Lüders, Christian: Entwicklung von Analysenverfahren und Referenzmaterialien für die Bestimmung von Phenolen in umweltrelevanten Matrices

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Kapitel 4. Entwicklung neuer Analysenverfahren für die Phenolanalytik

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Optimierung von Analysenverfahren für die Phenolanalytik, die sowohl zur Screening- als auch zur quantitativen Analyse eingesetzt werden können, sowie als Standard- und Referenzverfahren zur Herstellung und Zertifizierung von natürlichen Matrix-Referenzmaterialien genutzt werden sollen. Der Schwerpunkt lag dabei auf der Entwicklung spezifischer und unabhängiger Trenn- und Nachweistechniken für eine breite phenolische Substanzpalette. Die Validierung und der Vergleich der Analysenverfahren setzen Gemische bekannter Zusammensetzung und genau definierter Konzentration voraus. Diese können weder aus realen noch aus synthetisch hergestellten Matrixproben (siehe Kapitel 5) gewonnen werden. Die Extraktionstechniken standen daher nicht im Mittelpunkt der Untersuchungen, wurden aber an ausgewählten realen Matrixproben bezüglich ihrer Eignung für die Kombination mit den entwickelten Analysentechniken überprüft.

Für die Validierung und den Vergleich der Analysenverfahren wurden für diese Arbeit verschiedene Modellgemische hergestellt, die typische Vertreter der Alkyl-, Nitro- und Chlorphenole enthalten. Bei der Auswahl dieser Substanzen wurden folgende Gesichtspunkte berücksichtigt:

Zur Bewertung der Leistungsfähigkeit und für den Vergleich der neu entwickelten Verfahren sind in dieser Arbeit Verfahrenskenndaten wie Bestimmungsgrenzen, Selektivität, Meßunsicherheit der Analysendaten und Zeitaufwand ermittelt worden.


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Besonders geeignet für die Analytik von Phenolen zeigte sich das auf der Basis der Kapillarelektrophorese entwickelte Verfahren, das durch einen Ringversuch abgesichert werden konnte.

4.1. Extraktionstechniken

Für die Abtrennung der Analyte aus komplexen flüssigen und festen Umweltmatrices<126> stehen verschiedene Extraktionstechniken zur Verfügung (siehe Kapitel 3.1 ).

Zur Extraktion aus wäßrigen Proben wurden in der vorliegenden Arbeit die Flüssig-Flüssig-Extraktion und die Festphasenextraktion (SPE) eingesetzt. Aus festen Matrices wurden die Analyte mit der Beschleunigten Lösemittelextraktion (ASE, © Firma Dionex) abgetrennt.

Die Extraktion von phenolischen Verbindungen ist wegen ihrer unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften oft problematisch. Die polaren Substanzen sind aus ihrer Matrix nur schwer zu entfernen. Die vollständige Abtrennung von Substanzen aus flüssiger Matrix setzt unterschiedliche Verteilungskoeffizienten in der Matrix und dem Extraktionsmittel voraus. In festen Matrices können sich Phenole über polare funktionelle Gruppen an die Matrix anlagern, so daß die Extraktion erschwert wird, besonders für humoses Bodenmaterial.

4.1.1. Flüssig-Flüssig-Extraktion

Im Rahmen von Ringversuchsmessungen (15. VGS-Ringversuch, April 1997) wurden drei Phenole aus synthetischen Abwasserproben mit der Flüssig-Flüssig-Extraktion extrahiert. Dabei wurde in Anlehnung an eine DIN-Vorschrift35 (DIN 38407 F15) Pentachlorphenol, 2,4,6-Trichlorphenol und 2,6-Dichlorphenol durch Ausschütteln mit n-Hexan in einem Scheidetrichter extrahiert. Es wurden 250 mL Probe (pH = 4) drei mal mit je 8 mL n-Hexan extrahiert. Die organischen Phasen wurden in einem Maßkolben vereinigt und auf 25 mL mit n-Hexan aufgefüllt. Die Analyse erfolgte mit GC/MS nach Derivatisierung mit MSTFA (siehe Kapitel 4.2.3). Es zeigte sich, daß die Extraktionsausbeuten wegen unterschiedlicher Löslichkeiten der drei Substanzen zwischen Lösungsmittelmatrix und Extraktionsmittel sehr verschieden sind. So konnte PCP vollständig extrahiert werden, während bei 2,4-DMP nur Wiederfindungsraten unter 30% gefunden wurden (siehe Tabelle 2).


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Tabelle 2: Wiederfindungsraten der Flüssig-Flüssig-Extraktion

Analyt

Wiederfindungsrate /%

PCP

120

2,4-DMP

26

2,4,6-TCP

94

Daher wurde die Probe mit einer definierten Menge isotopenmarkierter Verbindungen der Analyte versetzt (13C6-PCP, 2,4-DMP-ring-d3, 2,4,6-TCP-ring-d2). Während der Extraktion verhalten sich die nicht markierten und die isotopenmarkierten Analyte gleich, so daß bei der quantitativen Analytik Wiederfindungsraten keinen entscheidenden Einfluß haben. Sind die Wiederfindungsraten jedoch sehr gering, wird die Unsicherheit durch die größere Streuung der Analysenergebnisse zu hoch. Bei Einsatz von isotopenmarkierten Standards kann die Flüssig-Flüssig-Extraktion als zuverlässiges Verfahren in der Phenolanalytik eingesetzt werden. Nachteilig sind jedoch der hohe Lösungsmittelverbrauch und die hohen Kosten für die isotopenmarkierten Verbindungen.

4.1.2. Festphasenextraktion

Die Festphasenextraktion (SPE) wird zur Trennung und Anreicherung<127> von Phenolen<128> aus flüssiger Matrix<129>,<130> eingesetzt. Untersuchungen an unterschiedlichen Trägermaterialien<131>,<132> haben ergeben, daß für jeden Analyt Wiederfindungsraten und Durchbruchszeiten bestimmt werden müssen. Die Analyte werden als neutrale Spezies aus der Matrix entfernt, um adsorptive Effekte zwischen der Matrix und den Analyten zu minimieren (pH-Wert des Extraktionsmittels je nach Analysentechnik ca. 2-4). Da die unterschiedlichen Stoffgruppen der Phenole sich in diesen Parametern stark unterscheiden, ist hier ebenso wie bei der Flüssig-Flüssig-Extraktion der Einsatz von isotopenmarkierten Standards anzuraten.

Teilweise werden phenolische Verbindungen mit Matrixbestandteilen ähnlicher physikochemischer Eigenschaften extrahiert. Aus demselben Grund werden die Phenole auf dem SPE Material gleichzeitig mit den Matrixkomponenten angereichert und wieder eluiert. Bei der Analyse der Proben sind die Analytsignale oft mit Signalen von Matrixkomponenten überlagert.

Ziel der Analytik von flüssigen Matrixproben sollte daher die direkte Analyse der Proben sein. So kann auf die stark fehlerbehaftete Bestimmung von Wiederfindungsraten und Durchbruchszeiten verzichtet werden.


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4.1.3. Beschleunigte Lösemittelextraktion

Die Beschleunigte Lösemittelextraktion (ASE) ist mittlerweile als effiziente Heißextraktionstechnik neben der Soxhletextraktion für feste Matrices anerkannt43.

Die ASE hat gegenüber der Soxhletextraktion den Vorteil, auch bei geringem Lösungsmittelverbrauch und schnellen Bearbeitungszeiten hohe Extraktionsausbeuten zu liefern.

Bei den erhöhten Druck- und Temperaturwerten (140 bar, 100 bis 140°C) während der Extraktion haben die Lösungsmittel andere Eigenschaften, die sich vorteilhaft nutzen lassen. Beispielsweise gelingt die Extraktion relativ polarer Phenole aus Bodenproben mit dem unpolaren Lösungsmittel n-Hexan, da sich die Verteilungskoeffizienten der Analyte bei den Extraktionsbedingungen gegenüber Soxhlet-Bedingungen ändern. Es ist jedoch darauf zu achten, daß thermolabile Analyte bei den gewählten Extraktionsbedingungen nicht zerstört werden. In diesem Fall muß die Probe mit Ultraschall extrahiert werden (Kaltextraktionsverfahren).

Bei der Soxhletextraktion müssen Lösungsmittelgemische aus n-Hexan und Aceton verwendet werden, um die Phenole quantitativ aus ihrer Matrix zu entfernen. Dadurch erhöht sich die Menge der mitextrahierten Matrixkomponenten drastisch.

Die Extraktion polarer Analyte aus Bodenproben mit der ASE muß für jede Matrix neu überprüft und optimiert werden. Bei humosen Bodenproben ist es möglich, daß die Extraktion mit n-Hexan aufgrund von Adsorption der Analyte an die Matrix nicht mehr ausreichend ist und zu polareren Extraktionsmitteln gewechselt werden muß. Bei den untersuchten Bodenproben wurde durch doppelte Nachextraktion der Proben gewährleistet, daß die Extraktionsausbeuten über 95% lagen.

Anhand von Holzproben, die mit PCP und anderen Holzschutzmittelwirkstoffen belastet waren, sind Extraktionsergebnisse von ASE und Soxhlet mit einander verglichen worden. Für die Mehrzahl der Substanzen liefert die ASE höhere Extraktionsausbeuten als die Soxhletextraktion. Das ist vor allem auf das bessere Eindringvermögen des Extraktionsmittels in die Holzmatrix unter ASE-Bedingungen zurückzuführen.

Die ASE ist in der Lage, eine Probe von ca. 10 g innerhalb von 30 min mit ca. 40 mL Lösungsmittel zu extrahieren. Mit der Soxhlet-Technik werden dazu mindestens 500 mL Lösungsmittel und eine Bearbeitungszeit von ca. 24 Stunden benötigt.


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4.2. Instrumentelle Analysenverfahren

Verschiedene qualitative und quantitative Anforderungen an die Analytik von phenolischen Verbindungen sowie die große Bandbreite der Stoffeigenschaften und Lösungsmittelmatrices der Analyte erfordern die Entwicklung von unterschiedlichen Analysenverfahren. In der vorliegenden Arbeit wurden die instrumentellen Techniken der HPLC-MS, HPLC-NMR, GC-MS und CE für die Entwicklung von Analysenverfahren für die Bestimmung von Phenolen in umweltrelevanten Matrices eingesetzt.

Auf dem Gebiet der HPLC-MS sind die Techniken der ”Electrospray Ionization“ (ESI) und ”Atmospheric Pressure Chemical Ionization“ (APCI) für die Untersuchung von Phenol-Modellgemischen in hydrophilen und hydrophoben Lösungsmitteln eingesetzt worden. Für die HPLC-NMR Kopplung wurden Verfahrenskenngrößen ermittelt sowie Möglichkeiten und Grenzen der Strukturaufklärung für die Phenolanalytik untersucht. Mit den besonders empfindlichen Techniken der GC-LR- und GC-HR-Massenspektrometrie wurden Analysenverfahren für hydrophobe Matrices entwickelt und validiert<133> (Bestimmung von Verfahrenskenngrößen und -unsicherheit). Es wurden kapillarelektrophoretische Trennverfahren für die Analytik von Phenolen in hydrophiler Matrix entwickelt. Das Verfahren der ”Direkten-MEKC-Stacking“-Technik wurde wegen seiner besonderen Eignung ebenfalls validiert.

Aus dem Vergleich der Analysenverfahren ergibt sich die Einsatzfähigkeit als Standard- oder Referenzverfahren.

4.2.1. HPLC-MS

Für die Analytik von Phenolen sind die APCI- und ESI-Techniken bisher noch nicht universell einsetzbar gewesen, da die Substanzen wegen ihrer verschiedenartigen physikochemischen Eigenschaften nicht alle erfolgreich ionisiert bzw. detektiert wurden (siehe Kapitel 0 ). Bisher gelang nur die Analyse der relativ polaren bzw. aciden Chlor- und Nitrophenole. Die unpolaren und wenig aciden Substanzen wie Alkylphenole konnten bisher mit den API-Techniken nicht gemessen werden<134>. Daher wurde untersucht, ob sich durch Wahl geeigneter Meßparameter auch die bisher nicht detektierten Substanzen ionisieren lassen.


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In dieser Arbeit wurde eine modulare HPLC-Apparatur der Firma Gynkotek eingesetzt (Gynkotek HPLC-System mit Niederdruck-Gradientenpumpe (Model 480) und Autosampler (CTC Analytics Liquid Sampler A200SE)). Die HPLC wurde an ein hochauflösendes, doppelfokussierendes Sektorfeld-Massenspektrometer der Firma Finnigan (MAT 95), über ein API-Interface (API II) gekoppelt. Das Interface wurde im APCI- und ESI-Modus betrieben.

4.2.1.1. HPLC-ESI-MS

Die ”Electrospray Ionization“- (ESI-) MS wird vorwiegend zur Analyse ionischer bzw. stark polarer Verbindungen eingesetzt (siehe Kapitel 0 ). Phenolische Substanzen liegen in Lösung je nach pH-Wert der Matrix entweder als neutrale Spezies oder als Ionen vor.

Mit der HPLC werden phenolische Verbindungen üblicherweise mit Eluenten im sauren bis neutralen pH-Bereich getrennt. Bei pH-Werten kleiner 9 liegen nur Substanzen mit einem niedrigen pKs-Wert wie Chlor- und Nitrophenole im Laufmittel als Ionen vor. Diese Substanzen lassen sich mit der ESI in das Massenspektrometer überführen und dort als negative Ionen nachweisen (siehe Abbildung 3 ). Verbindungen mit höheren pKs-Werten wie Alkylphenole sind bei diesen pH-Werten undissoziiert und massenspektrometrisch nicht zu erfassen. Bei alkalischen Laufmitteln (wäßrige Natronlauge, 100 mmol/L, pH = 12) liegen jedoch alle untersuchten Substanzen in der deprotonierten Form vor (siehe Tabelle 1) und können mit der ESI nachgewiesen werden.

Die ESI-negativ-Massenspektren der Analyte zeigen alle das gleiche Ionisierungsmuster. Als Beispiel ist in Abbildung 12 das ESI-negativ-Spektrum für 2,6-Dimethylphenol dargestellt. Das Signal für das deprotonierte Molekülion ([M-H]-) ist dabei dominierend. Daneben werden Addukte aus zwei deprotonierten Molekülionen und einem Natriumion ([2[M-H]-+Na+]-) detektiert. Natriumionen sind im Eluenten ubiquitär vorhanden.

Aus den Massenspektren lassen sich demnach nur Informationen über das Molekulargewicht der Phenolverbindung entnehmen. Da keine Fragmentionen auftreten, lassen sich vertiefende Aussagen zur Molekülstruktur des Phenolderivates (Struktur der Alkylketten, Stellungsisomerie) nicht treffen. Dagegen ist über die Erfassung des deprotonierten Molekülions im MID-Modus eine hochselektive und empfindliche Bestimmung der Verbindungen möglich.


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Abbildung 12: ESI-negativ-Massenspektrum für 2,6-Dimethylphenol

Meßparameter: MS: FIA mit wäßriger Natronlauge (100 mmol/L, pH = 12), ESI-negativ-Parameter: Spray-Spannung: 2,8 kV, Temperatur der Transferkapillare: 290°C, Sheath-Gas: 6 bar Luft, Full-Scan-Massenbereich: 100-600 Dalton, Auflösung: 1000, äquivalente Spektren zeigen folgende Substanzen: Phenol, 2-Methylphenol, 3-Methylphenol, 4-Methylphenol, 2-Ethylphenol, 3-Ethylphenol, 4-Ethylphenol, 2,3-Dimethylphenol, 2,4-Dimethylphenol, 2,5-Dimethylphenol, 3,4-Dimethylphenol, 3,5-Dimethylphenol, 2,3,5-Trimethylphenol, 2,3,6-Trimethylphenol, 2,4,6-Trimethylphenol, 3,4,5-Trimethylphenol, 2-Isopropylphenol, 2-Methoxyphenol, 3-Methoxyphenol, 4-Methoxyphenol, 2,6-Dimethoxyphenol, 1-Naphthol, 2-Naphthol, 5-Indanol, 2-Hydroxybiphenyl, 2,2´-Dihydroxydiphenyl, 2-Chlorphenol, 2,4-Dichlorphenol, 2,4,6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, 4-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, 2,4,6-Trinitrophenol, 2,4,6-Trinitrotoluen

Da sich die üblicherweise eingesetzten HPLC-Säulen (z.B. ODS-Material) bei pH-Werten oberhalb von pH = 9 zersetzen und die Säulen so zerstört werden, müssen spezielle Säulen eingesetzt werden, deren stationäre Phase über den gesamten pH-Bereich stabil ist.

Abbildung 13 zeigt das HPLC-UV-vis-Chromatogramm für die Trennung eines Modellgemisches (bestehend aus C1- bis C3-Alkylphenolen sowie verschieden substituierten Nitro- und Chlorphenolen, Zusammensetzung siehe Abbildung 14 ) an einer derartigen pH-stabilen Säule (polymerisiertes Trägermaterial, Firma Astec). Die Messung erfolgte im Gradientenbetrieb mit einem Laufmittel aus wäßriger Natronlauge (100 mmol/L, pH = 12) und Methanol.


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Abbildung 13: UV-vis-Chromatogramm für ein Phenolgemisch, Trennung bei pH = 12

Meßparameter: Gynkotek HPLC-System mit Niederdruck-Gradientenpumpe (Model 480) und Autosampler (CTC Analytics Liquid Sampler A200SE), Probenaufgabe: 7 µL (ca. 30 ng pro Einzelverbindung), Säule: Astec Polymer C18, Abmessungen: 250 x 4,6 mm, 5 µm Porengröße, thermostatisiert auf 40°C, Laufmittelzusammensetzung: 0 bis 10 min isokratisch: 40% Methanol/ 60% wäßrige Natronlauge (100 mmol/L, pH = 12) (v/v), 10 bis 45 min Gradientenbetrieb: bis 100% Methanol, 45 bis 55 min isokratisch: 100% Methanol, Fließgeschwindigkeit: 550 µL/min, UV-vis-Detektion mit DAD, abgebildete UV-Spur: 220 nm

Die Trenneigenschaften der Polymersäule ähneln denen der RP-Säulen. Die Phenolderivate mit polaren Substituenten (Nitro- und Chlorphenole) haben die kürzesten Retentionszeiten, die Alkylphenole werden entsprechend der Anzahl der C-Atome in der Alkylgruppe getrennt. Je mehr C-Atome in der Alkylkette des Analyten sind, desto hydrophober wird er und desto später wird er von der Säule eluiert.

Die Retentionszeiten lassen sich bei diesen Parametern nur schlecht reproduzieren, da sie sich schon bei geringfügigen pH-Wert- Schwankungen ändern, wie sie beispielsweise bei Erneuerung des Eluenten auftreten. Wegen der Eigenschaften des API-Interfaces (lineare Spraygeometrie) ist der Einsatz von stabilisierenden Puffern nicht möglich. Bei Verdampfen des Eluenten kann die Transferkapillare durch Rückstände der Puffersalze verstopft werden.


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Da deshalb keine Puffer für die Optimierung der HPLC-Trennung eingesetzt werden konnten, weisen die Signale ”Tailing“ auf, das ebenso in den Massenchromatogrammen der Analyse zu erkennen ist (siehe Abbildung 14 ). Die Messungen mit der HPLC-ESI-MS erfolgen im negativen Meßmodus.

Abbildung 14: Full-Scan-ESI-negativ-Massenchromatogramm des Phenolgemisches

Meßbedingungen: HPLC: siehe Abbildung 13 , MS: ESI-negativ-Parameter: Spray-Spannung: 2,8 kV, Temperatur der Transferkapillare: 290°C, Sheath-Gas: 6 bar Luft, Full-Scan-Massenbereich: 100-600 Dalton, Auflösung: 1000

Da die Substanzen zuerst den Dioden-Array-Detektor und erst danach das Massenspektrometer passieren, sind die Retentionszeiten des UV-vis-Chromatogramms


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( Abbildung 13 ) und des Full-Scan-ESI-negativ-Massenchromatogramms ( Abbildung 14 ) um einige Sekunden zueinander versetzt. Da es sich um dieselbe Analyse handelt, entsprechen die dosierten Substanzmengen denen aus Abbildung 13 .

In Spur E ( Abbildung 14 ) ist der Totalionenstrom (Summe über den Massenbereich von 100 bis 600 Dalton) der Analyse dargestellt. Der Totalionenstrom ist zu dem UV-vis-Chromatogramm der HPLC-Trennung aus Abbildung 13 äquivalent. Das Signal-/ Rausch-Verhältnis des Totalionenstroms ist etwa um den Faktor 10 kleiner als das des UV-vis-Signals.

Durch Auswahl geeigneter Massenspuren für die Analytionen können die Einzelverbindungen selektiv dargestellt werden. Bei den Chlor- und Nitrophenolen reicht die chromatographische Auflösung der HPLC zur Bestimmung der Einzelverbindungen nicht aus (siehe Abbildung 13 ). Die Selektivität des Massenspektrometers bezüglich der unterschiedlichen Analytmassen erlaubt hingegen die Einzeldarstellung und Bestimmung aller Komponenten (Spur A bis D).

Die Methylphenole werden bei diesem pH-Wert wegen ihrer identischen Nominalmassen jedoch nicht aufgelöst (A). Durch weitere Erhöhung des pH-Wertes können diese Substanzen aber auch chromatographisch getrennt werden.

Obwohl bei der Darstellung der Einzelmassenspuren sich das Signal-/ Rausch-Verhältnis um über eine Größenordnung verbessert, sind die Messungen im Full-Scan-Modus für die meisten analytischen Problemstellungen nicht empfindlich genug. Bei einer Verdünnung des untersuchten Modellgemisches um etwa drei Größenordnungen (auf ca. 1,5 mg/L) liegen die Konzentrationen unterhalb der Nachweisgrenze.

Um die Empfindlichkeit der Messung zu steigern, kann die massenspektrometrische Aufnahme direkt im MID-Modus (”Multiple Ion Detection“) durchgeführt werden. Dabei werden an Stelle des gesamten Massenbereichs (Full-Scan) nur die charakteristischen Massen der Analytionen detektiert (siehe das um etwa drei Größenordnungen verdünnte Modellgemisch in Abbildung 15). Während für die Alkylphenole (Spur A bis C) der Konzentrationsbereich der Nachweisgrenze erreicht ist, können Chlor- und Nitrophenole (Spur D) noch in weit geringerer Konzentration bestimmt werden.

Niedrigere Nachweisgrenzen lassen sich noch durch Erhöhung der dosierten Probenmenge erzielen. Diese Überdosierung kann bei HPLC-Gradientenbetrieb jedoch nur bei Wasserproben eingesetzt werden.


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Abbildung 15: MID-Massenchromatogramm für ausgewählte Substanzen des Phenolgemisches

Meßbedingungen: HPLC: Probenaufgabe: 30 µL (ca. 50 pg pro Einzelverbindung), ansonsten siehe Abbildung 13 , MS: ESI-negativ-Parameter: Spray-Spannung: 2,8 kV, Temperatur der Transferkapillare: 290°C, Sheath-Gas: 6 bar Luft, MID: Massenspuren für die deprotonierten Molekülionen der Verbindungen: 2-Methylphenol, 4-Methylphenol, 4-Ethylphenol, 2,4-Dimethylphenol, 2,6-Dimethylphenol, 2,4,6-Trimethylphenol, 1-Naphthol, 3-Methoxyphenol, 4-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, 2,4-Dichlorphenol, 2,4,6-Trichlorphenol, Auflösung: ca. 3000

4.2.1.2. HPLC-APCI-MS

Die ”Atmospheric Pressure Chemical Ionization“ (APCI, siehe Kapitel 3.2.1.1 und Abbildung 4 ) wird häufiger als die ESI-Technik in der Umweltanalytik eingesetzt. Während es Applikationen für polare und acide Phenole gibt<135>, sind bisher keine für Alkylphenole bekannt<136>,<137>. Phenolische Verbindungen mit acidem Charakter (Chlor- und Nitrophenole) lassen sich mit der APCI im Gegensatz zu den apolaren und nur schwach aciden Alkylphenolen relativ leicht zum Quasimolekülion deprotonieren und massenspektrometrisch erfassen.

Die Ionenausbeute wird wesentlich durch APCI-Parameter wie Temperatur und Volumen der Gasflüsse beeinflußt<138>,<139>.


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Bei niedrigen Temperaturen des Vaporizers (siehe Abbildung 4 ) werden vermehrt Addukte zwischen Analyt und Lösungsmittel oder Molekülen der APCI-Gase gebildet.

In dieser Arbeit wurde untersucht, ob durch systematische Variation der APCI-Parameter auch Alkylphenole ionisiert werden können, und sich mit der HPLC-APCI-MS nachweisen lassen. Daher wurde die Ionenausbeute für ausgewählte Analyte (3-Methylphenol, 4-Nonylphenol, 2-Isopropylphenol), die sich in ihrer Alkylkettenlänge unterscheiden, anhand der Signalintensität (doppelte quantitative Analyse) im gesamten möglichen Temperaturbereich des Vaporizers untersucht.

Wie Abbildung 16 zeigt, lassen sich Alkylphenole bei niedrigen Vaporizertemperaturen unterhalb von 300°C am besten ionisieren. Bei APCI-Messungen wird der Vaporizer sonst üblicherweise bei Temperaturen zwischen 350 und 450°C (substanzabhängig) betrieben.

Abbildung 16: Signalintensitäten für Alkylphenole bei Variation der Vaporizertemperatur

Meßparameter: FIA: Laufmittel: Methanol, Probenaufgabe: 5 µL methanolische Lösung, APCI: Gasflüsse: Sheath-Gas = 2060 mL/min, Aux Gas = 3181 mL/min, Temperatur der Transferkapillare: 210°C, Analyten: 3-Methylphenol: Menge: 7 µg, Massenbereich der Integration: 107,2-107,9+142,1-142,9 Dalton, 2-Isopropylphenol: Menge: 4 µg, Massenbereich der Integration: 135,05-135,3+167,05-167,3 Dalton, 4-Nonylphenol: Menge: 3 µg, Massenbereich der Integration: 218-220 Dalton


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Abbildung 16 zeigt, daß die Signalintensitäten der untersuchten Proben bei diesen Temperaturen im Bereich des Untergrundrauschens liegen. Nur 4-Nonylphenol zeigt bei diesen Temperaturen Signalintensitäten, die deutlich über dem Rauschen liegen. Durch Absenkung der Temperatur bis auf ca. 200°C nimmt die Signalintensität für alle Alkylphenole kontinuierlich bis zu 3 Größenordnungen zu, so daß es möglich ist, sie bei diesen vergleichsweise niedrigen Temperaturen zu detektieren. Die relative Intensitätszunahme ist bei allen untersuchten Substanzen gleich, so daß unterschiedliche Alkylkettenlängen für die Optimierung nicht berücksichtigt werden müssen. Änderungen bei der Temperatur der Transferkapillare zeigen eine ähnliche Wirkung, so daß sie an dieser Stelle nicht graphisch dokumentiert wurden.

Die Gasflüsse der APCI beeinflussen die Signalintensitäten ebenfalls deutlich. In Abbildung 17 sind die systematischen Untersuchungen am Beispiel von 4-Nonylphenol aufgezeigt. Das Eluat wird bei der APCI im Vaporizer durch das Sheath-Gas versprüht (siehe Abbildung 4 ).

Abbildung 17: Signalintensitäten für 4-Nonylphenol bei Variation der Gasflüsse in der APCI

Meßparameter: FIA: Laufmittel: Methanol, Probenaufgabe: 4-Nonylphenol, Menge: 3 µg in methanolischer Lösung, Integrationswerte erhalten durch Doppelbestimmung, Massenbereich der Integration: 218-220 Dalton

Temperatur der Transferkapillare: 210°C, Temperatur des Vaporizers: 190°C, die Werte für die Variation des Sheath-Gases wurden bei Aux-Gas Werten von 3181 mL/min gemessen, die Werte für die Variation des Aux-Gases wurden mit Sheath-Gas Werten von 2060 mL/min detektiert.


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Der Sheath-Gasfluß ist für die Ionenausbeute von geringer Bedeutung. Bereits bei sehr niedrigen Werten von 200 mL/min werden Intensitäten im Bereich des Maximums erreicht. Der Spraystrahl wird durch das Aux-Gas in Richtung Transferkapillare fokussiert. Die Signalintensitäten steigen kontinuierlich mit höheren Aux-Gas Werten an und erreichen bei ca. 3500 mL/min das Maximum. Die in der oben gezeigten Abbildung dargestellten Untersuchungen wurden bei einer Vaporizertemperatur von 190°C und optimierten Gasflüssen im APCI-Interface durchgeführt. Wie weitere Messungen zeigten, ist bei anderen Temperaturen und Gasflüssen diese Tendenz der Intensitätszunahme gleichbleibend. Die Untersuchung der Ionenbildungsprozesse liefert einige Hinweise für die ungewöhnlichen APCI-Parameter, bei denen Alkylphenole detektiert werden können.

Abbildung 18 zeigt das APCI-Massenspektrum von 2,6-Dimethylphenol bei negativer Ionisierung. Das [M-H]--Quasimolekülion ist in dem Spektrum dominierend.

Abbildung 18: APCI-negativ-Massenspektrum von 2,6-Dimethylphenol

Meßparameter: MS: FIA mit Methanol, APCI-negativ-Parameter: Temperatur des Vaporizers: 190°C, Temperatur der Transferkapillare: 210°C, Sheath-Gas: ca. 300 mL/min, Aux-Gas: ca. 3500 mL/min, Full-Scan-Massenbereich: 80-300 Dalton, Auflösung: 1000, äquivalente Spektren zeigen folgende Substanzen: Phenol, 2-Methylphenol, 3-Methylphenol, 4-Methylphenol, 2-Ethylphenol, 3-Ethylphenol, 4-Ethylphenol, 2,3-Dimethylphenol, 2,4-Dimethylphenol, 2,5-Dimethylphenol, 3,4-Dimethylphenol, 3,5-Dimethylphenol, 2,3,5-Trimethylphenol, 2,3,6-Trimethylphenol, 2,4,6-Trimethylphenol, 3,4,5-Trimethylphenol, 2-Isopropylphenol, 2-Methoxyphenol, 3-Methoxyphenol, 4-Methoxyphenol, 2,6-Dimethoxyphenol, 1-Naphthol, 2-Naphthol, 5-Indanol, 2-Hydroxybiphenyl, 2,2´-Dihydroxydiphenyl, 2,4-Di-tert.-butylphenol, 2,4,6-Tri-tert.-butylphenol, 4-Nonylphenol


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Neben dem deprotonierten Molekülion werden Signale für negativ geladene Adduktionen aus Analyt plus Lösungsmittelmolekül (in diesem Fall Methanol) oder Analyt plus Sauerstoffmolekül (aus den APCI-Gasen, eventuell ein Oxidationsprodukt) detektiert (Masse: 154 Dalton). Durch hochauflösende Messungen wurde die Zuordnung dieser Ionen bestätigt. Eine Änderung der Laufmittelzusammensetzung hat keinen Einfluß auf die Spektren. Die Intensität der Signale für die Adduktionen ist stark von den Gasflüssen und den Temperaturparametern des Vaporizers und der Transferkapillare abhängig.

Zum Ionenbildungsmechanismus wurden MS-MS Experimente durchgeführt. In Abbildung 19 ist das Tochterspektrum (Massenspektrum, aus dem hervorgeht, welche Fragmentionen -Tochterionen- aus welchen Primärionen -Mutterionen- gebildet werden) für die Ionen der Masse 154 Dalton von 2,6-Dimethylphenol dargestellt.

Abbildung 19: Tochterspektrum für die Ionen der Masse 154 Dalton von 2,6-Dimethylphenol

Meßparameter: MS: FIA mit Methanol, APCI-negativ-Parameter: Temperatur des Vaporizers: 190°C, Temperatur der Transferkapillare: 210°C, Sheath-Gas: ca. 300 mL/min, Aux-Gas: ca. 3500 mL/min, Full-Scan-Massenbereich: 90-300 Dalton, Auflösung: 1000, MS-MS-Parameter: linked-scan, 1. feldfreier Raum, collision activated, Stoßgas: Luft


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Abbildung 19 verdeutlicht, daß im ersten feldfreien Raum das deprotonierte Molekülion (Tochterion) aus den Ionen der Masse 154 (Mutterion) gebildet wird. Dieser Prozeß findet vermutlich im Massenspektrometer auf der gesamten Wegstrecke zwischen Ionenquelle und Detektor statt. Für hohe Intensitäten der Alkylphenole ist daher die Bildung der Adduktionen (Addukt-Precursor-Ionen) im Vaporizer und deren Transport in den Detektionsbereich des Massenspektrometers erforderlich.

Die Adduktionen entstehen bevorzugt bei den vergleichsweise niedrigen Temperaturen des Vaporizers (190°C). Das Eluat wird im Vaporizer durch das Sheath-Gas leicht versprüht. Hohe Sheath-Gasflüsse erhöhen die Ionenausbeute nicht.

Der Transport und die Fokussierung der Analyte in Richtung Transferkapillare wird hauptsächlich durch das Aux-Gas beeinflußt. Bei höheren Aux-Gasflüssen werden die Adduktionen schärfer auf die Transferkapillare fokussiert, so daß eine hohe Anzahl den Detektionsbereich des Massenspektrometers erreicht. Die Signalintensitäten der Alkylphenole nehmen deshalb zu höheren Aux-Gas-Werten hin zu.

Für die HPLC-APCI-MS Kopplung können neben Eluenten für die Umkehrphasen-Chromatographie (Methanol, Acetonitril und Wasser) auch hydrophobe Eluenten für die Normalphasen-Chromatographie (z.B. n-Hexan) verwendet werden. Auch mit diesem Lösungsmittel gelingt die Ionisierung der Analyte in der APCI. Für die Zusammensetzung der Eluenten gelten jedoch die gleichen Einschränkungen wie für die Kopplung zur ESI, so daß keine Puffer verwendet werden können (Salzfracht, vgl. Kapitel 0 ).

Da die Ionisation der phenolischen Verbindungen sowohl in Eluenten für Normal- als auch für Umkehrphasen-Chromatographie gelang, wurden Trenntechniken für beide chromatographische Systeme entwickelt, um die unterschiedlichen Trenneigenschaften und Vorteile beider Techniken auszunutzen, sowie Extrakte aus unterschiedlichen Probenvorbereitungstechniken (hydrophile und hydrophobe Lösungsmittel) direkt analysieren zu können. Liegen die Analyte beispielsweise in einer hydrophoben Matrix vor (z.B. organische Phase der Flüssig-Flüssig-Extraktion mit n-Hexan aus der Matrix Wasser), sind sie direkt für die HPLC-MS über eine Normalphasentrennung zugänglich und müssen nicht erst in eine polare Matrix wie Methanol überführt werden, um dann mit Umkehrphasen-Chromatographie getrennt zu werden. Die Umkehrphasen-Chromatographie kann für alle polaren Lösungsmittel (insbesondere Wasser) eingesetzt werden. Daher werden


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auch die meisten Trennungen in der Umweltanalytik auf RP-Säulen durchgeführt. Die Trennungen in den HPLC-Systemen wurden mit verschiedenen Säulen bezüglich Retentionszeiten, Auflösung, Eluent-Zusammensetzung und Gradient angepaßt.

Abbildung 20: Full-Scan-Massenchromatogramm eines Phenolgemisches nach Normalphasentrennung

Meßparameter: Gynkotek HPLC-System mit Niederdruck-Gradientenpumpe (Model 480) und Autosampler (CTC Analytics Liquid Sampler A200SE), Probenaufgabe: 7 µL (ca. 30 ng pro Einzelverbindung), Säule: Gynkotek Hypersil CPS, Abmessungen: 135 x 2 mm incl. Vorsäule, 5 µm Porengröße, thermostatisiert auf 25°C, Laufmittelzusammensetzung: 0 bis 8 min isokratisch: 100% n-Hexan, 8 bis 25 min Gradientenbetrieb: bis 3% Isopropanol/ 97% n-Hexan (v/v), 25 bis 35 min isokratisch bei diesen Bedingungen, Fließgeschwindigkeit: 450 µL/min, MS: APCI-negativ-Parameter: siehe: Abbildung 19


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In Abbildung 20 ist ein HPLC-APCI- Full-Scan-Massenchromatogramm (Massenbereich 100 bis 600 Dalton) für ein Phenolgemisch nach Trennung mit einer Normalphasen-Säule (Eluent: n-Hexan/ Isopropanol) dargestellt. Bei der dosierten Substanzmenge von 30 ng je Einzelverbindung ist im Totalionenstrom (Spur F) keine Differenzierung der Analyte möglich. Durch Auswahl der Massenspuren für die deprotonierten Molekülionen (Spuren A bis E) können die Einzelverbindungen jedoch selektiv dargestellt und quantifiziert werden. Die Selektivität des Massenspektrometers bezüglich der unterschiedlichen Analytmassen erlaubt oft auch die Bestimmung ungetrennter Komponenten.

Wegen der unterschiedlichen Selektivität der Normalphasen-Säule im Vergleich zu Umkehrphasen-Säulen ändern sich die Retentionszeiten der Analyten. Bei der Normalphasen-Chromatographie eluieren Alkylphenole mit höherer Anzahl an C-Atomen in den Alkylketten und entsprechend hohem lipophilen Anteil (z.B. C3-Alkylphenole - Spur D) vor weniger lipophilen Verbindungen (C2- und C1-Alkylphenole - Spuren A und B). Bei der RP-Chromatographie ist die Reihenfolge genau entgegengesetzt. Sterische Effekte der Molekülgeometrie beeinflussen bei der Normalphasentrennung in weit stärkerem Umfang die Retention als bei RP-Chromatographie. Aufgrund der beiden tert.-Butylgruppen hat 2,4-Di-tert.-butylphenol als C8-Alkylphenol eine längere Retentionszeit als alle anderen dargestellten Verbindungen.

Bei der RP-Chromatographie erfolgt die Trennung der Alkylphenole im Vergleich zur Normalphasen-Chromatographie mit umgekehrter Retentionsreihenfolge (vgl. Polymersäule, Abbildung 14 ).

Um die Empfindlichkeit der massenspektrometrischen Bestimmung zu steigern, kann im MID-Modus gearbeitet werden. Bei realen Matrixproben ist die Konzentration an Alkylphenolen oft so gering, daß im Full-Scan-Modus keine Quantifizierung möglich ist.

Dafür ist als Beispiel die HPLC-APCI-MS-Analyse einer Realprobe (Bodenprobe von einem Standort der petrochemischen Industrie) nach Umkehrphasentrennung (MID-Massenchromatogramm, in Abbildung 21 ) dargestellt.

Bei diesem Methanolextrakt ist eine Überdosierung wie bei Wasserproben aufgrund des Lösungsmittels und der mitextrahierten organischen Matrixbestandteile nicht möglich. Die Alkylphenole aus dem Extrakt einer Bodenprobe wurden entsprechend ihrer Hydrophobizität getrennt.


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Die relativ hydrophilen Alkylphenole (Spur A) eluieren vor den anderen hydrophoberen Substanzen (Spur B und C). Die Konzentration der Methylphenole (Spur A) liegt im Bereich der Nachweisgrenze, während die C2- und C3- Alkylphenole den Hauptanteil der Phenolkontamination des Bodens bilden.

Abbildung 21: APCI-MID-Massenchromatogramm für eine Realprobe nach Umkehrphasentrennung

Meßbedingungen: HPLC: Gynkotek HPLC-System mit Niederdruck-Gradientenpumpe (Model 480) und Autosampler (CTC Analytics Liquid Sampler A200SE), Probenaufgabe: 9 µL methanolischer Bodenextrakt, Säule: Gynkotek Inertsil ODS-2 (C-18-Material), Abmessungen: 270 x 2 mm incl. Vorsäule, 5 µm Porengröße, thermostatisiert auf 55°C, Laufmittelzusammensetzung: 0 bis 13 min isokratisch: 55% Wasser/ 45% Methanol (v/v), 13 bis 18 min Gradientenbetrieb: bis 100% Methanol, 18 bis 38 min isokratisch bei 100% Methanol, Fließgeschwindigkeit: 450 µL/min, MS: MID: Massenspuren für die deprotonierten Molekülionen der Alkylphenole mit unterschiedlicher Anzahl an C-Atomen in der Alkylkette (C1 bis C4) Auflösung: ca. 3000, andere Parameter wie Abbildung 19

In Tabelle 3 sind die Nachweisgrenzen (bestimmt bei dem Signal-/ Rausch-Verhältnis von 3/1) der untersuchten HPLC-APCI-MS-Techniken zusammengefaßt.


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Tabelle 3: Nachweisgrenzen des HPLC-APCI-MS-Verfahrens

Substanzname

NWG/(µmol/L)

Umkehrphasen

NWG/(mg/L)

Umkehrphasen

NWG/(µmol/L)

Normalphasen

NWG/(µg/L)

Normalphasen

3-Methylphenol

20

2,2

-

600

2,4-Dimethylphenol

10

1,2

3,3

400

3,4-Dimethylphenol

10

1,2

1,6

200

2,6-Dimethylphenol

1

0,1

4,9

600

3-Ethylphenol

10

1,2

2,5

300

4-Ethylphenol

10

1,2

2,5

300

2,3,6-Trimethylphenol

7

1,0

0,7

100

2,4,6-Trimethylphenol

40

5,5

2,1

300

2-Isopropylphenol

4

0,5

2,1

300

2,4-Di-tertiär-Butylphenol

2

0,4

2,4

500

2,6-Di-tertiär-butyl-4-methylphenol

2

0,4

0,23

5

2,4,6-Tri-tertiär-butylphenol

0,3

0,8

0,19

5

2-Methylresorcin

2

0,2

-

-

2-Hydroxybiphenyl

19

3,2

1,8

300

1-Naphthol

40

5,8

0,7

100

2-Naphthol

2

0,3

0,7

100

5-Indangl

75

10,0

7,5

1000

3-Methoxyphenol

64

8,0

4,0

500

4-Ethoxyphenol

4

0,5

3,6

500

3,5-Dimethoxyphenol

1

0,2

3,2

500

Mittels "Multiple Ion Detection" (MID) lassen sich Nachweisgrenzen im Bereich von 10 µmol/L im HPLC-Eluent Methanol erreichen. Wird mit Normalphasen (Eluent: n-Hexan) gearbeitet, ist die Detektion um ca. eine Größenordnung empfindlicher als bei Umkehrphasen (Methanol).


63

4.2.2. HPLC-NMR

In der Umweltanalytik gibt es bedingt durch die hohen Nachweisgrenzen in komplexen Matrices bisher nur wenige Applikationen für die HPLC-NMR.

Gegenüber anderen Detektionsverfahren wie UV-vis oder MS ermöglicht die NMR neben einer substanzspezifischen Charakterisierung auch Aussagen zur Struktur der Moleküle.

In dieser Arbeit wurden deshalb die Möglichkeiten und Grenzen der HPLC-NMR Kopplung für die Analytik von Phenolen untersucht. Unter anderem sollte geklärt werden, ob die Leistungsfähigkeit der NMR bezüglich ihrer Strukturaussagefähigkeit zur Identifizierung von Isomeren in komplexen Alkylphenolgemischen eingesetzt werden kann. Dazu wurden mehrere Phenol-Modellgemische hergestellt. Bei der Auswahl der Einzelverbindungen wurden möglichst viele Strukturisomere gleicher Massenzahl berücksichtigt, um die Aussagekraft der Methode vor allem gegenüber der HPLC-MS zu vergleichen.

Die Kopplung der HPLC an das NMR-Spektrometer erfolgt mit einer sogenannten ”Peak-Sampling-Unit“, mit der HPLC-Fraktionen gesammelt werden können. Sie können einzeln in den Probenkopf des NMR-Spektrometers überführt und dort bei angehaltenem Fluß vermessen werden (stopped-flow Messung). Wird die ”Peak-Sampling-Unit“ im Durchfluß betrieben, so erfolgt die Messung im ”on-flow“ Modus. Diese Technik wurde auf Grundlage vorausgegangener Untersuchungen<140>,72 eingesetzt. -->

Die Messungen wurden an einer Bischoff HPLC-Anlage mit UV-Detektor in Kopplung an ein Bruker AMX 600 Spektrometer bei der Meßfrequenz 600 MHz durchgeführt (1H-NMR-Spektrometrie). Der NMR-Probenkopf für die HPLC-Kopplung hat eine Durchfluß-Meßzelle mit 4 mm Innendurchmesser und 120 µL Detektionsvolumen.

Als Lösungsmittel für die Modellgemische wurden Methanol-d4 und Acetonitril-d3 verwendet. Die in Methanol-d4 aufgenommenen Spektren sind klarer auszuwerten, als die in Acetonitril-d3, da die phenolischen OH-Signale im Spektrum durch einen langsamen Protonenaustausch mit Methanol alle bei der chemischen Verschiebung 4,8 ppm liegen, wodurch die Spektren vereinfacht werden. In Acetonitril-d3 treten die phenolischen OH-Signale im Verschiebungsbereich der Aromaten auf und erschweren dort die Zuordnung der Signale.


64

Die Auflösungsgrenze der NMR zur Untersuchung komplexer Gemische ohne vorherige chromatographische Trennung ist schnell erreicht. Selbst bei hochauflösenden NMR-Spektrometern überlagern sich die Signale bereits bei Gemischen aus wenigen Substanzen.

Während Chor- und Nitrophenole in ihren Spektren Signale mit charakteristischen chemischen Verschiebungen aufweisen, sind die Spektren der Alkylphenole einander sehr ähnlich, so daß die Signale in Alkylphenolgemischen besonders stark überlagern.

In Abbildung 22 ist ein Ausschnitt aus dem Aromatenbereich für das 1H-NMR-Spektrum eines Modellgemisches aus 7 Alkylphenolen (Spur B, Konzentration ca. 500 mg/L) dargestellt.

Abbildung 22: Aromatenbereich der Spektren für ein Alkylphenolgemisch (B) und 3-Methylphenol (A)

Meßparameter: Bruker AMX 600 Spektrometer, Protonenspektren, Meßfrequenz: 600 MHz, Lösungsmittel: Methanol-d4, obere Abbildung: 3-Methylphenol, untere Abbildung: Gemisch aus 3-Methylphenol, 4-Methylphenol, 2,4-Dimethylphenol, 2,5-Dimethylphenol, 2,6-Dimethylphenol, 4-Ethylphenol, 2,4,6-Trimethylphenol, Konzentration: ca. 500 mg/L je Einzelsubstanz


65

Dieses Modellgemisch enthält lediglich zwei Methylphenole, vier Strukturisomere der C2-Alkylphenole sowie ein Trimethylphenol. Schon bei dieser geringen Anzahl an Substanzen ist die Grenze der NMR für die eindeutige Signalzuordnung durch Signalüberlagerung erreicht. Zum Vergleich ist darüber der Ausschnitt aus dem Spektrum für 3-Methylphenol abgebildet (Spur A). Bereits diese eine Substanz ist mit 4 Signalen bei unterschiedlichen chemischen Verschiebungen und Aufspaltungsmustern (4 chemisch nicht äquivalente Aromatenprotonen) an dem Gemischspektrum (Spur B) beteiligt.

Eine Konzentrationsänderung des Modellgemisches beeinflußt die Auflösung der NMR-Signale nicht, sondern verändert nur das Signal-/ Rausch-Verhältnis. Bei einem Modellgemisch mit 12 phenolischen Verbindungen (zusätzlich 5 weitere C2- und C3-Alkylphenole) konnte demzufolge keine eindeutige Signalauflösung mehr erreicht werden.

In Kopplung mit der HPLC lassen sich auch komplexe Gemische mit der 1H-NMR-Spektrometrie untersuchen, da durch die chromatographische Trennung die Überlagerungen in den 1H-NMR-Spektren wesentlich verringert werden können.

Für die Kopplung der HPLC an die NMR wurden die Parameter der Umkehrphasen-HPLC der HPLC-MS Kopplung (siehe Kapitel 0 ) an die Anforderungen der NMR angepaßt. Es wurden die Eluenten aus den Umkehrphasentrennungen mit Methanol/Wasser und Acetonitril/Wasser eingesetzt.

In der HPLC-NMR ist der Einsatz der üblicherweise in der Flüssigchromatographie verwendeten Lösungsmittel Wasser und Methanol nur eingeschränkt möglich. Die Analytprotonen haben um mehrere Größenordnungen niedrigere Konzentrationen als die hochkonzentrierten Lösungsmittelprotonen und können in undeuterierten Lösungsmitteln nicht detektiert werden, da die Detektoren nicht in der Lage sind, den hohen dynamischen Bereich mit ausreichender Empfindlichkeit abzudecken. Daher wurde das Wasser in den HPLC-Eluenten gegen Deuteriumoxid ausgetauscht.

Der Austausch der anderen Lösungsmittel gegen deuterierte Substanzen ist aus ökonomischen Gründen nicht sinnvoll. Die Protonensignale der anderen Lösungsmittel des Eluenten lassen sich durch spezielle Techniken vermindern, indem sie durch den Einsatz spezieller Pulsprogramme (in dieser Arbeit: eine eindimensionale (1-D) Version der Pulssequenz Noesyprtp, Firma Bruker) unterdrückt werden können.


66

Die HPLC-NMR-Messung erfolgte mit dem Eluenten Acetonitril/Deuteriumoxid im Verhältnis 60/40. Es wurde Acetonitril verwendet, da es mit dem Pulsprogramm im Vergleich zu Methanol relativ einfach zu unterdrücken ist (nur ein Protonensignal). Die unterdrückten Signale sind nur noch ca. 2 Größenordnungen intensiver als die Analytsignale, so daß eine quantitative Auswertung der Analyte möglich ist.

Sind acidere Substanzen in der Probe vorhanden, wie beispielsweise Chlor- und Nitroverbindungen, wird das Laufmittel mit Trifluoressigsäure-d1 angesäuert. Dadurch liegen die Analyte als Neutralteilchen vor und können selektiver getrennt werden.

Die Proben müssen in der Lösungsmittelzusammensetzung des Eluenten auf das HPLC-NMR-System aufgegeben werden. Anderenfalls treten häufig Störungen bei der Lösungsmittelunterdrückung auf, die dazu führen, daß die NMR-Spektren nicht mehr auszuwerten sind.

Die NMR-spektrometrische Messung erfolgt im Durchfluß. Das Laufmittel wird dazu bei sehr niedrigen Fließgeschwindigkeiten durch den Probenkopf geleitet. Je niedriger die Fließgeschwindigkeit ist, desto mehr NMR-Scans lassen sich pro Volumeneinheit messen. Die Anzahl der Scans n beeinflußt die Empfindlichkeit, da durch Akkumulation der Scans das Signal-/ Rausch-Verhältnis um n½ verbessert wird. Nach jedem Scan muß die Relaxationszeit der Analyte (ca. 12 Sekunden) abgewartet werden, bevor ein neuer Scan gestartet wird. Anderenfalls kommt es zu Verfälschungen der Signalintensitäten.

Die graphische Darstellung der HPLC-NMR-Analysen erfolgt nach Fourier-Transformation und Basislinienkorrektur in Form einer pseudo-zweidimensionalen Darstellung (chemische Verschiebung in F1-Richtung, chromatographische Zeitachse in F2-Richtung). Die Zeitachse wird dabei in Reihen eingeteilt, die einer definierten Anzahl an Scans (16 oder 32K Datenpunkte pro Reihe, je nach Fließgeschwindigkeit) entsprechen.

In Abbildung 23 ist das HPLC-NMR-Chromatogramm für das 7-Komponenten-Modellgemisch (siehe Abbildung 22 ) in der Gesamtansicht dargestellt. Im Bereich von 1,0 bis 2,5 ppm und bei 4,3 ppm liegen die durch das Pulsprogramm unterdrückten Lösungsmittelsignale. Die Basislinie ist in der Nähe der Signale durch die Unterdrückung stark verzerrt, so daß Analytsignale in diesen Bereichen oft nicht ausgewertet werden können. Der Aromatenbereich des Chromatogramms ist weitestgehend störungsfrei. Die Signale zwischen 5 und 12 ppm werden daher für die Auswertung der Analysen genutzt.


67

Abbildung 23: HPLC-NMR-Chromatogramm für ein Alkylphenolgemisch, Gesamtansicht

Meßparameter: Bischoff HPLC-System (Modell 1155), Säule: Gynkotek Inertsil ODS-2 (RP-18 Material) Länge: 250 x 4 mm, 5 µm Partikelgröße, Injektion: 300 µL, ca. 50 µg pro Einzelsubstanz, Eluent: 60/40 Deuteriumoxid/ Acetonitril (v/v), Fluß: 0,05 mL/min, Gemisch aus 3-Methylphenol, 4-Methylphenol, 2,4-Dimethylphenol, 2,5-Dimethylphenol, 2,6-Dimethylphenol, 4-Ethylphenol, 2,4,6-Trimethylphenol, Bruker AMX 600 Spektrometer Protonenspektren, Meßfrequenz: 600 MHz, 32K Datenpunkte in F2-Richtung, 90° Puls: 8,68 µs, Frequenzen und Leistungswerte für die Lösungsmittelunterdrückung: Acetonitril: O1 ~ 1300 Hz, dl0: 60 dB, Hydrogen-deuteriumoxid-d1 (Restwasser): O2 ~ 2700 Hz, hl2: 54 dB, Relaxationszeitintervall: p18: 12 s, Dauer einer Messung: ca. 4 Stunden

In Abbildung 24 ist der Aromatenbereich des HPLC-NMR-Chromatogramms vergrößert dargestellt und zeigt die hohe Auflösung der Analytsignale. Das Phenolgemisch ist chromatographisch nicht vollständig aufgelöst (chromatographische Zeitachse in F2-Richtung). Für die C2-Alkylphenole (Dimethyl- und Ethylphenole) lassen sich zwar noch unterschiedliche Retentionszeiten erkennen, die C1-Alkylphenole (Methylphenole) koeluieren bei diesen Bedingungen jedoch.

Durch die Einbeziehung der NMR-Signale wird die vollständige Auflösung der Substanzen anhand ihrer Protonensignale bei unterschiedlichen chemischen Verschiebungen ermöglicht.


68

Anders als in Abbildung 22 können die einzelnen Signale zur quantitativen Auswertung herangezogen werden.

Abbildung 24: Ausschnitt aus dem Aromatenbereich des HPLC-NMR-Chromatogramms

Die Strukturisomere der Alkylphenole lassen sich auf diese Weise charakterisieren und bestimmen. Zur Quantifizierung werden die Reihen auf der Zeitachse (F2-Richtung), in denen die Protonensignale für die zu bestimmende Substanz detektiert werden, aufsummiert und als eindimensionale Spektren abgebildet. In Abbildung 25 ist die Summe über die Reihen für die Methylphenole dargestellt.

Die Substanzen lassen sich über ihre chemischen Verschiebungen und Kopplungskonstanten qualitativ zuordnen. Je nach Anzahl äquivalenter Protonen lassen sich mehrere Signale für die einzelnen Analyte durch Integration quantitativ auswerten.

Die Absolutmengen der Methylphenole (3-Methylphenol: 32 µg, 4-Methylphenol: 42 µg, entspricht Konzentrationen von ca. 10 mg/L) liegen für diese Meßparameter bereits im Bereich der Bestimmungsgrenze. 4-Methylphenol läßt sich im Vergleich zu 3-Methylphenol


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etwas empfindlicher detektieren, da zwei der vier Protonen des aromatischen Systems äquivalent sind. Daher ist die Intensität der vier aromatischen Protonen auf nur 2 Signale verteilt. Bei 3-Methylphenol sind die aromatischen Protonen nicht äquivalent und erzeugen vier Signale mit entsprechend geringerer Intensität.

Abbildung 25: Summe über den Retentionsbereich der Methylphenole

Bei der Analyse eines komplexen Modellgemisches aus 23 phenolischen Verbindungen ähnlicher Zusammensetzung wie das mit den GC-MS-Verfahren (siehe Kapitel 0 ) analysierte Gemisch, werden die Grenzen der HPLC-NMR erreicht. Das Gemisch enthielt unter anderem alle Strukturisomere der Methyl-, Ethyl- und Dimethylphenole. Die Protonensignale der C2-Alkylphenole lassen sich nicht mehr auflösen. Die qualitative Zuordnung der Signale ist auch in diesem Fall noch möglich, die Quantifizierung hingegen nicht.

Zur Abschätzung der Nachweisgrenzen der HPLC-NMR wurden die Parameter, mit denen sich die Signalintensität beeinflussen lassen, verändert. Den größten Einfluß auf die Signalintensität hat die auf das Analysensystem aufgegebene Probenmenge, die nur durch


70

das Durchbruchsverhalten begrenzt wird. Daher wurden große Volumina an Probenlösung (bis zu 1000 µL) dosiert. Durch Überladung der HPLC-Säule nimmt zwar ihre Trennleistung ab, dieser Nachteil wird jedoch durch die NMR-spektrometrische Auflösung wieder ausgeglichen. Die Untersuchungen ergaben, daß Probenvolumina von 300 bis 500 µL der analysierten Gemische auf der benutzten HPLC-Säule ohne Durchbruchsverluste eingesetzt werden können.

Eine weitere Möglichkeit zur Verbesserung der Empfindlichkeit besteht in der Erhöhung der Zahl der akkumulierten Scans pro Volumenäquivalent. Je mehr Scans über dem Signal der Substanz akkumuliert werden, desto besser wird das Signal-/ Rausch-Verhältnis. Um die Scanzahl erhöhen zu können, muß die Verweilzeit der Substanz in der Detektionszelle verlängert werden - dieses geschieht durch die Reduzierung der Flußrate. So kann beispielsweise die Scanzahl durch Halbieren der Flußrate verdoppelt werden. Mit Halbierung der Flußrate verdoppelt sich allerdings auch die Analysenzeit (bei diesen Untersuchungen: 0,1 mL/min entspricht ca. 2,5 Stunden, 0,05 mL/min ca. 4 Stunden). Durch Verdopplung der Scanzahl n pro Volumeneinheit konnte die theoretisch erreichbare Verbesserung des Signal-/ Rausch-Verhältnisses um den Wert n½ nicht erreicht werden. Da außerdem die Analysenzeiten extrem lang werden, sollte die Erhöhung der Scanzahl nur im Bereich der Nachweisgrenze angewendet werden.

Die Nachweisgrenzen der HPLC-NMR liegen bei maximaler Probendosierung (1000 µL) und hoher Scanzahl pro Volumenäquivalent für die untersuchten Substanzen im Bereich von 10 bis 100 mg/L bzw. zwischen 5 und 20 µg pro aufgegebener Einzelsubstanz. Wie der Vergleich mit Tabelle 3 zeigt, liegen sie damit um bis zu drei Größenordnungen höher als die der HPLC-MS.

Obwohl die HPLC-NMR bedingt durch die Nachweisgrenzen im Bereich der quantitativen organisch-chemischen Spurenanalytik derzeit nicht einsetzbar ist, kann sie bei ausreichender Analytkonzentration eine genaue Strukturidentifizierung unbekannter Einzelkomponenten selbst in komplexen Matrixproben ermöglichen. Damit bietet sich die HPLC-NMR-Kopplung beispielsweise zur Aufklärung von Abbau- und Metabolisierungsprozessen phenolischer Inhaltsstoffe bzw. als Referenzverfahren an. Aktuelle technische Entwicklungen (z.B. HPLC-NMR im Gradientenbetrieb) lassen weitere Einsatzgebiete in der Umweltanalytik erwarten.


71

4.2.3. GC-MS

Die Kopplung der gaschromatographischen Trenntechnik mit der massenspektrometrischen Detektion, die aufgrund von charakteristischen Massenspektren einen spezifischen Nachweis der einzelnen Komponenten erlaubt, ist besonders für die Analyse unbekannter Gemische in der Laborpraxis unverzichtbar geworden. Die Technik setzt voraus, daß die Analyte sich unzersetzt verdampfen lassen.

Da die GC-MS gleichzeitig eine hohe Selektivität mit einer hohen Empfindlichkeit verbindet und die Bestimmung vieler Analyte bis in den Ultra-Spurenbereich ermöglicht, wird sie auch in zahlreichen Normverfahren eingesetzt.

Für die GC-MS-Analyse von Phenolen wurden Verfahren für Gerätekopplungen mit niedriger Massenauflösung (GC-LRMS) und mit hoher Massenauflösung (GC-HRMS) entwickelt und validiert. Jede Variante hat ihre individuellen Vor- und Nachteile. In beiden Verfahren erfolgte die Ionisation durch Elektronenstoß (EI) unter Erzeugung positiver Ionen.

Für die Untersuchung wurde ein Modellgemisch verschiedener Phenole in n-Hexan hergestellt. Dieses Gemisch umfaßte sämtliche C1- und C2-Alkylphenole, 5 C3-Alkylphenole, verschiedene Chlorphenole, Naphthole und Indanole sowie einige Alkoxyphenole. Von diesem Modellgemisch ausgehend wurden verschiedene Verdünnungen hergestellt. Eine Konzentrationsstufe wurde zu Vergleichszwecken so gewählt, daß sie dem Meßbereich der Kapillarelektrophorese entsprach (siehe Kapitel 4.2.4). Die unterste Konzentrationsstufe lag im Bereich der Bestimmungsgrenze für die GC-MS (1 µg/L).

4.2.3.1. GC-LRMS

Für die Messungen mit einem niederauflösenden Massenspektrometer wurde ein GC-MS-System MD800 (Firma Fisons) mit einem Carlo-Erba GC 8035 eingesetzt. Die Trennung erfolgte auf einer schwach polaren Kapillarsäule DB-XLB der Firma J\|[amp ]\|W mit Helium als Trägergas.

Um die Flüchtigkeit der Phenole zu erhöhen, ihre zum Teil hohe Polarität zu erniedrigen und stabile chromatographische Bedingungen für alle Analyte zu gewährleisten, ist eine Derivatisierung erforderlich. Als Derivatisierungsreagenzien wurden die Substanzen N-Methyl-N-(trimethylsilyl)-2,2,2-trifluoracetamid (MSTFA), Bis-(trimethylsilyl)-2,2,2-


72

trifluoracetamid (BSTFA) und Trimethylsilyl-imidazol bezüglich ihrer Eignung untersucht. Bedingt durch die Derivatisierungsreaktion treten in den Massenchromatogrammen diverse Störsignale auf. Es zeigte sich, daß die Umsetzung mit MSTFA zu den besten Ergebnissen führte, da nach dieser Reaktion die wenigsten Störsignale in den Massenchromatogrammen der Analysen detektiert wurden. Deshalb wurde MSTFA als Silylierungsreagenz eingesetzt.

Für die Optimierung der Trennung wurden die Retentionszeiten der Einzelsubstanzen bestimmt und die Auflösung der Analyte durch Anpassung des Temperaturprogramms bis zur Basislinientrennung verbessert. Wegen der Selektivität des Massenspektrometers können chromatographisch ungetrennte Substanzen unterschiedlicher Nominalmasse massenspektrometrisch aufgelöst werden.

Bei der quantitativen Analytik derivatisierter Phenole muß die Vollständigkeit der Derivatisierungsreaktion gewährleistet sein. Deshalb wurde die Reaktion mit hohem Überschuß an Derivatisierungsreagenz durchgeführt (mindestens im Verhältnis 3/1 Mol). Es muß auch beachtet werden, daß Wasserdampf aus der Luft sowie Lösungsmittelrückstände aus der Probenvorbereitung oder -extraktion (wie z.B. Methanol) mit dem Silylierungsmittel reagieren. In der Praxis haben sich für die Silylierungsreaktion Mengen von 500 µL Probe und 100 µL MSTFA-Lösung als praktikabel erwiesen. Die derivatisierten Proben bleiben innerhalb von 24 Stunden stabil.

Zur Prüfung der Vollständigkeit der Derivatisierung wurden die Retentionszeiten und Massenspektren der derivatisierten und underivatisierten phenolischen Verbindungen gemessen und katalogisiert. In Abbildung 26 ist als Beispiel das EI-Spektrum für 2,4,6-Trimethylphenol dargestellt. Das Spektrum zeigt neben dem Molekülion (136 Dalton) das intensivste Signal für das Fragment [M-CH3]+. Diese beiden Signale sind charakteristisch für die Spektren aller untersuchten Phenole. Abbildung 27 zeigt demgegenüber das EI-Massenspektrum für das Silylierungsprodukt des gleichen Phenols (2,4,6-Trimethylphenol). Auch in den Spektren der silylierten Proben werden die charakteristischen Signale für das Molekülion (208 Dalton) und das Fragment [M-CH3]+ detektiert. Durch die Reaktion mit MSTFA erfolgte im Analyt an der OH-Gruppe ein Austausch des Wassserstoffatoms gegen eine Trimethylsilylgruppe, wodurch sich eine Massenverschiebung um 72 Masseneinheiten im Vergleich zum freien Phenol ergibt. Ebenso wie bei den nicht silylierten Phenolen ist das abgebildete Spektrum mit den Signalen für Molekülion und dealkyliertes Fragment charakteristisch für alle untersuchten Substanzen.


73

Abbildung 26: EI-Massenspektrum für 2,4,6-Trimethylphenol, nicht derivatisiert

Meßparameter: GC: Carlo-Erba GC-System (GC 8035), Säule: J\|[amp ]\|W DB-XLB, Länge: 30 m, Innendurchmesser: 0,25 mm, Filmdicke 0,25 µm, He-Vordruck: 13 psi, Injektortemperatur: 240°C, Splitless Injektion (45 sec), Temperaturprogramm: von 55°C auf 220°C Heizrate: 6°/min, von 220°C auf 320°C Heizrate: 27°/min, Gesamtdauer: ca. 45 min, Interfacetemperatur: 250°C, Dosierung: 1 µL der Probe in n-Hexan, ca. 10 pg pro Einzelkomponente, GC-LRMS: Fisons (MD800), Ionenquellentemperatur: 230°C, Kathodenstrom: 150 µA, Multiplier: 600 V

Abbildung 27: EI-Massenspektrum für das TMS-Produkt von 2,4,6-Trimethylphenol

Meßparameter: Dosierung: 1 µL der silylierten Probe in n-Hexan, ca. 10 pg pro Einzelkomponente, weitere Parameter: siehe Abbildung 26


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Bei der Messung von derivatisierten Proben kann nun durch Auswahl geeigneter Massenspuren für die nicht derivatisierten Substanzen die Vollständigkeit der Reaktion überprüft werden. Zur Verifizierung kann im Full-Scan-Modus die Spektrenbibliothek mit den nicht derivatisierten Analyten genutzt werden.

Die quantitativen Analysen wurden im ionenselektiven Meßmodus SIR (”Single Ion Recording) durchgeführt, da so die Empfindlichkeit der Messungen gegenüber dem Full-Scan-Modus um bis zu zwei Größenordnungen verbessert wird (vgl. Kapitel 4.2.1 ).

Die Abbildung 28 zeigt den Ausschnitt eines Massenchromatogramms silylierter Phenole für eine GC-MS-Analyse im SIR-Modus. Die selektive Darstellung der Massenspuren (Molekülion der silylierten Phenole) erlaubt die Bestimmung der Einzelkomponenten, auch wenn diese chromatographisch nicht aufgelöst sind (Signale für 2-Isopropylphenol-TMS - Spur A - und 2-Methoxyphenol-TMS - Spur B).

Die Konzentration der Einzelkomponenten des in Abbildung 28 dargestellten Modellgemisches betrug ca. 1 µg/L. In dieser Konzentration sind auf allen Massenspuren bereits Störsignale im Intensitätsbereich der Analytsignale vorhanden (Spur A: Störsignal bei 15,117 min hat gleiche Intensität wie Signal von 2-Isopropylphenol bei 14,631 min). Durch die hohe Auflösung der Gaschromatographie ist die Quantifizierung der meisten Analytsignale trotzdem möglich. Die Bestimmungsgrenzen des GC-LRMS-Verfahrens liegen im Bereich von 0,2 bis 0,5 µg/L pro Einzelsubstanz.

Wegen der Einheitsauflösung eines Quadrupol-Massenspektrometers sind der quantitativen Analytik mit diesem Gerätetyp durch Querstörungen Grenzen gesetzt. So ist in diesem Fall die Bestimmung von 2,3-Dimethylphenol (15,090 min) im Spurenbereich nicht mehr möglich, da das Signal für das Molekülion von einem intensiven Matrixsignal (ebenso 15,090 min) gleicher Nominalmasse überlagert wird (vgl. Spur C in Abbildung 28 ).

Durch Wechsel der Massenspur auf das dealkylierte Fragmention kann in einigen Fällen der Überlagerung ausgewichen werden. In diesem Fall ist jedoch auch das Fragmention (179 Dalton) nicht frei von Überlagerungen. Für die Bestimmung von 2,3-Dimethylphenol in diesem Konzentrationsbereich müssen daher andere Messungen (z.B. mit einem hochauflösenden Gerät) durchgeführt werden (siehe Kapitel 4.2.3.2).


75

Abbildung 28: Chromatogramm für eine GC-MS-Analyse silylierter Phenole (Ausschnitt, SIR-Modus)

Meßparameter: Dosierung: 1 µL der silylierten Probe in n-Hexan, ca. 1 pg pro Einzelkomponente, weitere Parameter: siehe Abbildung 27

Das GC-LRMS-Verfahren eignet sich als Standardverfahren für die Phenolanalytik. Die Validierung ist in Kapitel 0 dargestellt.


76

4.2.3.2. GC-HRMS

Die hohe Selektivität der GC-HRMS ermöglicht es, auch Querstörungen durch Ionen gleicher Nominalmassen von den Analytsignalen zu trennen und so nahezu untergrundfrei zu messen. Der apparative und finanzielle Aufwand ist jedoch im Vergleich zu niederauflösenden Massenspektrometern wesentlich höher.

Es wurde ein doppelfokussierendes Sektorfeld-Massenspektrometer Finnigan MAT 95S mit Hewlett-Packard GC 5890 verwendet. Für die Derivatisierung und die chromatographische Trennung wurden die Parameter des im vorausgehenden Abschnitt beschriebenen GC-LRMS-Verfahrens genutzt.

In Abbildung 29 ist der Ausschnitt verschiedener Massenchromatogramme für eine GC-HRMS-Analyse silylierter Phenole dargestellt (Auflösung ca. 3000). Der Ausschnitt entspricht dem Retentionsbereich der GC-LRMS-Analyse aus Abbildung 28. Spur A in Abbildung 29 zeigt die unter hochauflösenden Bedingungen aufgenommenen C2-Alkylphenole. Sie entspricht Spur C in Abbildung 28, die mit dem niederauflösenden Quadrupol-Massenspektrometer gemessen wurde. Obwohl unter hochauflösenden Bedingungen die absoluten Signalintensitäten um ca. zwei Größenordnungen geringer sind, ist das Signal-/ Rausch-Verhältnis deutlich besser. Der Abbildungsvergleich zeigt auch, daß die quantitative Erfassung von 2,3-Dimethylphenol mit GC-HRMS gelingt, da der bei Niederauflösung störende Matrixpeak durch die höhere Selektivität abgetrennt wird. Auch die Störsignale der Silylierungsprodukte sowie andere Matrixsignale können durch die Hochauflösung separiert werden. Dies läßt sich am Vergleich der hochaufgelösten Massenspur von 2-Isopropylphenol (Abbildung 29, Spur C) zu der entsprechenden Analyse des Quadrupol-Massenspektrometers ( Abbildung 28 , Spur A) dokumentieren. Der bei Niederauflösung auftretende Matrixpeak (15,117 min) ist bei Hochauflösung (14,111 min) fast vollständig abgetrennt und das Untergrundrauschen im Vergleich zur LRMS-Analyse um mehrere Größenordnungen geringer (Verhältnis ca. 50:1). Die gleichen Effekte lassen sich auch in den Abbildungen bei den Spuren B für die Methoxyphenole erkennen.

Die Bestimmungsgrenzen des GC-HRMS-Verfahrens liegen im Bereich von 0,1 bis 0,3 µg/L pro Einzelsubstanz. Bedingt durch das verbesserte Signal-/ Rausch-Verhältnis liegen sie damit ca. um den Faktor 2 unter denen des GC-LRMS-Verfahrens.


77

Abbildung 29: Chromatogramm für eine GC-MS-Analyse silylierter Phenole (Ausschnitt, MID-Modus)

Meßparameter: GC: Hewlett-Packard GC-System HP-GC 5890, Säule: J\|[amp ]\|W DB-XLB, Länge: 30 m, Innendurchmesser: 0,25 mm, Filmdicke 0,25 µm, He-Vordruck: 11 psi, Injektortemperatur: 240°C, Splitless Injektion (45 sec), Temperaturprogramm: von 55°C auf 220°C Heizrate: 6°/min, von 220°C auf 320°C Heizrate: 27°/min, Gesamtdauer: ca. 45 min, Interfacetemperatur: 250°C, Dosierung: 1 µL der silylierten Probe in n-Hexan, ca. 1 pg pro Einzelkomponente, HRMS: MAT 95S: Ionenquellentemperatur: 230°C, Kathodenstrom: 150 µA, Multiplier: 2,3 kV, Auflösung: 3000, MID: Massenspuren für die exakten Analytmassen (Molekülion), Referenzgas: FC 43

Das GC-HRMS-Verfahren eignet sich als leistungsfähiges Referenzverfahren für die Phenolanalytik. Die Validierung ist in Kapitel 0 dargestellt.


78

4.2.3.3. Validierung der GC-MS-Verfahren

Die entwickelten Analysenverfahren zur Bestimmung von Phenolen mit der GC-MS wurde in eine Labor-Standardarbeitsanweisung (BAM-STAA-I.23-006<141>) überführt. Zur Verfahrensoptimierung und -erarbeitung war es zuvor notwendig, sämtliche Einzelschritte wie Herstellung und Verdünnung des Modellgemisches, Abstimmung der GC- und MS-Parameter und Anpassung der Quantifizierung zu prüfen und mehrfach zu wiederholen.

Die Verfahren wurden entsprechend der Standardarbeitsanweisung bearbeitet und validiert<142>. Bestandteile dieser Standardarbeitsanweisung sind die gravimetrische Herstellung und Verdünnung der Modellgemische, die Silylierung der Meßlösung mit MSTFA sowie Messung und Auswertung der MID-Massenchromatogramme.

Die Wiederholpräzision wurde durch Messung der relativen Peakflächen des Modellgemisches (siehe Kapitel 4.2.3) bei einer Konzentration von 2 µg/L über 10 direkt hintereinander durchgeführte Messungen für alle Analyte im Mittel zu 6% bestimmt. Der Nachweis von Selektivität und Spezifität erfolgte in den GC-MS-Verfahren durch Zuordnung der Retentionszeiten und Spektren. Bei der Auswertung selektiver Massenspuren (MID- oder SIR-Modus) wurden neben den quantifizierten Molekülionen ([M+]) zur Absicherung der Identifizierung auch die dealkylierten Fragmentionen ([M-CH3]+) detektiert. Die Unsicherheit der Probenvorbereitung zur Herstellung der synthetischen Proben beschränkt sich auf die Einwaage und Verdünnung. Da bei der Messung unterschiedlicher Proben im Rahmen der Wiederholpräzision keine signifikanten Abweichungen der Mittelwerte festgestellt wurden, wird der Anteil der Unsicherheit der Probenvorbereitung an der Verfahrensunsicherheit (Summe der Unsicherheiten aller Verfahrensabschnitte) zu unter 1% abgeschätzt (Berücksichtigung des 95% Vertrauensbereichs).

Die Verfahren wurden für zwei Konzentrationsbereiche validiert, (0,5 bis 50 µg/L und 5 bis 100 µg/L). Die Kalibrierkurven sind für alle Substanzen in den beiden Konzentrationsbereichen linear.

Für die Bestimmung der Vergleichspräzision ist es erforderlich, mit den Verfahren an mindestens einem Ringversuch teilzunehmen.

Die Bestimmungsgrenzen<143> liegen analytabhängig zwischen 0,1 und 0,7 µg/L (die Nachweisgrenzen ca. um den Faktor 2 niedriger). Die Bestimmungsgrenzen für 2,3-


79

Dimethylphenol und 2-Isopropylphenol wurden in der Tabelle für die GC-HRMS angegeben. Mit dem GC-LRMS-Verfahren sollten diese Analyte wegen der Querstörungen nicht bestimmt werden (siehe Abbildung 28 und Abbildung 29).

In Tabelle 4 sind ausgewählte Parameter der Validierung angegeben. Die Korrelationskoeffizienten wurden für die Kalibrierung einer Analysenreihe beispielhaft für das GC-LRMS-Verfahren angegeben und sind denen einer entsprechenden Kalibrierung der GC-HRMS gegenübergestellt. Die Anpassung der Werte an eine lineare Kalibrierung ist bei der GC-HRMS weniger fehlerbehaftet als bei der GC-LRMS (Korrelationskoeffizienten für die GC-HRMS liegen näher bei 1), da bei Messungen mit Hochauflösung das Signal-/ Rausch-Verhältnis größer ist.

Bei der GC-HRMS ergeben sich bezüglich der Tabelle 4 einige Abweichungen. Die Werte für die quantifizierte Masse entsprechen den exakten Massen der Molekülionen. Die Retentionszeiten weichen um einige Sekunden von den angegebenen ab, da sich die Säulen um ca. 20 cm in der Länge unterscheiden. Die Bestimmungsgrenzen der GC-HRMS liegen um ca. den Faktor 2 unter den Werten für die angegebenen GC-LRMS-Messungen.

Tabelle 4: Ausgewählte Validierungsparameter der GC-MS-Verfahren

Substanzname

quantifizierte Masse/ (m/z)

mittlere RT/

min

Bestimmungs-

grenze/ (µg/L)

Korrelationskoeffizienten GC-LRMS

Korrelationskoeffizienten GC-HRMS

Phenol-TMS

166,00

9,71

0,38

0,94997

0,99942

13C-Pentachlorphenol-TMS

328,60

29,02

0,68

ISTD

ISTD

2-Methylphenol-TMS (2-MP)

180,00

11,89

0,24

0,99850

0,99588

3-Methylphenol-TMS (3-MP)

180,00

12,16

0,26

0,99712

0,99853

4-Methylphenol-TMS (4-MP)

180,00

12,52

0,28

0,99853

0,99976

2-Ethylphenol-TMS (2-EtP)

194,00

13,59

0,61

0,99610

0,99685

3-Ethylphenol-TMS (3-EtP)

194,00

14,27

0,28

0,99980

0,99929

4-Ethylphenol-TMS (4-EtP)

194,00

14,91

0,34

0,99924

0,99981

2,5-Dimethylphenol-TMS (2,5-DMP)

194,00

14,08

0,30

0,99429

0,99853

3,5-Dimethylphenol-TMS (3,5-DMP)

194,00

14,45

0,32

0,99983

0,99940

2,4-Dimethylphenol-TMS (2,4-DMP)

194,00

14,54

0,29

0,99908

0,99834

2,6-Dimethylphenol-TMS (2,6-DMP)

194,00

14,91

0,35

0,99924

0,99938

2,3-Dimethylphenol-TMS (2,3-DMP)

194,00

15,10

0,40

0,69879

0,99961

3,4-Dimethylphenol-TMS (3,4-DMP)

194,00

15,41

0,42

0,92533

0,99923

2-Methoxyphenol-TMS (2-MeOP)

196,00

14,62

0,30

0,99907

0,99985

3-Methoxyphenol-TMS (3-MeOP)

196,00

16,10

0,22

0,99989

0,99877

4-Methoxyphenol-TMS (4-MeOP)

196,00

16,37

0,28

0,99691

0,99794

2-Isopropylphenol-TMS (2-iPrP)

208,00

14,65

0,15

0,99648

0,99946

2,3,5-Trimethylphenol-TMS (2,3,5-TMP)

208,00

17,07

0,21

0,99798

0,99892

2,4,6-Trimethylphenol-TMS (2,4,6-TMP)

208,00

17,31

0,28

0,99867

0,99934

2,3,6-Trimethylphenol-TMS (2,3,6-TMP)

208,00

17,87

0,27

0,99712

0,99890

3,4,5-Trimethylphenol-TMS (3,4,5-TMP)

208,00

18,16

0,28

0,99873

0,99903

5-Indanol-TMS

206,00

19,14

0,24

0,99817

0,99810

2,6-Dimethoxyphenol-TMS (2,6-DMeOP)

196,00

19,10

0,27

0,99859

0,99892

2,4,6-Trichlorphenol-TMS (2,4,6-TCP)

254,80

21,12

0,33

0,99930

0,99992

2,3,6-Trichlorphenol-TMS (2,3,6-TCP)

254,80

21,94

0,11

0,99296

0,99637

1-Naphthol-TMS

216,00

22,35

0,33

0,99625

0,99836

2-Naphthol-TMS

216,00

22,91

0,30

0,96953

0,99897

2,2´-Dihydroxydiphenyl-TMS

330,00

25,97

0,18

0,95081

0,99959

Pentachlorphenol-TMS (PCP)

322,60

29,03

0,68

0,99415

0,99935


80

Die Abbildungen 30 bis 33 (Abkürzungen der Analyte siehe Tabelle 4) zeigen die aus mehreren Messungen bestimmten Mittelwerte für zwei Konzentrationsniveaus des Modellgemisches im unteren µg/L-Bereich und die dazugehörigen Standardabweichungen (Berechnung für eine Stichprobe aus einer Grundgesamtheit). Zusätzlich sind die Analyt-Sollkonzentrationen (Einwaage) für die Einzelverbindungen angegeben. Für jede Einzelmessung wurde gesondert eine Kalibrierreihe erstellt (interner Standard -ISTD: 13C-Pentachlorphenol), wofür jeweils 5 Kalibrierlösungen unterschiedlicher Konzentration hergestellt und gemessen wurden (Meßzeit für eine Reihe ca. 7 Stunden). Innerhalb jeder Einzelmessung wurden jeweils die 29 Analyte des Modellgemisches quantifiziert.

In den Tabellen 10 bis 13 im Anhang sind die zu den Abbildungen gehörigen Zahlenwerte sowie die prozentuale Meßwertstreuung (Präzision) und die prozentuale Abweichung der Mittelwerte von der Sollkonzentration (Richtigkeit) für jede Einzelverbindung aufgelistet.

Abbildung 30 zeigt die Meßergebnisse für die GC-LRMS bei einem Konzentrationsniveau von 2 µg/L.

Abbildung 30: Parameter für die GC-LRMS, Konzentration des Modellgemisches ca. 2 µg/L


81

Die über alle Analyte gemittelte Abweichung der Mittelwerte von der Sollkonzentration liegt bei durchschnittlich 4% mit einer Streuung von 12% (siehe Anhang, Tabelle 10).

Die Werte für 2,3-Dimethylphenol und 2-Isopropylphenol haben signifikant erhöhte Abweichungen für die Streuung (größer 50%). Dies ist auf die problematische Integration der Analytsignale, die auf Querstörungen mit Matrixsignalen beruht, zurückzuführen (vgl. Abbildung 28). Die Querstörungen sind nicht immer vorhanden. So wurde die vergleichsweise große Streuung der Werte für 2-Naphthol in den folgenden Analysen nicht mehr beobachtet. Die Sollkonzentration der Einzelverbindungen liegen in allen Fällen innerhalb der Meßunsicherheit des Verfahrens.

In Abbildung 31 sind die entsprechenden Daten für die GC-HRMS für das identische Modellgemisch mit dem selben Konzentrationsniveau graphisch dargestellt. Die Vorgehensweise bei der Datenerfassung (z.B. Anzahl der Meßwerte und Kalibrierung) erfolgte auf die gleiche Weise wie bei der GC-LRMS.

Abbildung 31: Parameter für die für GC-HRMS, Konzentration des Modellgemisches ca. 2 µg/L


82

Wie die Gegenüberstellung der Abbildungen 30 und 31 (Tabellen 10 und 11) zeigt, sind die Meßunsicherheiten für die Mehrzahl der Analyte für beide Verfahren vergleichbar. Die Werte der GC-HRMS weichen durchschnittlich um 5% von den Sollwerten ab und streuen dabei um 9% (Einzelwerte siehe Anhang, Tabelle 11). Wie aus Abbildung 31 ersichtlich ist, lassen sich die Signale für 2,3-Dimethylphenol und 2-Isopropylphenol, die bei den GC-LRMS-Analysen durch Matrix-Querstörungen überlagert waren, nun jedoch bedingt durch die Hochauflösung mit gleicher Präzision wie die anderen Analyte bestimmen.

Die Minimierung der Querstörungen beim Einsatz der GC-HRMS wird auch im Konzentrationsbereich der Bestimmungsgrenze (Konzentration ca. 0,8 µg/L) festgestellt.

Abbildung 32 zeigt die Mittelwerte und Standardabweichungen für die Ergebnisse der GC-LRMS-Analysen. Während die nicht durch Querstörungen beeinflußten Signale noch mit Abweichungen von der Sollkonzentration von durchschnittlich 11% bei Streuungen um 17% bestimmbar sind, lassen sich die matrixgestörten Analytsignale (2,3-Dimethylphenol, 4-Methoxyphenol, 2-Isopropylphenol) nicht mehr mit ausreichender Qualität analysieren.

Abbildung 32: Parameter für die GC-LRMS, Konzentration des Modellgemisches ca. 0,8 µg/L


83

Die Analytsignale dieser drei Substanzen (2,3-Dimethylphenol, 4-Methoxyphenol, 2-Isopropylphenol) haben ungefähr die gleiche Intensität wie die Matrixsignale, so daß Abweichungen zwischen 50 und 100% auftreten (siehe Anhang, Tabelle 12).

Die GC-HRMS ermöglicht die Messung aller Analyte auch im unteren Spurenbereich ( Abbildung 33 ). Die Signale der Analyte, die bei den GC-LRMS-Analysen gestört waren, sind durch die Hochauflösung störungsfrei und lassen sich ohne Qualitätsverlust bei diesem niedrigen Konzentrationsniveau (0,8 µg/L) auswerten.

Bedingt durch das verbesserte Signal-/ Rausch-Verhältnis sind die Werte für die Abweichung von der Sollkonzentration und die Streuung etwas kleiner als bei den Daten der GC-LRMS (Daten siehe Anhang, Tabelle 13).

Abbildung 33: Parameter für die GC-HRMS, Konzentration des Modellgemisches ca. 0,8 µg/L

Die Validierung des Verfahrens in einem höheren Konzentrationsbereich liefert vergleichbare Ergebnisse.


84

In Abbildung 34 sind die Ergebnisse für die GC-HRMS aufgezeigt (11 Probenmessungen, Konzentration ca. 50 µg/L). In diesem Konzentrationsbereich liegen auch die mit der Kapillarelektrophorese untersuchten Proben (siehe Kapitel 0 ).

Die Werte für die Abweichung von der Sollkonzentration und die Streuung (Abweichung durchschnittlich 3%, Streuung 6%, Einzelwerte siehe Anhang, Tabelle 14) sind etwas geringer, als in dem zuvor diskutierten, um eine Größenordnung kleineren Konzentrationsbereich.

Normalerweise ist zu erwarten, daß mit steigender Analytkonzentration bei gleicher Probenmatrix die Meßunsicherheit des Verfahrens signifikant kleiner wird. Wie der Vergleich der Abbildungen 31, 33 und 34 erkennen läßt, wird diese Erwartung durch die Meßdaten der Validierung nicht bestätigt.

Abbildung 34: Parameter für die GC-HRMS, Konzentration des Modellgemisches ca. 50 µg/L

Hauptursache dafür ist, daß die Wiederholpräzision (6%) den größten Anteil zur Verfahrensunsicherheit beiträgt. Die Wiederholpräzision wiederum wird bei den gezeigten Signal-/ Rausch-Verhältnissen der GC-HRMS (siehe Abbildung 29 ) durch die automatische bzw. manuelle Signalintegration bestimmt. Mehrfachintegrationen haben ergeben, daß hierbei bereits Unsicherheiten von 3 bis 5% auftreten.


85

4.2.4. Kapillarelektrophorese

Während die Kapillarelektrophorese in der medizinischen und pharmazeutischen Analytik bereits weit verbreitet ist, existieren bisher nur wenige Anwendungsbeispiele<144>,<145>,<146> aus der Wasser- und Bodenanalytik<147>,<148>,<149>. In dieser Arbeit wurden kapillarelektrophoretische Trennverfahren für die Analytik von Phenolen entwickelt.

Um die Probleme der hohen konzentrationsbezogenen Nachweisgrenzen der Methode zu überwinden, müssen spezielle Verfahren entwickelt und eingesetzt werden (siehe Kapitel 0 ). Für die Entwicklung und Validierung neuer Anreicherungs- und Trenntechniken zur CE-Phenolanalytik wurde ein Modellgemisch 22 verschiedener Phenole in Isopropanol hergestellt. Dieses Gemisch umfaßte ausgewählte C1-, C2- und C3-Alkylphenole, verschiedene Chlorphenole, Naphthole und Indanole sowie einige Alkoxyphenole. Von diesem Modellgemisch ausgehend wurden verschiedene Verdünnungen in Wasser, Methanol bzw. Acetonitril hergestellt. Die unterste Konzentrationsstufe lag im Bereich von 0,1 mg/L.

Die Trennung und Anreicherung der phenolischen Verbindungen des Modellgemisches konnte erfolgreich mit der neuentwickelten ”Direkten-MEKC-Stacking“-Technik realisiert werden. Für die Validierung dieses Verfahrens wurde ein Ringversuch mit 12 phenolischen Inhaltsstoffen in Wasser organisiert und ausgewertet.

4.2.4.1. Kapillarzonenelektrophorese

Für die Untersuchung ionischer Analyten<150> läßt sich die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) nutzen (siehe Abbildung 7 ). In dieser Arbeit wurde die CZE für die Bestimmung von Pentachlorphenol<151> in Holz eingesetzt. Die Analyse wird in einem Elektrolyt aus Phosphatpuffer und organischen Additiven durchgeführt (siehe Abbildung 35 ). Die Detektion erfolgt bei 214 nm (Absorptionsmaximum für ionisches Pentachlorphenol, vgl. Abbildung 1 ).

Die Schwierigkeit dieses Verfahrens liegt in der Trennung der Analyte von Matrixbegleitstoffen, die bei der Extraktion aus der Matrix mit abgetrennt wurden (Bereich im Elektropherogramm bis 14 min). Weitere Matrixbegleitstoffe im Konzentrationsbereich des Pentachlorphenols lassen sich jedoch auch im Migrationszeitbereich von 17 bis 19 min erkennen. Durch die hohe Trennleistung der CE ist dennoch eine ungestörte Quantifizierung von Analyt und internem Standard möglich.


86

Abbildung 35: Bestimmung von Pentachlorphenol im methanolischen Extrakt einer Holzprobe

Meßparameter: Hewlett-Packard CE-System (HP-CE-3D), Fused-Silica-Kapillare (”Bubble-Cell“): effektive Länge: 72 cm, Innendurchmesser 50 µm, Elektrolyt; 10 mmol/L Natriumdihydrogenphosphat, 20 mmol/L Dinatriumhydrogenphosphat, 15% Acetonitril (v/v), 5% Methanol (v/v), Probenaufgabe: 50 mbar x 12 s Probe, 50 mbar x 15 s Elektrolyt, interner Standard: 2,3,6-Trichlorphenol, c = 1,32 mg/L), DAD-Detektion, abgebildet: 214 nm

Die Bestimmungsgrenzen der CZE liegen für dieses Verfahren bei ca. 1 mg/kg Pentachlorphenol in Holz.

Um die Analyte im Spurenbereich bestimmen zu können, eignet sich für die CZE die Anreicherungstechnik des ”Electro Stacking“<152>,<153> (siehe Abbildung 10 ).

Für die Bestimmung von Pentachlorphenol in Holz wird der Analyt um ca. den Faktor 10 angereichert und so die Bestimmungsgrenze erst bei ca. 100 µg/kg Holz erreicht. Die interne Anreicherung der Probe im Kapillarelektrophoresesystem ist jedoch nicht immer möglich, da ionische Matrixbegleitstoffe ebenfalls angereichert werden und es so zu Querstörungen kommen kann. Selbst mit säulenchromatographischer Vorreinigung und dem Einsatz der SPE kann ein ausreichendes Clean-Up nicht in jedem Fall erreicht werden. Durch Anwendung anderer Trenntechniken wie der MEKC kann diesen Problemen oft ausgewichen werden, da die Analyte bedingt durch das unterschiedliche Trennprinzip andere Migrationseigenschaften und -zeiten haben.


87

4.2.4.2. Micellare Elektrokinetische Chromatographie

Für die Untersuchung neutraler Analyte kann die CZE nicht eingesetzt werden, da diese Substanzen unspezifisch mit der Nettogeschwindigkeit des Elektroosmotischen Flusses transportiert werden. Zur Trennung neutraler Analyte wird die Micellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC) genutzt (siehe Abbildung 11 ).

Bei Einsatz der üblichen Elektrolytsysteme führen Anreicherungstechniken wie ”Electro Stacking“ nach vorausgegangenen Arbeiten119 bei der MEKC nur zu geringem Erfolg.

Auf Basis neuer Entwicklungen auf dem Gebiet der Anreicherungstechniken für Neutralteilchen (siehe Kapitel 3.2.3.4 ) wurde in dieser Arbeit ein neues Verfahren für die Trennung und Anreicherung von neutralen und ionischen Phenolen (unter besonderer Beachtung der Alkylphenole) entwickelt (siehe Abbildung 11) und anhand der für die Trennung und Anreicherung relevanten Parameter<154>,<155> optimiert.

Um die Anreicherungstechnik des ”Direkten-MEKC-Stacking“ einsetzen zu können, ist es erforderlich, den pH-Wert des Elektrolyten im sauren Bereich zu wählen (siehe 0 ). Nach Tabelle 1 liegen bei diesem pH-Wert bis auf einige Chlor- und Nitrophenole alle Analyte als neutrale Spezies vor.

Auf der Basis vorausgegangener Untersuchungen119 wurde ein MEKC-Elektrolyt aus Natriumdihydrogenphosphat-Lösung, SDS-Lösung und organischen Modifiern eingesetzt (50 mmol/L wäßrige Natriumdihydrogenphosphat-Lösung, 100 mmol/L SDS-Lösung, 10% Acetonitril (v/v), 5% Methanol (v/v)). Durch die Natriumdihydrogenphosphat-Lösung wird für den Elektrolyt ein pH-Wert<156> von 4,4 detektiert (die Bezeichnung ”pH-Wert“, die hier der Einfachheit halber genutzt wird, ist in dem Elektrolytsystem fragwürdig, da die Definition des pH-Wertes nur in reinem Wasser gültig ist).

Die konzentrationsbezogenen Nachweisgrenzen des Analysenverfahrens sind davon abhängig, wie stark sich die Analyte anreichern lassen. Dazu muß entsprechend der ”Direkten-MEKC-Stacking“-Technik nach (Kapitel 3.2.3.4 ) möglichst viel Probenlösung dosiert werden (Probenaufgabe durch Anlegen eines Drucks am Probengefäß über einen definierten Zeitraum). Erfahrungsgemäß liegen die Werte in einem Bereich von 50 mbar Druck über 50 bis 180 Sekunden. Die optimalen Werte sind von den physikochemischen Eigenschaften der Analyte abhängig. Daher wurden die Parameter für die maximal mögliche Dosierung ermittelt (siehe Abbildung 36 ).


88

Abbildung 36: Vergleich von unterschiedlichen Dosiermengen

Meßparameter: Hewlett-Packard CE-System (HP-CE-3D), Fused-Silica-Kapillare (”Bubble-Cell“): effektive Länge: 72 cm, Innendurchmesser 50 µm, Elektrolyt; 50 mmol/L Natriumdihydrogenphosphat, 15% Acetonitril (v/v), 5% Methanol (v/v), Probenaufgabe: 50 mbar x 12 s Wasser, 50 mbar x 60 s Probe, 50 mbar x 15 s Elektrolyt, DAD-Detektion, abgebildet: 200 nm

Abbildung 36 zeigt am Beispiel des Modellgemisches die Dosierung der maximal möglichen Probenmenge (50 mbar Druck über 60 Sekunden, B) im Vergleich zur Überdosierung (50 mbar Druck über 180 Sekunden, A). Während die Signale bei 50 mbar Druck über 60 Sekunden noch basisliniengetrennt sind, kommt es bei der Überdosierung durch Peaktailing zu Überlagerungen, die eine Quantifizierung der Analyse erschweren. Dieser Nachteil wird auch durch die höhere Signalintensität von A im Verhältnis zu B nicht ausgeglichen.

Bedingt durch die Eigenschaft der Phenole, Wasserstoffbrückenbindungen auszubilden, ist die maximal dosierbare Probenmenge dieser Verbindungsklasse vergleichsweise gering. Es wird vermutet, daß die Phenole bevorzugt von einer Hydrathülle umgeben sind. Die Anzahl der an der Hydrathülle beteiligten Moleküle entspricht dabei einer statistischen Verteilung. Die verschieden großen Analyt-Hydrat-Addukte haben geringfügig unterschiedliche Retentionszeiten, so daß es beim Trennprozeß zu Peakverbreiterungen und Peakverdopplungen kommt. Bei der Trennung von Nitroaromaten ist beispielsweise die vergleichsweise hoheProbendosierung von 50 mbar Druck über 180 Sekunden noch


89

störungsfrei möglich, da diese Substanzen keine Hydrate bilden und die oben genannten Effekte nicht auftreten.

Die Trennschärfe der Analyse ist von der Wanderungsgeschwindigkeit der Micellen während des Anreicherungsprozesses abhängig. Je schneller die Analyte mit den Micellen durch die Probenlösung an die Konzentrationsgrenze beim Elektrolyt gelangen (vgl. Abbildung 11 ), desto schmaler werden die Analytsignale, wodurch wiederum die Trennschärfe erhöht wird. Dieser Effekt kann durch Dosierung von etwas Wasser (”Wasserplug“) vor der Probe verstärkt werden, da so der Feldstärkengradient noch erhöht wird und die Micellen zusätzlich beschleunigt werden.

Für die Reproduzierbarkeit der Messungen ist es vorteilhaft, nach der Probe noch Elektrolyt auf die Säule zu dosieren (50 mbar Druck über 15 Sekunden). Dadurch müssen die Micellen zu Beginn des Trennprozesses nicht erst aus dem Elektrolytgefäß in die Kapillare wandern, sondern liegen bereits in der Säule vor.

Für die Bestimmung von phenolischen Verbindungen mit der entwickelten ”Direkten-MEKC-Stacking“-Technik wurden daher folgende Parameter für die Dosierung eingesetzt: 50 mbar Druck über 12 Sekunden Wasser, 50 mbar Druck über 60 Sekunden Probe, 50 mbar Druck über 15 Sekunden Elektrolyt. Die konzentrationsbezogenen Nachweisgrenzen der Kapillarelektrophorese lassen sich durch Einsatz spezieller Säulen weiter absenken. Der Einfluß der ”Bubble-Cell“-Kapillare (siehe 3.2.3.1 ) auf die Nachweisgrenzen ist in Abbildung 37 dargestellt. Die Aufnahme in A erfolgte mit einer Standardkapillare, die in B mit einer ”Bubble-Cell“-Kapillare. Die elektrophoretische Auflösung ist für beide Kapillartypen nahezu identisch. Bei gleicher Dosiermenge der Probe läßt sich mit der ”Bubble-Cell“-Kapillare eine Zunahme des Signal-/ Rausch-Verhältnisses von größer 3:1 erzielen, da die optische Weglänge des Detektorstrahls durch die Analytlösung entsprechend länger ist. Der Wechsel zwischen beiden Kapillartypen ist ohne jede Änderung der CE-Verfahrensparameter möglich.

Das Verfahren des ”Direkten-MEKC-Stacking“ ist nicht für stark hydrophile Substanzen geeignet. Die Analyte müssen eine minimale Aufenthaltswahrscheinlichkeit in der micellaren

Phase des Elektrolyten haben (siehe Kapitel 3.2.3.3 ). Anderenfalls werden sie mit dem EOF an der Injektionsseite aus dem System herausgespült. Dieser Effekt wird bei der Analytik der Verbindung Phenol deutlich. Diese Substanz hat von allen untersuchten phenolischen Verbindungen die niedrigste Aufenthaltswahrscheinlichkeit in der micellaren


90

Phase des Elektrolyten und daher die längste Migrationszeit (64,3 min). Bedingt durch die Diffusion ist das Signal für Phenol stark verbreitert und die Auswertung dadurch fehlerbehaftet.

Abbildung 37: Vergleich des Nachweisvermögens für Normal- und ”Bubble-Cell“-Kapillaren

Meßparameter: Hewlett-Packard CE-System (HP-CE-3D), Fused-Silica-Kapillare: oben Standardkapillare, effektive Länge: 92 cm (daher sind die absoluten Migrationszeiten der Analyte im Vergleich zur ”Bubble-Cell“-Kapillare länger), Innendurchmesser 50 µm, ”Bubble-Cell“-Kapillare: effektive Länge: 72 cm, Innendurchmesser 50 µm, Elektrolyt; 50 mmol/L Natriumdihydrogenphosphat, 15% Acetonitril (v/v), 5% Methanol (v/v), Probenaufgabe: 50 mbar x 12 s Wasser, 50 mbar x 60 s Probe, 50 mbar x 15 s Elektrolyt, DAD-Detektion, abgebildet: 200 nm

Das entwickelte Verfahren ermöglicht es, Phenole im Konzentrationsbereich von 0,2 bis 5 mg/L zu bestimmen. Die Bestimmungsgrenzen sind dabei von der Matrix der Analyte abhängig. Liegen rein wäßrige Lösungen vor, kann die Probe direkt dosiert werden. Befinden sich die Analyte dagegen in einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wie Methanol oder Acetonitril, muß die Probe vor der Dosierung 4:1 mit Wasser verdünnt werden. Anderenfalls wird das Gleichgewicht zwischen micellarer und wäßriger Phase im Elektrolyt gestört, so daß die Trennung der Analyte nicht gelingt. Dadurch liegen die realen Nachweisgrenzen für Proben in organischen Lösungsmitteln um den Faktor 5 über denen in rein wäßrigen Systemen.


91

4.2.4.3. Validierung des CE-Verfahrens

Das entwickelte Analysenverfahren zur Bestimmung von Phenolen mit der ”Direkten-MEKC-Stacking“-Technik in wäßrigen und polaren Lösungsmitteln wurde in eine Labor-Standardarbeitsanweisung (STAA-BAM-I.23-001<157>) überführt und validiert. Zur Verfahrensoptimierung und -erarbeitung war es zuvor notwendig, wie bei der GC-MS (siehe Kapitel 0 ) die Einzelschritte zu prüfen und mehrfach zu wiederholen.

Zur elektrophoretischen Trennung werden Fused-Silica-Kapillaren (effektive Länge: 72 cm, 0,5 µm Innendurchmesser) eingesetzt. Die für die Trennung angelegte Spannung betrug -24 kV. Das Trennsystem wurde bei 20°C konstant temperiert. Vor jeder Analyse muß die Fused-Silica-Kapillare mit Natronlauge (c = 0,5 mol/L), Wasser und Elektrolyt konditioniert werden.

Die Detektion der Substanzen erfolgt mit einem Dioden-Array-Detektor. Es muß beachtet werden, daß bei diesem Verfahren die Analyte vorwiegend als neutrale Spezies detektiert werden. Die UV-vis-Spektren unterscheiden daher sich von denen der ionischen Spezies der Analyte (siehe Kapitel 4.2.3.3). Die Quantifizierung erfolgte bei einer Wellenlänge von 200 nm, bei der die meisten der untersuchten Substanzen ein Absorptionsmaximum haben.

Zum Ausgleich verfahrensbedingter Schwankungen der Migrationszeiten und Intensitäten (Alterung des Elektrolyten, und Intensitätsschwankungen in der UV-Quelle) wurde die Technik des Internen Standards verwendet. Als interner Standard wurde 2-Hydroxybiphenyl eingesetzt, da diese Substanz bisher noch in keiner der untersuchten natürlichen Matrices detektiert wurde.

Das Verfahren wurde entsprechend der Standardarbeitsanweisung bearbeitet und validiert<158>. Bestandteile dieser Standardarbeitsanweisung sind die gravimetrische Herstellung und Verdünnung der Modellgemische und die Messung und Auswertung der Elektropherogramme.

Die Wiederholpräzision wurde durch Messung der relativen Peakflächen des Modellgemisches (siehe Kapitel 4.2.4) bei einer Konzentration von 1 mg/kg über 10 direkt hintereinander durchgeführte Messungen für alle Analyte im Mittel zu 10% bestimmt. Der Nachweis von Selektivität und Spezifität erfolgte durch Zuordnung der Migrationszeiten und UV-vis-Spektren. Die Unsicherheit der Probenvorbereitung zur Herstellung der synthetischen Proben beschränkt sich auf die Einwaage und Verdünnung. Da bei der Messung unterschiedlicher Proben im Rahmen der Wiederholpräzision keine signifikanten


92

Abweichungen der Mittelwerte festgestellt wurden, wird der Anteil der Unsicherheit der Probenvorbereitung an der Verfahrensunsicherheit ebenso wie bei der GC-MS zu unter 1% abgeschätzt. Die Kalibrierkurven sind über 2 Größenordnungen (0,05 bis 5 mg/L) linear. Die Bestimmungsgrenzen liegen analytabhängig zwischen 0,06 und 0,2 mg/L (die Nachweisgrenzen ca. um den Faktor 2 niedriger).

Die absoluten Retentionszeiten können bei Alterung des Elektrolyten erheblich schwanken. Die Streuung der relativen Retentionszeiten (bezogen auf die Retentionszeit des internen Standards) liegt jedoch bei unter 5%, wenn der Elektrolyt nach maximal 2 Wochen ausgetauscht wird.

Die Validierung wurde neben den aufgeführten Analyten (siehe Tabelle 5) noch für weitere phenolische Verbindungen durchgeführt (Phenol, 3-Ethylphenol, 2,3-Dimethylphenol, 2,3,6-Trimethylphenol, 2,6-Dimethoxyphenol, 2-Naphthol, 5-Indanol, 2-Methyl-4,6-dinitrophenol, 2,3,6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol). An dieser Stelle wird jedoch auf die Auflistung ihrer Validierungsparameter verzichtet.

In Tabelle 5 sind ausgewählte Parameter der Validierung aufgeführt. Die Korrelationskoeffizienten wurden für die Kalibrierung einer Analysenreihe beispielhaft angegeben.

Tabelle 5: Ausgewählte Validierungsparameter des ”Direkten-MEKC-Stacking“-Verfahrens

Substanzname

mittlere RT/ min

Bestimmungsgrenze/ (mg/L)

Korrelationskoeffizienten

2,4,6-Trichlorphenol (2,4,6-TCP)

15,26

0,111

0,9873

2-Hydroxybiphenyl

15,69

0,106

ISTD

2,4-Dichlorphenol (2,4-DCP)

15,78

0,204

0,9742

1-Naphthol

16,63

0,109

0,9967

2,4,6-Trimethylphenol (2,4,6-TMP)

16,94

0,086

0,9995

4-Ethylphenol (4-EtP)

18,65

0,085

0,9943

2,4-Dimethylphenol (2,4-DMP)

18,93

0,062

0,9990

2,6-Dimethylphenol (2,6-DMP)

20,25

0,080

0,9992

2,4-Dinitrophenol (2,4-DNP)

22,53

0,199

0,9902

4-Methylphenol (4-MP)

24,52

0,141

0,9935

2-Methylphenol (2-MP)

25,03

0,141

0,9961

4-Nitrophenol (4-NP)

25,65

0,198

0,9955

3-Methoxyphenol (3-MeOP)

33,81

0,148

0,9979

Abbildung 38 und Abbildung 39 (Abkürzungen der Analyte siehe Tabelle 5) zeigen die aus mehreren Messungen bestimmten Mittelwerte für zwei Konzentrationsniveaus (0,5 und 1,0 mg/kg) des Modellgemisches in der Matrix Wasser sowie die dazugehörigen Standardabweichungen (Berechnung für eine Stichprobe aus einer Grundgesamtheit). Zusätzlich sind die Analyt-Sollkonzentrationen (Einwaage) für die Einzelverbindungen angegeben. Für jede Einzelmessung wurde gesondert eine Kalibrierreihe erstellt, wofür


93

jeweils 5 Kalibrierlösungen unterschiedlicher Konzentration hergestellt und gemessen wurden (Meßzeit für eine Reihe ca. 5 Stunden). Mit einer Kalibrierreihe lassen sich beide angegebenen Niveaus analysieren. Die Konzentrationsangaben beziehen sich auf die Menge an Analyt in Menge der Gemischprobe. Diese Angabe resultiert daraus, daß aus Genauigkeitsgründen die Lösungen nicht volumetrisch, sondern gravimetrisch hergestellt wurden (die Unsicherheit der volumetrischen Verdünnung ist größer als die der gravimetrischen Verdünnung). Innerhalb jeder Einzelmessung wurden jeweils die 12 Analyte des Modellgemisches quantifiziert. In Tabelle 15 und Tabelle 16 im Anhang sind die zu den Abbildungen gehörigen Zahlenwerte sowie die prozentuale Meßwertstreuung (Präzision) und die prozentuale Abweichung der Mittelwerte von der Sollkonzentration (Richtigkeit) für jede Einzelverbindung aufgelistet.

Abbildung 38 zeigt die Mittelwerte und Standardabweichungen für die Validierungsmessungen im Konzentrationsbereich von 1,0 mg/kg. Die Werte weichen durchschnittlich um 6% von den Sollwerten ab und streuen dabei um 6%. Damit liegen die statistischen Abweichungen im Bereich der Wiederholpräzision (Einzelwerte: siehe Anhang, Tabelle 15).

Abbildung 38: Parameter für das ”Direkte-MEKC-Stacking“-Verfahren, Konzentration der Analyte der Analyte ca. 1 mg/kg


94

Auch im unteren Konzentrationsbereich (0,5 mg/kg, siehe Abbildung 39 ) liegen die Abweichungen von der Sollkonzentration durchschnittlich bei 10% und streuen im Bereich von 8%. Da dieses Konzentrationsniveau in der Größenordnung der Bestimmungsgrenze liegt, wird der Einfluß von Störsignalen des Untergrundes deutlich. So ist beispielsweise das Signal für 1-Naphthol durch Überlagerung mit einem Untergrundsignal gestört. Die statistischen Abweichungen liegen daher über 20% (siehe Anhang Tabelle 16).

Abbildung 39: Parameter für das ”Direkte-MEKC-Stacking“-Verfahren, Konzentration der Analyte ca. 0,5 mg/kg

Für die Bestimmung der Vergleichspräzision ist es erforderlich, das Verfahren in einem Ringversuch zu überprüfen. Da die Kapillarelektrophorese bisher in der Umweltanalytik kaum eingesetzt wird, wurde in dieser Arbeit ein Ringversuch zur Ermittlung der Verfahrenskenndaten durchgeführt (siehe 0 ). Danach ergeben sich für die Vergleichspräzision Werte von durchschnittlich 10% (analyt- und konzentrationsabhängig).


95

4.2.4.4. Durchführung eines Ringversuches

Für die im Rahmen der Validierung des Analysenverfahrens zur Bestimmung von Phenolen mit der ”Direkten-MEKC-Stacking“-Technik (Kapitel 4.2.4.3 ) notwendige Abschätzung der Vergleichspräzision wurde ein Ringversuch organisiert und durchgeführt.

Der Ringversuch diente gleichzeitig der Prüfung, ob und mit welchen Unsicherheiten synthetisch hergestellte wäßrige Lösungen phenolischer Verbindungen als Referenzmaterial einsetzbar sind (siehe Kapitel 5). Darüber hinaus sollte der Ringversuch die Möglichkeiten der MEKC als Referenzverfahren für die Zertifizierung von Referenzmaterialien prüfen.

Dieser Ringversuch ist nach Wissen des Autors der erste, der in Deutschland mit der Kapillarelektrophorese im Bereich der Umweltanalytik durchgeführt wurde. Da die Kapillarelektrophorese von Routineanalytik-Laboratorien in der Umweltanalytik bisher kaum eingesetzt wird, bestand ein generelles Problem darin, Teilnehmer für den Ringversuch zu gewinnen, die in der Lage waren, diese Messungen durchzuführen.

Für die statistische Absicherung der Ringversuchsergebnisse ist die Teilnahme von mindestens 6 Laboratorien erforderlich. Zu Beginn des Ringversuches wurde jedoch trotz umfangreicher Werbung um Teilnehmer nur die Mindestanzahl von 6 Laboratorien erreicht.

Leider waren von den 6 teilnehmenden Laboratorien nur 3 in der Lage, Ergebnisse zu liefern (teils aus personellen Gründen, teils aus mangelnder Erfahrung mit der MEKC). Die positiven Ringversuchsergebnisse erlauben daher keine statistisch abgesicherte Bestimmung der Vergleichspräzision, sondern nur eine Abschätzung ihrer minimalen Größe.

In dieser Arbeit werden neben ausgewählten Einzelergebnissen die laborübergreifenden Statistiken präsentiert. Die vollständige Auswertung der Ergebnisse ist im Bericht zum Ringversuch BAM-OCA-027<159> dargestellt.

Für den Ringversuch wurden Proben für die Bestimmung von 12 phenolischen Verbindungen in der Matrix Wasser präpariert. Sämtliche Analyteinwaagen und Verdünnungen wurden dabei gravimetrisch durchgeführt, um die Unsicherheit bei der Herstellung der Probe zu minimieren.

Es wurden 7 Lösungen unterschiedlicher Konzentration im Bereich von 0,1 bis 2,0 mg/kg hergestellt. Fünf dieser Lösungen dienten der Kalibrierung, zwei Proben der Konzentrationsniveaus 0,5 und 1,5 mg/kg wurden als Unbekannte gekennzeichnet. Allen Gemischen wurde als interner Standard 2-Hydroxybiphenyl zugesetzt.


96

Die Kalibrierlösungen, die unbekannten Proben und die Lösungen der Einzelsubstanzen wurden an die Ringversuchsteilnehmer verschickt. Um die Stabilität der Lösungen für die Zeit des postalischen Probentransports zu gewährleisten, wurden sie bei Raumtemperatur gelagert und nach unterschiedlichen Zeitabständen untersucht. Es zeigte sich, daß die Proben bei Raumtemperatur maximal eine Woche gelagert werden können. Durch Abbauprozesse ist eine quantitative Auswertung der Probe zu stark fehlerbehaftet. Da die Proben durch den postalischen Versand nur ca. 1 bis 2 Tage nicht gekühlt wurden, ist die Vergleichbarkeit der Ergebnisse gewährleistet (siehe Kapitel 5).

Die Messungen wurden von allen teilnehmenden Laboratorien nach der erarbeiteten Standardarbeitsanweisung (STAA-BAM-I.23-001158) durchgeführt.

Die Tabellen 6 bis 8 listen die Werte für die Analyt-Sollkonzentrationen und die detektierten Mittelwerte der Laboratorien sowie die prozentuale Meßwertstreuung (Präzision) und die prozentuale Abweichung der Mittelwerte von der Sollkonzentration (Richtigkeit) innerhalb des jeweiligen Laboratoriums für zwei Konzentrationsniveaus auf.

Tabelle 6: Statistische Werte für Laboratorium A, N = 4 Probenmessungen

Probe

Substanzname

Sollkonzentration/

(mg/kg)

Mittelwert/

(mg/kg)

Standard-

abweichung

Streuung/

(+/- %)

Abweichung/

(+/- mg/kg)

Abweichung/

(%)

Probe A

2,4,6-Trichlorphenol

1,108

1,133

0,040

3,6

0,025

2,2

 

2,4-Dichlorphenol

1,041

0,988

0,044

4,5

-0,054

-5,4

 

1-Naphthol

1,083

1,203

0,050

4,2

0,121

10,0

 

2,4,6-Trimethylphenol

1,055

1,023

0,012

1,2

-0,032

-3,2

 

4-Ethylphenol

1,048

1,154

0,052

4,5

0,106

9,2

 

2,4-Dimethylphenol

1,021

1,094

0,050

4,6

0,073

6,7

 

2,6-Dimethylphenol

1,092

1,197

0,072

6,1

0,104

8,7

 

2,4-Dinitrophenol

0,992

0,987

0,079

8,0

-0,005

-0,5

 

4-Methylphenol

1,010

1,067

0,094

8,8

0,057

5,3

 

2-Methylphenol

1,008

1,025

0,098

9,6

0,017

1,7

 

4-Nitrophenol

0,990

0,919

0,059

6,4

-0,071

-7,7

 

3-Methoxyphenol

0,975

1,128

0,102

9,0

0,154

13,6

Probe B

2,4,6-Trichlorphenol

0,553

0,510

0,041

8,1

-0,043

-8,4

 

2,4-Dichlorphenol

0,519

0,484

0,037

7,6

-0,035

-7,2

 

1-Naphthol

0,540

0,684

0,142

20,8

0,144

21,1

 

2,4,6-Trimethylphenol

0,526

0,489

0,011

2,3

-0,037

-7,5

 

4-Ethylphenol

0,523

0,592

0,058

9,8

0,069

11,7

 

2,4-Dimethylphenol

0,509

0,544

0,012

2,3

0,035

6,5

 

2,6-Dimethylphenol

0,545

0,594

0,018

2,9

0,050

8,4

 

2,4-Dinitrophenol

0,494

0,510

0,067

13,0

0,017

3,2

 

4-Methylphenol

0,503

0,572

0,030

5,2

0,069

12,1

 

2-Methylphenol

0,502

0,556

0,022

3,9

0,054

9,7

 

4-Nitrophenol

0,493

0,517

0,013

2,5

0,024

4,6

 

3-Methoxyphenol

0,486

0,596

0,080

13,5

0,110

18,4

Die Werte aus Laboratorium A (siehe Tabelle 6) ergeben für die Abweichung der Mittelwerte von der Sollkonzentration durchschnittlich 8% bei einer Streuung von 5%.


97

Tabelle 7: Statistische Werte für Laboratorium B, N = 2 Probenmessungen

Probe

Substanzname

Sollkonzentration/

(mg/kg)

Mittelwert/

(mg/kg)

Standard-

abweichung

Streuung/

(+/- %)

Abweichung/

(+/- mg/kg)

Abweichung/

(%)

Probe A

2,4,6-Trichlorphenol

1,108

1,003

1 Wert

1 Wert

-0,105

-10,5

 

2,4-Dichlorphenol

1,041

1,054

0,039

3,7

0,012

1,2

 

1-Naphthol

1,083

1,095

0,033

3,0

0,012

1,1

 

2,4,6-Trimethylphenol

1,055

1,108

0,156

14,1

0,052

4,7

 

4-Ethylphenol

1,048

0,997

0,063

6,3

-0,052

-5,2

 

2,4-Dimethylphenol

1,021

1,072

0,154

14,4

0,051

4,8

 

2,6-Dimethylphenol

1,092

1,361

0,274

20,2

0,269

19,7

 

2,4-Dinitrophenol

0,992

0,918

0,130

14,2

-0,074

-8,0

 

4-Methylphenol

1,010

1,062

0,088

8,3

0,052

4,9

 

2-Methylphenol

1,008

0,951

0,097

10,2

-0,057

-6,0

 

4-Nitrophenol

0,990

0,829

0,290

35,0

-0,161

-19,4

 

3-Methoxyphenol

0,975

0,931

0,107

11,5

-0,044

-4,7

Probe B

2,4,6-Trichlorphenol

0,553

0,506

0,040

8,0

-0,047

-9,3

 

2,4-Dichlorphenol

0,519

0,487

0,190

39,1

-0,032

-6,7

 

1-Naphthol

0,540

0,487

0,110

22,5

-0,053

-10,9

 

2,4,6-Trimethylphenol

0,526

0,542

0,011

2,0

0,015

2,9

 

4-Ethylphenol

0,523

0,451

0,017

3,8

-0,072

-15,9

 

2,4-Dimethylphenol

0,509

0,505

0,054

10,8

-0,004

-0,9

 

2,6-Dimethylphenol

0,545

0,629

0,292

46,5

0,084

13,4

 

2,4-Dinitrophenol

0,494

0,497

0,035

7,0

0,003

0,5

 

4-Methylphenol

0,503

0,519

0,008

1,5

0,015

2,9

 

2-Methylphenol

0,502

0,546

0,025

4,5

0,043

7,9

 

4-Nitrophenol

0,493

0,467

0,057

12,1

-0,026

-5,6

 

3-Methoxyphenol

0,486

0,472

0,046

9,7

-0,014

-3,1

Die Werte aus Laboratorium B (siehe Tabelle 7) ergeben für die Abweichung der Mittelwerte von der Sollkonzentration durchschnittlich 7% bei einer Streuung von 12%. Die Werte aus Laboratorium C (siehe Tabelle 8) ergeben für die Abweichung der Mittelwerte von der Sollkonzentration durchschnittlich 5% bei einer Streuung von 6%.

Tabelle 8: Statistische Werte für Laboratorium C, N = 4 Probenmessungen

Probe

Substanzname

Sollkonzentration/

(mg/kg)

Mittelwert/

(mg/kg)

Standard-

abweichung

Streuung/

(+/- %)

Abweichung/

(+/- mg/kg)

Abweichung/

(%)

Probe A

2,4,6-Trichlorphenol

1,108

1,066

0,058

5,5

-0,043

-4,0

 

2,4-Dichlorphenol

1,041

1,011

0,042

4,2

-0,030

-3,0

 

1-Naphthol

1,083

1,125

0,034

3,0

0,042

3,7

 

2,4,6-Trimethylphenol

1,055

1,119

0,085

7,6

0,064

5,7

 

4-Ethylphenol

1,048

1,101

0,057

5,2

0,053

4,8

 

2,4-Dimethylphenol

1,021

1,084

0,060

5,6

0,063

5,8

 

2,6-Dimethylphenol

1,092

1,177

0,091

7,7

0,084

7,1

 

2,4-Dinitrophenol

0,992

0,925

0,078

8,5

-0,066

-7,2

 

4-Methylphenol

1,010

1,074

0,091

8,5

0,064

5,9

 

2-Methylphenol

1,008

1,077

0,092

8,6

0,069

6,4

 

4-Nitrophenol

0,990

0,969

0,024

2,5

-0,022

-2,2

 

3-Methoxyphenol

0,975

1,078

0,076

7,1

0,103

9,6

Probe B

2,4,6-Trichlorphenol

0,553

0,540

0,016

3,0

-0,012

-2,3

 

2,4-Dichlorphenol

0,519

0,525

0,025

4,7

0,006

1,2

 

1-Naphthol

0,540

0,512

0,039

7,6

-0,028

-5,5

 

2,4,6-Trimethylphenol

0,526

0,591

0,038

6,4

0,065

10,9

 

4-Ethylphenol

0,523

0,579

0,023

4,0

0,056

9,7

 

2,4-Dimethylphenol

0,509

0,573

0,025

4,3

0,064

11,2

 

2,6-Dimethylphenol

0,545

0,585

0,016

2,7

0,040

6,9

 

2,4-Dinitrophenol

0,494

0,462

0,040

8,7

-0,032

-7,0

 

4-Methylphenol

0,503

0,542

0,021

3,8

0,039

7,1

 

2-Methylphenol

0,502

0,515

0,015

3,0

0,013

2,6

 

4-Nitrophenol

0,493

0,494

0,074

15,0

0,001

0,1

 

3-Methoxyphenol

0,486

0,511

0,023

4,5

0,025

4,8


98

Die Tabellen 6 bis 8 zeigen, daß die Messungen der verschiedenen Laboratorien für die Richtigkeit und Präzision des Analysenverfahrens Meßunsicherheiten von 5 bis 10% liefern.

Die Abweichung der Labormittelwerte vom Sollwert läßt sich graphisch in Form von sogenannten Z-Scores darstellen. Die Z-Scores geben die Abweichungen der Mittelwerte von der Sollkonzentration in Einheiten der Vergleichsstandardabweichung des Ringversuchs an. Die Vergleichsstandardabweichung steigt üblicherweise mit der Anzahl der Teilnehmer. Als obere Grenze des Toleranzbereiches ist der Wert für Z = 2 angenommen. Wegen der niedrigen Anzahl der Teilnehmer liegt der Toleranzbereich für diesen Ringversuch in sehr schmalen Grenzen. In Abbildung 40 sind die Z-Scores des Ringversuchs für Probe A (ca. 1 mg/kg) dargestellt (Abkürzungen der Substanznamen siehe Tabelle 5).

Abbildung 40: Darstellung der Z-Scores für die Probe A (ca. 1 mg/kg)

Wie aus der Abbildung hervorgeht, liegt nur ein Wert eines Labors (2,6-Dimethylphenol, Laboratorium B) knapp außerhalb des Toleranzbereiches.

Bei Probe B (ca. 0,5 mg/kg) liegen die Z-Scores für alle Analyte und Laboratorien innerhalb des Toleranzbereiches ( Abbildung 41 ).


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Abbildung 41: Darstellung der Z-Scores für die Probe B (ca. 0,5 mg/kg)

Um die Vergleichspräzision (näherungsweise) zu bestimmen, wurden die Werte der Laboratorien gemeinsam ausgewertet. Dazu wurden die Gesamtmittelwerte und Standardabweichungen aus den Einzelwerten aller Laboratorien bestimmt. Die Gesamtmittelwerte der Probe sind mit den zugehörigen Standardabweichungen (Berechnung für eine Stichprobe aus einer Grundgesamtheit) dargestellt.

Abbildung 42 zeigt die Gesamtmittelwerte und Standardabweichungen für alle Ringversuchsteilnehmer der Probe des Konzentrationsbereichs 1,0 mg/kg. Die Werte weichen durchschnittlich 5% von den Sollwerten ab. Die Vergleichspräzision des Verfahrens in diesem Konzentrationsbereich (entspricht der Spalte Streuung in Tabelle 17, siehe Anhang) ergibt sich damit näherungsweise zu 8%. Im unteren Konzentrationsbereich (0,5 mg/kg) liegen die Abweichungen von der Sollkonzentration bei durchschnittlich 5% und die Vergleichspräzision näherungsweise bei 11% (siehe Abbildung 43 und siehe Tabelle 18 im Anhang).

Die Auswertung des Ringversuchs zeigt, daß das entwickelte Verfahren zur Bestimmung von Phenolen mit der Kapillarelektrophorese geeignet ist, Analyte im Konzentrationsbereich von 0,05 bis 5 mg/kg mit etwa 10% Präzision und einer relativen Genauigkeit von minimal 5% unabhängig vom Meßlaboratorium zu bestimmen. Durch die hohe Genauigkeit der absoluten Gehaltsbestimmung konnte gleichzeitig der Nachweis erbracht werden, daß die entsprechend dem beschriebenen Verfahren gravimetrisch hergestellten synthetischen Proben die Voraussetzungen für den Einsatz als Referenzmaterial erfüllen (siehe Kapitel 5).


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Abbildung 42: Mittelwerte und Standardabweichungen über alle Laboratorien für das ”Direkte-MEKC-Stacking“-Verfahren, Konzentration der Analyte ca. 1 mg/kg

Abbildung 43: Mittelwerte und Standardabweichungen über alle Laboratorien für das ”Direkte-MEKC-Stacking“-Verfahren, Konzentration der Analyte ca. 0,5 mg/kg


Fußnoten:
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