3  Untersuchungen zur Biotransformation von 3 potentiellen Arzneistoffen durch Hep G2-Zellen

AWD 100-041, 3-(2-Mercaptoethyl)chinazolin-2,4(1H, 3H)-dion (siehe Abbildung 3-1), ist eine immunmodulierende Substanz mit stimulierenden und restaurativen Effekten auf das Immunsystem [26, 61, 96].

	Abbildung 3-1: AWD 100-041

Im Tierversuch erhöht AWD 100-041 nach p.o. Applikation dosisabhängig die antikörperbildenden Zellen. Mittels Plaque-Technik nach Cunningham wurde ein signifikanter Anstieg von IgG-Plaque-bildenden Zellen und IgM-Plaque-bildenden Zellen nachgewiesen.

Der zellproliferierende Effekt konnte durch Immunisieren der Versuchstiere mit Schaferythrozyten und fünftägiger p.o. Verabreichung des Wirkstoffes bestätigt werden. Im Lymphknotenassay und nach entsprechender histologischer Auswertung konnten nach Dinitrofluorbenzen und einmaliger Applikation von AWD 100-041 eine Zunahme der pyroninophilen Lymphoblasten und zellproliferative Effekte nachgewiesen werden. Dies findet bevorzugt im parakortikalen Bereich der Lymphknoten statt. Bei der Untersuchung der Beeinflussung der unspezifischen Immunabwehr durch AWD 100-041 wurde eine verstärkte „Spreading“- bzw. Phagozytoseaktivität bei durch Noxen aktivierten Makro-phagen des Meerschweinchenperitonealexsudats gefunden.

Die immunrestaurative Wirkung von AWD 100-041 konnte durch eine Zurückbildung der supprimierten Antikörperbildung nach Ganzkörperbestrahlung und Behandlung der Versuchstiere mit Zytostatika beobachtet werden. Auch die durch Carageenan verursachte Schwächung der humoralen Immunreaktion konnte zurückgebildet werden. Allerdings war in beiden Fällen die vollständige Wiederherstellung des Immunstatus nicht möglich.

Die immunstimulierende Wirkung von AWD 100-041 scheint auf eine Aktivierung der T-Helfer-Zellen und eine Förderung der Lymphokin- und Antikörpersekretion zurückzuführen zu sein. [Seite 49↓] Bei thymektomierten Tieren bleibt diese Wirkung aus. Als weitere Wirk-mechanismen werden die Makrophagenaktivierung und die indirekte Stimulation der Proliferation immunkompetenter Zellen durch verstärkte Freisetzung von Wachstumsfaktoren diskutiert [26, 57 , 61, 96].

Bei Untersuchungen zur Pharmakokinetik an Ratte und Kaninchen konnte gezeigt werden, daß AWD 100-041 nach p.o. Applikation aufgrund seiner schwach sauren Eigenschaften durch die Thiolgruppe und seiner Lipophilie recht schnell absorbiert wird. AWD 100-041 zeigt ein relativ großes Verteilungsvolumen und flutet schnell wieder ab. Die Bioverfügbarkeit ist durch den starken metabolischen Abbau eher gering [57].

Zur Gewinnung von Metaboliten wurde AWD 100-041 in Kulturmedium gelöst und die Hep G2-Kulturen 72h damit inkubiert. Vor der Extraktion der entstandenen Metaboliten von AWD 100-041 aus dem Kulturmedium wurde eine Konjugatspaltung durchgeführt, da bei der Hydroxylierung des aromatischen Systems Glucuronide und Sulfate entstanden sein könnten. Anschließend wurde das Kulturmedium mit Chloroform bei saurem und basischem pH extrahiert, da saure und auch basische Metaboliten erwartet wurden.

Der nach Einengen und methanolischer Aufnahme entstandene Extrakt wurde der HPLC unterzogen, wobei die Metaboliten getrennt wurden und gleichzeitig ein Spektrum von ihnen aufgenommen werden konnte. Die aus Tierversuchen und Nachsynthesen vorhandenen Referenzmetaboliten konnten zur Identifizierung mittels Vergleichs- und Mischchromatographie herangezogen werden. Das Ergebnis der Trennung mittels HPLC ist in Tabelle 3-1 zusammengefaßt:

Tabelle 3-1: Retentionszeiten von AWD 100-041 und seinen Metaboliten bei der HPLC mit zwei Gradientensystemen

Alle Metaboliten zeigten das gleiche Absorptionsspektrum in Methanol wie AWD 100-041 mit zwei Absorptionsmaxima bei 220 und 311nm und einem Schulterbereich bei 240nm.

Um dieses Ergebnis zu bestätigen wurden die durch HPLC getrennten Metaboliten und der [Seite 50↓] Extrakt der Dünnschichtchromatographie unterzogen. Wieder wurden die Vergleichsmeta-boliten für Vergleichs- und Cochromatographie genutzt. Da alle Metaboliten eine starke Eigenfluoreszenz mit ähnlicher Farbe und Intensität bei 366nm aufweisen, wurde dies als Detektion genutzt. Für diese Substanzen liegt die Erfassungsgrenze bei 1µg [57].

Das Ergebnis der DC mit zwei Fließmitteln ist in Tabelle 3-2 dargestellt:

Tabelle 3-2: R_f-Werte von AWD 100-041 und seinen Metaboliten bei der DC mit zwei Fließmittelsystemen

Eine Unterscheidung von AWD 100-041 und M1, die sehr ähnliche R_f-Werte hatten war durch Eintauchen der DC-Platte in eine Nitroprussidnatriumlösung möglich. Dabei färbte sich AWD 100-041 rot, während M1 farblos blieb.

Nach einer Inkubationszeit von 72h auf Hep G2-Kulturen waren weniger als 0,1% AWD 100-041 in der Probe vorhanden. Dies konnte durch Messen der Absorption bei 311nm auf entwickelten HPTLC-Platten mit Hilfe eines CAMAG-Scanners nachgewiesen werden. Da nach einer zellfreien 72-stündigen Inkubation unter gleichen Bedingungen ebenfalls kaum noch AWD 100-041 gefunden werden konnte, statt dessen aber das Disulfid vorlag, konnte davon ausgegangen werden, daß AWD 100-041 nichtenzymatisch dimerisiert. Weitere Artefakte wurden hierbei nicht gefunden, weshalb die gefundenen Metaboliten nach Inkubation mit Hep G2-Zellen enzymatisch entstanden sein mußten.

Abschließend wurde die Identität von M1 und M3 mittels GC/MS bestätigt. Bei M1 konnten der Molekülpeak bei m/z 236 und die Peaks der Fragmente m/z 189 und m/z 163 und der Basispeak m/z 146 gefunden werden. M3 lag nur in sehr geringen Konzentrationen vor, so daß nur der Molekülpeak m/z 268 nachgewiesen werden konnte.

In Tabelle 3-3 sind die entstandenen Fragmente der Metaboliten M1 und M3 aufgelistet. Die dargestellten Fragmentierungsmöglichkeiten bauen auf dem Zerfall von AWD 100-041 auf.

Tabelle 3-3: Fragmentierung der Metaboliten M1 und M3.

Da AWD 100-041 nach der Inkubationszeit kaum noch nachweisbar war, wurde sein Massenspektrum nicht untersucht. Die wesentlichen Fragmentationen von AWD 100-041 sind in Abbildung 3-2 wiedergegeben [57]

	Abbildung 3-2: Wesentliche Fragmentationen von AWD 100-041

Abbildung 3-3 gibt einen Überblick über die Hauptwege der Biotransformation von AWD 100-041.

Der erste Schritt bei der Metabolisierung von AWD 100-041 durch Hep G2-Zellen scheint die Bildung eines Thioethers oder Dialkylsulfids durch Methylierung des Schwefels durch Thiol-S-Methyltransferasen zu sein (M1). M1 ist auch der Hauptmetabolit bei der Umsetzung von AWD 100-041 durch Hep G2-Zellen. Danach entsteht durch CYP-vermittelte Oxidation von M1 erst ein Sulfoxid (M2) und schließlich ein Sulfon (M3), die in Abbildung 3-3 mit S=O-Doppelbindung formuliert sind. Eine Formulierung von Sulfoxiden und Sulfonen mit semipolarer S⁺-O^--Bindung ist ebenfalls möglich. Allerdings konnte das Sulfoxid bei der Aufklärung der Metaboliten nicht nachgewiesen werden. Es scheint nur ein kurzlebiges Zwischenprodukt bei der ohnehin geringen Bildung von M3 zu sein.

	[Seite 52↓] Abbildung 3-3: Hauptwege der Biotransformation von AWD 100-041

Bei der Biotransformation in der Rattenhepatozytenkultur und bei der Leberperfusion [57] entstehen ebenfalls die Metaboliten M1-M3, wobei hier, im Gegensatz zu den Hep G2-Kulturen, M2 der Hauptmetabolit ist und M1 nur in geringen Mengen bestehen bleibt. Des weiteren entstehen die Metaboliten M4-M6 durch Hydroxylierung des Aromaten. Dies findet bei Hep G2-Kulturen anscheinend nicht statt. Die Metaboliten, vor allem M6, treten auch als Konjugate auf, während bei Hep G2-Zellen durch fehlende Hydroxylierung keine Konjugate gefunden werden konnten.

Bei Versuchen an der Ratte mit anschließender Bestimmung von Metaboliten in Harn und Kot konnte AWD 100-041 und das Disulfid nur noch in Spuren nachgewiesen werden. Hauptmeta-boliten waren M2 und M3, sowie M4 und M6, die auch konjugiert vorlagen. Außerdem konnte noch ein weiteres, am Aromaten zweifach hydroxyliertes Dialkylsulfid nachgewiesen werden [57].

AR 12463 (5-Piperidino-7-[N-pentyl-(ß-hydroxyethyl)]amin-s-triazolo[1,5-a]pyrimidin) ist ein Deri-vat des Arzneistoffes Trapidil (Rocornal^Ò). Die Strukturformel ist in Abbildung 3-4 abgebildet.

	Abbildung 3-4: AR 12463

Triazolopyrimidine wie Trapidil haben eine vasodilatierende Wirkung, hemmen die Thrombozytenaggregation, steigern dosisabhängig die Diurese, führen zu Bronchodilatation und wirken positiv inotrop [18, 44, 47, 76]. AR 12463, zeigt zwar keine positiv inotrope Wirkung, ist aber antiarrhythmisch wirksam [74]. Die Thrombozytenaggregationshemmung beruht auf einer Erhöhung der Prostacyclinsynthese, eine konzentrationsabhängige Hemmung der Thromboxansynthese und der Hemmung der Ca²⁺-Freisetzung aus Thrombozyten [9, 10, 43]. Des weiteren konnte im Tierversuch eine Senkung des als Artheroskleroseindex verwendeten Quotienten Gesamtcholesterol/ HDL-Cholersterol nachgewiesen werden [6].

Zur Gewinnung von Metaboliten wurden die Hep G2-Kulturen mit AR 12463-haltigem Medium 72h inkubiert. Durch Vorversuche konnte beobachtet werden, daß unbehandelte Hep G2-Kulturen keine zur Isolation ausreichende Metabolitenmenge bildeten, weshalb PB-behandelte Hep G2-Zellen herangezogen wurden.

Zur Isolierung der Metaboliten von AR 12463, wurde das Kulturmedium bei basischem pH mit einer Chloroform/ Isopropanol-Mischung extrahiert. Um die bei Vorversuchen ermittelten Konjugate zu erfassen, wurde die wäßrige Phase anschließend mit Glucuronidase und Sulfatase behandelt und dann wieder extrahiert. Die eingeengten und in Methanol aufgenommenen Extrakte wurden mittels HPLC aufgetrennt, wobei gleichzeitig ein Spektrum der Metaboliten aufgenommen wurde. Mit Hilfe von Vergleichsubstanzen konnten die Metaboliten durch Vergleichs- und Cochromatographie identifiziert werden. Die Ergebnisse der HPLC-Trennung sind in Tabelle 3-4 dargestellt:

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Tabelle 3-4: Retentionszeiten von AR 12463 und seinen Metaboliten bei der HPLC mit zwei Gradientensystemen

AR 12463 und M4 konnten auch in der Konjugatfraktion gefunden werden.

Um dieses Ergebnis zu bestätigen wurden die aufgetrennten Metabolite der DC unterzogen. Wieder wurde mit den Vergleichssubstanzen Vergleichs- und Cochromatographie durchgeführt. Detektiert wurde mit Hilfe der Fluoreszenzlöschung auf mit Fluoreszenzindikator imprägnierten DC-Kieselgelplatten bei 254nm, wobei die Nachweisgrenze bei ca. 1µg für AR 12463 liegt [57]. Die Ergebnisse für zwei Fließmittelsysteme sind in Tabelle 3-5 zusammengetragen:

Tabelle 3-5: R_f-Werte von Ar 12463 und seinen Metaboliten bei der DC mit zwei Fließ-mittelsystemen

Abschließend wurden die gefundenen Metaboliten mit MS auf ihre Identität geprüft. M4, der Hauptmetabolit und M7 konnten aufgrund ihrer Fragmentierung bestätigt werden. M3 lag in zu geringen Konzentrationen vor, um verläßliche Ergebnisse erhalten zu können.

In Tabelle 3-6 sind die bei der MS gefundenen Fragmente von AR 12463 und den Metaboliten M4 und M7 aufgelistet. Abbildung 3-5 zeigt die Fragmentierung von AR 12463.

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Tabelle 3-6: Fragmentierung von AR 12364 und seinen Metaboliten M4 und M7 [57]

	Abbildung 3-5: Fragmentierung von AR 12463 in der MS

Einen Überblick über die Hauptwege der Metabolisierung von AR 12463 gibt Abbildung 3-6.

	Abbildung 3-6: Hauptwege der Biotransformation von AR 12463

AR 12463 wurde nur gering von Hep G2-Kulturen metabolisiert. Erst nach Behandlung der Zellen mit PB konnte eine Metabolitenkonzentration erreicht werden, die auswertbar war.

Hauptmetabolit von AR 12463, gebildet durch Hep G2-Zellen ist M4, der durch CYP-vermittelte Einführung einer Hydroxylgruppe an die Pentylseitenkette entsteht. Daran schließt sich die Oxidation der Hydroxylgruppe, möglicherweise durch Dehydrierung durch Alkohol-dehydrogenasen [57], zum Keton an. Dieser Metabolit (M7) entsteht aber in geringeren Mengen. Von M4 und AR 12463 konnten auch Konjugate nachgewiesen werden. M7 wurde anscheinend nicht oder in nicht nachweisbaren Mengen konjugiert, was durch seine geringere Konzentration begründet sein könnte. Der Metabolit M3, mit einer Hydroxylgruppe am Piperidinring und einer [Seite 57↓] Ketogruppe in der Pentylseitenkette, konnte nur im Gesamtextrakt über die HPLC und DC nachgewiesen werden. In der isolierten Fraktion, die durch HPLC Trennung gewonnen wurde, war die Konzentration zu gering, um über MS nachgewiesen werden zu können. Die Bildung von M3 würde voraussetzen, daß zuvor der Metabolit M1 entstanden wäre. Dieser, mit einer Hydroxylgruppe am Piperidinring und in der Pentylseitenkette, kann wiederum aus M4 entstehen. Daß der Piperidinring zuerst hydroxyliert wird (M5) ist auch möglich, stellt aber in Rattenhepatozyten nur ein Nebenweg dar [57].

Bei Rattenhepatozytenkulturen sind die Hauptmetaboliten, wie auch bei der Leberperfusion, M5 und M4. Des weiteren werden die Metaboliten M3 und M7 gebildet. M3 wird noch weiter transformiert durch Bildung einer Ketogruppe und Einführen einer Doppelbindung am Piperidinring. M1 konnte nur nach Kurzzeitinkubation nachgewiesen werden. Danach wurde es zu M3 verstoffwechselt. Als Konjugate traten vor allem M1, M4 und M5 auf. AR 12463 und M7 wurden kaum konjugiert, traten aber auch nur in geringen Mengen auf [57]. Insgesamt wurden bei der Rattenhepatozytenkultur 0,4mg AR 12463 pro 10⁶ Zellen umgesetzt, während es bei Hep G2-Kulturen nur 0,014mg nach PB-Induktion waren.

2-Hydroxy-5-methyllaurophenon-oxim (FLM 5011), in Abbildung 3-7 dargestellt, ist ein 5-Lipoxygenasehemmstoff mit antiphlogistischer, antiasthmatischer, antiinflammatorischer, antiproliferativer und cardioprotektiver Wirkung. Seine Toxizität ist gering. Der Einfluß von FLM 5011 auf verschiedene Entzündungsprozesse und anaphylaktische Prozesse in vivo konnte anhand des Carrageeninödems der Rattenpfote, des UV-B-Erythems in Meerschweinchen, des Ovalbumin-induzierten allergischen Asthmas beim Meer-schweinchen und der Myokarditis gezeigt werden [90].

	Abbildung 3-7: FLM 5011

Bei Untersuchungen zur Pharmakokinetik konnte gezeigt werden, daß die schlecht wasserlösliche Substanz peroral als Suspension kaum absorbiert wird. Nachweisbare Blutspiegel konnten erst nach Lösen der Substanz in Erdnußöl gefunden werden. Nach [Seite 58↓] schnellem Anfluten konnte FLM 5011 vor allem in der Dünndarmwand, in der Magenwand, in Leber, Herz und Lunge gefunden werden [90].

FLM 5011 wird in der Leber über den Abbauweg der Fettsäuren durch w- und b-Oxidation metabolisiert. Die Metaboliten, die bei der w-Oxidation entstehen haben eine stärkere inhibitorische Wirkung auf die Lipoxygenase als FLM 5011.

Die Wirksamkeit von FLM 5011 entsteht wahrscheinlich durch eine Interaktion von Hydroxam-, Oxim- oder Hydroxylaminstruktur in Nachbarschaft zum aromatischen System mit dem Radikalzentrum des Enzyms. Dieses ist für die Wasserstoffabspaltung bei der Oxidation der Arachidonsäure verantwortlich. Auch eine Wechselwirkung mit dem Non-Häm-Eisen im katalytischen Zentrum der Lipoxygenase ist möglich [57]. Zusätzlich wird die Lipoxygenase durch Binden des Laurinsäurerestes von FLM 5011 an die hydrophobe Region gehemmt.

Die aus Membranlipiden durch Phospholipase A₂ freigesetzte Arachidonsäure kann durch Cyclooxygenasen zu Prostaglandinen oder durch Lipoxygenasen zu Leukotrienen umgesetzt werden. Die 5-Lipoxygenase führt zu einer Hydroperoxidstruktur am C-Atom 5 der Arachidonsäure. Durch Umlagerung dieser 5-Hydroperoxyeikosatetraensäure (5-HPETE) entsteht das Leukotrien A₄, welches zu den Leukotrienen B₄, C₄, D₄ und E₄ umgewandelt werden kann. Des weiteren entsteht 5(S)-Hydroxyeicosatetraensäure (5(S)-HETE).

Die Leukotriene A₄, C₄, D₄ und E₄ gehören zu den stärksten Konstriktoren der Bronchialmuskulatur und spielen eine entscheidende Rolle bei Asthmaanfällen. Auch bei Entzündungen sind sie durch Erhöhen der Kapillarpermeabilität und durch Förderung von Ödembildung beteiligt. Leukotrien B₄ ist vermutlich an der Wanderung von Leukozyten in entzündetes Gewebe mit verantwortlich. Außer der 5-Lipoxygenase konnten in verschiedenen Geweben auch 12- und 15-Lipoxygenasen nachgewiesen werden. Die biologische Bedeutung der entstandenen Arachidonsäurederivate 12- und 15-HPETE ist noch relativ wenig bekannt [66].

Zur Gewinnung von Metaboliten wurden Hep G2-Zellen 72h mit FLM 5011-haltigem Kulturmedium inkubiert. FLM 5011 und seine Metaboliten wurden sowohl vor als auch nach Konjugatspaltung mit einer Chloroform/ Isopropanol-Mischung aus der wäßrigen Phase extrahiert. Da die Metaboliten eine Carbonsäuregruppe, sowie eine phenolische OH-Gruppe besitzen, war eine Bildung von Konjugaten zu erwarten. Die Chloroformphase wurde eingeengt und das Extrakt in Methanol aufgenommen. Die Metaboliten wurden mit Hilfe von HPLC und Verwendung von bereits vorhandenen Vergleichsmetaboliten für Vergleichs- und Cochromatographie, aufgetrennt und isoliert. Die Nachweisgrenze für FLM 5011 lag bei 1-5µg [57]. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3-7 zusammengefaßt.

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Tabelle 3-7: Retentionszeiten von FLM 5011 und seinen Metaboliten bei der HPLC mit zwei Gradientensystemen

Alle Metaboliten sowie FLM 5011 konnten auch in der Fraktion der Konjugate gefunden werden. Da FLM 5011 auch konjugiert vorlag, wurde anscheinend die Carbonsäuregruppe und die phenolische OH-Gruppe konjugiert.

Des weiteren wurden die gefundenen Metaboliten als auch das Extrakt für die DC herangezogen. Wiederum wurden Vergleichs- und Cochromatographie mit den Vergleichs-metaboliten durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3-8 aufgeführt.

Tabelle 3-8: R_f-Werte von FLM 5011 und seinen Metaboliten bei der DC mit drei Fließ-mittelsystemen

Detektiert wurden die Substanzen über Fluoreszenzlöschung. Da sie auch eine Eigenfluoreszenz besitzen, konnten sie ebenfalls über ihre Fluoreszenz bei 366nm erkannt werden. Ein Eintauchen der DC-Platte in eine FeCl₃-Lösung ergab bei den Oximen eine violettschwarze Färbung und bei den Ketonen eine gelbe Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 366nm.

Zur Erhärtung der Ergebnisse wurden die gewonnenen Metaboliten mittels MS identifiziert.

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Tabelle 3-9: Fragmentierung von FLM 5011 und seinen Metaboliten

Da die Fragmentierung der Oximmetaboliten auf die Fragmentierung von FLM 5011 zurückgeht und die der Ketone auf das FLM 5011 Keton, ist in Abbildung 3-8 die wesentliche Fragmentation von FLM 5011 und dem FLM 5011 Keton dargestellt.

	Abbildung 3-8: Wesentliche Fragmentationen von FLM 5011 (oben) und FLM 5011 Keton (unten)

3.3.2  Vergleich des Metabolitenspektrums von Hep G2-Zellen mit Versuchen an der Wistar-Ratte

FLM 5011 unterliegt dem typischen Abbau einer Fettsäure. Damit die Seitenkette abgebaut werden kann, muß sie in w-Stellung hydroxyliert werden, welches wahrscheinlich wie bei der Laurinsäure-Hydroxylierung durch CYP 4 A-Isoenzyme katalysiert wird (siehe 2.3.4). Dieser Metabolit wird schnell zur Carboxyverbindung oxidiert, die ebenfalls sehr kurzlebig ist. Anschließend kann der Abbau der Seitenkette durch b-Oxidation einsetzen, wobei schrittweise C₂-Fragmente abgespalten werden [57]. Die Biotransformation der Oximgruppe erfolgt durch Aldehydoxidasen [105]. Dabei entsteht zuerst ein Imin, das anschließend nach Wasseranlagerung und Ammoniakabspaltung zu einem Keton wird.

Die wichtigsten Metaboliten sind in Abbildung 3-9 dargestellt.

	Abbildung 3-9: Hauptwege der Biotransformation von FLM 5011

In Urin und Faeces der Ratte, sowie in Rattenhepatozytenkulturen konnten hohe Konzentrationen von Metaboliten von FLM 5011 gefunden werden [60]. In Hep G2-Kulturen wurde ein Umsatz von 0,049mg FLM 5011 pro 10⁶ Zellen beobachtet. Die Hauptmetaboliten in der Hepatozytenkultur M2, M3 und M4 sind auch die Hauptmetaboliten im Urin der Ratte und im Urin des Menschen [90]. M2 und M4 konnten ebenfalls als Hauptmetaboliten, vor allem ihre Ketoformen, in Hep G2-Kulturen gefunden werden. Da M3 ein Zwischenprodukt bei der Bildung von M4 aus M2 ist, müßte es ebenfalls entstanden sein, wahrscheinlich wurde es aber zu schnell abgebaut und lag somit in Konzentrationen vor, die nicht detektierbar waren. Alle durch Hep G2-[Seite 63↓] Zellen gebildeten Metaboliten traten auch als Konjugate auf. Da auch FLM 5011 und sein Keton konjugiert wurden, ist es wahrscheinlich, daß vor allem an der phenolischen Hydroxylgruppe glucuronidiert und auch sulfatiert wurde. Eine Konjugation an den Carboxylgruppen der Metaboliten ist ebenfalls möglich. Aminosäurekonjugate, wie sie bei der Ratte gefunden wurden [57], konnten nicht festgestellt werden. Ebenfalls konnten auch die w-Hydroxy- und die Iminverbindung von FLM 5011 nicht gefunden werden. Diese traten bei Kurzzeitinkubationen von FLM 5011 auf Rattenhepatozytenkulturen auf. Da dies auch Intermediärprodukte bei der Bildung anderer Metaboliten sind, wurden sie bei einer Inkubationszeit von 72h auf Hep G2-Zellen wahrscheinlich schon verstoffwechselt.