Untersuchungen zur Biotransformation und Toxizität mit
der Hepatomzellinie Hep G2 im Vergleich zu
Primärkulturen der Wistarratte

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat)
im Fach Pharmazie

eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der
Humboldt-Universität zu Berlin

von
Katrin Imke Mühlenfeld

geboren am 11.8.1968, Berlin

Präsident:
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Dr. h.c. H. Meyer

Dekan:
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. J.P. Rabe

Gutachter:
1. Prof. Dr. habil. A. Langner
2. Prof. Dr. habil. H.-H. Borchert
3. PD Dr. habil. A. Baumann

Tag der mündlichen Prüfung: 25.10.1999

Inhaltsverzeichnis

• 1 Einleitung und Problemstellung
• 2 Charakterisierung der verwendeten in-vitro-Testsysteme
  • 2.1 Die Zellkulturen
    • 2.1.1 Die Hep G2-Kultur
      • 2.1.1.1 Morphologie
      • 2.1.1.2 Kultivierung
    • 2.1.2 Die Hepatozytenkultur
      • 2.1.2.1 Isolation der Hepatozyten
      • 2.1.2.2 Kultivierung
    • 2.1.3 Die Lymphozytenkultur
      • 2.1.3.1 Isolation
      • 2.1.3.2 Kultivierung
  • 2.2 Subzelluläre Fraktionen
  • 2.3  Fremdstoffmetabolische Charakterisierung
    • 2.3.1  7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung
      • 2.3.1.1  7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung durch Hep G2- und Rattenhepatozyten-kulturen
      • 2.3.1.2 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung in Zellhomogenaten und in subzellulären Fraktionen
      • 2.3.1.3  7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung durch Rattenlymphozytenkulturen
    • 2.3.2 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung
      • 2.3.2.1 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung durch Hep G2- und Rattenhepatozyten-kulturen
      • 2.3.2.2 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung durch Zellhomogenate und subzelluläre Fraktionen
    • 2.3.3 Aminophenazon-N-demethylierung
      • 2.3.3.1 Aminophenazon-N-demethylierung durch Hep G2- und Rattenhepatozyten-kulturen
      • 2.3.3.2 Aminophenazon-N-demethylierung durch Zellhomogenate und isolierte Zellorganellen
    • 2.3.4  4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen-Reduktion
      • 2.3.4.1  4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen-Reduktion durch Hep G2- und Rattenhepato-zytenkulturen
      • 2.3.4.2  4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen-Reduktion durch Zellhomogenate und subzelluläre Fraktionen
      • 2.3.4.3 4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen-Reduktion durch Rattenlymphozytenkulturen
    • 2.3.5  p-Nitrophenol-Konjugation
      • 2.3.5.1  p-Nitrophenolkonjugation durch Hep G2- und Rattenhepatozytenkulturen
      • 2.3.5.2 p-Nitrophenolkonjugation in Zellhomogenaten und subzellulären Fraktionen
• 3  Untersuchungen zur Biotransformation von 3 potentiellen Arzneistoffen durch Hep G2-Zellen
  • 3.1 AWD 100-041
    • 3.1.1 Aufklärung der durch Hep G2-Kulturen gebildeten Metaboliten
    • 3.1.2 Vergleich des Metabolitenspektrums von Hep G2-Zellen mit Versuchen an der Wistar-Ratte
  • 3.2  AR 12463
    • 3.2.1 Aufklärung der durch Hep G2-Kulturen gebildeten Metaboliten
    • 3.2.2  Vergleich des Metabolitenspektrums von Hep G2-Zellen mit Versuchen an der Wistar-Ratte
  • 3.3 FLM 5011
    • 3.3.1 Aufklärung der durch Hep G2-Kulturen gebildeten Metaboliten
    • 3.3.2  Vergleich des Metabolitenspektrums von Hep G2-Zellen mit Versuchen an der Wistar-Ratte
• 4  Zytotoxizitäts- und Proliferationsuntersuchungen mit Hilfe von Hep G2-Zellen
  • 4.1 Proliferation und Zytotoxizität
    • 4.1.1 Die Testsysteme
      • 4.1.1.1 Der LDH Test
      • 4.1.1.2  Bestimmung des DNA-Gehalts mit bisBenzimid
      • 4.1.1.3 Bestimmung des Proteingehalts mit Amidoschwarz
    • 4.1.2 Die Testsubstanzen
      • 4.1.2.1  AWD 100-041
      • 4.1.2.2 AR 12463
      • 4.1.2.3  FLM 5011
      • 4.1.2.4  Solanum lycopersicon
      • 4.1.2.5  3-Methylcholanthren
      • 4.1.2.6  Phenobarbital
      • 4.1.2.7 Clofibrat
      • 4.1.2.8  DMSO
      • 4.1.2.9 Vergleich von DMSO mit anderen Lösungsmitteln
      • 4.1.2.10  7-Ethoxyresorufin
  • 4.2  Apoptose
    • 4.2.1 Erkennen von Apoptose
    • 4.2.2 Nachweis von apoptotischen Vorgängen nach Inkubation mit FLM 5011
• 5  Diskussion und Zusammenfassung
• 6 Experimenteller Teil
  • 6.1 Geräte
  • 6.2 Substanzen und Kulturzubehör
  • 6.3 Zellkulturen und Versuchstiere
  • 6.4 Sterilisation
  • 6.5 Kultivierung der Hep G2-Zellen
    • 6.5.1  Medium und Kultivierungsbedingungen
    • 6.5.2  Kultivierung an Cytodex®
  • 6.6 Kultivierung der Hepatozyten
    • 6.6.1  Isolation
    • 6.6.2 Medium und Kultivierungsbedingungen
  • 6.7  Kultivierung der Lymphozyten
    • 6.7.1 Isolation
    • 6.7.2 Medium und Kultivierungsbedingungen
  • 6.8  Modellreaktionen
    • 6.8.1  7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung
    • 6.8.2 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung
    • 6.8.3  Aminophenazon-N-demethylierung
    • 6.8.4 4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen-Reduktion
    • 6.8.5  p-Nitrophenol-Konjugation
    • 6.8.6 Bestimmung der Enzymaktivitäten in Ultraschall-behandelten Zellkulturen
    • 6.8.7 Bestimmung der Enzymaktivitäten in isolierten Zellorganellen von Hep G2-Zellen
  • 6.9 Statistische Auswertung
  • 6.10 Biotransformation von potentiellen Arzneistoffen
    • 6.10.1 AWD 100-041
      • 6.10.1.1 Gewinnung der Metaboliten
      • 6.10.1.2  Isolation und Identifikation der Metaboliten mittels HPLC
      • 6.10.1.3 Identifikation der Metaboliten mittels DC
      • 6.10.1.4  Identifizierung der Metaboliten mittels MS
    • 6.10.2 AR 12463
      • 6.10.2.1 Gewinnung der Metaboliten
      • 6.10.2.2 Isolation und Identifikation der Metaboliten mittels HPLC
      • 6.10.2.3 Identifikation der Metaboliten mittels DC
      • 6.10.2.4 Identifikation der Metaboliten mittels von GC/MS
    • 6.10.3  FLM 5011
      • 6.10.3.1  Gewinnung der Metaboliten
      • 6.10.3.2 Isolation und Identifikation der Metaboliten mittels HPLC
      • 6.10.3.3 Identifikation der Metaboliten mittels DC
      • 6.10.3.4 Identifizierung der Metaboliten mittels MS
      • 6.10.3.5  Bestimmung der Umsatzrate
  • 6.11 Zytotoxizitätsbestimmungen
    • 6.11.1 Der Amidoschwarztest
    • 6.11.2 Der LDH Test
    • 6.11.3 Bestimmung der Zytotoxizität durch Quantifizieren des DNA-Gehalts
  • 6.12 Nachweismethoden für Apoptose
    • 6.12.1 DNA-Leiter
    • 6.12.2 Anfärben von apoptotischen Zellen mit Annexin-V-Biotin
    • 6.12.3 ApoAlert FLICE Assay von CLONTECH Laboratories
• 7 Literatur
• Abkürzungsverzeichnis
• Danksagung
• Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1-1: Vor- und Nachteile von in-vitro-Testsystemen in der Toxikologie [100]
• Tabelle 2-1: Konjugierungsrate des gebildeten Resorufins in %
• Tabelle 2-2: Einfluß des Lösungsmittels auf die Umsetzung von 7-Ethoxyresorufin durch Hep G2-Zellen
• Tabelle 2-3: Umsatzraten von 7-Ethoxyresorufin durch Hep G2-Zellen bei ansteigender Substratkonzentration
• Tabelle 2-4: 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung in Zellhomogenaten nach Ultraschall-behandlung,±s, n=6
• Tabelle 2-5: 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung in Zellhomogenaten nach Ultraschall-behandlung, ±s, n=6
• Tabelle 2-6: Aminophenazon-N-demethylierung durch Zellhomogenate, ±s, n=6
• Tabelle 2-7: Azoreduktase-Aktivität in Zellhomogenaten nach Ultraschallbehandlung, ±s, n=6
• Tabelle 2-8: Nitrophenolkonjugation durch Zellhomogenate nach Ultraschallbehandlung, ±s, n=6
• Tabelle 3-1: Retentionszeiten von AWD 100-041 und seinen Metaboliten bei der HPLC mit zwei Gradientensystemen
• Tabelle 3-2: Rf-Werte von AWD 100-041 und seinen Metaboliten bei der DC mit zwei Fließmittelsystemen
• Tabelle 3-3: Fragmentierung der Metaboliten M1 und M3.
• Tabelle 3-4: Retentionszeiten von AR 12463 und seinen Metaboliten bei der HPLC mit zwei Gradientensystemen
• Tabelle 3-5: Rf-Werte von Ar 12463 und seinen Metaboliten bei der DC mit zwei Fließ-mittelsystemen
• Tabelle 3-6: Fragmentierung von AR 12364 und seinen Metaboliten M4 und M7 [57]
• Tabelle 3-7: Retentionszeiten von FLM 5011 und seinen Metaboliten bei der HPLC mit zwei Gradientensystemen
• Tabelle 3-8: Rf-Werte von FLM 5011 und seinen Metaboliten bei der DC mit drei Fließ-mittelsystemen
• Tabelle 3-9: Fragmentierung von FLM 5011 und seinen Metaboliten
• Tabelle 4-1: IC50-Werte von AWD 100-041
• Tabelle 4-2: IC50-Werte von AR 12463
• Tabelle 4-3: IC50-Werte von FLM 5011
• Tabelle 4-4: Einfluß von 5(S)-HETE auf die Proliferation von Hep G2-Zellen
• Tabelle 4-5: IC50-Werte des Mazerats des Krautes von Solanumlycopersicon, Tomatin und Tomatidin
• Tabelle 4-6: IC50-Werte von 3-Methylcholanthren
• Tabelle 4-7: IC50-Werte von Phenobarbital
• Tabelle 4-8: IC50-Werte von Clofibrat
• Tabelle 4.2-8: Einfluß von verschiedenen Lösungsmittel auf das Proliferationsverhalten von Hep G2-Kulturen über 24h bei einer Konzentration von jeweils 0,5%
• Tabelle 4-9: Unterschiede zwischen Nekrose und Apoptose [108]
• Tabelle 4-10: FLICE-Aktivitäten in Hep G2-Zellen nach 4h Inkubation mit 0,05mM FLM 5011 und unterschiedlichen 5(S)-HETE-Konzentrationen
• Tabelle 5-1: Fremdstoffmetabolische Enzymaktivitäten in Hep G2-Zellen und Ratten-hepatozyten, + geringe, ++ mittlere, +++ hohe Aktivität bzw. Induzierbarkeit, *[58, 67]

Bilder

• Abbildung 1-1: Möglicher Einsatz von Zellkulturen für Biotransformationsuntersuchungen in der präklinischen Phase der Arzneimittelentwicklung
• Abbildung 2-1: Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen einer Hep G2-Kultur bei 100-facher Vergrößerung. Links: Interferenz-Phasenkontrastaufnahme, rechts: Phasenkon-trastaufnahme
• Abbildung 2-2: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Hep G2-ZellenBild A: 4400-fache Vergrößerung, Bild B: 20000-fache Vergrößerung
• Abbildung 2-3: Wachstumskurve von Hep G2-Kulturen, ±s, n = 5, *a<0,05
• Abbildung 2-4: Hep G2-Zellen kultiviert auf Cytodex®, 40-fache Vergrößerung
• Abbildung 2-5: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Hepatozyten der Wistar-Ratte
• Abbildung 2-6: Monolayerkultur von Hepatozyten, 40-fache VergrößerungBild A: wenige Minuten nach der Aussaat, Bild B: nach 6h, Bild C: nach 24h,Bild D: nach 72h, Bild B-D: Phasenkontrastaufnahmen
• Abbildung 2-7: Lymphozyten nach Isolation angefärbt mit May-Grünwald-Lösung. Die Zellkerne die beinahe 90% der Lymphozyten ausmachen sind stark blauviolett gefärbt. Das Plasma ist schwächer gefärbt.
• Abbildung 2-8: Deethylierung von 7-Ethoxyresorufin
• Abbildung 2-9: Umsatz von 7-Ethoxyresorufin durch unbehandelte und mit Induktoren vorbe-handelte Hep G2-Zellen, sowie durch Hepatozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=8, a<0,01
• Abbildung 2-10: 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung durch Hep G2-Monolayerkulturen auf Polystyren und Cytodex®,±s, n=6, *a<0,05 bzw. **a<0,01
• Abbildung 2-11: Verteilung der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylase-Aktivität in den sub-zellulären Fraktionen von Hep G2-Zellen, ±s, n=6
• Abbildung 2-12: Umsatz von 7-Ethoxyresorufin durch Lymphozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=8, a<0,01 bzw. *a<0,05
• Abbildung 2-13: 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung
• Abbildung 2-14: Umsatz von 7-Ethoxycoumarin durch Hep G2-Zellkulturen und Hepatozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=10, a<0,01
• Abbildung 2-15: Verteilung der 7-Ethoxycoumarin-O-deethylase-Aktivität auf die subzellulären Fraktionen von Hep G2-Zellen, ±s, n=6
• Abbildung 2-16: Demethylierung von Aminophenazon
• Abbildung 2-17: Formaldehydbestimmung nach Nash
• Abbildung 2-18: Aminophenazondemethylierung durch Hep G2-Zellen und Hepatozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=10, a<0,01
• Abbildung 2-19: Verteilung der Aminophenazon-N-demethylase-Aktivität auf die sub-zellulären Fraktionen von Hep G2-Zellen, ±s, n=6
• Abbildung 2-20: Azoreduktion von 4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen
• Abbildung 2-21: Kupplung von 4-(N,N-Dimethylamino)anilin an Fluorescamin
• Abbildung 2-22: Azoreduktion von DAB durch Hep G2-Zellen und Hepatozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=10, a<0,01
• Abbildung 2-23: Verteilung der Azoreduktase-Aktivität auf die subzellulären Fraktionen von Hep G2-Zellen, ±s, n=6
• Abbildung 2-24: Azoreduktion von DAB durch Lymphozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=8, α<0,01
• Abbildung 2-25: Glucuronidierung und Sulfatierung von p-Nitrophenol
• Abbildung 2-26: Konjugation von p-Nitrophenol durch Hep G2-Zellen und Hepatozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=10, a<0,01
• Abbildung 2-27: Verteilung der Konjugierungsaktivität in isolierten subzellulären Fraktionen von Hep G2-Zellen, ±s, n=6
• Abbildung 3-1: AWD 100-041
• Abbildung 3-2: Wesentliche Fragmentationen von AWD 100-041
• Abbildung 3-3: Hauptwege der Biotransformation von AWD 100-041
• Abbildung 3-4: AR 12463
• Abbildung 3-5: Fragmentierung von AR 12463 in der MS
• Abbildung 3-6: Hauptwege der Biotransformation von AR 12463
• Abbildung 3-7: FLM 5011
• Abbildung 3-8: Wesentliche Fragmentationen von FLM 5011 (oben) und FLM 5011 Keton (unten)
• Abbildung 3-9: Hauptwege der Biotransformation von FLM 5011
• Abbildung 4-1: Bestimmung der LDH
• Abbildung 4-2: Amidoschwarz 10B
• Abbildung 4-3: Einfluß von AWD 100-041 auf den Protein- und DNA-Gehalt sowie auf die Membranpermeabilität von Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α < 0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert
• Abbildung 4-4: Einfluß von AR 12463 auf den Protein- und DNA-Gehalt sowie auf die Membranpermeabilität von Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, a<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert
• Abbildung 4-5: Einfluß von FLM 5011 auf den Protein- und DNA-Gehalt sowie auf die Membranpermeabilität von Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,05, *kein signifikanter Unterschied zum Blindwert
• Abbildung 4-6: Strukturformel von Tomatidin. Der Zuckeranteil von Tomatin ist:
• Abbildung 4-7: Einfluß eines Solanum lycopersicon-Mazerates auf Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert
• Abbildung 4-8: Einfluß von Tomatin auf Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert
• Abbildung 4-9: Einfluß von Tomatidin auf Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert
• Abbildung 4-10: Einfluß von 3-Methylcholanthren auf den Protein- und DNA-Gehalt sowie auf die Membranpermeabilität von Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,01
• Abbildung 4-11: Einfluß von Phenobarbital auf den Protein- und DNA-Gehalt sowie auf die Membranpermeabilität von Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert
• Abbildung 4-12: Einfluß von Clofibrat auf den Protein- und DNA-Gehalt sowie auf die Membranpermeabilität in Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α < 0,0
• Abbildung 4-13: Einfluß von DMSO auf den Protein- und den DNA-Gehalt, sowie die Membranpermeabilität von Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert
• Abbildung 4-14: Einfluß von 7-Ethoxyresorufin auf die Proliferation von Hep G2-Kulturen innerhalb 24h, ±s, n=8, α<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindw
• Abbildung 4-15: Zeiose: Bildung von "apoptotic bodies" bei Hep G2-Zellen nach Behandlung mit FLM 5011
• Abbildung 4-16: DNA-GelelektrophoreseReihe 1 und 2: DNA von unbehandelte Hep G2-ZellenReihe 3 und 4: DNA von 4h mit FLM 5011 behandelte Hep G2-ZellenReihe 5 und 6: DNA von 24h mit FLM 5011 behandelten Hep G2-KulturenReihe 7: käuflich erworbene 100 Basenpaar-Leiter von GIBCO BRL als Kontrolle
• Abbildung 4-17: Färbung mit Annexin-V-Biotin
• Abbildung 4-18: FLICE-Aktivität in FLM 5011 behandelten Hep G2-Kulturen
• Abbildung 5-1: Auslösung von Apoptose durch FLM 5011 in Hep G2 Zellen