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4  Zytotoxizitäts- und Proliferationsuntersuchungen mit Hilfe von Hep G2-Zellen

4.1 Proliferation und Zytotoxizität

4.1.1 Die Testsysteme

Für Zytotoxizitäts- oder Proliferationsuntersuchungen an Zellen in Kulturen ist ein direktes Zählen der Zellen mit Hilfe eines Mikroskops oder mit einem elektronischen Zellzähler nicht immer geeignet. Deshalb wurden diese Methoden häufig durch indirekte Methoden ersetzt. Dabei werden bestimmte Komponenten der Zellen, wie DNA- und Proteingehalt, die Aktivität bestimmter Enzyme, die zelluläre Aufnahme von Farbstoffen oder fluoreszierenden Stoffen oder auch die Radioaktivität von Zellen nach Einbau eines Nukleotid-“labels“, bestimmt. Es werden also Parameter charakterisiert, die auch Indikatoren für überlebensnotwendige Zellfunktionen sind. Dazu gehören Zellteilung und Wachstum, Proteinsynthese und Proteingehalt, Anhaftungs- und Ablöseverhalten, Sauerstoffverbrauch, Membranintegrität und Energieverbrauch.

Die Testsysteme können in zwei Hauptklassen unterteilt werde: die Schnelltests oder auch Kurzzeittests, bei denen die Membranpermeabilität oder eine Stoffwechselveränderung bestimmt wird, und die Langzeittests, bei denen die Überlebensrate oder der Erhalt der Reproduktionskapazität von Zellen über Zellzahl, Proteingehalt oder DNA-Gehalt bestimmt wird.

Effekte auf den Stoffwechsel oder die Vitalität einer Zelle können reversibel sein. Um einen irreversiblen Effekt auf die Überlebensfähigkeit der Zellen nachzuweisen, müssen die Kulturen nach der Inkubation mit der entsprechenden Substanz in Abwesenheit der Substanz weiter kultiviert werden. Dies kann z.B. mit dem Test auf Plattiereffizienz quantifiziert werden, bei dem Zellen 24h mit der Substanz inkubiert und dann trypsiniert werden. Nach mehreren Tagen können dann die gebildeten Zellkolonien ausgezählt werden [34].

4.1.1.1 Der LDH Test

Der Zelltod wird häufig über die Quantifizierung der Membranschädigung bestimmt. Oft werden die Aufnahme oder die Exklusion von Farbstoffen, wie z.B. Trypanblau oder Ethidiumbromid, genutzt oder das Abgeben von radioaktiven Isotopen z.B. [3H]-Prolin oder -Thymidin. Die dritte Möglichkeit ist das Bestimmen von zytosolischen Enzymen im Kulturmedium, die aus geschädigten Zellen diffundieren können, wobei die Enzymaktivität direkt proportional zur Zahl der lysierten Zellen ist. Die Laktatdehydrogenase (LDH) ist ein stabiles, im Zytoplasma aller [Seite 65↓] Zellen vorkommendes Enzym, das bei Zellschädigung schnell in das Kulturmedium abgegeben wird. Die Enzymaktivität der LDH wurde mit Hilfe des Cytotoxicity Detection Kits von Boehringer Mannheim bestimmt.

Im ersten Schritt wird Laktat durch die freigesetzte Laktatdehydrogenase zu Pyruvat oxidiert, während NAD+ zu NADH+H+ reduziert wird. In der zweiten enzymatischen Reaktion werden zwei Wasserstoffatome von NADH+H+ auf das gelbe Tetrazoliumsalz INT (2-[4-Iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetrazoliumchlorid) transferiert und es entsteht das rote Formazan Salz. Hierbei wird Diaphorase als Katalysator eingesetzt.

Da für den Test nur 0,2-2x104 Zellen notwendig sind, kann er arbeitserleichternd in Mikrotiterplatten durchgeführt werden. Da fetales Kälberserum auch LDH enthält, ist es unbedingt notwendig immer eine Mediumblindprobe mitzuführen. Auch die getesteten Substanzen können einen Einfluß auf die LDH- oder die Diaphorase-Aktivität haben und sie beispielsweise hemmen, weshalb auch hier das Mitführen einer zusätzlichen Kontrolle erforderlich ist. Des weiteren wurde die LDH-Aktivität in unbehandelten Kulturen und in mit 1% Triton X 100 behandelten Kulturen überprüft, um die minimale, spontane und die maximal mögliche LDH-Freisetzung der Zellen zu bestimmen.

Das Prinzip der Bestimmung der LDH-Aktivität ist in Abbildung 4-1 dargestellt.

Abbildung 4-1: Bestimmung der LDH


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4.1.1.2  Bestimmung des DNA-Gehalts mit bisBenzimid

Neben der Zellzahl sind die Bestimmung von DNA- und Proteingehalt die gebräuchlichsten Meßwerte bei der Quantifizierung von zellulärem Material. Die DNA kann durch ihre Absorption bei 260nm bestimmt werden, wobei aber viele Zellbestandteile, z.B. Proteine stören. Deshalb ist diese Methode nur für gereinigte DNA geeignet. Bisbenzimid (Hoechst 33258, 2’-4[Hydroxyphenyl]-5-(4-methyl-1-piperazinyl)-2,5’-bis-1H-benzimidazol) ist ein fluoreszierender Farbstoff, der sich selektiv in Adenin/ Thymin-reichen Regionen der DNA anlagert. Es findet dabei jedoch keine Interkalation in die DNA-Doppelhelix statt. Die Quantifizierung des DNA-Gehalts von Zellen mit bisBenzimid beruht auf der Zunahme der Fuoreszenzemission von bisBenzimid bei 458nm infolge der Wechselwirkung des Farbstoffs mit der DNA. Dies wird bei pH 7,4 und bei hoher Salzkonzentration, bei der das Chromatinprotein dissoziiert, durchgeführt. Vorher ist ein Zellaufschluß durch Behandlung mit Ultraschall oder durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Kulturen notwendig. Diese Methode gestattet einen Nachweis von 10ng/ml und erfordert eine doppelsträngige DNA [56].

Bei der Bestimmung des DNA-Gehalts wird die DNA von allen Zellen bestimmt, die adherent sind. Geschädigte oder tote Zellen, die sich nicht vom Substrat gelöst haben werden mitbestimmt. Der DNA-Gehalt in einer Zelle ist annähernd konstant, weshalb durch Bestimmung des DNA-Gehalts direkt auf die Zellzahl geschlossen werden kann. Im Hinblick auf das Proliferationsverhalten von Hep G2-Zellen, dargestellt in Abbildung 2-3, wurde ein DNA-Gehalt von 85% nach einer Inkubation mit einer Substanz über 24h so bewertet, daß kein Wachstum stattgefunden hat. Prozentzahlen darunter weisen auf Zelltod hin. Bei Werten zwischen 85% und 100% hatte zwar Wachstum stattgefunden, dieses wurde aber gehemmt. Für Inkubationszeiten von 72h lag dieser Grenzwert bei 65%.

4.1.1.3 Bestimmung des Proteingehalts mit Amidoschwarz

Das Anfärben von Zellproteinen mit Amidoschwarz 10B kann für Tests der Proliferation, der Zytotoxizität, für die Bestimmung adherenter Zellen und zur Quantifizierung der Zellzahl herangezogen werden. Doch ist das Verhältnis von Proteingehalt zu DNA-Gehalt nur unter standardisierten Bedingungen in einer Zelle bzw. in einer Zellkultur konstant. Ansonsten können Proteingehalt bzw. RNA-Gehalt einer Zelle beträchtlichen Schwankungen unterworfen sein, weshalb die Nutzung der Proteinbestimmung zur Quantifizierung der Zellzahl fraglich ist.

Zur Bestimmung des Proteingehalts mittels Amidoschwarz 10B werden die Zellen mit Formaldehyd fixiert, nicht adherente Zellen entfernt und die adherenten Zellen mit Amidoschwarz bei saurem pH inkubiert. Dabei bindet der Farbstoff an den Amidostickstoff des Proteins. Proteingebundener Farbstoff kann danach vollständig mit NaOH eluiert werden und mit Hilfe [Seite 67↓]eines Mikrotiterplatten-Photometers photometrisch vermessen werden. Eine Linearität zwischen Zellzahl und Absorption war in einem Bereich von 1000-64000 Zellen pro well gewährleistet, was bei der Validierung dieses Tests mit Hilfe von HaCaT-Zellen festgestellt wurde [91].

Das Anfärben von Zellproteinen ermöglicht eine Detektion sowohl von zytostatischen als auch zytolytischen Effekten toxischer Substanzen, wenn die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellinie bekannt ist. Eine Unterscheidung zwischen vitalen und toten Zellen ist nicht möglich. Da aber bei adherent wachsenden Zellen sich unter den meisten Kulturbedingungen tote Zellen vom Substrat lösen, kann davon ausgegangen werden, daß die bestimmten Proteine von lebenden Zellen stammen. Zellen die also geschädigt oder schon tot sind und sich nicht vom Substrat gelöst haben, werden bei dem Amidoschwarz-Assay mitbestimmt [91].

Abbildung 4-2: Amidoschwarz 10B

4.1.2 Die Testsubstanzen

Als Testsubstanzen wurden die Arzneistoffe AWD 100-041, AR 12463 und FLM 5011, deren Metabolitenspektrum in vitro aufgeklärt wurden, herangezogen, da schon bei der Inkubation Veränderungen an den Kulturen aufgefallen waren. Als weiteres Arzneimittel wurde ein Mazerat des Krautes von Solanum lycopersicon eingesetzt. Die Ergebnisse zur Untersuchung des Einflusses von Solanum lycopersicon-Mazeraten im Vergleich mit den Hauptalkaloiden Tomatin und Tomatidin entsprang einer Zusammenarbeit mit dem Gemeinschaftskrankenhaus Havelhöhe.

Des weiteren wurden die Induktoren 3-MC, PB und Clofibrat getestet, um den Einfluß vor allem auf den Proteingehalt in Hep G2-Kultur besser beurteilen zu können. Da DMSO häufig als Lösungsmittel für schwer lösliche Substanzen eingesetzt wurde, mußte es getestet werden, um für verschiedene DMSO-Konzentrationen Vergleichswerte zu haben. Auch andere Lösungsmittel, wie Ethanol und Methanol, wurden überblickshalber auf ihren Einfluß auf das Proliferationsverhalten von Hep G2-Kulturen überprüft.


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4.1.2.1  AWD 100-041

Die Ergebnisse der Proliferations- und Toxizitätsuntersuchungen von AWD 100-041 an Hep G2-Kulturen sind in Abbildung 4-3 dargestellt.

Abbildung 4-3: Einfluß von AWD 100-041 auf den Protein- und DNA-Gehalt sowie auf die Membranpermeabilität von Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α < 0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert

AWD 100-041 steigerte in einer Konzentration von 0,5mM die Proliferation und die Proteinsynthese. Bei steigender Konzentration nahm dieser Effekt rasch ab und bei einer Inkubationszeit von 72h war schon ab 1mM AWD 100-041 ein starker toxischer Effekt zu beobachten, während eine Inkubationszeit von 4h kaum Einfluß auf die Hep G2-Kultur zeigte. Der Proteingehalt war nach 24h immer noch bei einer Konzentration von 1,5mM gegenüber dem DNA-Gehalt erhöht, obwohl schon ein Absterben der Zellen begonnen hatte. Dies könnte auf eine Hypertrophie der überlebenden Zellen zurückzuführen sein. Bei höheren Konzentrationen korrelierte der Proteingehalt wieder mit dem DNA-Gehalt der Kulturen. Die durch Kurvenanpassung ermittelten IC50-Werte sind in Tabelle 4-1 zusammengetragen.


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Tabelle 4-1: IC50-Werte von AWD 100-041

Inkubationszeit

[h]

IC50-Werte ermittelt über Proteingehalt [mM]

IC50-Werte ermittelt über DNA-Gehalt [mM]

24

1,97

1,93

72

1,5

0,96

Der Einfluß von AWD 100-041 auf die Membranintegrität von Hep G2-Zellen war nur geringfügig.

4.1.2.2 AR 12463

Die Ergebnisse der Proliferations- und Toxizitätsuntersuchungen mit AR 12463 an Hep G2-Kulturen sind in Abbildung 4-4 dargestellt.

Abbildung 4-4: Einfluß von AR 12463 auf den Protein- und DNA-Gehalt sowie auf die Membranpermeabilität von Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, a<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert

Die daraus resultierenden IC50-Werte, kalkuliert über Kurvenanpassung, sind in Tabelle 4-2 zusammengetragen.


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Tabelle 4-2: IC50-Werte von AR 12463

Inkubationszeit

[h]

IC50-Werte ermittelt über Proteingehalt [mM]

IC50-Werte ermittelt über DNA-Gehalt [mM]

24

0,31

0,31

72

0,46

0,18

Eine Inkubation von 4h mit AR 12463 hatte kaum einen Einfluß auf die Hep G2-Kultur (siehe Abbildung 4-4). Trotz fehlender Signifikanz der Unterschiede der Mittelwerte zum entsprechenden Blindwert war ein deutlicher Trend zur Abnahme des Proteingehalts der Kulturen bei steigender Konzentration zu erkennen.

Nach 72h trat eine Proliferationserhöhung bei einer Konzentration von 0,1mM auf, die von einer Steigerung des Proteingehalts der Kultur begleitet wurde. Die erhöhten Proteinwerte bei gleichzeitig sinkendem DNA-Gehalt setzten sich weiter fort. Erst bei einer Konzentration von 1mM korrelierten DNA- und Proteingehalt wieder.

Proliferierende Effekte konnten nach einer Inkubationszeit von 24h nicht beobachtet werden, wohl aber eine Erhöhung des Proteingehalts. Trotz hohen Proteingehalts war ein Absterben von Zellen schon bei 0,15mM zu erkennen. Bei AR 12463 schien es nicht zu einer Bildung von Metaboliten zu kommen, die toxischer sind, da der DNA-Gehalt nach 72h, vor allem bei den niedrigeren Konzentrationen höher war als nach 24h. Die Diskrepanz zwischen DNA- und Proteingehalt von mit AR 12463 behandelten Hep G2-Kulturen spiegelt sich deutlich in den IC50-Werte für 72h wieder (sieheTabelle 4-2).

AR 12463 zeigte einen ausgeprägten Einfluß auf die Membranpermeabilität, der sich mit steigender Konzentration ebenfalls erhöhte. Bei 2mM war dieser schon mit einer Erhöhung der Membranpermeabilität um über 50% beträchtlich, dürfte aber bei geringeren Konzentrationen nicht ausschließlich für die Toxizität verantwortlich sein.


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4.1.2.3  FLM 5011

In Abbildung 4-5 sind die Ergebnisse der Proliferations- und Toxizitätsuntersuchungen von FLM 5011 an Hep G2-Kulturen dargestellt. Die daraus über Kurvenanpassung kalkulierten IC50-Werte sind in Tabelle 4-3 zusammengetragen.

Abbildung 4-5: Einfluß von FLM 5011 auf den Protein- und DNA-Gehalt sowie auf die Membranpermeabilität von Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,05, *kein signifikanter Unterschied zum Blindwert

Tabelle 4-3: IC50-Werte von FLM 5011

Inkubationszeit

[h]

IC50-Werte ermittelt über Proteingehalt [mM]

IC50-Werte ermittelt über DNA-Gehalt [mM]

24

0,12

0,1

72

0,045

0,06

Bei niedrigen Konzentrationen zeigte FLM 5011 trotz bereits stark proliferationshemmender Effekte eine übermäßige Erhöhung des Proteingehalts in Hep G2-Kulturen. Mit steigender Konzentration kam es dann schnell zu einem ausgeprägten Absterben der Zellen, gekennzeichnet durch einen sehr geringen DNA- und Proteingehalt sowie einer starken [Seite 72↓] Erhöhung der Membranpermeabilität bei hohen Konzentrationen. Auch schon nach 4h kam es ab 0,5mM zu einem schnellen Absterben der Zellen. Da unter dem Mikroskop starke Veränderungen der Zellmorphologie, wie z.B. Bildung von „blebs“, zu erkennen waren, wurde eine weitere Untersuchung auf apoptotische Vorgänge angeschlossen (siehe 4.2).

Im Tierversuch konnten keine toxischen Erscheinungen von FLM 5011 beobachtet werden. Auch extrem hohe Konzentrationen führten nicht zum Tod von Versuchstieren [90]. Es konnte weiterhin festgestellt werden, daß die Metaboliten von FLM 5011 wesentlich weniger toxisch sind als die Ausgangssubstanz. In vivo unterliegt FLM 5011 einer ausgeprägten Verstoffwech-selung und wird dabei fast vollständig metabolisiert. In der Hep G2-Kultur aber wurde nur ein geringer Teil FLM 5011 umgesetzt und damit in weniger toxische Metaboliten umgewandelt (siehe 3.3.2). Dies erklärt die Diskrepanz zwischen der Toxizität in vivo und in vitro.

Die Beeinflussung des Wachstumsverhaltens von Hep G2-Zellen durch FLM 5011 hängt offensichtlich mit seinem Wirkmechanismus als Lipoxygenasehemmer zusammen. In diesem Zusammenhang kann vermutet werden, daß das Konzentrationsverhältnis von Arachidonsäure und deren durch die Lipoxygenase gebildeten Metaboliten für das Wachstum und die Vitalität von Hep G2-Zellen von Bedeutung ist. Vor allem die Konzentration von 5(S)-HETE hat eine wichtige Funktion bei der Proliferation, denn es konnte gezeigt werden, daß 5(S)-HETE zur Steigerung der Proliferation führt und bei mit Lipoxygenaseinhibitoren behandelten Zellkulturen das Absterben der Zellen verhindern kann [4]. Dieses Phänomen konnte auch an Hep G2-Zellen beobachtet werden. Nach einer Inkubationszeit von 72h zeigten mit 5(S)-HETE behandelte Hep G2-Kulturen eine wesentlich höhere Zellzahl als unbehandelte Kulturen. Dieser Effekt war bei einer 5(S)-HETE Konzentration von 1µM am größten. In Tabelle 4-4 sind die Ergebnisse der Bestimmung des DNA-Gehalts von mit 5(S)-HETE behandelten Kulturen mittels bisBenzimid dargestellt.

Tabelle 4-4: Einfluß von 5(S)-HETE auf die Proliferation von Hep G2-Zellen

5(S)-HETE-Konzentration

[µM]

DNA-Gehalt

[%]

0

100 ± 8,6

0,1

102,5 ± 4,7

1

169,1 ± 17

10

120,1 ± 14,4


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4.1.2.4  Solanum lycopersicon

Die Tomate, Solanum lycopersicon L. oder auch Lycopersicon esculentum Mill., enthält wie andere Arten aus der Gattung Solanum viele Steroidalkaloide. Das Hauptglykosid der oberirdischen Organe ist das a-Tomatin, ein Tetraosid des Tomatidins. Der höchste Alkaloidgehalt wird in der Hauptblütezeit erreicht und beträgt dann 0,2-1,2%. Danach nimmt der Tomatingehalt ab und in reifen Früchten kann kein Tomatin mehr nachgewiesen werden. Des weiteren kommen noch andere Steroidalkaloide in der Tomate vor: das Glykosid des Solanidins, das a-Solanin und Solasodin.

Die meisten pharmakologischen Wirkungen der Steroidalkaloide lassen sich durch ihre saponinähnlichen Eigenschaften erklären. Durch Komplexbildung mit Sterolen schädigen sie die Erythrozytenmembran und haben damit eine hämolytische Aktivität. Sie reizen stark Haut und Schleimhaut und haben eine bakteriostatische, antivirale, fungizide und insektizide Wirkung. Am Herzen haben sie eine positiv inotrope Wirkung und sehr hohe Dosen sind teratogen. Auch eine Hemmung der Cholinesterasen wird diskutiert [106]. Bei peroraler Gabe werden die Solanum-Steroidalkaloide teilweise hydrolisiert und nur schlecht resorbiert, wobei die begleitenden Steroidsaponine die Resorption fördern. Die maximale Gewebskonzentration wird nach ca. 12h erreicht, wobei eine Akkumulation in Leber, Niere, Lunge und Milz möglich ist. Die Elimination erfolgt über Darm und Niere. Die Hauptmetaboliten sind die Aglykone, die auch Alkamine genannt werden [106]. Auch bei Hep G2-Kulturen konnte ein Umsatz von Tomatin zu Tomatidin festgestellt werden (Ergebnisse nicht dargestellt). Bei der Zufuhr von toxischen Dosen kommt es zu einer starken gastrointestinaler Reizung. Weitere Vergiftungserschei-nungen sind Schwindel, Benommenheit, Kopfschmerzen, Temperaturanstieg und Bradykardie bis hin zu Krämpfen und Atemlähmung. Die toxischen Dosen beim Menschen werden bei peroraler Applikation auf 2-5µmol/kg, die letale auf 3-6µmol/kg Körpergewicht geschätzt [106].

Mazerate von Solanum lycopersicon werden im Rahmen einer anthroposophischen Therapie zusammen mit Mistelpräparaten bei Hepatitis C eingesetzt [71, 72].

Abbildung 4-6: Strukturformel von Tomatidin. Der Zuckeranteil von Tomatin ist:

¬1bGal4¬1bGlc(2¬1bGlc)3¬1bXyl

In Abbildung 4-7 sind die Ergebnisse der Proliferationsuntersuchungen an Hep G2-Zellen mit [Seite 74↓] einem Mazerat des Krautes von Solanum lycopersicon dargestellt. Die Konzentration des Tomatins in diesem Mazerat war bekannt, weshalb hier die Tomatinkonzentrationen angegeben wurden, um mit der Reinsubstanz vergleichen zu können. Tomatin ist zwar das Hauptalkaloid, doch können auch andere Steroidalkaloide Einfluß auf die Proliferation haben. Diese kommen in wesentlich geringeren Mengen vor, sind aber ähnlich toxisch. Leider sind die genauen Konzentrationen im Mazerat nicht bekannt.

Abbildung 4-7: Einfluß eines Solanum lycopersicon-Mazerates auf Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert

Das Solanum lycopersicon-Mazerat zeigte eine ausgeprägte Membrantoxizität nach 24h. Dies dürfte der Grund für die starken zytotoxischen Erscheinungen bei höheren Konzentrationen im nmolaren Bereich bezogen auf den Tomatingehalt sein. In sehr niedrigen Konzentrationen entsprechend 0,02pmol-0,2nmol Tomatin war das Mazerat leicht proliferationshemmend, doch fand immer noch Zellteilung statt. Der Proteingehalt der Kulturen wurde erhöht. Diese Steigerung der Proteinsynthese hatte bei 0,2pmol Tomatin ein Maximum erreicht. Diese Ergebnisse wurden nun verglichen mit Proliferations-untersuchungen mit reinem Tomatin (siehe Abbildung 4-8). Auch Tomatin zeigt im nmolaren Bereich eine ausgeprägte Membrantoxizität. Da diese ähnlich hoch war wie beim Solanum lycopersicon-Mazerat, ist es möglich, daß die Membrantoxizität hauptsächlich durch Tomatin ausgelöst wurde.


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Die Beeinflussung des Proteingehalts der Kulturen im pmolaren Bereich konnte nicht bestätigt werden, weshalb die Steigerung des Proteingehalts durch andere Substanzen hervorgerufen worden sein muß.

Sowohl bei Tomatin als auch beim Mazerat lag der Bruch zwischen Proliferationshemmung und Zelltod bei 2,04nmol/ml. Hierbei kam es bei Tomatin zu einer Diskrepanz zwischen DNA-Gehalt und Proteingehalt der Kulturen. Möglicherweise kommt es zu einer Hypertrophie der Zellen oder aber es bleiben viele Zellproteine auch schon toter Zellen am Substrat haften und wurden mitbestimmt. Unter dem Mikroskop konnte ein Schrumpfen der Zellen ohne Ablösung vom Substrat beobachtet werden. Dies könnte ein Hinweis auf apoptotische Vorgänge sein.

Da Tomatin auch in der Hep G2-Kultur zu Tomatidin umgesetzt wurde, wurde auch dieses auf seinen Einfluß auf Zellkulturen überprüft (siehe Abbildung 4-9). Dazu wurde Tomatidin in den gleichen Konzentrationen wie Tomatin eingesetzt. Doch erfolgte die Spaltung von Tomatin zu Tomatidin nicht quantitativ, denn nach 72h war Tomatin mittels DC noch nachweisbar.

Abbildung 4-8: Einfluß von Tomatin auf Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert

Tomatidin hatte auf Hep G2-Zellen so gut wie keinen membrantoxischen Effekt (siehe Abbildung 4-9). In den niedrigen Konzentrationen zeigte es keine Hemmung der Proliferation, doch war der Proteingehalt der Kulturen gegenüber der Kontrolle erhöht. Die Steigerung der Proteinsynthese [Seite 76↓] nach geringen Mengen des Solanum lycopersicon-Mazerats könnte also auf die Bildung von Tomatidin zurückgeführt werden.

Im nmolaren Bereich konnte dann eine Proliferationshemmung beobachtet werden, wobei mit steigender Konzentration auch ein Absterben von Zellen zu verzeichnen war. Im nmolaren Bereich ist nochmals eine starke Erhöhung des Proteingehalts gegenüber des DNA-Gehalts zu erkennen.

Abbildung 4-9: Einfluß von Tomatidin auf Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert

Der Einfluß des Mazerats von Solanum lycopersicon auf Hep G2-Kulturen wurde größtenteils von den Hauptalkaloiden Tomatin und dessen Aglykon Tomatidin bestimmt. Die Erhöhung der Membranpermeabilität wurde wahrscheinlich überwiegend von Tomatin ausgelöst. Andere Steroidalkaloide, wie Solanin, Solanidin und Solasodin sind genauso wie das Aglykon Tomatidin weniger membrantoxisch. Die Erhöhung des Proteingehalts bei gleichbleibendem DNA-Gehalt könnte durch Tomatidineinfluß entstanden sein, welches während der Inkubationszeit aus Tomatin gebildet wird. Doch auch a-Solanin hatte in geringen Konzentrationen einen starken Einfluß auf die Proteinsynthese. So führten Konzentrationen von 0,58-1,2nmol/ml Solanin zu einer Erhöhung des Proteingehalts der Zellkulturen auf 175-181% bei gleichbleibendem DNA-Gehalt. Insgesamt war das Solanum lycopersicon-Mazerat im Bereich höherer Tomatin-konzentrationen etwas weniger toxisch als reines Tomatin, welches auf protektive Wirkungen [Seite 77↓] anderer Inhaltsstoffe hinweist.

In Tabelle 4-5 sind die IC50-Werte des Mazerats von Solanum lycopersicon, Tomatin und Tomatidin noch einmal vergleichend zusammengestellt. Die IC50-Werte des Solanum lycopersicon-Mazerats beziehen sich auf den Tomatingehalt, der in dem entsprechend zugesetzten Volumen des Mazerats enthalten war.

Tabelle 4-5: IC50-Werte des Mazerats des Krautes von Solanumlycopersicon, Tomatin und Tomatidin

Zusatz

IC50-Werte ermittelt über Proteingehalt [nmol/ml]

IC50-Werte ermittelt über DNA-Gehalt [nmol/ml]

Solanum lycopersicon- Mazerat

4,49

1,7

Tomatin

5,7

0,8

Tomatidin

-

15

4.1.2.5  3-Methylcholanthren

Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe, wie 3-Methylcholanthren (3-MC), induzieren vor allem CYP Isoenzyme der Familie I. Die Enzyminduktion geht ohne Hypertrophie des endoplasmatischen Retikulums von statten. 3-MC, möglicherweise auch ein Metabolit, bindet in der Zelle an einen zytosolischen Rezeptor. Dieser wiederum wird in den Zellkern geschleust und führt dort zu einer Derepression der CYP I-Gene und damit zu einer verstärkten Bildung der entsprechenden mRNA. Daran schließt sich eine erhöhte Synthese der Enzyme an [78, 79].

In der Hep G2-Kultur zeigte 3-MC schon nach 24h eine stark proliferationshemmende Wirkung (siehe Abbildung 4-10). Ab einer Konzentration von 1µM war ein Absterben der Zellen zu erkennen. Der Proteingehalt war nur wenig vermindert, was auf eine Erhöhung der Proteinsynthese zurückzuführen sein könnte.

Nach 72h wiederum war der Proteingehalt vermindert, während sich der DNA-Gehalt gegenüber einer Inkubationszeit von 24h kaum verändert hatte. Unter dem Mikroskop konnte nun eine starke Veränderung der Kultur beobachtet werden. Die Zellen waren zusammengeschrumpft und hatten nur noch geringen Kontakt mit dem Substrat.

3-MC führte nicht zu einer Erhöhung der Membranpermeabilität, weshalb die hohe Toxizität nicht darauf beruhen kann.


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Abbildung 4-10: Einfluß von 3-Methylcholanthren auf den Protein- und DNA-Gehalt sowie auf die Membranpermeabilität von Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,01

Die Diskrepanz zwischen Protein- und DNA-Gehalt der mit 3-MC behandelten Hep G2-Kulturen spiegelt sich auch in den kalkulierten IC50-Werten wieder:

Tabelle 4-6: IC50-Werte von 3-Methylcholanthren

Inkubationszeit

[h]

IC50-Werte ermittelt über den Proteingehalt [µM]

IC50-Werte ermittelt über den DNA-Gehalt [µM]

24

6

2,2

72

1,7

1,33


[Seite 79↓]

4.1.2.6  Phenobarbital

Phenobarbital (Phenylethylbarbitursäure) ist das einzige als Antiepileptikum in Deutschland eingesetzte Barbitursäurederivat. Es ist wirksam gegen Grand mal Anfälle und fokale kortikale Anfälle. Phenobarbital (PB) induziert sowohl in vitro als auch in vivo das mikrosomale Mono-oxygenase-System, wobei die CYP-Isoenzyme unterschiedlich stark in ihrer Aktivität erhöht werden. Daneben werden einige Glucuronyltransferasen und andere Enzyme durch PB induziert, weshalb es in vivo zu einem stärkeren Metabolismus und einer schnelleren Elimi-nation auch anderer Arzneistoffe kommen kann, die durch diese Enzyme abgebaut werden.

Die Induktion durch Barbiturate ist wahrscheinlich auf eine Erhöhung der Transkriptions- und Translationsrate, sowie einer Stabilisierung der mRNA zurückzuführen. Bei Induktion durch PB kommt es auch zu einer Veränderung in der Zelle: die Zelle hypertrophiert, das endoplasmatische Retikulum proliferiert und die Proteinsynthese ist stark erhöht. In vivo zeigt sich dies durch eine Vergrößerung der Leber [78].

Abbildung 4-11 zeigt die Ergebnisse der Proliferations- und Toxizitätsuntersuchungen von PB an Hep G2-Zellen.

Abbildung 4-11: Einfluß von Phenobarbital auf den Protein- und DNA-Gehalt sowie auf die Membranpermeabilität von Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert

In Hep G2-Kulturen (siehe Abbildung 4-11) zeigte PB in geringen Konzentrationen einen leicht [Seite 80↓] proliferationshemmenden Effekt. Bei der für die Induktion eingesetzte Konzentration von 0,8µM hat überhaupt kein Wachstum stattgefunden. Doch ist der Proteingehalt hier im Vergleich zum DNA-Gehalt stark erhöht, was durch eine bei dieser und bei höheren Konzentrationen einsetzende Hypertrophie der Zelle mit verstärkter Proteinsynthese begründet sein könnte. Dies kann auch an Hand der IC50-Werten erkannt werden.

Tabelle 4-7: IC50-Werte von Phenobarbital

Inkubationszeit

[h]

IC50-Werte ermittelt über Proteingehalt [mM]

IC50-Werte ermittelt über DNA-Gehalt [mM]

24

3,4

1,3

72

1,55

0,83

Veränderungen der Membranpermeabilität konnten nicht festgestellt werden, so daß die Zellzahlminderung nicht auf ein Absterben der Zellen durch erhöhte Membranpermeabilität zurückgeführt werden kann.

4.1.2.7 Clofibrat

Clofibrat (2-(4-Chlorphenoxy)-2-methylpropionsäureethylester) ist ein antilipidämischer Arzneistoff. Wie auch andere Clofibrinsäurederivate und auch Clofibrinsäure selbst, vermindert Clofibrat in vivo die VLDL-Konzentration im Plasma und hemmt die Cholesterolbiosynthese in der Leber. Im Plasma wird vor allem aber die Triglyceridkonzentration vermindert, während die Cholesterolkonzentration nur geringfügig vermindert und gelegentlich sogar leicht erhöht wird [97].

Clofibrat führt zu einer Induktion von CYP 4 A. Parallel dazu kommt es zu einer Vermehrung der Peroxysomen und einer Erhöhung von peroxysomalen Lipid-metabolisierenden Enzymen.

Die Ergebnisse der Proliferations- und Zytotoxizitätsuntersuchungen von Clofibrat an Hep G2-Zellen sind in Abbildung 4-12 dargestellt.

[Seite 81↓] Abbildung 4-12: Einfluß von Clofibrat auf den Protein- und DNA-Gehalt sowie auf die Membranpermeabilität in Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α < 0,0

In der Hep G2-Kultur kam es zu starken Störungen der Membranintegrität bei schon geringen Clofibratkonzentrationen. Bei 3,2µM Clofibrat war sogar die maximale Freisetzung an LDH aus dem Zytoplasma erreicht. Diese ausgeprägte Membrantoxizität dürfte der Auslöser für die stark proliferationshemmende Wirkung von Clofibrat bei niedrigen und für das Absterben von Zellen bei höheren Konzentrationen sein. Die durch Esterspaltung entstehende freie Clofibrinsäure könnte für diese Schädigungen verantwortlich sein.

Zu einer Steigerung der Proteinsynthese kommt es bei Clofibratzugabe nicht. Proteingehalt und DNA-Gehalt korrelieren miteinander, was auch die IC50-Werte zeigen (sieheTabelle 4-8)

Tabelle 4-8: IC50-Werte von Clofibrat

Inkubationszeit

[h]

IC50-Werte ermittelt über Proteingehalt [mM]

IC50-Werte ermittelt über DNA-Gehalt [mM]

24

0,39

0,45

72

0,62

1,96


[Seite 82↓]

4.1.2.8  DMSO

Dimethylsulfoxid (DMSO) ist eine farblose hygroskopische Flüssigkeit, die mit Wasser, Alkoholen, Aceton, Chloroform und Benzen mischbar ist. DMSO gehört zu den nukleophilen aprotischen Lösungsmitteln und löst deshalb vor allem Kationen sehr gut.

In der primären Hepatozytenkultur erhält DMSO die Albuminsynthese und verhindert die DNA-Synthese. Es hat differenzierende Eigenschaften und führt zu einer Stabilisierung von Morphologie und Überleben der Zellen. Dieser Effekt soll bei einer Konzentration von 0,5% einsetzen und bei 2% optimal sein. Ein Anstieg von Phenobarbital induzierbaren CYP-Isoenzymen durch DMSO konnte nicht beobachtet werden [7].

Abbildung 4-13: Einfluß von DMSO auf den Protein- und den DNA-Gehalt, sowie die Membranpermeabilität von Hep G2-Kulturen, ±s, n=8, α<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindwert

Auf Hep G2-Kulturen hatte DMSO einen proliferationshemmenden Effekt (siehe Abbildung 4-13). Der Einfluß auf den Proteingehalt war gering und nur bei höheren Konzentrationen war der Proteingehalt gegenüber dem DNA-Gehalt leicht erhöht. Vor allem nach 24h war die Zellzahl erniedrigt, weshalb es zu einem Absterben von Zellen gekommen sein mußte. Nach 72h hat sich die Zellzahl wieder erhöht. Es muß also zu einem Wachstum der überlebenden Zellen gekommen sein. Eine Membrantoxizität war nur bei 2% DMSO im Kulturmedium zu beobachten. [Seite 83↓] Diese lag bei 36,2%, weshalb eine Zugabe von 2% DMSO zum Kulturmedium, auch bei Hepatozytenkulturen nicht vorgenommen wurde. Eine Konzentration von bis zu 0,5% schien keine beträchtlichen Auswirkungen zu haben, weshalb bei allen Versuchen diese Konzentration nicht überschritten wurde. Trotzdem ist das Mitführen von Kontrollen bei Zytotoxizitäts- oder Proliferationsversuchen mit Substanzen, die in DMSO gelöst wurden vorteilhaft. Bei höheren DMSO Konzentrationen als 0,5% würde das Fehlen von Kontrollen zu verfälschten Ergebnissen führen.

4.1.2.9 Vergleich von DMSO mit anderen Lösungsmitteln

Die meisten Testsubstanzen, die im Rahmen von Biotransformations- und Zytotoxizitäts-untersuchungen herangezogen wurden, waren nicht wasserlöslich.

Bei der Wahl des Lösungsmittels sollte nicht nur das Löseverhalten eine Rolle spielen, sondern auch der Einfluß des Lösungsmittels auf die Zellkultur. Aceton zeigte den geringsten Einfluß auf die Proliferation von Hep G2-Zellen. Die nur geringfügige Hemmung der Proliferation ist zwar günstig, doch verdunstet Aceton zu schnell, um genaue, kleine Volumina zu pipettieren. Eine längere Lagerung von Lösungen führt durch Verdunstung des Acetons zu zusätzlicher Ungenauigkeit.

Methanol hingegen zeigte nicht nur proliferationshemmende Eigenschaften, sondern auch ein geringes Absterben der Zellen bei einer Konzentration von 0,5%. Ethanol war zwar weniger toxisch und zeigte keinerlei Einfluß auf die Membranintegrität, war aber ebenfalls proliferationshemmend. Ethanol wird schnell metabolisiert und führt in Hepatozyten zu Veränderungen im Intermediärstoffwechsel [7]. Auch bei Methanol und Ethanol ist das genaue Pipettieren von kleinen Volumina aufgrund schneller Verdunstung problematisch [7].

DMSO mit nur geringen proliferationshemmenden Effekten und ohne auffälligen Einfluß auf den Proteingehalt (siehe 4.1.2.8), schien daher das geeignetste Lösungsmittel zu sein.

Tabelle 4.2-8: Einfluß von verschiedenen Lösungsmittel auf das Proliferationsverhalten von Hep G2-Kulturen über 24h bei einer Konzentration von jeweils 0,5%

Lösungsmittel

Kontrolle

Aceton

Methanol

Ethanol

DMSO

DNA-Gehalt in %

100,0 ± 5

93,6 ± 5,4

71,6 ± 7

80,4 ± 8

87,2 ± 6,8


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4.1.2.10  7-Ethoxyresorufin

Im Rahmen der Überprüfung der optimalen Substratkonzentration von 7-Ethoxyresorufin (siehe 2.3.1.1) in Hep G2-Kulturen, wurden bei Konzentrationen über 8µM 7-Ethoxyresorufin Zellveränderungen beobachtet. Daher galt es, den Einfluß von 7-Ethoxyresorufin auf die Proliferation von Hep G2-Zellen zu untersuchen.

Die Proliferation von Hep G2-Zellen über 24h, die unterschiedlichen 7-Ethoxyresorufin-konzentrationen ausgesetzt waren, ist in Abbildung 4-14 dargestellt. Ermittelt wurde der DNA-Gehalt der Kulturen mittels bisBenzimid. In den Konzentrationen 1-2µM zeigte 7-Ethoxyresorufin keinerlei Auswirkung auf die Proliferation. Darüber hinaus, bis zu einer Konzentration von 16µM, inhibierte 7-Ethoxyresorufin das Wachstum der Zellen. 24µM 7-Ethoxyresorufin wirkten zytotoxisch auf Hep G2-Zellen und konnten damit für die Bestimmung von Enzymaktivitäten nicht eingesetzt werden.

Abbildung 4-14: Einfluß von 7-Ethoxyresorufin auf die Proliferation von Hep G2-Kulturen innerhalb 24h, ±s, n=8, α<0,05, * kein signifikanter Unterschied zum Blindw


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4.2  Apoptose

Der Zelltod tritt über zwei unterschiedliche Mechanismen auf: der Nekrose und der Apoptose.

Die Nekrose wird durch extreme Veränderung physiologischer Verhältnisse, z.B. pH-Änderungen oder hohe Temperaturen, hervorgerufen. Als Erstes verliert die Zelle dabei die Fähigkeit der Aufrechterhaltung der Homöostase, wodurch Wasser und extrazelluläre Ionen einströmen können und die Zelle, vor allem die Mitochondrien, anschwellen lassen. Schließlich kommt es zum Aufbrechen der Zellmembran und damit zur Lyse der Zelle. Da hierbei auch lysosomale Enzyme in den Extrazellularraum gelangen, ist in vivo ein nekrotischer Vorgang meist an eine Entzündung gekoppelt.

Im Gegensatz dazu tritt die Apoptose, der programmierte Zelltod, unter physiologischen Bedingungen auf. Es kommt zur Chromatinaggregation, zur Kondensation von Nukleus und Zytoplasma und schließlich zur Fragmentation der Zelle in kleine Partikel („apoptotic bodies“) mit intakter Membran, Zytoplasma, Kernmaterial, Ribosomen und intakten Mitochondrien. In vitro schwellen diese „apoptotic bodies“ an und lysieren. Dieser Vorgang wird sekundäre Nekrose genannt. In vivo werden die „apoptotic bodies“ schnell erkannt und durch Makrophagen oder durch angrenzende epitheliale Zellen phagozytiert.

Die Apoptose läuft innerhalb weniger Stunden ab. Dieser Zeitraum läßt sich in drei Stadien einteilen:

Die wichtigsten Unterschiede zwischen Nekrose und Apoptose sind noch einmal in Tabelle 4-9 zusammengefaßt.


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Tabelle 4-9: Unterschiede zwischen Nekrose und Apoptose [108]

Nekrose

Apoptose

Morphologische Unterschiede

Verlust der Membranintegrität

Membran-“blebbing“

Chromatinform bleibt erhalten

Chromatin aggregiert an der Kernmembran

Schwellen der Zelle

Zellschrumpfung

komplette Lyse der Zelle

Bildung von „apoptotic bodies“

Schwellung der Mitochondrien

alle Organellen bleiben intakt

biochemische Unterschiede

Verlust der Regulation der Homöostase

enzymatisch regulierter Prozeß

passiver Prozeß

Energie- (ATP-) abhängiger Prozeß

zufällige Spaltung der DNA, keine Banden-bildung im Elektropherogramm

mono- und oligonukleosomale Fragmenta-
ion der DNA, „Leiter“ im Elektropherogramm

DNA-Fragmentation nach Lyse der Zelle

DNA-Fragmentation vor der Lyse der Zelle

physiologische Unterschiede

Tod von Zellgruppen

Tod einer einzigen Zelle im Verband

entsteht durch unphysiologische Verhältnisse

induziert durch physiologische Signale

Phagozytose durch Makrophagen

Phagozytose durch Makrophagen und angrenzende Zellen

Entstehen einer Entzündung

keine Entzündung

Die Apoptose ist ein stark regulierter Prozeß, der über hormonelle und rezeptorvermittelte Signale kontrolliert wird. Eine große Rolle spielen Calcium-Ionen, die z.B. über den second messenger Inositol-(1,4,5)-triphosphat oder durch exogenen Substanzen aus intrazellulären Speichern freigesetzt werden können. Viele Endonukleasen, Proteasen, Phosphatasen und Phospholipasen werden durch stark erhöhte zytoplasmatische Calcium-Konzentrationen aktiviert, wobei auch Calmodulin involviert ist.

Daneben sind andere signalübertragende Stoffe an der Auslösung von Apoptose beteiligt. Dazu gehören Proteinkinase C, cAMP, Protein Tyrosin Kinasen und Ceramide. Sie können aber auch die Apoptose hemmen. Proliferation, Differenzierung und Apoptose sind also nah verwandte Zellantworten, die viele molekulare Mechanismen gemeinsam haben [73]. Die vielfältigen Faktoren, die die Apoptose modulieren, können in zwei Gruppen eingeteilt werden: Die eine Gruppe beeinflußt die Entscheidung der Zellen in der G0-Phase, ist aber nicht an der Ausführung der Apoptose beteiligt. Dazu gehören die Onkogene, DNA-Schäden, Fas, der [Seite 87↓]Tumornekrosefaktor, das Tumorsuppressorgen p53 und die bcl-2-Familie. Faktoren, die direkt am Prozeß der Apoptose beteiligt sind, sind Proteasen der ICE (Interleukin-1bconverting enzyme)-Familie, Nukleasen und Scramblase, die u.a. für die Translokation von Phosphatidyl-serin auf die Außenseite der Zytoplasmamembran während der Apoptose verantwortlich ist [31].

In vivo ist die Apoptose ein Beitrag zur Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase, z.B. in Niere und Leber. Des weiteren kommt sie im Rahmen der Embryogenese bei der Entwicklung von Händen und Füßen, sowie bei der Gewebsatrophie, wie z.B. der Rückbildung des Milchdrüsen-gewebes nach der Laktation, vor. Sie soll auch der Aussonderung anormaler Zellen dienen, z.B. durch Auslösen von Apoptose in autoreaktiven Zellen über zytotoxische T-Zellen [8].

Interessant ist die Auslösung von Apoptose bei Zellen, die durch Überexpression von Wachstumsfaktoren einen gestörten Apoptoseablauf haben. Hier ergeben sich neue therapeutische Ansatzpunkte für die Bekämpfung von Krebs. Andererseits gibt es viele Krankheiten, die auf Grund exzessiver apoptotischer Vorgänge entstehen und die es zu bekämpfen gilt. Dazu gehören die HIV-Infektion und neurodegenerative Störungen, wie die Alzheimer Krankheit [69].

4.2.1 Erkennen von Apoptose

Ein typisches Kennzeichen für Apoptose ist die Fragmentierung der DNA durch endogene Nukleasen an den internukleosomalen Linker-Regionen in der F-Phase. Die Detektion von kurzen DNA-Bruchstücken kann daher zur Detektion von Apoptose dienen. Die zelluläre DNA wird nach Lyse der Zelle mit Phenol und Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Durch Agarosegel-Elektrophorese und Anfärben mit Ethidiumbromid können dann die unterschiedlichen DNA-Banden im Elektropherogramm sichtbar gemacht werden („DNA-Leiter“). Auch der Nachweis der DNA-Bruchstücke über eine radioaktive Markierung ist möglich.

In einem früheren Stadium der Apoptose kommt es zu einer Veränderung in der Zellmembran. Während bei einer gesunden Zelle Phosphatidylserin nur auf der dem Zytoplasma zugewandten Seite vorkommt, findet bei der apoptotischen Zelle eine Translokation von Phosphatidylserin auf die Außenseite der Plasmamembran statt. Hier kann es durch Annexin V, einem Calcium-abhängigen, Phospholipid-bindendem Protein mit hoher Affinität für Phosphatidylserin, detektiert werden. Da aber nekrotische Zellen nach Verlust der Membranintegrität Annexin V binden können, ist es notwendig mit einem Farbstoff, der nur in nekrotische Zellen mit permeabilisierter Membran eindringen kann, gegenzufärben. Dazu kann Trypanblau oder Propidiumiodid genutzt werden.

Eine weitere Methode zum Nachweis von Apoptose ist die Bestimmung nuklearer proteolytischer Aktivität, denn das nukleare Enzym Poly(ADP-Ribose)Polymerase (PARP), welches bei DNA-Reparaturprozessen beteiligt ist, wird ebenfalls in einer frühen Phase durch Apoptose-[Seite 88↓] spezifische Proteasen gespalten. Diese Proteasen aus der ICE-Familie lösen die apoptotische Kaskade aus [28, 103]. Eine von ihnen ist z.B. die Protease Apopain, die PARP in zwei Fragmente schneidet. Die Spaltprodukte und PARP selbst können dann nach einer Gelelektrophorese mit polyklonalen Antikörpern sichtbar gemacht werden. Andere ICE-verwandte Proteasen spalten auch Lamine. Lamine sind Filamentproteine, die für die Aufrechterhaltung der Struktur der inneren Zellmembran verantwortlich sind. Ihre Proteolyse führt zu der typischen morphologischen Transformation des Kerns. Diese Veränderungen können im Elektronenmikroskop sichtbar gemacht werden [15].

4.2.2 Nachweis von apoptotischen Vorgängen nach Inkubation mit FLM 5011

Nach Inkubation von FLM 5011 auf Hep G2-Kulturen konnten bereits nach 24h starke morphologische Veränderungen an den Zellen erkannt werden. Die Zellen schrumpften und lösten sich vom Substrat ab. Eine starke „bleb“-Bildung der Zellen (siehe Abbildung 4-15), führten zu der Vermutung, daß für das gehäufte Auftreten von Zelltod nach Inkubation mit FLM 5011, apoptotische Vorgänge verantwortlich zu machen sind. Morphologische Veränderungen können frühestens nach 6-8h optisch beobachtet werden.

Abbildung 4-15: Zeiose: Bildung von "apoptotic bodies" bei Hep G2-Zellen nach Behandlung mit FLM 5011

Um diese Annahme zu überprüfen, wurde DNA aus Hep G2-Kulturen extrahiert. Dazu wurden die Zellen mit dem Detergenz Triton X 100 lysiert. Anschließend folgte eine Chloroform-Phenol- [Seite 89↓] Extraktion der Zellsuspension mit dem Ziel, die wäßrige Phase von Proteinen zu befreien. Die Proteine werden dabei denaturiert und dissoziieren von der DNA. Auch Lipide werden dabei aus der wäßrigen Phase entfernt. Der Zusatz von Chloroform führt zu einem schnellen Trennen der Phasen, wobei die denaturierten Proteine als weiße Interphase zu erkennen sind. Zur Extraktion mit Phenol sollte farbloses Phenol verwendet werden, da rötlich verfärbtes Phenol Chinone enthält, die Phosphodiester spalten und die DNA quervernetzen können [110]. Nun wurde aus der wäßrigen Phase die DNA als Natriumsalz nach Zusatz von Natriumacetat mit Hilfe von Ethanol gefällt. Damit die Ausbeute an DNA groß genug war, mußte bei -20°C gefällt werden. Nach dem Waschen der DNA wurde sie in TE-Puffer zur Lagerung aufgenommen. EDTA chelatisiert dabei Schwermetallionen, die für DNase-Aktivität benötigt werden und der relativ hohe pH-Wert von 8 verhindert eine Deamidierung [110]. Um zu verhindern, daß die kurzkettigen Bruchstücke der RNA bei die Gelelektrophorese stören, wurden sie durch Behandlung mit RNase bei 37°C entfernt.

Nach Elektrophorese in einem Agarosegel konnten nun die DNA-Bruchstücke unterschiedlicher Länge mit Ethidiumbromid, welches zwischen den Basenpaaren interkaliert und fluoresziert, sichtbar gemacht werden.

In Abbildung 4-16 ist eine Photographie mit UV-Filter von einem Elektropherogramm abgebildet.

DNA unbehandelter Zellen zeigten keine Fragmentierung. Die Kettenlänge der DNA lag über 5000 Basenpaare. Dies konnte abgeschätzt werden über die Marker Bromphenolblau bzw. Xylencyanol, welche bei diesen Bedingungen wie lineare doppelsträngige 300 Basenpaar- bzw., 4000 Basenpaar-DNA-Fragmente laufen, sowie über die DNA-Leiter. Nach 4h Inkubation mit FLM 5011 lag der Schwerpunkt der längerkettigen DNA bei ca. 4000 Basenpaaren. Kürzere Fragmente konnten in geringen Konzentrationen im Bereich von 1000-2000 Basenpaaren beobachtet werden. Nach 24h wiederum waren im Bereich von 5000 Basenpaaren keine Fragmente mehr zu sehen, sondern nur noch im Bereich um 4000 Basenpaaren. Zwischen 100 und 2000 Basenpaaren konnten bandenförmig kurze Fragmente detektiert werden. Eine Fragmentation der DNA hat also nach Inkubation mit FLM 5011 bereits nach 4h in geringem Maß, da DNA-Fragmentierung frühestens nach 4h nachgewiesen werden kann, und nach 24h deutlich sichtbar stattgefunden.


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Abbildung 4-16: DNA-Gelelektrophorese
Reihe 1 und 2: DNA von unbehandelte Hep G2-Zellen
Reihe 3 und 4: DNA von 4h mit FLM 5011 behandelte Hep G2-Zellen
Reihe 5 und 6: DNA von 24h mit FLM 5011 behandelten Hep G2-Kulturen
Reihe 7: käuflich erworbene 100 Basenpaar-Leiter von GIBCO BRL als Kontrolle

Annexin V ist ein Calcium- und Phospholipid-bindendes Protein, welches antikoagulierend durch Inhibition der Prothrombinaktivierung wirkt. Es hemmt weiterhin Phospholipase A2 und Proteinkinase C. Annexin V bindet sehr spezifisch an Phosphatidylserin, welches im frühen Stadium der Apoptose von der Innenseite der Plasmamembran nach außen geschleust wird. Dabei binden 4-8 Annexin-V-Moleküle an ein Phosphatidylserin, was das Signal für die Detektion intensiviert [109]. Die Translokation von Phosphatidylserin an die Außenseite der Zytoplasmamembran kann frühestens nach 2-4h nachgewiesen werden.

Die Anfärbung der mit FLM 5011 behandelten Zellkulturen mit Annexin V fiel ebenfalls positiv aus.

Mit FLM 5011 vorbehandelte Hep G2-Zellen wurden mit einer Annexin-V-Biotin-Lösung inkubiert, dann fixiert, und schließlich nach diversen Waschschritten über eine enzymatische Reaktion sichtbar gemacht. Dazu wurde Streptavidin genutzt, welches spezifisch an Biotin bindet. Nach Zugabe von Diaminbenzidin wurde dieses durch die an Streptavidin gekoppelte Peroxidase zu einem rotbraun gefärbten Produkt umgesetzt. Apoptotische Zellen erschienen nun tief rotbraun, während alle anderen Zellen kaum gefärbt waren.


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Abbildung 4-17: Färbung mit Annexin-V-Biotin

Nach einer 4-stündigen Inkubation mit FLM 5011 konnten nur wenig Zellen beobachtet werden, die mit Trypanblau angefärbt werden konnten und damit den nekrotischen Anteil der Zellen repräsentierten.

Die Färbung mit Annexin V hingegen zeigte einen große Zahl an gefärbten Zellen (siehe Abbildung 4-17), wodurch die Hypothese, daß es sich um apoptotische Vorgänge handelte, bestätigt wurde.

Das ApoAlertTM FLICE/Caspase-8 Fluorescent Assay Kit detektiert die Apoptose zu einem noch früheren Zeitpunkt, als es bei den anderen Methoden der Fall ist. Die Protease Caspase-8 (FLICE) gehört zu den ICE verwandten Proteasen und wird durch ein membrangebundenes Enzym aktiviert. FLICE steht ganz am Anfang der ICE-Proteasen Kaskade, bei der ICE-Proteasen entstehen, die für die Spaltung von DNA-reparierenden Enzymen wie PARP verantwortlich sind.

Die FLICE-Aktivität wurde hierbei durch Zugabe eines exogenen Substrats detektiert. Dabei handelte es sich um 7-Amino-4-trifluoromethylcoumarin (AFC), welches an ein Tetrapeptid gebunden war. Die Fluoreszenz von AFC wird, nach Abspaltung vom Tetrapeptid IETD durch FLICE, bathochrom verschoben. FLICE-Aktivitäten können schon nach 1-2h nachgewiesen werden [3]. In FLM 5011 behandelten Kulturen wurde die FLICE-Aktivität nach unterschied-lichen Zeiten bestimmt (siehe Abbildung 4-18).


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Abbildung 4-18: FLICE-Aktivität in FLM 5011 behandelten Hep G2-Kulturen

Nach 1-2h war zwar nur eine geringe, aber deutlich detektierbare FLICE-Aktivität zu beobachten. Die maximale FLICE-Aktivität wurde nach 4h erreicht. Danach nahm die FLICE-Aktivität in den Hep G2-Zellen wieder ab, was durch Abbau des Enzyms und durch Einsetzen der sekundären Nekrose erklärt werden könnte.

Apoptose ausgelöst durch 5-Lipoxygenaseinhibitoren konnte durch Zusatz von 5(S)-HETE in einigen transformierten Zellen verhindert bzw. reduziert werden [39], was annehmen läßt, daß die Reduktion der 5(S)-HETE-Konzentration, nicht aber der Anstieg von Arachidonsäure oder deren vermehrte Cyclooxygenase Metaboliten, der auslösende Faktor sei. Um diese These zu überprüfen, wurden Hep G2-Zellen mit FLM 5011 unter Zusatz unterschiedlicher 5(S)-HETE Konzentrationen inkubiert und anschließend die FLICE-Aktivität quantifiziert.

Tabelle 4-10: FLICE-Aktivitäten in Hep G2-Zellen nach 4h Inkubation mit 0,05mM FLM 5011 und unterschiedlichen 5(S)-HETE-Konzentrationen

Zusatz

FLICE-Aktivität

[µU/106 Zellen]

FLM 5011

4,08 ± 0,09

FLM 5011 + 0,1µM 5(S)-HETE

2,79 ± 0,07

FLM 5011 + 1µM 5(S)-HETE

2,14 ± 0,05

FLM 5011 + 10µM 5(S)-HETE

0,26 ± 0,05


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Der Zusatz von 5(S)-HETE reduzierte deutlich die FLICE-Aktivität auf weniger als ein Zehntel der Aktivität ohne 5(S)-HETE Zusatz (siehe Tabelle 4-11). Dies bestätigt die Vermutung, daß die Verringerung der 5(S)-HETE-Konzentration in der Hep G2-Zelle ein Signal für Apoptose sein kann.

Auch schon in anderen transformierten Zellen konnte festgestellt werden, daß die Inhibition der Lipoxygenase Apoptose auslöst [2, 4, 19, 39, 104]. Tang et al. [104] konnten zeigen, daß durch Inhibition der Lipoxygenase die Konzentration von bcl-2, ein Protein, welches die Überlebenszeit von Zellen verlängert, reduziert wird, so daß es nach 48h nicht mehr nachgewiesen werden konnte. Die Konzentration des bax-Proteins, welches bcl-2 komplexiert und damit antagonisiert, sank zwar auch, aber in wesentlich geringerem Maß, so daß insgesamt der bcl-2/bax-Quotient stark gesenkt wurde. Ein niedriger Quotient bedeutet, daß weniger bcl-2-bax-Heterodimere entstehen und mehr freie, Apoptose auslösende bax-Homodimere vorhanden sind [111]. Bax-Homodimere sind wiederum an der Aktivierung von Floppasen, wie z.B. Scramblase, beteiligt, welche für die Translokation von Phosphatidylserin an die Außenseite der Zytoplasmamembran verantwortlich sind.

Die Ergebnisse lassen annehmen, daß die Lipoxygenase eine wichtige Rolle bei der Modulierung von Proliferation und Zelltod spielt. Tang et al. [104] vermuten, daß das Lipoxygenasesystem mit Hilfe von reaktiven freien Radikalen bestimmte Gene, wie die der ICE-Proteasen, reguliert. Letztere wiederum sind dann für die Steuerung der bcl-2 Expression und damit für die Regulation von Proliferation und Zelltod verantwortlich.


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10.09.2004