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2 Charakterisierung der verwendeten in-vitro-Testsysteme

2.1 Die Zellkulturen

2.1.1 Die Hep G2-Kultur

Die humane Zellinie Hep G2 wurde 1979 von Aden et al. [1] aus einer Leberbiopsie eines Kindes, das an einem primären Hepatoblastom erkrankt war, isoliert. Diese Zellinie besitzt noch viele Funktionen, die für normale humane Hepatozyten typisch sind. In Kultur sezernieren Hep G2-Zellen die meisten Plasmaproteine, wie z.B. Albumin, Fibrinogen, a-Fetoprotein und Apolipoproteine in das Medium [52]. Hep G2-Zellen besitzen des weiteren die Fähigkeit Glykogen zu bilden, wenn genügend Glucose im Kulturmedium vorhanden ist, und produzieren Collagen I, III und IV [12]. Viele Untersuchungen mit Hep G2-Zellen beschäftigten sich mit Synthese, Sekretion, Abbau und Regulation von Lipoproteinen und ihren Apolipoproteinen [z.B. 16, 30] und haben damit die Bedeutung dieser Zellinie etabliert.

2.1.1.1 Morphologie

Unter dem Lichtmikroskop (siehe Abbildung 2-1) erscheinen Hep G2-Zellen als flache, polygonal wachsende Zellen mit einer Größe von 12-19µm. Sie wachsen größtenteils, aber nicht ausschließlich als Monolayer. Im Zellrasen zeigen Hep G2-Zellen epitheloides Wachstum, das am Rand unregelmäßiger und aufgebläht erscheint. Zellen, die sich vom Zellverband gelöst haben, wachsen gelegentlich auch fibroblastenartig. Bei längeren Kultivierungszeiten kommt es zu einem dreidimensionalen Wachstum. In den Zellhaufen sind die interzellulären Verbindungen sehr intensiv, so daß eine Dissoziation mit Trypsin erschwert war.

Die morphologische Gestalt von Hep G2-Zellen ist denen von humanen Hepatozyten in Kultur sehr ähnlich [5]. Im Gegensatz zu Hepatozyten des Menschen oder der Ratte besitzen sie einen sehr großen Nukleus von 8-12µm. Gelegentlich konnten große Vakuolen, von denen einige nach Anfärben mit Ölrot als Lipidtropfen identifiziert werden konnten, im Zytoplasma beobachtet werden [12].


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Abbildung 2-1: Phasenkontrastmikroskopische Aufnahmen einer Hep G2-Kultur bei 100-facher Vergrößerung. Links: Interferenz-Phasenkontrastaufnahme, rechts: Phasenkon-trastaufnahme

Gallenkanäle, auf beiden Seiten durch tight junctions abgeschlossen und mit langen Mikrovilli versehen, konnten von Bouma et al. [12] durch Elektronenmikroskopie bei 20000-fachen und 37000-fachen Vergrößerungen gefunden werden. Das rauhe endoplasmatische Retikulum (RER) und der Golgi Apparat mit mehreren Dictyosomen konnten auf elektronenmikrosko-pischen Aufnahmen gut erkannt werden. Der Zellkern (K), Mitochondrien (M), Lysosomen, zwei Desmosomen (D), große Vakuolen (V) und Lipidtropfen (L) konnten ebenfalls identifiziert werden (siehe Abbildung 2-2), nicht aber Peroxysomen [12].

Abbildung 2-2: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Hep G2-Zellen
Bild A: 4400-fache Vergrößerung, Bild B: 20000-fache Vergrößerung


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2.1.1.2 Kultivierung

Die Kultivierung der Hep G2-Zellen erfolgte als Monolayer in Polystyren-Kulturgefäßen. Daher kamen 25cm2- und 75cm2-Kulturflaschen, sowie 24well-Multischalen und 96well-Mikrotiter-platten zur Anwendung.

Eine Beschichtung mit Kollagen war für die Anheftung und die Kultivierung der Zellen nicht erforderlich, führte aber zu einer geringen Steigerung der Cytochrom P450-Aktivität (siehe 2.3.1.1).

Das Kulturmedium bestand aus einer Mischung von RPMI 1640 und Medium 199. RPMI 1640 ist ein komplexes Medium, das auch oft für die Kultivierung von Hepatozyten der Ratte und des Menschen eingesetzt wurde [7]. Es ist ein Calcium-armes Medium (0,625mM) mit Glucose als Hauptkohlenstoffquelle. Medium 199 enthält noch einige Komponenten, die in RPMI 1640 nicht enthalten sind. Dazu gehören einige Vitamine, wie L-Ascorbinsäure, Calciferol, Nicotinsäure, DL-a-Tocopherolphosphat und Vitamin-A-acetat. Des weiteren enthält Medium 199 noch ein Eisensalz und Purin- bzw. Pyrimidinbasen sowie D-Ribose und Desoxyribose.

Der Zusatz von nicht essentiellen Aminosäuren zu den schon im Medium enthaltenden essentiellen Aminosäuren erwies sich als vorteilhaft. Nicht essentielle Aminosäuren werden zwar von den Zellen produziert, werden dann aber in das Kulturmedium abgegeben und stehen somit den Zellen nicht mehr in ausreichender Konzentration zur Verfügung. Die Erhöhung des Aminosäuregehalts im Kulturmedium sorgt deshalb für eine ausgewogene Stickstoffbilanz und eine hohe Proteinsynthese [7]. Vor allem der Zusatz von L-Glutamin beeinflußt stark die Wachstumsrate, denn Glutamin wird neben Glucose von vielen Zellen als Energie- und Kohlenstoffquelle genutzt. Hierbei wurden 4mM L-Glutamin dem Medium zugesetzt.

Als weitere Energiequelle wurde 1mM Natriumpyruvat zugesetzt. Dies kann zu Laktat oder Acetoacetat und schließlich nach Durchlaufen des Zitronensäurezyklus zu CO2 abgebaut werden und unterhält damit die endogene CO2-Produktion [34]. Zusätzlich wird die Proteinsynthese angeregt [7]. NaHCO3 ist sowohl Puffersubstanz als auch essentieller Nahrungsbestandteil. Bei starkem Wachstum treten erhöhte CO2-Werte auf, die den pH-Wert erniedrigen. Der Abfall des pH-Wertes kann durch NaHCO3-Zusatz neutralisiert werden [65].

Ein Zusatz von fetalem Kälberserum (FKS) ist für viele Zellinien notwendig. Hep G2-Zellen wachsen sowohl bei 5% als auch bei 10% FKS gut, wobei bei 5% FKS wesentlich geringere Enzymaktivitäten beobachtet werden konnten [25]. In FKS sind viele Komponenten enthalten, die das Wachstum von Zellen stark beeinflussen. Proteine, wie Albumin und Globuline, sind die Hauptbestandteile des Serum. Proteine, wie Fibronektin und Fetuin fördern die Zellanheftung an das Substrat, während a2-Makroglobulin Trypsin hemmt und deshalb nach einer Passage mit Trypsin für die Regeneration der Zellen von Bedeutung ist. Da viele transformierte Zellen eher geringe Mengen an Fibronektin produzieren, ist es notwendig, Fibronektin dem Kulturmedium [Seite 11↓] zuzusetzen. Kulturmedien, die 10% fetales Kälberserum enthalten, haben eine Fibronektin-konzentration von 2-3µg/ml [80].

In FKS sind diverse Wachstumsfaktoren enthalten, die einen Einfluß auf das Wachstum und die Differenzierung haben. Dazu gehört z.B. PDGF (platelet-derived growth factor), ein dimeres Polypeptid, das Zellmigration und Zellproliferation induziert. Die in FKS ebenfalls enthaltenen Peptide der Familie der EGF (epidermal growth factor) und der FGF (fibroblast growth factor) sind an der Regulation von Proliferation und Differenzierung beteiligt [42]. In geringen Mengen sind auch Hormone wie Insulin zur Förderung der Glucose- und Aminosäureaufnahme in die Zelle und Hydrocortison, welches an der Regulation von Adhäsion und Proliferation beteiligt ist, im FKS vorhanden. Auch die Spurenelemente Eisen, Kupfer und Zink, die an Serumprotein gebunden sind, werden von FKS bereitgestellt [34].

Die Hitzeinaktivierung von fetalem Kälberserum bei 56°C für 30min soll störende Einflüsse verschiedenster Art beseitigen. Dazu gehört z.B. die Laktatdehydrogenase, deren Zerstörung vor allem dann vorteilhaft sein kann, wenn der Gehalt der LDH im Zellkulturüberstand als Maß für die Schädigung der Zellen gemessen werden soll [65]. Auch Viren und Mykoplasmen werden zerstört. Allerdings ist mit einem großen Verlust an Vitaminen und Wachstumsfaktoren zu rechnen, der andererseits das Wachstum der Zellen negativ beeinflußt. Deshalb wurde auf eine Hitzeinaktivierung des Serums verzichtet.

Der Zusatz einer Penicillin/Streptomycin-Mischung erwies sich trotz der Gefahr einer Resistenz-bildung und eines negativen Einflusses auf die Proliferation als vorteilhaft, um Verluste an Zell-material zu vermeiden. Konzentrationen von 280µM Penicillin und 70µM Streptomycin haben keinen Effekt auf die Zellintegrität und nur eine geringe Auswirkung auf die Proteinsynthese [7].

Um die Wachstumsgeschwindigkeit zu bestimmen wurde eine Wachstumskurve von Hep G2-Zellen erstellt. Da bei den Modellreaktionen für die fremdstoffmetabolische Charakterisierung (siehe 2.3) innerhalb der Inkubationszeiten von 72h kein Mediumwechsel erfolgte, wurden die Wachstumskurven sowohl mit Mediumwechsel als auch ohne Mediumwechsel ermittelt (siehe Abbildung 2-3).

Hierzu wurden 105 Zellen eingesät. Davon hefteten sich aber auf Grund von Zellschädigungen durch Trypsin oder mechanische Reizungen nur 0,87x105 Zellen an. Dies entspricht einem Verlust von 13%. Nach 4h fand in allen Kulturen ein Mediumwechsel statt. Anschließend wurden einige Kulturen ohne weiteren Wechsel des Mediums kultiviert, die anderen Kulturen bekamen nach jeweils 24h frisches Medium.

Die Ausgangszellzahl wurde nach Einsetzen des Wachstums der Zellen nach 24h wieder erreicht. In Kulturen, bei denen kein Mediumwechsel vorgenommen wurde, war die logarith-mische Wachstumsphase sehr kurz und nach 48h blieb die Zellzahl fast stabil. Eine Kultivierung über 72h ohne Mediumwechsel führte zwar nicht zu einem Nährstoffmangel, der ein Absterben von Zellen induzierte, verlangsamte aber das Wachstum und war damit trotzdem für die [Seite 12↓] Durchführung der fremdstoffmetabolischen Charakterisierung mittels Modellreaktionen (siehe 2.3) geeignet. Kulturen, bei denen alle 24h ein Mediumwechsel vorgenommen wurde, zeigten nach 48h eine wesentlich stärkere Proliferation. Diese Form der Kultivierung ist daher für die schnelle Anzucht von Hep G2-Zellen von Vorteil.

Abbildung 2-3: Wachstumskurve von Hep G2-Kulturen, ±s, n = 5, *a<0,05

Die Verwendung von Microcarrier bietet den Vorteil der Gewinnung von großen Mengen an Zellmaterial. Monolayerkulturen auf Microcarrier haben eine maximale Kulturfläche im Verhältnis zum Kulturmediumvolumen. Ein weiterer Vorteil ist die relativ einfache Handhabung, die der Suspensionskultur ähnlich ist. Nachteilig ist die schwierige Zellzählung, weshalb ihr häufig eine Protein- oder DNA-Bestimmung vorgezogen wird. Da die Zellen auch hier an einer Grenze zwischen Fest- und Flüssigphase wachsen, ist das Mikroskopieren möglich.

Microcarrier können aus Polystyren, Sephadex oder Polyacrylamid bestehen und mit Kollagen oder Gelatine beschichtet sein [34]. Die hierbei benutzten Cytodex® 3 Microcarrier bestehen aus einer quervernetzten Dextranmatrix, an die denaturiertes Kollagen I kovalent gebunden ist. Dabei soll die Beschichtung mit Kollagen die Anheftung der Zellen durch bevorzugtes Binden von Fibronektin an denaturiertes Kollagen beschleunigen [80].


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Abbildung 2-4: Hep G2-Zellen kultiviert auf Cytodex®, 40-fache Vergrößerung

Hierbei wurden Microcarrier eingesetzt, um den Effekt der Kultivierung auf Kollagen auf die Biotransformation zu untersuchen (siehe 2.3.1.1).

2.1.2 Die Hepatozytenkultur

Die Leber ist das größte zentrale Stoffwechselorgan des Intermediärstoffwechsels im Organismus und übernimmt wichtige Funktionen bei der Entgiftung, Inaktivierung und Ausscheidung körpereigener und körperfremder Substanzen. Sie ist weiterhin die größte exokrine Drüse, was sich durch die Bildung und Ausscheidung der Galle darstellt. Die Leber, die unter der rechten Zwerchfellkuppel liegt, wird zu etwa 75% durch die Pfortader mit venösem Blut aus Magen, Dünndarm, Dickdarm, Teilen des Mastdarms, Bauchspeicheldrüse und Milz versorgt. Die arterielle Versorgung über die Leberarterie deckt nur 25% des Blutbedarfs. Das Blut gelangt über die Kapillaren der Leber in Venen und wird über die untere Hohlvene abgeführt. Die Bauelemente der Leber sind die nahezu sechseckigen Leberläppchen, die durch Bindegewebszüge voneinander getrennt sind. Da, wo mehrere Läppchen zusammenstoßen und sich Bindegewebszwickel bilden, die periportale Felder genannt werden, verlaufen die Äste der Pfortader. Die Wände der Leberkapillaren, den so genannten Sinusoiden, bestehen aus zwei Zelltypen: den Endothelzellen und den zum retikuloendothelialen System zugehörigen Kupfferschen-Sternzellen. Letztere können Zelltrümmer, Bakterien und Fremdstoffe aufnehmen und speichern und sind wahrscheinlich auch am Abbau von Erythrozyten beteiligt. Zwischen der [Seite 14↓] Wand der Lebersinusoide und den Hepatozyten ist ein Spalt, der Disséscher Raum genannt wird. In diesen reichen die zahlreichen Mikrovilli der Hepatozyten und können so direkten Kontakt mit Stoffen, die aus der Kapillarwand getreten sind, aufnehmen [107]. Die Hepatozyten repräsentieren 60-65% der Zellen der Leber. Da sie wesentlich größer sind als die Nichtparenchymzellen, nehmen sie über 80% des Volumens der Leber ein. Weitere Zell-typen der Leber sind die für die Fett- und Vitamin-A-Speicherung zuständigen Ito-Zellen, die Pit-Zellen, denen endokrine Funktionen zugeschrieben werden, und die schon genannten Endothelzellen und Kupfferschen-Sternzellen.

Jeder Hepatozyt ist mit mehreren Nachbarzellen eng verbunden über tight, intermediate und gap junctions, sowie über Desmosomen. Gallenkanäle mit Mikrovilli werden zwischen den Hepatozyten ausgebildet. Während der Isolation von Hepatozyten werden die Zellkontakt-strukturen endozytiert, können aber bei Kultivierung der Zellen als Monolayer erneut gebildet werden [7].

2.1.2.1 Isolation der Hepatozyten

Die Isolation der Hepatozyten aus der Rattenleber erfolgte anhand der Zwei-Schritt-Kollagenase-Perfusionstechnik nach Seglen et al. [93]. Dabei wird die Leber zuerst mit einem größeren Volumen Calcium-freien Mediums entblutet und erst dann wird der enzymatische Gewebeaufschluß begonnen. Durch die Perfusion mit großen Volumina Calcium-freien Mediums werden Calcium-Ionen von den Desmosomen eluiert, was dann zu einer großen Zellausbeute mit geringer Zellschädigung führt. Daß bei dem Kollagenase-haltigen Perfusionsmedium wieder Calcium zugeführt wird, hat nicht nur Auswirkungen auf die Kollagenaseaktivität, sondern hat ebenfalls den Zweck, Hepatozyten die Möglichkeit des Ausgleiches von anormalen Ionenverteilungen zu geben.

Mit 0,05% Kollagenase können gute Ergebnisse erzielt werden. Geringere Konzentrationen führen nicht zu weniger geschädigten Zellen. Der Zusatz von Heparin zum Kulturmedium ist nicht notwendig, da die Leber schnell entblutet wird und dadurch eine relativ geringe Gefahr der Thrombenbildung besteht. Auch der Zusatz eines Chelatbildners um eine komplette Calcium-Elution zu erreichen, führt nicht zu einer höheren Ausbeute [7]. Um einen stabilen pH zu erhalten wurde das Perfusionsmedium mit 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethan-sulfonsäure (HEPES) gepuffert.

Die Perfusion wurde erst abgebrochen, wenn die Leber sich durch leichten Druck irreversibel verformte. Da dies stark von der Qualität der Kollagenase abhängt, konnte der zweite Schritt von unterschiedlicher Dauer sein. Ein leichtes Anschwellen der Leber am Anfang der Perfusion durch Unterbrechen des Ausflusses, sollte die Zellausbeute erhöhen. Allerdings steigt bei zu starker Schwellung oder zu hohem Perfusionsdruck schnell die Anzahl an geschädigten Zellen [7].


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Das Waschen der Zellen mit 0-4°C gekühltem Medium führt zwar zu einem Kalium-Verlust in der Zelle und zu einem Einstrom von Natrium-Ionen, aber dies scheint reversibel zu sein. Außerdem ist der Verlust an Enzymen wesentlich größer, wenn bei Raumtemperatur gewaschen werden würde [7]. Das Waschen verringert den ungewollten Anteil an Kupfferschen-Sternzellen, Fibroblasten und Endothelzellen [65].

Nach Waschen und Suspendieren der Zellen in Kulturmedium, wurde die Vitalität der Zellen mit Trypanblau getestet. Trypanblau ist ein saurer Farbstoff, der als Anion vorwiegend an Proteine bindet. Bei lebenden, vitalen Zellen kann Trypanblau nicht in das Zellinnere gelangen, während tote Zellen sich anfärben lassen und dann unter dem Mikroskop blau erscheinen. Der Farbstoffausschluß wird darauf zurückgeführt, daß bei der nicht geschädigten Zelle das Plasmamembranpotential unter Energieaufwand erhalten bleibt, wobei die zytoplasmatische Seite negativ geladen ist. Ein Verlust des Potentials erlaubt ein Eindringen von negativ geladenem Trypanblau. Allerdings ist die Farbstoffaufnahme stark pH-abhängig, so daß darauf zu achten ist, daß der pH nicht unter 7 sinkt, da sonst auch vitale Zellen angefärbt werden. Trypanblau ist prinzipiell zytotoxisch, weshalb die Zellen sofort beobachtet werden müssen, da der Anteil an gefärbten Zellen mit der Zeit zunimmt [65]. Abbildung 2-5 zeigt die transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme eines Hepatozyten im Überblick [57]. Im Unterschied zu transformierten Zellen, z.B. Hep G2-Zellen, ist der Zellkern wesentlich kleiner.

Abbildung 2-5: Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Hepatozyten der Wistar-Ratte


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2.1.2.2 Kultivierung

Die Kultivierung der Hepatozyten erfolgte ebenfalls als Monolayer. Um mit begrenzten Mengen an Hepatozyten arbeiten zu können und damit den Verbrauch an Versuchstieren gering zu halten, wurden bevorzugt 24well-Multischalen zur Kultivierung eingesetzt.

Hepatozyten heften sich nur sehr schlecht an Polystyren-Kulturgefäße. Doch scheint die Adhäsion an ein Substrat und die damit verbundenen Änderungen in der Zellform und der Organisation des Zytoskeletts einen großen Einfluß auf die Proteinsynthese und den Erhalt leberspezifischer Funktionen zu haben. Hepatozyten heften sich gut an alle Sorten von Kollagen, obwohl sie eine besonders hohe Affinität zu Kollagen IV haben. Kollagen I ist das am meisten genutzte Kollagen, da es leicht zu gewinnen und billig ist. Es bildet einen gelartigen Film, auf denen sich Hepatozyten schnell und am Anfang mit wenig abgeflachter Form anheften. Eine hohe Zelldichte (1-2x105 Zellen/cm2) und große Kulturmedienvolumina förden zusätzlich die Anheftung der Hepatozyten an das Substrat [7].

Der Zusatz von Insulin zum Kulturmedium verbessert nicht nur das Anheftungsverhalten der Hepatozyten, sondern erhöht ebenfalls die Proteinsynthese und die Albuminsekretion. Auch sollen leberspezifische Funktionen besser erhalten bleiben, besonders wenn dem Medium noch das Glucocorticoid Dexamethason zugesetzt wird. Der Zusatz von Phenobarbital, vor allem im Zusammenhang mit Insulin und Dexamthason, führt zu einem längeren Erhalt der typischen Zellmorphologie. Es kommt aber auch zu einer Induktion von Cytochrom P450-Isoenzymen und einer Stimulation der DNA-Synthese, wobei letztere stark von der Konzentration abhängt, denn bei hohen Phenobarbitalkonzentrationen kommt es zu einer Inhibition der DNA-Synthese. Darüber hinaus wird ein Herabsetzen des oxidativen Stresses durch Phenobarbital diskutiert [7]. Konzentrationen von Dimethylsulfoxid (DMSO) bis zu 2% erhalten lange einen differenzierten Zustand der Hepatozyten in Kultur. Die DNA-Synthese wird blockiert und die Zellen bleiben über Wochen mit spezifischen Funktionen erhalten. Da aber für 2% DMSO ein negativer Einfluß auf die Membranintegrität von Hep G2-Zellen gezeigt werden konnte (siehe 4.1.2.8), wurde hier auf die Zufuhr hoher DMSO-Konzentrationen verzichtet.

Der Erhalt von Cytochrom P450-Aktivitäten kann auch durch Zusatz von Nicotinamid gewährleistet werden. Dies kommt wahrscheinlich nicht durch Induktion, sondern durch Inhibition des Abbaus bestimmter Isoenzyme zustande. Im Kulturmedium sind ca. 0,8mg/l Nicotinamid enthalten [7].

Kurz nach der Aussaat zeigten die Hepatozyten auf Kollagen eine eher kugelige Form. Tote oder geschädigte Zellen behielten die Kugelform bei und saßen oft auf dem gesunden Zellrasen. Nach spätestens 48h waren dann alle vitalen Zellen ganz abgeflacht und zeigen eine eher hexagonale Form. Dies ist in Abbildung 2-6 zu sehen.


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Abbildung 2-6: Monolayerkultur von Hepatozyten, 40-fache Vergrößerung
Bild A: wenige Minuten nach der Aussaat,
Bild B: nach 6h,
Bild C: nach 24h,
Bild D: nach 72h,
Bild B-D: Phasenkontrastaufnahmen

2.1.3 Die Lymphozytenkultur

Lymphozyten machen 20% der Gesamtheit der Leukozyten aus. Sie können in B- und T-Lymphozyten, sowie in sogenannte Nullzellen oder NonT-NonB-Zellen, die keine für Lym-phozyten charakteristischen Oberflächenantigene besitzen, unterteilt werden. Alle Lymphozyten stammen von lymphoiden Vorläuferzellen ab. T-Zellen werden im Thymus, B-Zellen in der fetalen Leber sowie im Knochenmark und Nullzellen nur im Knochenmark gebildet. Nach ihrer Bildung wandern die Lymphozyten in die sekundären lymphatischen Gewebe über die Blutbahn und die Lymphe aus. Morphologisch werden zwei Arten von Lymphozyten unterschieden: die kleinen Lymphozyten, die keine Granula besitzen und ein hohes Kern-Plasma-Verhältnis haben und die großen Lymphozyten, die azurophile Granula besitzen und ein niedriges Kern-Plasma-Verhältnis haben. Letztere sind meistens T-Lymphozyten [84].


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2.1.3.1 Isolation

Lymphozyten kommen im Blut und in den immunkompetenten Organen Tonsillen, Lymphknoten und Milz vor. Sie können sowohl aus dem Blut als auch aus der Milz gewonnen werden, wobei die Ausbeute bei der Gewinnung aus der Milz größer ist. Die aus der Milz gewonnenen Zellen, auch Splenozyten genannt, bestehen aus 60-80% Lymphozyten, wovon 40-50% B- und 50-60% T-Lymphozyten sind. Der Rest setzt sich aus Makrophagen, Monozyten, Erythrozyten, Retikulum- und Endothelzellen zusammen. In der Milz befinden sich die Lymphozyten vor allem in der weißen Pulpa. Die dort befindliche periarterioläre lymphatische Scheide besteht aus T- und B-Zell-Arealen. Diese Lymphzell-ansammlungen enthalten im Keim- und Entwicklungszentrum Entwicklungsstufen der B-Lymphozytenreihe. Unmittelbar um die Zentralarteriole befinden sich die Entwicklungsstufen der T-Zellen. Der Abfluß der Lymphozyten erfolgt über die lymphatische Scheide.

T- und B-Lymphozyten sind über die Zentralarteriolen mit der Marginalzone, die weiße und rote Pulpa voneinander trennt, verbunden. Diese enthält sowohl T- als auch B-Lymphozyten. Reifende Plasmablasten können die Marginalzone überqueren und in die rote Pulpa gelangen, die hauptsächlich zum Abbau von verbrauchten Erythrozyten zuständig ist [84].

Die aus der Milz isolierten Lymphozyten sind im Gegensatz zu aus Blut oder Thymus isolierten Lymphozyten ausschließlich reife B- und T-Lymphozyten. Reife B-Lymphozyten sind für die Regulation der humoralen Immunantwort, reife T-Lymphozyten für die der zellvermittelten Immunantwort verantwortlich [40].

Aus der Zellsuspension, die aus der Milz durch Zerkleinern oder Ausdrücken gewonnen werden kann [85], lassen sich Lymphozyten leicht durch Zentrifugation über einer Schicht aus Polysucrose-Natriumditrizoat-Lösung (HistopaqueÒ1077) abtrennen. Nach Zentrifu-gation befinden sich die meisten Lymphozyten in der Grenzschicht und nur einige Blutplättchen oder Monozyten verunreinigen diese. Erythrozyten und Granulozyten befinden sich hauptsächlich im Polysucrose-Natriumditrizoat-Gemisch oder sedimentieren zu einem Pellet. Aus einer Milz konnten nahezu 107 Lymphozyten gewonnen werden. Trotz des mechanischen Zellaufschlusses der Milz scheint dieses Verfahren ein sehr schonendes zu sein, denn die Vitalität der Lymphozyten, getestet durch Trypanblau-Ausschluß, betrug immer über 90%.


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Abbildung 2-7: Lymphozyten nach Isolation angefärbt mit May-Grünwald-Lösung. Die Zellkerne die beinahe 90% der Lymphozyten ausmachen sind stark blauviolett gefärbt. Das Plasma ist schwächer gefärbt.

2.1.3.2 Kultivierung

Die aus der Rattenmilz isolierten Lymphozyten wurden als Suspension kultiviert. Als Kulturmedium wurde RPMI 1640 gewählt, welches speziell zur Kultivierung von Lymphozyten und Hybridomzellen entwickelt wurde. Der niedrige Calcium-Gehalt dieses Mediums ist für Suspensionskulturen vorteilhaft. 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethan-sulfonsäure (HEPES) wird in Konzentrationen von 10-50mM verwendet, die nicht toxisch sind. HEPES Zusatz bewirkt vor allem im physiologischen Bereich eine gute Pufferung und pH-Stabilität, auch bei schnell wachsenden Kulturen mit starker Ansäuerung [65]. Mit Zusatz von 10% fetalem Kälberserum zum Medium sind Lymphozyten in Kultur über mehrere Tage vital. Andererseits kann es durch fetales Kälberserum zu einer unspezifischen Stimulation der Lymphozyten kommen [85]. Um allerdings eine Teilung der normalerweise nicht proliferierenden Zellen zu erwirken, ist eine Stimulierung der Zellen mit spezifischen Antigenen oder mit mitogenen Lektinen notwendig [65]. Lektine, also Proteine, die spezifische Kohlenstoffdeterminanten auf der Zelloberfläche binden und quervernetzen, stimulieren lymphatische Zellen polyklonal. Die stimulatorische Wirkung ist also nicht auf eine antigene Funktion zurückzuführen. Lymphozyten existieren normalerweise als ruhende Zellen in der G0-Phase, treten aber sofort nach Kontakt mit einem polyklonalen Mitogen in die G1-Phase ein und durchlaufen dann den gesamten Zellzyklus. Wie bei der Stimulation durch Antigene differenzieren Lymphozyten zu Gedächtniszellen oder zu Effektorzellen, wobei B-Lymphozyten zu Immunglobulin-sezernierenden Plasmazellen und T-Lymphozyten zu Lymphokine produzierende und zytotoxisch agierende Zellen werden. Im Gegensatz zur Antigenstimulation werden durch Lektine viele Lymphozytenklone aktiviert, während bei der Antigenstimulation nur die Klone der Lymphozyten aktiviert werden, die die spezifischen Rezeptoren tragen. Doch werden von Lektinen nicht alle Lymphozyten-untergruppen stimuliert sondern nur ca. ein Drittel. Außerdem kommt es zu einer Zunahme des Zellvolumens und des [Seite 20↓] Zytoplasmas, das wegen des hohen RNA-Anteils basophil ist. Der Zellkern liegt exzentrisch [84].

Für die Wechselwirkung zwischen Lektinen und Zellen sind spezielle Mitogenrezeptoren von Bedeutung. An ihnen sind Kohlenhydrate gebunden, die mit der Bindungstelle des Lektins interagieren. Die meisten Lektine reagieren mit nur einem einzigen Zucker, z.B. Galaktose. Andere haben eine breitere Spezifität und reagieren mit einer Reihe eng verwandter Zucker oder aber mit komplexen Kohlenhydraten in Glykoproteinen der Zelloberfläche.

Die in der Immunologie am häufigsten eingesetzten mitogenen Lektine sind Concanavalin A, Phythämagglutinin und Pokeweed-Mitogen. Phythämagglutinin, ein Glykoprotein aus Phaseolus vulgaris, stimuliert vorzugsweise T-Lymphozyten. Concanavalin A aus Canavalia ensiformis (Schwertbohne) ist ein reines Protein, das an a-D-Mannose- oder an a-D-Glucose-Reste bindet. Concanavalin A besteht aus vier identischen Untereinheiten und bildet spontan in Abhängigkeit vom pH-Wert Dimere oder höhere Aggregate. Jede Untereinheit besitzt eine Bindungsstelle für Kohlenhydrate und eine für Ca2+- und Mn2+-Ionen, die für die Anlagerung an Kohlenhydrate benötigt werden. Concanavalin A aktiviert vor allem T-Lymphozyten. B-Lymphozyten können nur aktiviert werden, wenn eine Quervernetzung der Zucker besteht [51, 84].

2.2 Subzelluläre Fraktionen

Für vertiefende Untersuchungen der fremdstoffmetabolischen Aktivitäten wurden aus Hep G2-Zellen subzelluläre Fraktionen und Zellorganellen gewonnen, um insbesondere die enzymatische Verteilung zu charakterisieren. Die Aktivitäten in Zellorganellen und im Zytosol wurden dabei mit denen im Homogenat, das durch Ultraschallbehandlung gewonnen wurde, verglichen.

Durch geeignete Zellaufschlußverfahren und anschließende differentielle Zentrifugation ist es möglich, einzelne Zellorganellen zu isolieren. Der Einsatz einer Ultraschallbehandlung ist am Anfang der Isolation problematisch, da Zellorganellen zerstört werden können. Mit der Verwendung einer geeigneten Apparatur für den Zellaufschluß, wie z.B. des Potter-Elvehjems, können intakte Organellen erhalten werden. Zur Verhinderung der Autolyse sowie von Inaktivierungs- und Denaturierungsprozessen, die durch Wärmeentwicklung bei dieser Homogenisationstechnik ausgelöst werden können, ist eine ständige Kühlung notwendig. Das entstandene Zellhomogenat kann mit Hilfe der Differentialzentrifugation in einzelne Zellorganellen aufgetrennt werden. Die Zentrifugation bei 600 bis 700g ermöglicht die Abtrennung von Zellkernen und Zelltrümmern. Durch eine anschließende Zentrifugation des entstandenen Überstandes bei 9000g wird die Fraktion der Rohmitochondrien abgetrennt, während Zytosol und Mikrosomen im Überstand bleiben. Dieser Überstand kann nun durch Ultrazentrifugation bei 105000g aufgetrennt werden, wobei die Mikrosomen das Pellet bilden. Die Trennung von Mitochondrien und Lysosomen bzw. Peroxysomen erfolgt durch Zentrifugation im Dichtegradienten. Zur Herstellung solcher Gradienten werden gepufferte [Seite 21↓] Saccharoselösungen oder Polysaccharide wie Ficoll eingesetzt. Die Zentrifugation wird so lange durchgeführt bis die einzelnen Partikel nicht mehr wandern und sich zu Banden zusammengeschlossen haben. Dies ist der Fall, wenn die Zellkompartimente die Bereiche der Dichte des Gradienten erreicht haben, die ihrer Partikeldichte entsprechen [50].

Von besonderer Bedeutung ist die bei der Homogenisiation und Fraktionierung von Zellen aus dem endoplasmatischen Retikulum entstandene Mikrosomenfraktion. In den Mikrosomen ist der größte Teil des Cytochrom P450-abhängigen Monooxygenase-Systems lokalisiert. Viele biotransformatorische Untersuchungen finden deshalb an isolierten Mikrosomen statt. Trotz der vorgeschalteten Aufnahme der Fremdstoffe in die Zelle, wurde für Hepatozyten häufig eine ähnlich hohe Rate an Phase-I-Metabolismus gefunden wie in der Mikrosomenfraktion [7].

Mikrosomen sind nicht in der Lage Phase-II-Metaboliten zu bilden, wenn nicht die entsprechenden Zusätze, wie z.B. UDP-Glucuronsäure für die Glucuronidierung, zum Testansatz hinzugefügt werden. Ohne diese Zusätze käme es zu einer Akkumulation von Phase-I-Metaboliten, welches in intakten Zellen durch den einsetzenden Phase-II-Metabolismus verhindert wird. Dies kann zu Unterschieden der Mengenverhältnisse von Phase-I-Metaboliten in den beiden in-vitro-Systemen führen [7].


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2.3  Fremdstoffmetabolische Charakterisierung

Unter fremdstoffmetabolischer Charakterisierung versteht man Reaktionen, die die Umsetzung von bestimmten Substraten durch fremdstoffmetabolisierende Enzyme repräsentieren. Dies sind Indikatorreaktionen für bestimmte Isoenzyme, die Modellcharakter besitzen. Das für die Biotransformation entscheidende Schlüsselenzym ist die mischfunktionelle Monooxygenase Cytochrom P450.

Das Cytochrom P450-abhängige Monooxygenase-System spielt eine zentrale Rolle im Metabolismus exogener aber auch endogener Verbindungen. Cytochrom P450 (CYP)-Isoenzyme sind eine Familie von Hämoproteinen mit einem Thiolat-gebundenem Häm als prostetische Gruppe und einer stark differierenden Apoproteinstruktur, die für die Substratspezifität verantwortlich ist. Sie kommen bei Säugern in Mitochondrien und im endoplasmatischen Retikulum vor. Sowohl mikrosomale als auch mitochondriale CYP sind integrale Membranproteine, die durch hydrophobe Wechselwirkungen fest an die Membran gebunden sind. Mikrosomale CYP bilden den größten Teil der Membranproteine im endoplasmatischen Retikulum. Sie bilden in der Membran mit NADPH-Cytochrom P450-Reduktase und Cytochrom b5 ein Enzymsystem und katalysieren Oxigenierungsreaktionen. Ihre Synthese erfolgt in den membrangebundenen Ribosomen, wobei sie während dieses Prozesses in die Membran des endoplasmatischen Retikulums eingebaut werden [86].

Die Homologie der cDNA-Sequenz von Ratten- und humanen CYP-Formen liegt im Durchschnitt bei 70-80% [98]. Diese hohe Übereinstimmung kommt durch hoch konservierte Regionen, wie z.B. CYP-Reduktase und das Häm, zustande. Die Änderung einer einzigen Aminosäure kann die CYP-Aktivität jedoch völlig verändern. Dies kann sich als eine Erhöhung bzw. Erniedrigung der Enzymaktivität oder auch als eine Veränderung der Substratspezifität darstellen [64]. Eine Extrapolation von Tier zu Mensch ist deshalb sehr begrenzt. Ferner sind Menschen unterschiedlicher Nahrung oder induzierenden Xenobiotika ausgesetzt, wodurch CYP-Aktivitäten verändert werden können. Zigarrettenrauch z.B. erhöht die Aktivität von CYP 1 A1 [98].

In der Zellkultur sind die Aktivitäten von CYP extrem abhängig von der Zusammensetzung des Mediums. Dabei kann es zu Aktivitätsunterschieden bei der CYP 1 A-Familie in Hep G2-Zellen bis zu 5000% kommen. Vor allem der Zusatz von L-Cystein scheint bei der Expression von CYP, aber auch von anderen Enzymen, wie z.B. UDP-Glucuronyltransferasen, eine entschei-dende Rolle zu spielen [25]. Das Substrat auf dem die Zellen wachsen z.B. Polystyren, Kollagen oder Matrigel, kann ebenfalls einen Einfluß auf die Enzymaktivitäten haben [7]. Ein weiterer Einfluß auf die Enzymaktivität in Zellinien ist der Zeitabschnitt des Wachstums der Kultur. Je nach dem, ob ein Experiment 24h nach Aussaat der Zellen, während des exponentiellen Wachstums oder bei Konfluenz gestartet wird, kann zu unterschiedlichen Ergebnissen führen. Bei primären Hepatozytenkulturen verändert sich die CYP-Aktivität während der Dauer der Kultivierung. Vor [Seite 23↓] allem in den ersten 5 Tage der Kultivierung kann sie erheblich sinken. Die Glucuronidierungsrate zeigt einen geringen Abfall innerhalb der ersten 2 Tage, steigt aber danach stark an. Die Sulfatierung fällt während der ersten 3 Tage stark ab, erreicht bei primären Hepatozyten der Wistar-Ratte aber ihre Ausgangsaktivität wieder [99]. Dies ist bei humanen Hepatozytenkulturen nicht der Fall [53]. Es ist also erforderlich den Zeitpunkt des Versuchsbeginns im Hinblick auf das Alter der Kultur zu standardisieren [24].

2.3.1  7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung

Das Phenoxazonderivat 7-Ethoxyresorufin ist ein spezifisches Substrat für CYP 1 A1 und 2 [98]. CYP 1 A2 kommt in der Leber der Ratte konstitutiv vor und kann in allen anderen Geweben wie auch CYP 1 A1 spezifisch induziert werden. Potente Induktoren sind planare Moleküle, die auch bevorzugte Substrate sind, z.B. polyzyklische aromatische Kohlen-wasserstoffe, wie das Karzinogen 3-Methylcholanthren (3-MC) oder planare polyhalogenierte Biphenyle, wie 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) [78].

Die Deethylierung von 7-Ethoxyresorufin erfolgt durch Angriff des am Cytochrom P450 aktivierten Sauerstoffs am a-C-Atom zum Heteroatom unter Bildung eines Halbacetals, welches wegen seiner geringen Stabilität zu Acetaldehyd [79] und dem stark fluoreszierende Resorufin gespalten wird. Aufgrund seiner Fluoreszenz kann Resorufin direkt im Kulturmedium detektiert und quantifiziert werden. Da eine freie Hydroxylgruppe entsteht, ist damit zu rechnen, daß diese konjugiert wird, weshalb eine Deglucuronidierung und -sulfatierung nötig ist, um die gesamte Umsatzrate zu erfassen.

Neben dem spezifischen Induktor 3-MC wurde auch Phenobarbital (PB) eingesetzt. PB ist weniger spezifisch und führt bei der CYP 2-Familie zur stärksten Induktion [78, 98].

Abbildung 2-8: Deethylierung von 7-Ethoxyresorufin

Da es sich bei 7-Ethoxyresorufin und allen anderen Substraten der Modellreaktionen um wasserunlösliche Substanzen handelte, wurde anhand der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung auch der Einfluß des Lösungsmittels getestet.


[Seite 24↓]

2.3.1.1  7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung durch Hep G2- und Rattenhepatozyten-kulturen

Der Umsatz von 7-Ethoxyresorufin durch unbehandelte Hep G2-Zellen während der ersten Stunde entsprach den Werten, die auch von Doostar et al. [25] mit modifiziertem Earl’s Medium gefunden wurden. Die Aktivität blieb während 72h annähernd konstant. Um den Einfluß der unterschiedlichen Induktoren auf die CYP-Aktivität in Hep G2-Zellkulturen zu testen, wurden neben unbehandelten Zellen auch mit 3-MC und PB vorbehandelte Zellen auf ihre Aktivität überprüft (Abbildung 2-9).

PB-induzierte Zellen zeigten einen leicht erhöhten Umsatz. Die Induktion mit 3-MC führte jedoch zu einer Umsatzsteigerung von fast 700% über 72h, wobei die Aktivität der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylase innerhalb von 72h anstieg. Dies bestätigt die Spezifität sowohl des Induktors als auch des Substrats.

Abbildung 2-9: Umsatz von 7-Ethoxyresorufin durch unbehandelte und mit Induktoren vorbe-handelte Hep G2-Zellen, sowie durch Hepatozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=8, a<0,01

Ähnliche Ergebnisse wurden auch von Grant et al. [41] beschrieben, wobei für PB keine Aktivitätserhöhung, und für Benz(a)anthracen, ebenfalls ein Induktor von CYP 1 A1 und 2, der weniger toxisch ist und deshalb in höheren Konzentrationen eingesetzt werden konnte, eine über 10-fache Erhöhung innerhalb einer Stunde gefunden wurde. Allerdings war der Umsatz wesentlich geringer als hier beschrieben, was möglicherweise auf ein anderes eingesetztes [Seite 25↓] Kulturmedium (Dulbecco’s modified Eagle’s Medium) zurückzuführen sein könnte. Ähnliche Ergebnisse hinsichtlich der Induzierbarkeit der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung wurde auch von Donato et al. [22] sowohl für Ratten- als auch für humane Hepatozyten gefunden, wobei humane Hepatozyten insgesamt etwas niedrigere Aktivitäten aufwiesen. Durch PB konnte ebenfalls nur eine geringe, für 3-MC aber eine erhebliche Erhöhung der Umsatzrate festgestellt werden.

Die Hepatozytenkultur zeigte hierbei eine wesentlich geringere Aktivität als unbehandelte Hep G2-Kulturen. Nyberg et al. [77] fanden zwar wesentlich geringere CYP 1 A1- und 2-Aktivitäten in Hep G2-Zellen als in Hepatozyten, hier wurde aber das Medium nur mit 5% anstatt mit 10% fetalem Kälberserum versetzt. Dies kann die CYP-Aktivität in Hep G2-Zellen stark verringern [25].

Da die Hepatozyten auf Kollagen kultiviert werden mußten, wurde auch der Einfluß des Substrats auf die Umsatzrate bei Hep G2-Zellen untersucht, da diese für die Versuche auf Polystyren kultiviert wurden. Der Einfluß des Substrats ist in Abbildung 2-10 dargestellt. Hierbei wurde der Einfluß von Kollagen durch den Einsatz von Cytodex® mit normalem Polystyren verglichen.

Abbildung 2-10: 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung durch Hep G2-Monolayerkulturen auf Polystyren und Cytodex®,±s, n=6, *a<0,05 bzw. **a<0,01

Der Einfluß von Kollagen auf die Enzymaktivität der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylase in Hep G2-Zellen war nur gering. Die Umsatzrate der auf Kollagen kultivierten Zellen war ca. 10% höher als die der auf Polystyren kultivierten Hep G2-Zellen. Ferner war die Konjugierungsrate etwas erhöht (siehe Tabelle 2-1).

In Tabelle 2-1 ist der konjugierte Anteil des gebildeten Resurofins dargestellt. Dabei war der [Seite 26↓] dominierende Faktor die Glucuronidierung. Die Sulfatbildung betrug nur 20% aller Konjugate. Dies entspricht auch den Ergebnissen von Grant et al. [41], wobei ein Verhältnis von Glucuroniden zu Sulfaten von 5:1 bei Hep G2-Zellen und 4:1 für humane Hepatozyten in Kultur bei 1-Naphthol gefunden wurde (siehe auch 2.3.5.1).

Tabelle 2-1: Konjugierungsrate des gebildeten Resorufins in %

Zeit

[h]

Hep G2-Zellen

Hep G2-Zellen
kultiviert auf
Cytodex®

Hep G2-Zellen induziert mit
3-MC

Hep G2-Zellen induziert mit
PB

Hepatozyten
der Wistar-Ratte

1

32,5 ± 1,2

37 ± 5,7

63,9 ± 5,7

80 ± 7,3

97,4 ± 2,24

4

41,6 ± 3

52,9 ± 5,4

56,5 ± 3,5

64,5 ± 4,4

98,1 ± 4,5

24

48,8 ± 4,2

51,8 ± 5

65,6 ± 2,8

80,1 ± 9,2

88,6 ± 7,44

48

54,5 ± 3,9

57,2 ± 7,3

65,6 ± 3,6

72,2 ± 7,9

88,3 ± 6,7

72

65,7 ± 2,5

61,5 ± 6,6

75,8 ± 5,3

71,3 ± 4,7

87,5 ± 5,8

Bei induzierten Hep G2-Zellen war der Anteil der Konjugate höher als bei nicht vorbehandelten Hep G2-Zellen. Anscheinend wird Resorufin durch 3-MC- und PB-induzierbare UDP-Glucuronyl-transferasen konjugiert. Auch Sulfatasen können durch 3-MC induziert werden (siehe 2.3.5).

Hepatozytenkulturen zeigten eine wesentlich größere prozentuale Konjugationsrate als Hep G2-Zellen, wobei der Anteil der Sulfate an den Konjugaten ein Drittel beträgt [95]. Ein konkreter Vergleich der Aktivitäten ist hierbei aber nicht möglich, da es sich um sehr verschiedene Substratkonzentrationen handelte.

Der Einfluß des Lösungsmittels auf die Umsatzrate von 7-Ethoxyresorufin ist in Tabelle 2-2 abgebildet. Hierbei betrug die Inkubationszeit 24h und die Lösungsmittelkonzentration 0,5%.

Tabelle 2-2: Einfluß des Lösungsmittels auf die Umsetzung von 7-Ethoxyresorufin durch Hep G2-Zellen

Lösungsmittel

DMSO

Ethanol

96%

Methanol

Aceton

Umsatzrate [nmol/106 Zellen]

8,6 ± 0,7

4,3 ± 0,36

7,2 ± 0,5

8 ± 0,6

Die höchste Aktivität wurde in Hep G2-Kulturen gefunden, die mit in DMSO gelöstem 7-Ethoxyresorufin versetzt wurden. Methanol und Ethanol verringerten den Umsatz signifikant. Der Zusatz von Aceton führte zwar nur zu einem geringen Abfall der Umsatzrate im Vergleich zu [Seite 27↓] DMSO-behandelten Zellen, der Unterschied war aber signifikant (a < 0,05). Durch die schnelle Verdunstung von Aceton, erwies sich das Pipettieren kleiner Volumina und die Langzeitlagerung der Lösung als problematisch, weshalb Aceton nicht als Lösungsmittel zum Einsatz kam.

DMSO stabilisiert in isolierten Hepatozyten sowohl die CYP-Aktivität als auch die Aktivitäten der Phase-II-Reaktionen [83, 89]. Hierbei wurden Konzentrationen (2%) eingesetzt, die bei Hep G2-Zellen schon eine Freisetzung von Laktatdehydrogenase aus dem Zytosol bewirkten (siehe 4.1.2.8.). Eine Konzentration von weniger als 0,5% führte bei Hep G2-Zellen nicht zu toxischen oder proliferationshemmenden Erscheinungen (siehe 4.1.2.8), weshalb für alle folgenden Versuche DMSO als Lösungsmittel eingesetzt wurde.

Da die Enzymaktivität und damit die Umsatzrate stark von der Substratkonzentration abhängig ist, wurde dies durch Einsatz unterschiedlicher 7-Ethoxyresorufinkonzentrationen untersucht. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2-3.

Tabelle 2-3: Umsatzraten von 7-Ethoxyresorufin durch Hep G2-Zellen bei ansteigender Substratkonzentration

Konzentration

[nmol/ml]

Gesamtresorufin [nmol/106 Zellen]

1

1,34 ± 0,12

2

2,2 ± 0,11

4

6,7 ± 0,6

8

8,6 ± 0,7

16

11,3 ± 1

24

6,5 ± 1,1

Niedrige Substratkonzentrationen führten zu einer geringeren Bildung von Resorufin. Mit steigender Konzentration nahm die Umsatzrate bis zu einer Konzentration von 16nmol/ml zu. Bei 24nmol/ml 7-Ethoxyresorufin zeigten die Hep G2-Zellen toxische Erscheinungen wie Schrumpfungen, fibroblastoide Veränderungen und Ablösungen vom Substrat. Diese durch Zytotoxizität hervorgerufenen Veränderungen erklären auch den starken Abfall des Umsatzes von 7-Ethoxyresorufin, weshalb das Ergebnis nicht bei der Bestimmung des Km-Wertes mit einbezogen wurde. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit würde, theoretisch über den Lineweaver-Burk-Plot errechnet, bei 39,44nmol/ml Ethoxyresorufin erreicht werden. Dies lag weit im toxischen Bereich und konnte nicht bei Ganzzellen angewendet werden. Der theoretisch errechnete Km-Wert, also die Konzentration bei der die halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit [Seite 28↓] erreicht wird, lag mit 29,07nmol/ml 7-Ethoxyresorufin auch im toxischen Bereich und konnte ebenfalls nicht für Biotransformationsuntersuchungen an Zellkulturen herangezogen werden. Die eingesetzte Konzentration lag hiermit in einem Bereich, bei dem relativ hohe Umsatzraten beobachtet werden konnten, aber keine toxischen Erscheinungen bei den Zellkulturen auftraten. Der Einfluß von 7-Ethoxyresorufin auf die Proliferation von Hep G2-Kulturen wird in 4.1.2.10 besprochen.

2.3.1.2 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung in Zellhomogenaten und in subzellulären Fraktionen

Hep G2-Zellen und Rattenhepatozyten zeigten nach Ultraschallaufschluß eine geringfügig höhere Umsatzrate von 7-Ethoxyresorufin als in der Kultur (siehe Tabelle 2-4), welches in der besseren Zugänglichkeit der Enzyme für die Substrate begründet sein könnte. Auch konnte gezeigt werden, daß die 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung induzierbar war. Wiederum war 3-MC bei der Hep G2-Kultur der stärkere Induktor. Die Glucuronidierungs-raten wurden nicht bestimmt.

Tabelle 2-4: 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung in Zellhomogenaten nach Ultraschall-behandlung,±s, n=6

Zellhomogenat

Umsatz

[nmol/106 Zellen/h]

Hep G2-Zellen

3,32 ± 0,26

Hep G2-Zellen induziert mit 3-MC

6,9 ± 0,3

Hep G2-Zellen induziert mit PB

4,1 ± 0,3

Hepatozyten

1,55 ± 0,1

Bei der Untersuchung der Verteilung der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylase-Aktivität auf die Zellorganellen (siehe Abbildung 2-11) konnte gezeigt werden, daß die für die Umsetzung von 7-Ethoxyresorufin verantwortlichen Enzyme in den Mikrosomen lokalisiert waren. Restaktivitäten im Zytosol könnten auf eine unvollständige Trennung von Zytosol und Mikrosomen hinweisen. Die daneben auftretenden geringen Aktivitäten in Mitochondrien und Lysosomen könnten die selbe Ursache haben oder aber auf geringe CYP-Konzentrationen in diesen Organellen hinweisen. Auffällig war, daß die Aktivität in isolierten Mikrosomen höher war als im Zellhomogenat, welches möglicherweise auf einen beschleunigten Abbau von CYP durch freigesetzte lysosomale Proteasen im Zellhomogenat zurückgeführt werden könnte.


[Seite 29↓]

Abbildung 2-11: Verteilung der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylase-Aktivität in den sub-zellulären Fraktionen von Hep G2-Zellen, ±s, n=6

2.3.1.3  7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung durch Rattenlymphozytenkulturen

Die Ergebnisse der Biotransformation von 7-Ethoxyresorufin durch Lymphozytenkulturen sind in Abbildung 2-12 dargestellt. Da bei Lymphozyten keine UDP-Glucuronyltransferase- und Sulfataseaktivitäten zu erwarten sind [59], wurde auf eine Deglucuronidierung und -sulfatierung verzichtet.

Anders als von Stephen et al. [101] berichtet, konnten geringe, aber detektierbare 7-Ethoxyresorufin-O-deethylase Aktivitäten in Lymphozyten gefunden werden. Im Gegensatz zu humanen Lymphozyten, scheinen Lymphozyten der Ratte CYP 1 A1 und 2 auch ohne Induktion zu besitzen [46]. Die Enzymaktivität war während der ersten Stunde am höchsten und nahm dann über 72h ab. Nach Inkubation mit Concanavalin A blieb sie höher und die Umsatzrate stieg um das 1,5-fache an. PB-Inkubation führte nicht zu einer Induktion, sondern zu einer leichten Hemmung der Enzymaktivität. Eine Behandlung mit Concanavalin A erhöhte wiederum die Umsatzrate. Die höchste Induktion konnte bei 3-MC behandelten Lymphozyten beobachtet werden. Hier war die Umsatzrate 2-fach erhöht. Eine zusätzliche Behandlung mit Concanavalin A steigerte die Bildung von Resorufin nochmals um knapp 20% und führte nicht, wie für Thymuslymphozyten und dem Induktor 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin beschrieben, zu einer Inhibition der Enzymaktivität [101].


[Seite 30↓]

Abbildung 2-12: Umsatz von 7-Ethoxyresorufin durch Lymphozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=8, a<0,01 bzw. *a<0,05

Durch Fung et al. [35] konnte gezeigt werden, daß Lymphozyten der Ratte sowohl konstitutiv als auch nach Induktion mit 3-MC CYP 1 A1, nicht aber CYP 1 A2, enthalten. Es kann also angenommen werden, daß die beobachtete 7-Ethoxyresorufin-O-deethylase-Aktivität nur auf CYP 1 A1-Aktivität zurückzuführen ist.

2.3.2 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung

Ein weniger spezifisches Substrat für CYP 1 A1 und 2 ist 7-Ethoxycoumarin. Dessen Umsetzung wird weiterhin von CYP 2 B1 und 2 und CYP 2 A1 katalysiert [78]. Die CYP 2 B-Familie wird vor allem durch Barbiturate induziert, wobei Phenobarbital der stärkste Induktor durch transkriptionale Aktivierung und Stabilisierung der mRNA ist. CYP 2 B2 ist in der Leber der Ratte konstitutiv, während CYP 2 B1 nur in Lunge und Testis konstitutiv, in allen anderen Geweben aber induzierbar ist. Auch CYP 2 A1 kommt in der Leber konstitutiv vor und kann durch PB und 3-MC induziert werden [98]. Da also sowohl PB- als auch 3-MC-induzierbare CYP an der Umsetzung von 7-Ethoxycoumarin beteiligt sind, ist zu erwarten, daß die Vorbehandlung mit PB einen stärkeren Einfluß zeigt als bei der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung.

Die Aktivitäten der CYP 2 A1, 2 B1 und 2 werden in vivo stark beeinflußt von [Seite 31↓] Wachstums-hormonen und sind damit altersabhängig. CYP 2 A1-Aktivitäten hängen darüber hinaus vom Geschlecht ab und ändern sich bei Diabetes oder hohem Blutdruck, während CYP 2 B1 und 2 sich bei Hunger erhöhen [98].

Der Mechanismus der Deethylierung von 7-Ethoxycoumarin findet wie unter 2.3.1 für 7-Ethoxyresorufin beschrieben statt. Die Fluoreszenz des entstandenen 7-Hydroxycoumarins (siehe Abbildung 2-13 ) ist stark abhängig von der Temperatur und vom pH der wäßrigen Lösungen in der es bestimmt wird. Deshalb ist eine genaue Standardisierung der Temperatur, des pH-Werts und der Zeit der Messung nach Reextraktion in wäßriges Milieu unbedingt erforderlich [82].

Aufgrund der entstandene freie Hydroxylgruppe, die prinzipiell konjugiert werden kann, ist eine Deglucuronidierung und -sulfatierung zur Bestimmung des Gesamtumsatzes erforderlich.

Abbildung 2-13: 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung

2.3.2.1 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung durch Hep G2- und Rattenhepatozyten-kulturen

In Abbildung 2-14 ist die Umsatzrate von 7-Ethoxycoumarin durch unbehandelte und induzierte Hep G2-Zellen sowie durch Hepatozyten der Ratte dargestellt.

Alle Kulturen zeigten die höchste Aktivität in der ersten Stunde, danach blieb die Aktivität der 3-MC-induzierten Hep G2-Zellen am höchsten. PB-induzierte Hep G2-Zellen zeigten hier eine deutlich höhere Aktivitätserhöhung als bei der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung, welches bestätigt, daß an der 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung nicht nur die 3-MC-induzierbaren CYP 1 A1- und 2-, sondern auch die PB induzierbare CYP 2 B1-und 2-Isoenzyme an der Umsetzung beteiligt sind. Doch scheinen letztere in einem geringeren Maß die Deethylierung zu katalysieren oder aber ihre Induzierbarkeit ist im Vergleich zu den 3-MC-induzierten Formen geringer. Dawson et al. [17] fanden für die Induzierbarkeit der 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung ähnliche Ergebnisse, doch waren die Gesamtumsatzraten wesentlich niedriger als die hier gezeigten, was durch einen geringen Zusatz von fetalem Kälberserum (5%) begründet sein könnte. Nach 4h Inkubationszeit wurden von Dawson et al. eine 1,3-fache Erhöhung der Umsatzrate für PB-induzierte Kulturen und eine 32-fache für 3-MC-induzierte Kulturen gefunden. Die in Abbildung 2-14 dargestellten Werte ergeben eine 1,1-fache bzw. 1,7- [Seite 32↓] fache Erhöhung für PB bzw. 3-MC nach 4h und eine 2,8-fache bzw. 5,4-fache Erhöhung für PB bzw. 3-MC nach 72h Inkubationszeit. Trotz höherem Gesamtumsatz, ist hierbei die Induktion geringer. Allerdings wurden von Dawson et al. höhere Konzentrationen der Induktoren eingesetzt, nämlich 1mM PB statt 0,8mM und 5µM 3-MC statt 1,5µM, wobei 5µM 3-MC auf Hep G2-Zellen stark toxisch wirkten (siehe 4.1.2.5).

Abbildung 2-14: Umsatz von 7-Ethoxycoumarin durch Hep G2-Zellkulturen und Hepatozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=10, a<0,01

Die Enzymaktivität der Hepatozyten war, wie auch schon bei der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung, geringer als bei Hep G2-Kulturen. Zwar wurden auch höhere Aktivitäten (4-10nmol/106 Zellen/h) von Rattenhepatozytenkulturen über 1h berichtet [49, 82], diese lagen aber nicht wesentlich höher, als die von unbehandelten Hep G2-Zellen (5,5nmol/106 Zellen/h).

2.3.2.2 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung durch Zellhomogenate und subzelluläre Fraktionen

Sowohl in Hepatozyten als auch in Hep G2-Zellen war die Aktivität der 7-Ethoxycoumarin-O-deethylase nach Ultraschallbehandlung größer als in der Zellkultur, wie in Tabelle 2-5 zu sehen ist. Eine Induktion der Enzymaktivität durch 3-MC führte zu einer 1,6-fachen Erhö-hung und war damit geringer als bei der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung. Die Induktion mit PB fiel mit einer [Seite 33↓] 1,25-fachen Zunahme genauso hoch aus, wie bei 7-Ethoxyresorufin, war aber höher als in der Zellkultur, bei der sich eine Erhöhung der Umsatzrate durch PB erst nach 48h bemerkbar machte. Insgesamt unterstreicht dieses Ergebnis noch einmal die geringere Induzierbarkeit der 7-Ethoxycoumarin-O-deethylase-Aktivität durch 3-MC, was auf einen höheren Anteil an CYP 2 B1- und 2- sowie CYP 2 A1-Aktivität als bei der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung hinweist.

Tabelle 2-5: 7-Ethoxycoumarin-O-deethylierung in Zellhomogenaten nach Ultraschall-behandlung, ±s, n=6

Zellhomogenat

Umsatz

[nmol/106 Zellen/h]

Hep G2-Zellen

7,2 ± 0,6

Hep G2-Zellen induziert mit 3-MC

11,45 ± 1,1

Hep G2-Zellen induziert mit PB

9,02 ± 0,72

Hepatozyten

3,6 ± 0,27

Die Untersuchungen der Verteilung der 7-Ethoxycoumarin-O-deethylase-Aktivität auf die Zellorganellen zeigten ähnliche Ergebnis wie die der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylase. Die höchste Aktivität konnte in den Mikrosomen gefunden werden, während die Restaktivitäten in Zytosol, Mitochondrien und Lysosomen sehr gering waren. Auch hier war die Aktivität in den Mikrosomen höher als im Zellhomogenat, was wiederum auf den Abbau von CYP durch nach Ultraschallbehandlung frei gewordenen lysosomalen Proteasen zurückgeführt werden könnte.


[Seite 34↓]

Abbildung 2-15: Verteilung der 7-Ethoxycoumarin-O-deethylase-Aktivität auf die subzellulären Fraktionen von Hep G2-Zellen, ±s, n=6

2.3.3 Aminophenazon-N-demethylierung

Aminophenazon (PyramidonÒ) ist ein Pyrazolin-5-on, das als Analgetikum, Antipyretikum und Antiphlogistikum zum Einsatz kam, aber wegen des Risikos der Entstehung des karzinogenen N-Nitrosodimethylamins aus der Dimethylaminogruppe 1978 aus dem Handel gezogen wurde [92].

Seine drei Hauptmetaboliten in vivo sowie in vitro entstehen durch Demethylierung zum sekundären und schließlich zum primären Amin(siehe Abbildung 2-16) und durch Hydroxylierung zu 3-Hydroxymethyl-2-methyl-4-dimethylamino-1-phenyl-3-pyrazolin-5-on [29]. Die Bildung von 2-Methyl-4-monomethylamino-1-phenyl-3-pyrazolin-5-on ist bei der primären Hepatozytenkultur der Ratte der Hauptabbauweg von Aminophenazon. Dieser Metabolit ist nach Inkubation in einer 10mal höheren Konzentration vorhanden als alle anderen Metaboliten. Das primäre Amin und in 3-Stellung hydroxyliertes Aminophenazon entstehen nur in vergleichsweise geringen Mengen. Weitere Metaboliten sind 4-Acetyl-und 4-Formylamino-1-phenyl-3-pyrazolin-5-on [94].

Die Demethylierung von Aminophenazon (siehe Abbildung 2-16) wird vor allem durch CYP 3 A1 und 2 katalysiert. CYP 3 A1 und 2 werden besonders spezifisch durch Pregnenolon-16a-carbonitril induziert. Weniger spezifische Induktoren sind andere Steroide, z.B. Dexamethason, aber auch PB und Makrolidantibiotika, nicht aber 3-MC [78]. CYP 3 A2 kommt in der Leber und im Darm der Ratte konstitutiv vor und seine Aktivität hängt vom Alter und vom Geschlecht ab. Auch Wachstumshormone, Diabetes und Hunger verändern die Enzymaktivität. CYP 3 A1 kann [Seite 35↓] in allen Geweben induziert werden [98].

Bei der oxidativen Demethylierung von Aminophenazon erfolgt der Angriff des aktivierten Sauerstoffs an der Methylgruppe. Es entsteht ein Carbinolamin, das wegen geringer Stabilität schnell in das sekundäre bzw. primäre Amin und Formaldehyd zerfällt [79].

Abbildung 2-16: Demethylierung von Aminophenazon

Die Bestimmung des entstandenen Formaldehyds wurde nach der Methode von Nash et al. [75, 112] durchgeführt. Dabei wird gebildeter Formaldehyd mit Acetylaceton in Gegenwart von überschüssigem Ammoniumsalz zu 3,5-Diacetyl-1,4-dihydrolutidin umgesetzt, welches photometrisch bestimmt werden kann.

Abbildung 2-17: Formaldehydbestimmung nach Nash

2.3.3.1 Aminophenazon-N-demethylierung durch Hep G2- und Rattenhepatozyten-kulturen

Wie in Abbildung 2-18 zu erkennen ist, war die Demethylierung von Aminophenazon in Hepatozytenkulturen wesentlich höher als in Hep G2-Zellen. Selbst eine Induktion der Hep G2-Zellen mit Dexamethason führte nicht zu einer ähnlich hohen Umsatzrate, sondern nur zu einer 1,5-fachen Erhöhung. Die Induktion mit Phenobarbital fiel mit einer 1,3-fachen Erhöhung ebenfalls gering aus und der Effekt von 3-MC auf die Demethylierung war noch geringer.


[Seite 36↓]

Abbildung 2-18: Aminophenazondemethylierung durch Hep G2-Zellen und Hepatozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=10, a<0,01

2.3.3.2 Aminophenazon-N-demethylierung durch Zellhomogenate und isolierte Zellorganellen

Hep G2-Zellen und Hepatozyten zeigten nach Behandlung mit Ultraschall ähnliche Umsatz-raten bei der Aminophenazon-N-demethylierung (siehe Tabelle 2-6). Da Hepatozyten einen wesentlich höheren Umsatz in der Zellkultur hatten, war dies überraschend. Möglicher-weise sind die an dieser Reaktion beteiligten CYP-Isoenzyme im Zellhomogenat von Ultraschall behandelten Hepatozyten wesentlich stärker einer Zersetzung durch lysosomale Proteasen ausgesetzt als in Hep G2-Zellhomogenaten. Insgesamt zeigten hier Hep G2 Zellen sogar einen geringfügig höheren Umsatz als Hepatozyten.

Tabelle 2-6: Aminophenazon-N-demethylierung durch Zellhomogenate, ±s, n=6

Zellhomogenat

Umsatz [nmol/106 Zellen/h]

Hep G2-Zellen

11,7 ± 0,33

Hepatozyten

9,3 ± 0,5

Daß in Hep G2-Zellen ebenfalls eine Zersetzung von CYP 3 A1 und 2 stattfand, ist in [Seite 37↓] Abbildung 2-19 zu erkennen. Das Zellhomogenat zeigte einen wesentlich geringeren Umsatz als die Mikrosomenfraktion nach Isolierung der Zellorganellen. Auch in Lysosomen und Mitochondrien, sowie im Zytosol, konnten relevante Aminophenazon-N-demethylase-Aktivitäten nachgewiesen werden.

Abbildung 2-19: Verteilung der Aminophenazon-N-demethylase-Aktivität auf die sub-zellulären Fraktionen von Hep G2-Zellen, ±s, n=6

2.3.4  4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen-Reduktion

Die Reduktion von 4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen (DAB) wird durch die CYP 4 A-Isoenzyme katalysiert.

CYP 4 A-Isoenzyme kommen bei der Ratte in Leber und Niere konstitutiv vor und können durch Peroxysomen-proliferierende Agenzien, wie z.B. der hypolipidämische Arzneistoff Clofibrat, über die Aktivierung der Transkription mittels PPAR (peroxysome proliferator activated receptor) induziert werden [97].

Substrate für CYP 4 A sind normaler Weise gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (C6-C12), die in w-Stellung hydroxyliert werden. Zu einem geringeren Anteil und durch andere CYP-Isoenzyme, wie z.B. CYP 2 E1, kann auch eine Hydroxylierung in w-1-Stellung stattfinden [13]. Durch w- und w-1-Hydroxylierung entstehen primäre sowie sekundäre Alkohole, die weiter metabolisiert werden zu Dicarbonsäuren bzw. w-1-Oxo-Fettsäuren. Die Dicarbonsäuren können dann der peroxysomalen b-Oxidation zugeführt werden. Die CYP 4 A-Subfamilie hat eine besonders hohe Spezifität für das Substrat Laurinsäure und ist weiterhin am Metabolismus der Arachidonsäure und deren Folgeprodukten beteiligt [78].

Die Karzinogenität der meisten Azofarbstoffen, wie z.B. DAB, beruht auf einer intakten Azofunktion. Daher ist die Reduktion von DAB und anderen Azoverbindungen ein [Seite 38↓] Hauptabbauweg zur Inaktivierung dieser Karzinogene. DAB wird aber auch oxidativ metabolisiert über N-Demethylierung, Ringhydroxylierung und N-Hydroxylierung. Diese Reaktionen werden durch PB und 3-MC induzierbare CYP-Formen katalysiert, die Reduktion von DAB aber ausschließlich durch Clofibrat induzierbare CYP [81,102]. DAB wird weiterhin auch durch NADPH-Cytochrom P-450 Reduktase unter anaeroben Bedingungen [62] und durch zytosolische Reduktasen [45] reduziert.

Abbildung 2-20: Azoreduktion von 4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen

Das gebildete 4-(N,N-Dimethylamino)anilin kann nach der Methode von Huang et al. [45] bestimmt werden. Nur dieses Produkt wird unter den Bedingungen dieses Assays extrahiert. Nach der Extraktion wird 4-(N,N-Dimethylamino)anilin an Fluorescamin gekuppelt, wobei ein stark fluoreszierendes Produkt entsteht. Fluorescamin kann auch zur Bestimmung von primären Aminogruppen in Proteinen oder von Aminosäuren genutzt werden [45].

Abbildung 2-21: Kupplung von 4-(N,N-Dimethylamino)anilin an Fluorescamin


[Seite 39↓]

2.3.4.1  4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen-Reduktion durch Hep G2- und Rattenhepato-zytenkulturen

Die Reduktion von DAB durch Hep G2- und Hepatozytenkulturen ist in Abbildung 2-22 dargestellt:

Abbildung 2-22: Azoreduktion von DAB durch Hep G2-Zellen und Hepatozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=10, a<0,01

Die Umsatzrate von DAB durch Hep G2-Zellen ließ sich erheblich steigern durch Vorbehandlung mit Clofibrat. Es kam zu einem 4,5-fachen Umsatz während der ersten Stunde. Der Unterschied zwischen unbehandelten und Clofibrat behandelten Zellen wurde während 24h Inkubationszeit kleiner und war schließlich nur noch 1,3-fach. Da Clofibrat ein CYP-spezifischer Induktor ist, kann die Erhöhung der Aktivität auf eine Erhöhung der CYP-Aktivität zurückgeführt werden. Durch Inkubation mit Metyrapon kam es wie erwartet zu einer Senkung der Umsatzrate um 60-70%, aber es blieb eine Restaktivität zurück, die der Aktivität der zytosolischen Azoreduktasen entsprechen könnte, da diese nicht durch Metyrapon gehemmt werden [45].

Eine Vorbehandlung mit 3-MC und PB führte zu einer leichten Inhibition der Azoreduktase-aktivität, obwohl von Huang et al. [45] eine Induzierbarkeit der zytosolischen Azoreduktasen durch 3-MC berichtet wurde. Eine Verringerung der Umsatzrate durch Vorbehandlung mit PB wurde auch von Raza et al. [81] für Rattenhepatozyten gefunden. Für frisch isolierte Hepatozyten konnte nur eine 13,5% Inhibition der Azoreduktion von DAB durch Metyrapon [Seite 40↓] gefunden werden. Eine stärkere Hemmung wurde durch andere CYP-Inhibitoren, wie z.B. a-Naphthoflavon erreicht.

Hepatozyten der Ratte zeigten eine deutlich geringere Aktivität als Hep G2-Zellen. Der geringe Anstieg der Umsatzrate mit der Zeit kann darauf zurückzuführen sein, daß die Aktivität der Azoreduktion während der ersten 24h der Kultivierung stark absinkt [102]. Stoddart et al. [102] fanden ähnliche, aber etwas höhere Aktivitäten der Azoreduktase, die aber immer noch niedriger waren, als die hier dargestellten von Hep G2-Zellen.

Der Anteil von CYP 4-Aktivität an der Azoreduktion von DAB scheint sowohl in Hep G2-Zellen als auch in Hepatozyten der Ratte [102] relativ hoch zu sein. Eine Induktion durch Clofibrat, bzw. eine Hemmung der CYP-Aktivität durch CYP-Inhibitoren ist bei beiden Systemen möglich.

2.3.4.2  4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen-Reduktion durch Zellhomogenate und subzelluläre Fraktionen

Die Reduktion von DAB durch Hep G2-Zellen nach Ultraschallbehandlung (siehe Tabelle) war geringer als in intakten Zellkulturen. Dies traf auch auf Hepatozyten zu. Ein Grund für dieses Phänomen könnte eine vermehrte Spaltung des CYP 4 A-Isoenzyms durch freigewordenen lysosomale Proteasen sein. Auch hier zeigte sich deutlich die Induzierbarkeit der Azoreduktase-Aktivitäten durch Zusatz von Clofibrat. Hepatozyten hatten, wie in der Zellkultur eine geringere Umsatzrate als unbehandelte Hep G2-Zellen.

Tabelle 2-7: Azoreduktase-Aktivität in Zellhomogenaten nach Ultraschallbehandlung, ±s, n=6

Zellhomogenat

Umsatz in

nmol/106 Zellen/h

Hep G2-Zellen

17 ± 1,1

Hep G2-Zellen induziert mit Clofibrat

33 ± 4

Hepatozyten der Wistar-Ratte

5,9 ± 0,6

Die Verteilung der Azoreduktase-Aktivität auf die Zellorganellen zeigte deutlich, daß Azoreduktase sowohl in den Mikrosomen als auch im Zytosol vorhanden war, wobei die zytosolische Aktivität, im Gegensatz zu der mikrosomalen, nicht auf CYP zurückzuführen ist [62, 81, 102]. Azoreduktase-Aktivität in den Lysosomen und Mitochondrien waren sehr gering und nur schwer detektierbar, weshalb angenommen werden kann, daß sie auf Grund einer unvollständigen Trennung der Organellen entstanden sein könnten.


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Abbildung 2-23: Verteilung der Azoreduktase-Aktivität auf die subzellulären Fraktionen von Hep G2-Zellen, ±s, n=6

2.3.4.3 4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen-Reduktion durch Rattenlymphozytenkulturen

Im Gegensatz zu den Umsatzraten bei Hep G2-Zellen und Hepatozyten, ist der Umsatz von DAB durch Lymphozyten der Ratte nicht im mikromolaren sondern im nanomolaren Bereich. Die Umsatzrate konnte sowohl durch den CYP 4 A-spezifischen Induktor Clofibrat als auch und in wesentlich höherem Maß durch das Mitogen Concanavalin A erhöht werden. Metyrapon führte zwar zu einer Hemmung der Enzymaktivität, aber die Inhibition war wesentlich kleiner als bei Hep G2-Zellen. Gründe dafür könnten eine unvollständige Hemmung von CYP 4 A oder ein höherer Anteil an zytosolischen Reduktasen an der Azoreduktion sein. Daß an der Enzymaktivität CYP 4 A beteiligt ist, zeigte die Induzierbarkeit der Aktivität durch Clofibrat. Die Erhöhung der Umsatzrate durch Concanavalin A ist wesentlich stärker, als es bei der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung beobachtet werden konnte. Es ist möglich das diese starke Zunahme der Umsatzrate nicht allein auf die Aktivität von CYP-Isoenzymen zurückzuführen ist, sondern daß durch die allgemeine Zunahme der Proteinsynthese nach Behandlung mit Concanavalin A ein Anstieg von zytosolischen Reduktasen stattgefunden hat.


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Abbildung 2-24: Azoreduktion von DAB durch Lymphozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=8, α<0,01

Auch hier konnte, wie bei der 7-Ethoxyresorufin-O-deethylierung (siehe 2.3.1.3), nicht nur die Stimulierung der Lymphozyten, sondern auch eine Veränderung der biotransformatorischen Eigenschaften durch Behandlung mit dem mitogenen Lektin Concanavalin A beobachtet werden.

2.3.5  p-Nitrophenol-Konjugation

Die Konjugation von lipophilen Substanzen mit Glucuronsäure und Sulfaten (siehe Abbildung 2-25) ist die bedeutendste Phase II-Reaktion. Die zu konjugierenden Substanzen müssen die entsprechenden strukturellen Voraussetzungen, z.B. eine Hydroxy- oder Carbonylgruppe, besitzen. Das Ziel der Konjugierung ist die Inaktivierung, Detoxifikation und Elimination unterschiedlicher Arzneistoffe, Umweltchemikalien und endogener Substanzen. Dabei wird die Hydrophilie dieser Substanzen erhöht, damit diese durch Galle oder Urin ausgeschieden werden können.

UDP-Glucuronyltransferasen sind membrangebundene Enzyme des endoplasmatischen Retikulums der Leber und anderer Organe, die viele Verbindungen mit dem Zucker UDP-Glucuronsäure zu Glucuroniden konjugieren. Dazu gehören nicht nur exogene Substanzen, wie Arzneistoffe, Farbstoffe, Pestizide usw., sondern auch endogene Substanzen z.B. Bilirubin, [Seite 43↓] Gallensäuren, Steroide und fettlösliche Vitamine.

UDP-Glucuronyltransferasen übertragen Glucuronsäure auf Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Kohlenstoffatome des Akzeptormoleküls. Dazu muß UDP-Glucuronsäure zuerst an das aktive Zentrum der UDP-Glucuronyltransferase binden, wodurch die a-Bindung zu UDP gelockert wird. Nun kann es zu einer Bindung mit einem nucleophilen Akzeptormolekül auf der anderen Seite der Glucuronsäure kommen, wobei ein b-D-Glucuronid und freies UDP entsteht [67].

Die p-Nitrophenol-UDP-Glucuronyltransferase ist die am stärksten durch 3-MC induzierbare Form in der Rattenleber, sie kommt aber auch in der Niere, Lunge, Darmmukosa, Milz und in der Haut vor. Außer p-Nitrophenol glucuronidiert dieses Enzym auch andere Phenole, wie z.B. 1-Naphthol oder 4-Methylumbelliferon, sowie Phenolgruppen von polyzyklischen Kohlenwasserstoffen, z.B. Benzopyren. Auch andere UDP-Glucuronyltransferasen mit überlappender Substratspezifität können bei der Glucuronidierung von p-Nitrophenol beteiligt sein.

Sulfotransferasen kommen sowohl im Zytoplasma als auch im endoplasmatischen Retikulum in allen Geweben vor. Auch hier existieren unterschiedliche Enzymformen mit unterschiedlichen und überlappenden Substratspezifitäten, wobei vor allem die Gruppe der Phenol-Sulfotransferasen für die Konjugierung von p-Nitrophenol verantwortlich sein sollten.

Als Cosubstrat dient den Sulfotransferasen 3’-Phosphoadenosin-5’-phosphosulfat (PAPS), in dem die Sulfatgruppe aktiviert vorliegt. Es werden vor allem Phenole und Alkohole, gelegentlich aber auch primäre Amine mit Schwefelsäure verestert.

Die Aktivität der Sulfotransferasen hängt im allgemeinen von Alter und Geschlecht ab. Über Induktion von Sulfotransferasen ist nicht viel bekannt. Einige Sulfotransferasen können durch 3-MC oder Sexualhormone induziert werden [58].

Sulfotransferasen werden auch durch die Interaktionen von Sulfaten und Glucuroniden beeinflußt. Bei niedrigen Substratkonzentrationen dominiert meist die Sulfatierung, während bei höheren Substratkonzentrationen die Glucuronidierung vorherrscht [58, 95]. In vivo sind die Transferasen in der Leber unterschiedlich verteilt. So befinden sich höhere Sulfotransferase-Aktivitäten im periportalen Regionen; Glucuronyltransferasen sind mehr in der perizentralen Region lokalisiert.

In primären Hepatozytenkulturen gibt vor allem das Alter der Kultur den entscheidenden Ausschlag für den Anteil der Sulfate bei der Konjugation einer Substanz. Die Aktivität der Sulfotransferase beginnt schon nach 24h zu sinken, die Aktivität der Glucuronyl-transferasen steigt mit dem Alter der Kultur nachdem sie ein anfängliches Tief von 24h überwunden hat [53].


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Abbildung 2-25: Glucuronidierung und Sulfatierung von p-Nitrophenol

2.3.5.1  p-Nitrophenolkonjugation durch Hep G2- und Rattenhepatozytenkulturen

Abbildung 2-26 zeigt das Ergebnis der Nitrophenolkonjugation durch unbehandelte Hep G2-Kulturen, sowie 3-MC- und PB-induzierte Kulturen, im Vergleich mit Hepatozytenkulturen der Wistar-Ratte.

Unbehandelte und induzierte Hep G2-Zellen zeigten in den ersten 4h die höchste Enzymaktivität. Danach sank die Aktivität und blieb schließlich über 72h fast konstant. Am höchsten blieb sie bei PB-induzierten Zellen, aber auch 3-MC-induzierte Zellen zeigten eine verstärkte Aktivität gegenüber unbehandelten Hep G2-Zellen.

Obwohl die p-Nitrophenol-UDP-Glucuronyltransferase zu den 3-MC-induzierbaren Transferase-formen gehören soll [67], ist die Umsatzrate bei PB-induzierten Hep G2-Kulturen am höchsten. Bock und Bock-Hennig [11] fanden zwar ebenfalls eine Erhöhung der Umsatzrate nach PB-Induktion bei Hep G2-Zellen, aber eine geringere als bei 3-MC-induzierten. Allerdings wurde hier eine 3-MC-Konzentration gewählt (5µmol), die im Versuch für Hep G2-Zellen stark toxisch war.

Da die Umsatzrate bei PB-induzierten Zellen sehr hoch war, müssen außer 3-MC-induzierbaren Isoformen auch noch andere PB-induzierbare UDP-Glucuronyltransferasen an der Konjugation von p-Nitrophenol beteiligt sein. Eine PB induzierbare Form ist die 4-Hydroxybiphenyl-UDP-Glucuronyltransferase, die auch Phenolphthalein und einige Sexualhormone glucuronidiert [67]. Stark erhöhte Phenolphthaleinglucuronidierung nach PB-Gabe konnte in Rattenhepatozyten und in Hep G2-Zellen beobachtet werden [41].

Grant et al. [41] fanden eine um die Hälfte verringerte UDP-Glucuronyltransferase Aktivität in Hep G2-Zellen verglichen mit humanen Hepatozyten, wobei die hier gefundenen Werte für Hep G-Zellen mit diesen korrelieren. Auch der Anteil an Sulfaten an den Gesamtkonjugaten betrug hierbei wie bei Grant et al. 20%, während es bei humane Hepatozyten 25% Sulfate sein sollen [41].


[Seite 45↓]

Abbildung 2-26: Konjugation von p-Nitrophenol durch Hep G2-Zellen und Hepatozyten der Wistar-Ratte, ±s, n=10, a<0,01

Die Enzymaktivität in Rattenhepatozyten zeigte einen ähnlichen Verlauf wie in unbehandelte Hep G2-Zellen. Sie war in den erste 4h höher als in Hep G2-Zellen, sank aber auch ab und blieb schließlich über 72h fast konstant. Der Anteil der Sulfate an den Gesamtkonjugaten dürfte hier größer sein als bei humanen Hepatozyten und Hep G2-Zellen. Shipley et al. [95] berichtete ein Verhältnis von 2:1 von Glucuroniden zu Sulfaten bei der Konjugierung von p-Nitrophenol durch Hepatozyten von männlichen Sprague-Dawley-Ratten.

Unbehandelte Hep G2-Zellen hatten eine geringere Aktivität als unbehandelte Hepatozyten der Ratte. Dies kann durch gezielte Induktion ausgeglichen werden.

2.3.5.2 p-Nitrophenolkonjugation in Zellhomogenaten und subzellulären Fraktionen

Die Ergebnisse der Konjugation von p-Nitrophenol durch mit Ultraschall behandelte Zellen erhärten die Ergebnisse aus 2.3.5.1 (siehe Tabelle 2-8). Hep G2-Zellen zeigten einen etwas geringeren Umsatz als Hepatozyten der Wistar-Ratte. Doch konnte die Konjugationsrate in Hep G2-Zellen erheblich gesteigert werden durch Induktoren.

Auch hier zeigte sich, daß PB der potentere Induktor für die Glucuronyltransferasen bzw. Sulfotransferasen war. Dieses Ergebnis unterstreicht, daß bei der Konjugation von p-Nitrophenol [Seite 46↓] durch Glucuronyl- und Sulfotransferasen andere, größtenteils PB-induzierbare Isoenzyme beteiligt sein müssen. Bei der Wistar-Ratte wird die Konjugationsrate stärker durch 3-MC beeinflußt [58, 67].

Tabelle 2-8: Nitrophenolkonjugation durch Zellhomogenate nach Ultraschallbehandlung, ±s, n=6

Zellhomogenat

Umsatz

[nmol/106 Zellen/h]

Hep G2-Zellen

15 ± 1,5

Hep G2-Zellen induziert mit 3-MC

92 ± 1,5

Hep G2-Zellen induziert mit PB

188 ± 6

Hepatozyten

18,2 ± 0,7

Der Hauptort der Konjugation war wie zu erwarten die Mikrosomenfraktion (siehe Abbildung 2-27). Hier findet die Glucuronidierung von Substraten statt [67].

Geringe Aktivitäten im Zytosol könnten auf Glucuronyltransferase-Aktivitäten zurückgeführt werden, die aufgrund unvollständiger Abtrennung der Mikrosomen vorhanden sein könnten.

Da im Zytosol die Sulfotransferasen lokalisiert sind [58], kann weiterhin angenommen werden, daß auch Sulfotransferasen am Umsatz beteiligt waren, obwohl kein weiterer PAPS-Zusatz zum Inkubationsansatz erfolgte. Dies würde vorraussetzen, daß sehr geringe Konzentrationen von PAPS, wie sie nach der Auftrennung der einzelnen Fraktionen durch Verdünnungen in der Zytosolfraktion vorliegen, für meßbare Aktivitäten der Sulfotrans-ferasen ausreichend sind.

Auch in Mitochondrien und Lysosomen konnten Umsätze detektiert werden, doch waren diese geringfügig und könnten deshalb auch durch unvollständige Trennung von Zytosol oder Mikrosomen entstanden sein.


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Abbildung 2-27: Verteilung der Konjugierungsaktivität in isolierten subzellulären Fraktionen von Hep G2-Zellen, ±s, n=6


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10.09.2004