenden Wanderungsgeschwindigkeit zusätzlich noch die elektrophoretische Mobilität in der wäßrigen Phase (siehe Kapitel 0 ) vektoriell überlagert.

Der Selektivität der oben beschriebenen MEKC-Trennung sind Grenzen gesetzt. Je hydrophober ein Analyt ist, desto größer wird seine Aufenthaltswahrscheinlichkeit in der micellaren Phase des Elektrolyten. Seine Wanderungsgeschwindigkeit nähert sich daher der Micellgeschwindigkeit an. Ein Gemisch aus stark hydrophoben Analyten wird demnach nicht mehr getrennt, da alle Analyte mit der Geschwindigkeit der Micellen durch die Kapillare wandern.

Die Selektivität der MEKC-Trennung läßt sich jedoch durch dieselben Parameter wie bei der CZE beeinflussen. So bewirkt der Zusatz von organischen Additiven wie Methanol und Acetonitril Änderungen der Löslichkeiten der Analyte in der wäßrigen Phase, indem die Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen und die Polarität beeinflußt werden.

Weiterhin können Additive mit hydrophoben Gruppen (z.B. n-Hexanol) in die äußere Schicht der Micelle eingebaut werden und so die Wechselwirkung zwischen Analyt und Micelle beeinflussen104,<108>. Stark polare Additive wie Methanol und Acetonitril wechselwirken hingegen kaum mit den Micellen und können daher als EOF-Marker eingesetzt werden<109>.

Der Zusatz von organischen Additiven zum Elektrolyt beeinflußt jedoch in hohem Maße die micellaren Eigenschaften (Bildung, Größenverteilung, Form, CMC, etc.) und damit auch das Trennprinzip<110>. Bis heute sind die komplexen Trennmechanismen von Multikomponent-Elektrolyten noch nicht aufgeklärt<111>. Während einige Autoren der Meinung sind, daß das Trennprinzip weiterhin auf den Verteilungsgleichgewichten der Analyte zwischen der micellaren und wäßrigen Phase beruht, sagen andere, daß die CMC durch den Zusatz der Additive Acetonitril und Methanol so stark steigt, daß Micellen bei den gewöhnlich verwendeten Gemischen nicht mehr gebildet werden. Da jedoch neutrale Analyte in solchen Elektrolyten noch meßbare Eigenmobilitäten haben, die auf Wechselwirkungen mit Tensidmolekülen beruhen müssen, wird vermutet, daß die Trennung in diesem Fall auf


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Wechselwirkungen mit Tensidmonomeren zurückzuführen ist. Diese Vermutung erklärt die Trennung jedoch nicht hinreichend, da gezeigt werden konnte, daß die Analytmobilitäten für diese Wechselwirkungen zu hoch sind111. Eine Untersuchung des Elektrolyten auf die Existenz von Micellen ist folglich naheliegend.

Ob Micellen in einem Elektrolytgemisch vorliegen oder nicht, kann durch Messung der Kritischen Micellaren Konzentration des Tensids untersucht werden, da oberhalb der CMC Micellen gebildet werden.

Dazu eignen sich beispielsweise Techniken wie konventionelle oder quasielastische Lichtstreuung, statische oder zeitaufgelöste Fluoreszenz, Voltammetrie<112>, Kapillarelektrophorese<113>,<114> und Messungen der Konduktivität oder Oberflächenspannung<115>,<116>. Ein Vergleich gestaltet sich hierbei sehr schwierig, da die Meßergebnisse stark methodenabhängig sind.

Anhand von Konduktivitätsmessungen haben Seifar et al.111 gezeigt, daß Meßergebnisse für die CMC in Gemischen mit dem organischen Modifier Acetonitril vorsichtig interpretiert werden müssen. In rein wäßrigen Tensidlösungen findet oberhalb der CMC ein abrupter Phasenübergang statt. Der thermodynamische Energieunterschied zur begünstigten micellaren Phase ist sehr gering. Rechnungen haben gezeigt, daß die micellare Phase dabei um etwa 1% energetisch bevorzugt ist. Wird die Tensidkonzentration oberhalb der CMC weiter erhöht, bilden sich immer mehr Micellen. Die Konzentration an freien Tensidmonomeren in der wäßrigen Phase bleibt hingegen konstant (siehe oben). Die Aggregationszahlen der Micellen sind für SDS-Lösungen in reinem Wasser relativ schmal um die Zahl 70 normalverteilt.

In Gegenwart von Acetonitril erfolgt dieser Phasenübergang hingegen nicht so abrupt. Es wird nun thermodynamisch nicht mehr nur der kleine Bereich an Micellaggregaten um die Zahl 70 begünstigt, sondern die Micellen haben eine breitere Verteilung bezüglich ihrer Aggregationszahl. Der Phasenübergang ist unschärfer, weswegen die Bezeichnung CMC in solchen Systemen nur eingeschränkt verwendet werden kann.

Außerdem bleibt bei steigender Tensidkonzentration die Konzentration der freien Tensidmonomere in der wäßrigen Phase nicht mehr konstant. Da sich das Lösungsvermögen der wäßrigen Phase durch Acetonitril für die Tensidmonomere verbessert, steigt deren Konzentration in der wäßrigen Phase bei steigender Gesamtkonzentration des Tensids


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kontinuierlich an. Je höher dabei die Acetonitril-Konzentration ist, desto stärker werden die Monomere in der wäßrigen Phase gegenüber den Micellen begünstigt. Ein abrupter Wechsel der physikalischen Eigenschaften wie bei der Kritischen Micellaren Konzentration in rein wäßrigen Tensidlösungen ist bei Gemischen mit organischen Additiven nicht mehr zu beobachten.

Es ist daher wahrscheinlich, daß sich die micellare Phase bei Erhöhung der Tensidkonzentration sukzessiv von kleinen zu größeren Aggregationszahlen ausbildet, während gleichzeitig die Monomerkonzentration in der wäßrigen Phase steigt.

Um einen Einblick in das Trennprinzip des in dieser Arbeit verwendeten Elektrolyten zu gewinnen, wurde untersucht, ob in diesem System Micellen gebildet werden. Dazu wurde analysiert, ob ein Phasenübergang ähnlich wie bei der CMC in wäßrigen Systemen mit Hilfe von Oberflächenspannungsmessungen bestimmt werden kann. Die erhaltenen Daten wurden mit den Literaturwerten verglichen und die Ergebnisse interpretiert.

Die Oberflächenspannung einer Flüssigkeit läßt sich mit Hilfe eines Tensiometers messen<117>.

Tenside haben die Eigenschaft, die Oberflächenspannung von wäßrigen Lösungen zu erniedrigen. Dies kommt dadurch zustande, daß die Tensidmoleküle aus dem inneren ihrer Lösung an die Oberfläche diffundieren und sich dort so orientieren, daß der hydrophobe Schwanz aus der Lösung herausgedreht ist und der hydrophile Kopf in die wäßrige Lösung eintaucht. Der so entstehende Grenzflächenfilm erniedrigt die Oberflächenspannung der Lösung.

Ab der CMC wird die Oberflächenspannung nicht weiter erniedrigt. Es bilden sich bei höheren Konzentrationen nur noch weitere Micellen in der Lösung, so daß die Konzentration an Monomeren nicht weiter steigt.

Das Meßprinzip des Tensiometers beruht auf der Messung der Kraft, die von der Flüssigkeit auf einen eintauchenden ringförmigen Meßkörper ausgeübt wird. Da die Größe der Kraft stark temperaturabhängig ist, wird das System bei 25°C thermostatisiert. Beim Herausziehen des Meßkörpers bildet sich am Ring eine Flüssigkeitslamelle, die auf den Ring eine Zugkraft ausübt. Die Messung erfolgt mit einem induktiven Kraftaufnehmer, der die gemessene Kraft in eine Gleichspannung umwandelt, die von einem Schreiber als Funktion der Zeit registriert wird. Da Zeit und Lamellenlänge linear verknüpft sind, wird so ein Kraft/


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Dehnungsdiagramm der Lamelle registriert. Aus dem Maximum des Kraftverlaufes läßt sich die Oberflächenspannung delta berechnen ( Gleichung 9 ).

Gleichung 9

delta = FZM/2U [mN/m]

 

FZM = maximale Zugkraft

 

U = Ringumfang

Um Absolutwerte für die Kraft anzugeben, wird das System mit speziellen Gewichten kalibriert. Danach entspricht ein Skalenteil des Schreiberausschlags einem mN/m. Aus dem Maximum des Schreiberausschlags kann direkt die Oberflächenspannung der Lösung abgelesen werden.

In wäßrigen Tensidlösungen kann die CMC bestimmt werden, indem die Oberflächenspannung gegen die logarithmierte Tensidkonzentration aufgetragen wird. Bis zur CMC fällt die Oberflächenspannung dabei kontinuierlich ab, darüber ändert sie sich hingegen nicht mehr. An diesem Minimum der Kurve kann die CMC direkt abgelesen werden. Danach steigt die Oberflächenspannung wieder leicht an oder bleibt bei diesem Wert konstant. Wird so die Kritische Micellare Konzentration von SDS in Wasser bestimmt, ergibt sich ein Wert von 8 mmol/L (vgl. Abbildung 9 ).

Die Optimierung des Elektrolytgemisches für die Bestimmung von Phenolen mit der MEKC hat die Zusammensetzung 50 mmol/L Natriumdihydrogenphosphat-Lösung, 100 mmol/L SDS, 5% (v/v) Methanol und 10% (v/v) Acetonitril (siehe Kapitel 0 ) ergeben. Aufgrund des Elektrolyten und des 15%igen Anteils an organischen Modifiern sollte die Micellbildung wie oben beschrieben beeinflußt werden. Daher wurde untersucht, ob sich durch die Messung der Oberflächenspannung des Elektrolyten Aussagen zur Micellbildung ableiten lassen.

Dazu wurde die Oberflächenspannung des MEKC-Elektrolyten (50 mmol/L Natriumdihydrogenphosphat-Lösung 5% (v/v) Methanol und 10% (v/v) Acetonitril) bei verschiedenen SDS-Konzentrationen von 0 bis 120 mmol/L mit einem Tensiometer bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 9 dargestellt. Das Diagramm zeigt die Kraft/ Konzentrationskurven für SDS in Wasser und im MEKC-Elektrolyt bei 25°C. Die Oberflächenspannungs-Konzentrationskurve für SDS in Wasser fällt von 74 mN/m steil bis zum Minimum bei der CMC (31 mN/m, 8 mmol/L, Literaturwerte118) ab. Oberhalb der CMC gelangen alle Tensidmonomere in die micellare Phase. Das Auftreten dieses Minimums läßt


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sich durch grenzflächenaktive Verunreinigungen im System SDS/ Wasser erklären. Unterhalb der CMC erniedrigen die Verunreinigungen die Oberflächenspannung der Lösung. Werden oberhalb der CMC Micellen gebildet, lagern sich die Verunreinigungen in die Micellen ein, so daß die Oberflächenspannung der Lösung wieder leicht steigt.

Abbildung 9: Oberflächenspannungs-/ Konzentrations-Kurven für SDS in Wasser und im MEKC-Elektrolyt

Das Ansteigen der Meßwerte oberhalb der CMC kommt auch dadurch zustande, daß es Teilchen der Lösung (Tensidhydrate und Micellen) gelingt, die bewegliche Oberflächenstruktur zu durchbrechen, um sich in den Oberflächenfilm einzulagern. Bei Werten im Bereich der Sättigungskonzentration liegen die Meßwerte für die Oberflächenspannung bei ca. 33 mN/m. Ein geringerer Wert als das Minimum der CMC wird nicht erreicht.

Im Vergleich zur wäßrigen SDS-Lösung ist der Kurvenverlauf für die Oberflächenspannung im MEKC-Elektrolyt wesentlich flacher. Dies kann auf den Phosphatpuffer zurückgeführt werden, durch den die Oberflächenspannung bereits von 74 auf 54 mN/m erniedrigt wird.

Der Zusatz der organischen Additive beeinflußt die Oberflächenspannung hingegen nicht (53,9 mN/m), da die kleinen und polaren Moleküle gut in das Netz der Wasserstoffbrückenbindungen des Wassers eingebaut werden können.


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Vergleichbare Extremwerte für die Kurve der wäßrigen Lösung sind bei der Kurve für den Elektrolyt nicht vorhanden. Nach dem langsamen Absinken der Oberflächenspannung von 53,9 auf 39,8 mN/m fällt die Kurve zwischen den Meßwerten bei 5 und 8 mmol/L deutlich um 2 mN/m auf 37,2 mN/m ab. Dieses Abfallen läßt vermuten, daß hier ein Phasenübergang stattfindet, der dem bei der Kritischen Micellaren Konzentration in Wasser ähnelt. Bis zur höchsten SDS-Konzentration bei 120 mmol/L fallen die Meßwerte dann langsam weiter bis auf den Minimalwert bei 35,5 mN/m ab. Dieser Kurvenverlauf ist im Vergleich mit dem zur Bestimmung der CMC in Wasser ungewöhnlich, da das Minimum bei der CMC dort normalerweise nicht unterschritten wird. Ein Maximum bei Konzentrationen oberhalb der CMC tritt ebenfalls nicht auf.

Die Meßergebnisse lassen sich ebenso wie die von Seifar et al. interpretieren112. Der Phasenübergang bei 7-8 mmol/L läßt darauf schließen, daß ab dieser Konzentration im Elektrolyt die Micellbildung beginnt. Die Micellen im Elektrolyt werden jedoch im Gegensatz zu Micellen in Wasser sukzessiv von kleinen zu größeren Aggregationszahlen gebildet. Kleinere Tensidaggregate entstehen wahrscheinlich schon bei Konzentrationen unterhalb von 7 mmol/L. Ein abrupter Wechsel der physikochemischen Eigenschaften ist daher nicht mehr zu beobachten.

Das Lösungsvermögen der Monomere in der wäßrigen Phase hat sich durch die organischen Additive Methanol und Acetonitril verbessert. Daher steigt die Monomerkonzentration in der wäßrigen Phase des Elektrolyten mit steigender Gesamtkonzentration des Tensids ebenfalls kontinuierlich an. Da die Monomere in der wäßrigen Phase die Oberflächenspannung des Systems erniedrigen, sinken die Meßwerte dafür auch oberhalb des Phasenübergangs bis zum Minimalwert bei der Sättigungskonzentration weiter ab. Ein Minimum wie bei der CMC in Wasser wird nicht ausgebildet, da die dafür verantwortlichen oberflächenaktiven Verunreinigungen ebenso wie die Tensidmoleküle schon bei niedrigeren Konzentrationen Aggregate in der Lösung bilden.

Die Ergebnisse der Untersuchung des MEKC-Elektrolyten auf die Existenz von Micellen anhand von Oberflächenspannungsmessungen deuten darauf hin, daß trotz der relativ hohen Konzentration an organischen Additiven Micellen gebildet werden. Die Micellbildung erfolgt bei steigender SDS-Konzentration jedoch nicht abrupt wie in rein wäßrigen Systemen mit einer schmalen Größenverteilung um die Aggregationszahl 70. Wahrscheinlicher ist die kontinuierliche Bildung von Micellen mit sehr unterschiedlichen Aggregationszahlen.


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Gleichzeitig steigt mit der SDS-Gesamtkonzentration auch die Konzentration der Monomere in der wäßrigen Phase des Elektrolyten. Dieses beeinflußt die Löslichkeit der Analyte in der wäßrigen Phase und folglich auch deren Verteilungskoeffizienten zwischen micellarer und wäßriger Phase.

Der Phasenübergang von Tensidmonomeren zu Micellen ist einerseits durch die breite Verteilung der Micellaggregationszahl und andererseits durch die hohe Tensidmonomer-Konzentration in der wäßrigen Phase unschärfer als im Vergleichssystem SDS/ Wasser.

Die Untersuchung der Micellbildungsprozesse am verwendeten MEKC-Elektrolyt bestätigt, daß durch die breite Verteilung der Micellaggregationszahl die Signalbreite zunimmt und die Dosiermenge in rein organischen Lösungsmitteln ohne Peakverbreiterung begrenzt ist.

3.2.3.4. Anreicherungstechniken

Die Empfindlichkeit der CE bezogen auf die Stoffmenge des Analyten ist sehr hoch. Mit der Fluoreszenzdetektion gelingt es zum Beispiel, nur wenige Moleküle einer Substanz nachzuweisen.

Die konzentrationsbezogenen Nachweisgrenzen liegen jedoch oft um Größenordnungen über denen anderer Analysentechniken wie z.B. der HPLC. Dies resultiert aus den extrem kleinen Probenvolumina, die auf die Kapillare aufgegeben werden, und aus der durch den Kapillardurchmesser begrenzten optischen Weglänge für die on-line UV-vis-Detektion.

Um die konzentrationsbezogenen Nachweisgrenzen zu senken, ist es möglich, die Probe innerhalb der Kapillare aufzukonzentrieren. Dabei unterscheidet man zwischen der Anreicherung von ionischen Analyten und Neutralteilchen.

Zur Anreicherung von ionischen Analyten aus wäßrigen Lösungen sind in der Literatur unterschiedliche Techniken beschrieben. Als gut geeignet für den Einsatz in der CZE hat sich die Technik des ”Electro Stacking“ erwiesen<118> ( Abbildung 10 ).

Die Kapillare wird dabei während der Dosierung durch Anlegen einer Druckdifferenz mit der Probenlösung überladen. Es ist theoretisch möglich, die gesamte Kapillare mit der zu analysierenden Lösung zu füllen (A).

Zur Anreicherung (B) von Anionen wird eine Hochspannung (-Vs) mit umgekehrter Polarität angelegt. Die wäßrige Probe hat einen wesentlich höheren elektrischen Widerstand als das


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Elektrolytsystem. Daher ist die elektrische Feldstärke in dem Kapillarbereich, der mit wäßriger Probe gefüllt ist, höher, und die Ionen haben dort entsprechend höhere elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeiten. An der Konzentrationsgrenze zum Elektrolyt werden die Analyte langsamer und reichern sich an, während das Wasser durch den umgekehrten Elektroosmotischen Fluß aus der Kapillare herausgedrückt wird.

Abbildung 10: Schematische Darstellung der Anreicherungstechnik ”Electro Stacking“

Der Strom steigt während dieses Prozesses kontinuierlich an. Hat er ca. 95% des Maximalwertes erreicht, wird mit der Messung begonnen, indem wieder zur normalen Polarität umgeschaltet wird (C). Nun beginnt der Trennprozeß der CZE. Für die Anreicherung von Kationen müssen die Polaritäten entsprechend geändert werden.

Neutrale Substanzen können so nicht angereichert werden. Auch für die Anwendung bei der MEKC ist ”Electro Stacking“ ungeeignet. Wegen der breiten Größenverteilung der Micellen


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kommt es zur Peakverbreiterung beim Anreicherungsprozeß, so daß ein erheblicher Verlust der Auflösung akzeptiert werden muß<119>.

Für die Anreicherung von Neutralteilchen müssen andere Techniken eingesetzt werden. Diese Techniken sind neu und befinden sich noch weitestgehend im Stadium der Entwicklung. Es sind nur wenige Applikationen dazu in der Literatur beschrieben.

Die in dieser Arbeit eingesetzte Anreicherungstechnik für neutrale Analyte basiert auf Veröffentlichungen der Arbeitsgruppe Terabe<120>,<121>,<122>,<123>,<124>,<125> zu diesem Thema und wurde für die Aufgabenstellung der vorliegenden Arbeit entsprechend weiterentwickelt (siehe Kapitel 4.2.4.2 ). Die Anreicherungstechnik wird im folgenden als ”Direktes-MEKC-Stacking“ bezeichnet (Abbildung 11).

Zunächst wird die Probe durch Anlegen eines Druckes auf die Kapillare aufgegeben (A). Ebenso wie beim ”Electro Stacking“ für ionische Spezies wird die Kapillare mit Probenlösung überladen. Vor der Probe wird etwas Wasser dosiert, um eine große Differenz in der Feldstärke zwischen Probe und Elektrolyt zu erzielen. Bei niedrigen pH-Werten sind die Silanolgruppen an der inneren Kapillaroberfläche weitestgehend protoniert, wodurch sich das Zeta-Potential und damit auch der Elektroosmotische Fluß verringert.

Wird nun eine negative Spannung an der Seite der Probenaufgabe angelegt (B), fließt in diesem Fall der EOF in Richtung der Injektionsseite der Kapillare. Die negativ geladenen Micellen sind schneller als der EOF und wandern in Richtung Detektor. Eine Änderung der Polarität der Spannung ist in diesem Fall für die Anreicherung nicht nötig. Der Anreicherungsprozeß ist genauso wie beim ”Electro Stacking“ auf unterschiedliche elektrische Feldstärken zwischen Probenzone und Elektrolyt zurückzuführen.

Während ihrer Verweilzeit innerhalb der micellaren Phase werden die Analyte in Richtung Detektor transportiert, innerhalb der wäßrigen Phase hingegen mit dem EOF in die andere Richtung (C). Die Trennung der Analyte erfolgt durch die unterschiedlichen Aufenthaltswahrscheinlichkeiten der Analyte in der wäßrigen und micellaren Phase des Elektrolyten. Spezies, die mit der micellaren Phase nur wenig wechselwirken, können mit dieser Technik nur schlecht oder gar nicht angereichert werden (s. Kapitel 0 , z.B. Phenol). Die Lösungsmittelmatrix wird mit dem EOF während der Trennung aus der Kapillare herausgespült.


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Abbildung 11: Anreicherungstechnik für neutrale Moleküle


Fußnoten:
<26> Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser, Abwasser, Schlammuntersuchung und Bodenbeschaffenheit, Beuth Verlag Berlin
<27> ISO/TC 190/3/7, DIN ISO 14154, Bestimmung von ausgewählten Chlorphenolen in Böden: Gaschromatographisches Verfahren (1998)
<28> ISO/TC 190/SC 3/WG6 N50, Soil Quality - Determination of Phenols - Gas Chromatographic Method with Flame Ionisation Detection, DIN Berlin (1995)
<29> EU- Direktive 80/778 CEE
<30> Phenolindex: DIN 38709 H-16-3
<31> EPA Method 8040, Phenols (1986)
<32> EPA Test Method, Phenols - Method 604 (1982)
<33> H. Waldmann, ”Die gaschromatographische Bestimmung von Phenolen in Wasser - Entwicklungen in der Normungsarbeit“, GIT Spezial Chromatographie 2 (1993) 58-59
<34> DIN EN 12673, Entwurf - Wassserbeschaffenheit: Gaschromatographische Bestimmung einiger ausgewählter Chlorphenole in Wasser (1997)
<35> DIN 38407-15 (1996): Gemeinsam erfaßbare Stoffgruppen in Wasser (GC-ECD), DIN EN 12673 (1997): Chlorphenole in Wasser (GC-ECD)
<36> D. Puig, D. Barceló, ”Comparison of different sorbent materials for on-line liquid-solid extraction followed by liquid chromatographic determination of priority phenolic compounds in environmental waters“, J. Chromatogr. A 733 (1996) 371-381
<37> M.A. Crespín, E. Ballesteros, M. Gallego, M. Valcárcel, ”Trace enrichment of phenols by on-line solid-phase extraction and gas chromatographic determination“, J. Chromatogr. A 757 (1997) 165-172
<38> G. Schwedt, ”Festphasenextraktion als Probenvorbereitung für die Chromatographie“, Nachr. Chem. Tech. Lab. 44 (1996) Supplement S63-S68
<39> R. Eisert, K. Levsen, ”Festphasenmikroextraktion organischer Spuren aus wäßrigen Umweltproben“, GIT Fachz. Lab. 6 (1996) 582-588
<40> K.D. Buchholz, J. Pawliszyn, ”Optimization of Solid-Phase Microextraction Conditions for Determination of Phenols“, Anal. Chem. 66 (1994) 160-167
<41> V. Lopez-Avila, R. Young, R. Kim, ”Accelerated Extraction of Organic Pollutants Using Microwave Energy“, J. Chromatogr. Sci. 33 (1995) 481-484
<42> E. Pocurull, M. Calull, R.M. Marcé, F. Borrull, ”Determination of phenolic compounds at low µg l-1 levels by various solid-phase extractions followed by liquid chromatography and diode-array detection“, J. Chromatogr. A 719 (1996) 105-112
<43> EPA Methode 600/4-81-055: ”Iterim Methods for the Sampling and Analysis of Priority Pollutants in Sediments and Fish Tissue“
<44> E. Bosch, P. Bou, H. Allemann, M. Rosés, ”Retention of Ionizable Compounds on HPLC. pH Scale in Methanol - Water and pK and pH Values of Buffers“, Anal. Chem. 68 (1996) 3651-3657
<45> X. Li, J.S. Fritz, ”Novel additives for the separation of organic compounds by high-performance liquid chromatography“, J. Chromatogr. A 728 (1996) 235-247
<46> G. Marko-Varga, D. Barceló, ”Liquid Chromatographic Retention and Separation of Phenols and Related Aromatic Compounds on Reversed Phase Columns“, Chromatographia 34 (3/4) (1992) 146-154
<47> C. Baiocchi, M.A. Roggero, D. Giacosa, E. Marengo, ”HPLC Separation and Determination of Complex Mixtures of Phenolic Compounds on Different Stationary Phases. An Efficient General Screening Method for the Presence of Phenols in Water“, J. Chromatogr. Sci. 33 (1995) 338-347
<48> E.R. Brouwer, I. Liska, R.B. Geerdink, P.C.M. Frintrop, W.H. Mulder, H. Lingeman, U.A.T. Brinkman, ”Determination of Polar Pollutants in Water Using an On-Line Liquid Chromatographic Preconcentration System“, Chromatographia 32 (9/10) (1991) 445-452
<49> V. Coquart, M.-C. Hennion, ”Trace-level determination of polar phenolic compounds in aqueous samples by high-performance liquid chromatography and on-line preconcentration on porous graphitic carbon“, J. Chromatogr. 600 (1992) 195-201
<50> J. Czuczwa, C. Leuenberger, J. Tremp, W. Giger, M. Ahel, ”Determination of trace levels of phenol and cresols in rain by contiuous liquid-liquid extraction and high-performance liquid chromatography“, J. Chromatogr. 403 (1987) 233-241
<51> D. Barceló, aus: Environmental Analysis: Techniques, Applications and Quality Assurance, G.A. Marko-Varga, ”Liquid chromatographic determination of phenols and substituted derivatives in water samples“, Elsevier, Amsterdam, London, New York, Tokyo (1993)
<52> D. Puig, D. Barceló, ”Comparative study of on-line solid phase extraction followed by UV and electrochemical detection in liquid chromatography for the determination of priority phenols in river water samples“, Anal. Chim. Acta 311 (1995) 63-69
<53> B. Paterson, C.E. Cowie, P.E. Jackson, ”Determination of phenols in environmental waters using liquid chromatography with electrochemical detection“, J. Chromatogr. A 731 (1996) 95-102
<54> J. Ruana, I. Urbe, F. Borrull, ”Determination of phenols at the ng/l level in drinking and river waters by liquid chromatography with UV and electrochemical detection“, J. Chromatogr. A 655 (1993) 217-226
<55> R. Salzer, U. Mayer, W. Engewald, T. Welsch, J. Dib, ”Direkte HPLC-FTIR-Kopplung zur Identifizierung von Phenolderivaten“, Z. Chem. 29 (6) (1989) 215-216
<56> T.C. Schmidt, M. Petersmann, L. Kaminski, E. von Löw, G. Stork, ”Analysis of aminobenzoic acids in waste water from a former ammunition plant with HPLC and combined diode array and fluorescence detection“, Fresenius J. Anal. Chem. 357 (1997) 121-126
<57> W.M.A. Niessen, J. van der Greef, ”Liquid Chromatography - Mass Spectrometry“, Chromatographic Science Series Volume 58, Marcel Dekker, Inc., New York, Basel, Hong Kong (1992)
<58> M. Linscheid, ”Die Kopplung von Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie“, CLB 41 (1990) 125-133
<59> K. Levsen, ”Mass Spectrometry in Environmental Organic Analysis“, Org. Mass Spectrom. 23 (1988) 406-415
<60> J.F. Garcia, D. Barceló, ”An Overview of LC-MS Interfacing Systems with Selected Applications“, HRC 16 (1993) 633-641
<61> P. Kebarle, L. Tang, ”From Ions in Solution to Ions in the Gas Phase - The Mechanism of Electrospray Mass Spectrometry“, Anal. Chem. 65 (1993) 972A-986A
<62> A. Preiß, U. Levin, L Wennrich, M. Findeisen, J. Efer, ”Analysis of nitrophenols and other nitroaromatic compounds in ammunition wastewater by high-field proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR) spectroscopy and chromatographic methods“, Fresenius J. Anal. Chem. 357 (1997) 676-683
<63> A. Preiß, K. Levsen, E. Humpfer, M. Spraul, ”Application of high-field proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR) spectroscopy for the analysis of explosives and related compounds in groundwater samples - a comparison with the high-performance liquid chromatography (HPLC) method“, Fresenius J. Anal. Chem. 356 (1996) 445-451
<64> H.C. Dorn, ”1H-NMR: A New Detector for Liquid Chromatography“, Anal. Chem. 56 (1984) 747A-758A
<65> E. Bayer, K. Albert, M. Nieder, E. Gromm, T. Keller, ”On-Line Coupling of High-Performance Liquid Chromatography and Nuclear Magnetic Resonance“, J. Chromatogr. 186 (1979) 497-507
<66> S.A. Korhammer, A. Bernreuther, ”Hyphenation of high-performance liquid chromatography (HPLC) and other chromatographic techniques (SFC, GPC, GC, CE) with nuclear magnetic resonance (NMR): A review“, Fresenius J. Anal. Chem. 354 (1996) 131-135
<67> U.G. Sidelmann, A.W. Nicholls, P.E. Meadows, J.W. Gilbert, J.C. Lindon, I.D. Wilson, J.K. Nicholson, ”High performance liquid chromatography directly coupled to 19F and 1H NMR for the analysis of mixtures of isomeric ester glucuronide conjugates of trifluoromethylbenzoic acids“, J. Chromatogr. A 728 (1996) 377-385
<68> M. Spraul, M. Hofmann, P. Dvortsak, J.K. Nicholson, I.D. Wilson, ”High-Performance Liquid Chromatography Coupled to High-Field Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: Application to the Urinary Metabolites of Ibuprofen“, Anal. Chem. 65 (1993) 327-330
<69> J.C. Lindon, J.K. Nicholson, I.D. Wilson, ”Advances in Chromatography“, Marcel Dekker, New York (1996) 315-382
<70>
<71> M. Godejohann, A. Preiss, C. Mügge, ”Quantitative Messurements in Continuous-Flow HPLC/NMR“, Anal. Chem. 70 (1998) 590-595
<72> M. Godejohann, Dissertation: ”Der Einsatz der HPLC-1H-NMR in der Umweltanalytik“, Cuvillier Verlag, Göttingen (1997)
<73> K. Levsen, P. Mußmann, E. Berger-Preiß, A. Preiß, D. Volmer, G. Wünsch, ”Analysis of Nitroaromatics and Nitramines in Ammunition Waste Water and in Aqueous Samples from Former Ammunition Plants and Other Military Sites“, Acta hydrochim. hydrobiol. 21 (1993) 153-166
<74> A. Besner, R. Gilbert, P. Tétreault, L. Lépine, J.-F. Archambault, ”Determination of Pentachlorophenol and Its Hydrocarbon Solvent in Wood, Soil, and Water by Gas Chromatography and FT-IR Spectroscopy in a Single-Sample Treatment“, Anal. Chem. 67 (1995) 442-446
<75> K.D. Buchholz, J. Pawliszyn, ”Determination of Phenols by Solid-Phase Microextraction and Gas Chromatographic Analysis“, Environ. Sci. Technol. 27 (1993) 2844-2848
<76> M.I. Turnes, I. Rodriguez, M.C. Mejuto, R. Cela, ”Determination of chlorophenols in drinking water samples at the subnanogram per millilitre level by gas chromatography with atomic emission detection“, J. Chromatogr. A 683 (1994) 21-29
<77> C. Minero, M. Vincenti, S. Lago, E. Pelizzetti, ”Determination of trace amounts of high hydrophilic compounds in water by direct derivatization and gas chromatography - mass spectrometry“, Fresenius J. Anal. Chem. 350 (1994) 403-409
<78> W.M. Shackelford, J.M. McGuire, ”Analysis of Extractable Priority Pollutants in Water by GC/MS“, Spectra 10(4) (1986) 17-21
<79> P. Mußmann, K. Levsen, W. Radeck, ”Gas-chromatographic determination of phenols in aqueous samples after solid phase extraction“, Fresenius J. Anal. Chem. 348 (1994) 654-659
<80> M.I. Turnes, I. Rodriguez, C.M. Garcia, R. Cela, ”Determination of chlorophenols in drinking water with high resolution gas chromatography - tandem mass spectrometry“, J. Chromatogr. A 743 (1996) 283-292
<81> R. Weinberger, ”Practical Capillarelektrophoresis“, Academic Press, Inc., Boston, San Diego, New York, London, Sydney, Tokyo, Toronto (1993)
<82> J.W. Jorgenson, K. DeArman Lukacs, ”Zone Electrophoresis in Open-Tubular Glass Capillaries“, Anal. Chem. 53 (1981) 1298-1302
<83> O. Vesterberg, ”History of Electrophoretic Methods“, J. Chromatogr. 480 (1989) 3-19
<84> F. Kohlrausch, ”Ueber Concentrations-Verschiebungen durch Electrolyse im Inneren von Lösungen und Lösungsgemischen“, Ann. d. Phys. u. Chem. N.F. 62 (1897) 209-239
<85> A. Tiselius, ”A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures“, Trans. Faraday Soc. 33 (1937) 524-531
<86> S. Hjertén, ”Free Zone Electrophoresis“, Chromatogr. Rev. 9 (1967) 122-219
<87> R. Virtanen, ”Zone electrophoresis in a narrow-bore tube employing potentiometric detection“, Acta Polytech. Scand. 123 (1974) 1-67
<88> F.E.P. Mikkers, F.M. Everaerts, Th.P.E.M. Verheggen, ”High-Performance Zone Electrophoresis“, J. Chromatogr. 169 (1979) 11-20
<89> Y. Walbroehl, J.W. Jorgenson, ”On-Column UV Absorption Detector for Open Tubular Capillary Zone Electrophoresis“, J. Chromatogr. 315 (1984) 135-143
<90> E. Gassmann, J.E. Kuo, R.N. Zare, ”Electrokinetic Separation of Chiral Compounds“, Science 230 (1985) 813-814
<91> J.A. Olivares, N.T. Nguyen, C.R. Yonker, R.D. Smith, ”On-Line Mass Spectrometric Detection for Capillary Electrophoresis“, Anal. Chem. 59 (1987) 1230-1232
<92> W.G. Kuhr, E.S. Yeung, ”Indirect Fluorescence Detection of Native Amino Acids in Capillary Zone Electrophoresis“, Anal. Chem. 60 (1988) 1832-1834
<93> S. Terabe, K. Otsuka, K. Ichikawa, A. Tsuchiya, T. Ando, ”Electrokinetic Separations with Micellar Solutions and Open-Tubular Capillaries“, Anal. Chem. 56 (1984) 111-113
<94> H. Engelhardt, W. Beck, T. Schmitt, ”Capillary Electrophoresis“, F. Vieweg \|[amp ]\| Sohn Verlagsgesellschaft mbH, Braunschweig, Wiesbaden (1996)
<95> D.M. Goodall S.J. Williams, D.K. Lloyd, ”Quantitative aspects of capillary electrophoresis“, Trends Anal. Chem. 10 (1991) 272-279
<96> W. Kleiböhmer, K. Cammann, J. Robert, E. Mussenbrock, ”Determination of explosives residues in soils by micellar electrokinetic capillary chromatography and high-performance liquid chromatography - A comparative study“, J. Chromatogr. 638 (1993) 349-356
<97> Y.F. Yik, C.L. Ng, C.P. Ong, S.B. Khoo, H.K. Lee, S.F.Y Li, ”Analysis of Environmental Pollutants Using High Performance Capillary Electrophoresis“, Bull. Singapore Natl. Inst. Chem. 18 (1990) 91-100
<98> W.C. Brumley, Environmental Applications of Capillary Electrophoresis for Organic Pollutant Determination“, LCGC 13 (7) (1995) 556-568
<99> S.F.Y. Li, ”Capillary Electrophoresis - Principles, Practice and Applications“, Journal of Chromatography Library Vol. 52, Elsevier, Amsterdam, London, New York, Tokyo (1992)
<100> W.C. Brumley, W.J. Jones, ”Comparison of micellar electrokinetic chromatography (MEKC) with capillary gas chromatography in the separation of phenols, anilines and polynuclear aromatics Potential field-screening applications of MEKC“, J. Chromatogr. A 680 (1994) 163-173
<101> H. Süsse, H. Müller, ”Application of the micellar electrokinetic capillary chromatography to the analysis of pesticides“, Fresenius J. Anal. Chem. 352 (1995) 470-473
<102> D.N. Heiger, ”High-Performance Capillary Electrophoresis - An Introduction“, Hewlett Packard GmbH (1992)
<103> D.W. Armstrong, ”Micelles in Separations: A Practical and Theoretical Review“, Sep. Purif. Methods 14 (1985) 213-304
<104> P.G. Muijselaar, K. Otsuka, S. Terabe, ”Micelles as pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography“, J. Chromatogr. A 780 (1997) 41-61
<105> S. Terabe, T. Katsura, Y. Okada, Y. Ishimaha, K. Otsuka, ”Measurement of Thermodynamic Quantities of Micellar Solubilization by Micellar Elektrokinetic Chromatography with Sodium Dodecyl Sulfate“, J. Microcol. Sep. 5 (1993) 23-33
<106> Y. Moroi, ”Micelles - Theoretical and Applied Aspects“, Plenum Press, New York, London (1992)
<107> J.N. Israelachvili, ”Intermolecular and Surface Forces“, Second Edition, Academic Press, London San Diego, New York, Boston, Sydney, Tokyo, Toronto (1992)
<108> P.K. Misra, B.K. Mishra, G.B. Behera, ”Micellization of ionic surfactants in tetrahydrofuran- water and acetonitrile- water mixed- solvent systems“, Colloids Surf. 57 (1991) 1-10
<109> M.G. Khaledi, ”Micelles as separation media in high-performance liquid chromatography and high-performance capillary electrophoresis: overview and perspective“, J. Chromatogr. A 780 (1997) 3-40
<110> J.R. Kirchhoff, J.D. Skelton, Jr., K.T. Brooks, ”Electrochemical and Spectrochemical Measurements in Sodium Dodecyl Sulfate Micellar Solution as a Function of Electrolyte Concentration“, Kapitel 4 in: Electrochemistry in Colloids and Dispersions, Editors: R.A. Mackay, J. Texter, VCH Publishers Inc., New York (1992) 43-53
<111> R.M. Seifar, J.C. Kraak, W.T. Kok, ”Mechanism of Electrokinetic Separations of Hydrophobic Compounds with Sodium Dodecyl Sulfate in Acetonitrile - Water Mixtures“, Anal. Chem. 69 (1997) 2772-2778
<112> J. Texter, F.R. Horch, S. Qutubuddin, E. Dayalan, ”Voltammetric Detection of Micelle Formation“, J. Colloid Interface Sci. 135 (1990) 263-271
<113> J.C. Jacquier, P.L. Desbène, ”Determitation of critical micelle concentration by capillary electrophoresis - Application to oragano-saline electrolytes“, J. Chromatogr. A 743 (1996) 307-314
<114> A. Cifuentes, J.L. Bernal, J.C. Diez-Masa, ”Determination of Critical Micelle Concentration Values Using Capillary Electrophoresis Instrumentation“, Anal. Chem. 69 (1997) 4271-4274
<115> K. Shinoda, T. Nakagawa, B.-I. Tamamushi, T. Isemura, ”Colloidal Surfactants - Some Physicochemical Properties“, Academic Press, New York, London (1963)
<116> D. Danino, Y. Talmon, R. Zana, ”Alkanediyl-alpha,omega- bis (dimethylalkylammonium bromide) Surfactants (Dimeric Surfactants). 5. Aggregation and Microstructure in Aqueous Solutions“, J. Chromatogr. A 780 (1997) 41-61
<117> Lauda- Tensiometer - Betriebsanleitung und Anwendungen, Dr. R. Wobser GmbH \|[amp ]\| Co. KG, Lauda- Königshofen
<118> R.-L. Chien, D.S. Burgi, ”On-column Sample Concentration Using Field Amplification in CZE“, Anal. Chem. 64 (1992) 489A-496A
<119> C. Lüders, ”Möglichkeiten und Grenzen der Kapillarelektrophorese bei der Analytik von Phenolen und Tensiden“, Diplomarbeit, Marburg/ Lahn (1996)
<120> J.P. Quirino, S. Terabe, K. Otsuka, J.B. Vincent, G. Vigh, ”Sample concentration by sample stacking and sweeping using a microemulsion and a single- isomer sulfated beta- cyclodextrin as pseudostationary phases in electrokinetic chromatography“, J. Chromatogr. A 838 (1999) 3-10
<121> J.P. Quirino, S Terabe, ”On-line concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatography V. Field-enhanced sample injection with reverse migrating micelles“, Anal. Chem. 70 (1998) 1893-1901
<122> J.P. Quirino, S Terabe, ”On-line concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatography IV. Field-enhanced sample injection“, J. Chromatogr. A 798 (1998) 251-257
<123> J.P. Quirino, S Terabe, ”On-line concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatography II. Reversed electrode polarity stacking mode“, J. Chromatogr. A 791 (1997) 255-267
<124> J.P. Quirino, S. Terabe, ”On-line concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatography - I. Normal stacking mode“, J. Chromatogr. A 781 (1997) 119-128
<125> J.P. Quirino, S. Terabe, ”On-Line Concentration of Neutral Analytes for Micellar Electrokinetic Chromatography. 3. Stacking with Reverse Migrating Micelles“, Anal. Chem. 70 (1998) 149-157


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