[Seite 94↓]

5  Diskussion und Zusammenfassung

Die Suche nach alternativen Methoden zu Tierversuchen ist weltweit ein aktueller Gegenstand in der Wirkstofforschung. Die vorliegende Arbeit ordnet sich mit der Bearbeitung einiger Fragen des Fremdstoffmetabolismus in diese Richtung ein. Sie hatte die Aufgabe, die Eignung von Hep G2-Zellkulturen als in vitro-System zur Untersuchung der Biotransformation und Toxizität festzustellen und erhaltene Ergebnisse mit denen anderer in vitro-Testsysteme entsprechender Komplexität zu vergleichen. Hierzu wurden insbesondere primäre Zellkulturen von Rattenhepatozyten herangezogen, da diese häufig als in vitro-Modell genutzt werden und dementsprechend viele Vergleichsdaten vorliegen [z.B. 22, 82, 83, 98]. Zusätzlich erfolgten einige Untersuchungen an Lymphozytenkulturen, die aufgrund der enzymatischen Ausstattung als Komplementärsystem von Interesse sind.

Primärkulturen von Hepatozyten sind das am häufigsten eingesetzte in vitro-System für Studien zur Biotransformation, da die Leberparenchymzelle über das fast komplette für den Fremdstoffmetabolismus relevante Enzymmuster mit hoher Aktivität verfügt. Allerdings ist die Lebensdauer von Primärkulturen, insbesondere von kultivierten Hepatozyten, begrenzt. Diese hängt neben den objektiv bedingten Veränderungen der Zelle unter in vitro-Bedingungen von vielen experimentellen Faktoren ab.

Der entscheidende Schritt für die Kultivierung von Hepatozyten ist deren Isolation. Bei hoher Ausbeute sollten die isolierten Zellen eine ausreichende Vitalität besitzen. Die Zwei-Schritt-Methode nach Seglen et al. [93] mit Kollagenase, z.B. aus Clostridium histolyticum, führt zu einer Gewebedesintegration, ohne die isolierten Hepatozyten zu stark zu schädigen [57]. Mit dieser Methode konnte hier ein zufriedenstellendes Ergebnis mit einer Vitalität von 80% erreicht werden. Die Hepatozyten wurden als Monolayer kultiviert. Ein kritischer Schritt zu Beginn der Kultivierung nach Einsaat der Zellen ist die Anheftung der Hepatozyten an das Substrat, wofür hierbei Kollagen I benutzt wurde. Da sich nicht alle Zellen anheften, muß hier mit einem Verlust an Material gerechnet werden. Problematisch kann sich auch die Anheftung von stark geschädigten Zellen auf vitale Zellen auswirken. Die geschädigten Zellen können nicht mehr entfernt werden und es kommt zu verfälschten Werten bei der Zellzählung.

Die Isolierung und Kultivierung von Hepatozyten ist relativ kostenintensiv, bedingt durch einen hohen Tierverbrauch bei der Gewinnung der Zellen und durch den Einsatz teurer Chemikalien.

Lymphozytenkulturen sind ebenfalls Primärkulturen. Die Isolation der Zellen aus der Rattenmilz ist weniger problematisch. Bei Zellausbeuten von bis zu 107 Lymphozyten pro Milz und einer hohen Vitalität von über 90% konnte schnell und kostengünstig gearbeitet werden. Die Kultivierung als Suspension gestaltet sich relativ einfach, da der komplizierte Schritt der Anheftung entfällt. Nachteilig ist auch hier der hohe Verbrauch an Versuchstieren.

Biotransformationsuntersuchungen mit Primärkulturen sind auf Grund der begrenzten [Seite 95↓] Lebensdauer der Zellen nur eingeschränkt durchführbar. Entsprechende Zellinien mit hoher Proliferationsrate sind dagegen für Monate bis Jahre weiter verwendbar. Die Isolations- und Reinigungsschritte entfallen, so daß dadurch bedingte schädigende Einflüsse auf die Zellen nicht vorhanden sind.

Die Hepatomzellinie Hep G2 ist eine immortalisierte Leberzellinie humanen Ursprungs mit epithelartiger Zellmorphologie. Im Gegensatz zu Hepatozyten ist sie in Kultur stark proliferierend und behält im Verlauf der Kultivierung viele spezifische Funktionen bei. Die Kultivierung erfolgte als Monolayer. In dieser Form ist das Wachstum der Zelle sehr stark. Aufgrund unzureichender Kontakthemmung können hierbei Zellhaufen entstehen, die eine genaue Zellzählung erschweren. Sie sind mit Trypsin nur schwer in Einzelzellen aufzuschließen. Man kann sie teilweise durch regelmäßiges Abzentrifugieren nach der Trypsinierung eliminieren. Ein Vorteil der geringen Kontakthemmung besteht in einer damit einhergehenden verringerten Dichtebegrenzung und damit einer hohen Sättigungsdichte. Hep G2-Zellen zeigten eine hohe Plattiereffizienz (ca. 90%, siehe Abbildung 2-3) und haben einen kleineren Serumbedarf als Hepatozyten. Allerdings führt ein geringerer Serumzusatz zu einem langsameren Wachstum sowie zur Beeinflussung biochemischer Leistungen [24].

Die Ermittlung der fremdstoffmetabolischen Aktivitäten der einzelnen Zellkulturen erfolgte über die quantitative Erfassung des Umsatzes von Modellsubstanzen. Zur Charakterisierung der Phase I-Biotransformation wurden dabei solche Substrate eingesetzt, die eine relativ hohe Spezifität für wenige Isoenzyme des Monooxygenasesystems Cytochrom P450 (CYP), der enzymatischen Hauptkomponente des Fremdstoffmetabolismus, aufweisen. Die ausgewählten Substanzen können leicht in die Zelle penetrieren und die dort gebildeten Metaboliten werden in das Kulturmedium abgegeben, ohne daß es zu einer Akkumulation im Zellrasen oder in der extrazellulären Matrix kommt [22, 57].

Neben der Bestimmung der CYP-Basisaktivität der Zellen wurden Untersuchungen zur Induzierbarkeit vorgenommen.

Die Deethylierung von 7-Ethoxyresorufin und 7-Ethoxycoumarin wird durch die Isoenzyme CYP 1 A1 und 2 bzw. CYP 2 A1 und 2 katalysiert. Die Aktivitäten dieser Isoenzyme waren in Hep G2-Zellen höher als in Hepatozyten. Die geringere Umsatzrate in Hepatozyten kann jedoch durch Veränderungen in der Zusammensetzung des Kulturmediums erhöht werden und hängt darüber hinaus vom Rattenstamm ab. Die Induzierbarkeit der Isoenzyme CYP 1 A1 und 2, die beide 7-Ethoxyresorufin umsetzen, ist in Hep G2-Zellen und Rattenhepatozyten recht ähnlich. Beide Zellarten zeigten nach Inkubation mit 3-MC eine starke Erhöhung der Umsatzrate, während die Vorbehandlung mit PB nur einen geringen Anstieg der Enzymaktivität auslöste. Die schwache Induktion durch PB kann auf eine geringe Beteiligung des PB-induzierbaren CYP 2 B1 zurückzuführen sein, welches geringfügig an der Deethylierung von 7-Ethoxyresorufin beteiligt [Seite 96↓] ist.

Im Gegensatz dazu ist die Induzierbarkeit der 7-Ethoxycoumarin-O-deethylase durch PB höher. Dies ist durch eine andere Spezifität der entsprechenden Reaktion bedingt, die durch die Isoenzyme CYP 2 A1 sowie 2 B1 und 2 katalysiert wird.

Hinsichtlich der subzellulären Verteilung in Hep G2-Zellen sind die Enzymaktivitäten fast ausschließlich in Mikrosomen zu finden.

Lymphozyten haben im Rahmen von Biotransformationsuntersuchungen als Testsystem für Monooxygenierungen Bedeutung erlangt, da sie lediglich CYP-Aktivitäten aufweisen. Damit ist es möglich, CYP-katalysierte Reaktionen isoliert zu betrachten und Aussagen zur Rang- und Reihenfolge von Reaktionsschritten bei der Fremdstoffmetabolisierung insbesondere bei komplexen Prozessen abzuleiten. Aus diesem Grund wurden ausgewählte Untersuchungen vorgenommen, die bereits bekannte Erkenntnisse ergänzen sollten. Das Isoenzyme CYP 1 A1 kommt in Lymphozyten konstitutiv mit geringer Basisaktivität vor [35]. Erwartungsgemäß erhöhte der Induktor 3-MC die Aktivität, während PB eher hemmend wirkte. Auch eine Inkubation mit dem Mitogen Concanavalin A bewirkte eine Erhöhung des Umsatzes des Substrates 7-Ethoxyresorufin, woraus geschlußfolgert werden kann, daß die Monooxygenaseaktivitäten von Proliferationsprozessen der Zellen abhängig sind.

Neben den oben beschriebenen Isoenzymen ist die CYP 3-Familie für den Fremdstoffmetabolismus von Interesse. Aminophenazon diente dabei als Substrat zur Untersuchung von CYP 3 A1 und 2, die die Verbindung N-demethylieren. Hierbei zeigten die Hepatozyten eine höhere Enzymaktivität als Hep G2-Zellen. Nach Vorbehandlung mit dem spezifischen Induktor Dexamethason erhöhte sich leicht die Aktivität ohne jedoch die entsprechenden Werte der Hepatozyten zu erreichen. Die Verbindungen 3-MC und PB waren ebenfalls von nur geringem Einfluß.

In den Hep G2-Zellen wurde der Hauptanteil der Aminophenazon-N-demethylase-Aktivität in den Mikrosomen gefunden. Jedoch waren in anderen Zellorganellen, wie Mitochondrien , Lysosomen und Peroxysomen, noch beträchtliche Aktivitäten zu finden. Der detektierbare Umsatz von Aminophenazon im Zytosol dürfte aus Verunreinigungen der Präparation oder durch unspezifische Demethylasen zurückgehen.

Die Reduktion des Modellsubstrates 4-(N,N-Dimethylamino)azobenzen wird u.a. durch die Isoenzyme der Subfamilie CYP 4 A katalysiert. In Hep G2-Zellen konnte eine sehr viel höhere Aktivität nachgewiesen werden als in Hepatozyten. Durch Vorbehandlung mit dem spezifischen Induktor Clofibrat ließ sich diese Azoreduktase-Aktivität weiter steigern. Die Erklärung für den schwachen Umsatz in Hepatozyten könnte im anderen Weg der Metabolisierung des Substrats zu finden sein. So kann die Verbindung prinzipiell durch andere Isoenzyme demethyliert und ringhydroxyliert werden. Bei diesem Weg würde dann eine geringe Menge des Produkts 4-(N,N-Dimethylamino)anilin entstehen. Die Behandlung der Zellen mit dem Inhibitor der CYP-Aktivität [Seite 97↓] Metyrapon führte zu einem drastischen Abfall des Umsatzes. Damit wird die Beteiligung der Monooxygenasen an der Azoreduktion unterstrichen. Man kann jedoch nicht ausschließen, daß ein Teil des Substrates durch Reduktasen metabolisiert wird. Das wird besonders deutlich, wenn man sich die subzelluläre Verteilung der Aktivitäten ansieht. Der Anteil der Mikrosomen dürfte auf CYP-Isoenzyme zurückgehen. Im Zytosol können es nur Reduktasen sein.

Lymphozyten der Wistar-Ratte zeigten einen wesentlich geringeren Umsatz an DAB als Hep G2-Kulturen und Hepatozyten der Ratte. Die Aktivität dürfte ebenfalls sowohl auf CYP-Aktivität, auf Grund der Induzierbarkeit durch Clofibrat, als auch auf zytosolische Reduktasen zurückzuführen sein. Weiterhin erhöhte Behandlung mit Concanavalin A die Azoreduktion.

Die Konjugation von p-Nitrophenol durch Glucuronyltransferasen und Sulfotransferasen ist eine repräsentative Reaktion des Phase II-Prozesses der Biotransformation. Hepatozyten und Hep G2-Zellen haben relativ hohe Enzymaktivitäten, die sich über einen längeren Kultivierungszeit-raum nicht verändern. Interessant ist die Induzierbarkeit. Im Gegensatz zu Hepatozyten, deren Glucuronyltransferasen und Sulfotransferasen größtenteils durch 3-MC induziert werden, lassen sich in Hep G2-Zellen diese Aktivitäten mit PB in noch höherem Ausmaß stimulieren. Subzellulär sind diese Enzymaktivitäten vor allem in den Mikrosomen zu finden.

Die Charakterisierung der fremdstoffmetabolischen Aktivitäten in Hepatozyten und Hep G2-Zellen konnte durch die Bestimmung repräsentativer Enzyme der Biotransformation vorgenommen werden. Vergleicht man beide Zellarten unter Hinzuziehung von Ergebnissen aus der Literatur (siehe Tabelle 5-1), stellen sich sowohl Gemeinsamkeiten als auch Unterschie-de heraus. Dabei muß man zwischen Basisaktivität, bedingt durch das Vorhandensein konstitutiver Enzyme, und der durch Induktion hervorgerufenen enzymatischen Aktivität differenzieren. Die in der Literatur häufig geäußerte Ansicht, Leberzellinien haben grundsätzlich ein anderes Isoenzymmuster mit verschobener Aktivität, kann pauschal nicht bestätigt werden. Für eine Aussage sollten grundsätzlich die Einzelenzyme charakterisiert und verglichen werden, die die gleiche oder zumindest ähnliche Substratspezifität haben.

Neben den in Tabelle 5-1 aufgeführten Ergebnissen wurde festgestellt, daß sowohl Ratten-hepatozyten als auch Hep G2-Zellen Benzyloxyresorufindealkylase- (CYP 2 B1 und 2, [41]), Glutathion-S-transferase- [24, 83], Epoxidhydrolase- [24, 41] und Arylhydrocarbonhydroxylase-Aktivität [87] besitzen, wobei die Aktivitäten nicht miteinander verglichen wurden. Im Gegensatz zu Hepatozyten der Ratte besitzen Hep G2-Zellen keine CYP 2 E1-Aktivität [87, 77], was über die Aktivitätsbestimmung der p-Nitrophenolhydroxylase und der Anilihydroxylase getestet wurde.


[Seite 98↓]

Tabelle 5-1: Fremdstoffmetabolische Enzymaktivitäten in Hep G2-Zellen und Ratten-hepatozyten, + geringe, ++ mittlere, +++ hohe Aktivität bzw. Induzierbarkeit, *[58, 67]

Enzym (Substrat)

Aktivität in Hep G2-Zellen

Aktivität in Hepatozyten der Ratte

CYP 1 A1/2 (7-Ethoxyresorufin)

+++

++

Induzierbarkeit

3-MC

PB

+++

+

 

CYP 1 A1/2, CYP 2 B1/2 (7-Ethoxycoumarin)

+++

++

Induzierbarkeit

3-MC

PB

+++

++

 

CYP 3 A1/2 (Aminophenazon)

+

++

Induzierbarkeit

3-MC

PB

Dexamethason

-

(+)

+

 

CYP 4 A (DAB)

++

+

Induzierbarkeit

3-MC

PB

Clofibrat

-

-

++

 

Glucuronyl-/ Sulfotransferase (p-Nitrophenol)

++

+++

Induzierbarkeit

3-MC

PB

++

+++

+++*

+*

Die unterschiedliche Wahl von Kulturmedien, Kulturformen und Isolationsmethoden erschwert den konkreten Vergleich der Ergebnisse, insbesondere auch mit Befunden aus der Literatur. Hier sind die methodischen Modifikationen sehr vielfältig. Es ist bekannt, daß Enzyme, wie z.B. CYP, durch Zusammensetzung des Nährmediums und durch Zusatz von Serum, Hormonen und Wachstumsfaktoren unterschiedlich beeinflußt werden können, so daß entsprechende Enzyme gehemmt, aber auch induziert werden können [23, 24, 25]. Die verschiedenen Zellarten werden auf diese Faktoren in unterschiedlichem Grad antworten.

Die Überprüfung der Enzymausstattung von Hep G2-Zellen ist nicht nur von akademischen Interesse. Im Rahmen der angewandten Forschung soll dieses Testsystem zur Untersuchung der Biotransformation von Wirkstoffen eingesetzt werden. Dies erfolgte zunächst anhand von drei potentiellen Arzneistoffen, deren Biotransformationsmuster in der Ratte und in [Seite 99↓] Rattenhepatozyten aufgeklärt wurde. Die Substanzen unterschieden sich hinsichtlich ihrer strukturellen, physiko-chemischen und reaktiven Eigenschaften drastisch. Damit wurde in dieser Hinsicht ein relativ breites Substratspektrum eingesetzt, was die Aussagekraft zur Eignung des Modells erhöht.

Der Wirkstoff AWD 100-041 wurde in Hep G2-Zellkulturen wie in Rattenhepatozyten am Thiolrest methyliert. Anschließend erfolgte die Oxidation des Schwefels zum Sulfoxid und schließlich zum Sulfon. Eine CYP-vermittelte Ringhydroxylierung und anschließende Konjugation der Phenolgruppe fand im Gegensatz zur Hepatozytenkultur nicht statt. Aus der Muttersubstanz kann nichtenzymatisch das entsprechende Disulfid entstehen, was durch Inkubation ohne Zellen nachweisbar war. Die Hep G2-Kultur zeigte sich durch die fehlende Hydroxylaseaktivität den Hepatozyten unterlegen. Aufgrund eigener Untersuchungen sowie von Angaben aus der Literatur über die Biotransformation von Coumarin und Anilin [87] ist die fehlende bzw. geringe Hydroxylaseaktivität der Hep G2-Zellen bekannt.

Bei der Metabolisierung des Wirkstoffes AR 12463 konnten in der Hep G2-Zellkultur 3 Metaboliten gefunden werden. Im Gegensatz dazu wird in Rattenhepatozyten die Substanz zu insgesamt 6 Metaboliten verstoffwechselt, von denen 2 Produkte mengenmäßig vorherrschen. Von diesen Hauptmetaboliten M4 und M5 wird nur M4 auch in Hep G2-Zellen gebildet. M5 wird möglicherweise schnell weiter abgebaut. Die Konjugation von AR 12463 und seinen Metaboliten entspricht der in Rattenhepatozyten. Allerdings ist diese Aktivität in Hep G2-Zellen geringer.

Die Hauptwege der Metabolisierung von FLM 5011 waren identisch. Der Abbau der Laurylseitenkette erfolgte durch b-Oxidation nach CYP 4 A-vermittelter w-Hydroxylierung und Carboxylierung. An w-Hydroxy- und w-Carboxygruppen sowie der phenolischen Hydroxylgruppe findet Konjugation statt. Die Umwandlung der Oximgruppe in eine Ketogruppe konnte ebenfalls beobachtet werden.

Insgesamt ist festzustellen, daß die Hep G2-Zellen bei der Fremdstoffbiotransformation eine geringere Aktivität aufwiesen. Trotzdem ist es bemerkenswert, daß bei den eingesetzten Wirkstoffen die Hauptwege der Metabolisierung durch diese Zellart aufgeklärt werden können. Obwohl Hepatozyten und Hep G2-Zellen sich in manchen Enzymaktivitäten deutlich unterscheiden und das der Grund für die ausbleibende Bildung bestimmter Metaboliten sein kann, ist doch offensichtlich die überlappende Substratspezifität bestimmter Enzyme, insbeson-dere von CYP, eine entscheidende Eigenschaft. Überlappenden Substratspezifität heißt, daß sowohl das gleiche Strukturelement von verschiedenen Isoenzymen angegriffen werden kann als auch, daß das gleiche Isoenzym verschiedene Strukturelemente metabolisch verändern kann. Somit ist zumindest in qualitativer Hinsicht mit ähnlichen oder sogar gleichen Biotransformationsmustern in unterschiedlichen Zellkulturen zu rechnen. Hierbei ist auch der analytische Aspekt zu berücksichtigen. Das vermeintliche Ausbleiben eines Metaboliten unter den eingesetzten experimentellen Bedingungen der Aufarbeitung der Kultur bedeutet nicht [Seite 100↓] immer, daß seine Bildung nicht erfolgte. Bei Produktmengen unterhalb des pg- oder ng-Bereiches erreichen die analytischen Möglichkeiten natürlich ihre Grenzen.

Für die Durchführung von Untersuchungen zur Beeinflussung des Zellwachstums, insbesondere auch unter dem Gesichtspunkt der Ermittlung der Toxizität von Wirkstoffen, sind stark proliferierende Zellinien besonders gut geeignet. Daher konnten entsprechende Untersuchungen zur Proliferation und Zytotoxizität erfolgreich mit der Hep G2-Zellinie ausgeführt werden. Um unterschiedliche Aspekte des Wachstums oder der Zellschädigung zu erfassen, sind verschieden methodische Ansätze erforderlich. Daher umfaßten die Testungen die LDH-Bestimmung, die Bestimmung des Proteingehalts sowie des DNA-Gehaltes. Eine direkte Übertragung der Ergebnisse auf andere Zellkulturen ist nicht unbeschränkt möglich, denn es konnte beispielsweise festgestellt werden, daß Hep G2-Zellen weniger empfindlich auf Tetrachlorkohlenstoff reagierten als isolierte Hepatozyten der Ratte [68]. Die Untersuchungen wurden an den drei potentiellen Arzneistoffen durchgeführt. Darüber hinaus fanden die Testungen an einem Phytopharmakon sowie an Substanzen, die im Rahmen der Kultivierung und Inkubation verwendet wurden, statt. Neben der Abklärung eines toxischen Potentials galt es daneben, die optimalen Konzentrationen für die Inkubationsansätze bei Biotransformationsstudien zu finden.

Die Wirkstoffe AWD 100-041 und AR 12463 waren relativ zelluntoxisch. In frühen Inkubationszeiträumen konnte eine Zunahme des Proteingehaltes bei gleich bleibendem DNA-Gehalt festgestellt werden, was auf mögliche Induktionsprozesse zurückzuführen ist. Nach größeren Inkubationszeiträumen fand dann ein konzentrationsabhängige Beeinflussung des Zellwachstums statt. Die normale Membranpermeabilität bleibt erhalten.

Die Toxizität der Substanz FLM 5011 war wesentlich höher. Schon bei geringen Konzentrationen zeigten sich deutliche antiproliferative Effekte, obwohl die Beeinflussung der Membran gering war. Die Ursache für die Beobachtung ist möglicherweise im Wirkungsmechanismus der Verbindung zu suchen. Durch Hemmung der 5-Lipoxygenase sinkt die Konzentration des proliferativ wirkenden Produktes der Arachidonsäure 5(S)-HETE, das offensichtlich im Wachstumsgeschehen der Zellen von Bedeutung ist [4]. Nach Inkubation von Hep G2-Zellen mit 5(S)-HETE konnte eine vermehrte Proliferation beobachtet werden.

Die Toxizitäts- und Proliferationsuntersuchungen mit dem Solanum lycopersicon-Mazerat zeigten, daß insbesondere das Hauptalkaloid der Droge Tomatin für die Beeinflussung des Zellwachstums verantwortlich ist. Sowohl DNA- als auch Proteingehalt veränderten sich wäh-rend der Inkubation mit dem Mazerat bzw. dem Alkaloid in ähnlicher Weise. Die Membran-toxizität war allerdings beim Mazerat höher. Dieser Effekt geht auf zusätzliche Inhaltsstoffe zurück, deren membranschädigende Wirkung bekannt ist, wie z. B. Saponine. Das Aglykon Tomatidin, das in Hep G2-Zellkulturen aus Tomatin z. T. entsteht, zeigte in geringen Konzentra-[Seite 101↓]tionen eine Erhöhung der Proteinsynthese, wobei aber nicht der DNA-Gehalt zunahm.

Die Studien an den eingesetzten Induktoren 3-MC und PB zeigten ein dualistisches Verhalten bei der Beeinflussung des Zellwachstums. In geringen Konzentrationen erhöhte sich deutlich die Proteinsynthese, insbesondere nach Inkubation mit Phenobarbital. Nach längeren Inkubationszeiträumen und höheren Konzentrationen überwogen die toxischen Effekte, die sich durch die Abnahme der Konzentration von Proteinen als auch der DNA zeigten. Der Induktor Clofibrat bewirkt eine Störung der Membranintegrität. Der Proteingehalt der Zellen wurde nicht beeinflußt.

Eine wichtige Frage beim Arbeiten mit Zellkulturen ist der Einsatz von Lösungsmitteln. Schwerlösliche Substanzen müssen vor Inkubation oft mit organischen Lösungsmitteln angelöst werden, damit ihr Einsatz sinnvoll ist. Prinzipiell muß dabei aber mit Einflüssen auf das Zellwachstum und auch auf zellspezifische Leistungen gerechnet werden. Besonderes Augenmerk galt dem Lösungsmittel DMSO, da es meist zum Einsatz kommt. In der Literatur wird ein wachstumshemmender Effekt diskutiert, der auf eine Beeinflussung der Membranfluidität aber auch auf eine DNA-Methylierung zurückgehen kann [34]. An der Hep G2-Zelle zeigt sich ein konzentrationsabhängiges Verhalten. In geringen Konzentrationen, die üblicherweise eingesetzt werden, war DMSO kaum proliferationshemmend. Toxische Effekte wurden erst bei Konzentrationen über 2 % beobachtet.

Bei Zytotoxizitätsuntersuchungen mit dem Lipoxygenasehemmer FLM 5011 an Hep G2-Zellen wurden bei einigen Zellen morphologische Veränderungen unter dem Mikroskop beobachtet. Die fibroblastoid aussehenden Zellen hatten einen geschrumpften Zelleib, der Zellkern war kondensiert und es zeigte sich ein intensives Membranblebbing. Solche Bilder deuten meistens auf apoptotische Prozesse hin. Daher wurden einige Testungen zum Nachweis des programmierten Zelltods in der Kultur vorgenommen.

FLM 5011 löste in Hep G2-Zellen Apoptose aus. Die Bildung einer „DNA-Leiter“, die Präsenz von Phosphatidylserin auf der Außenseite der Zytoplasmamembran sowie die Aktivität von ICE verwandten Proteasen (FLICE/Caspase-8) sind eindeutige Indikatoren für diesen Prozeß. Diese Parameter konnten in der Zellkultur nachgewiesen bzw. bestimmt werden. Damit kann die Apoptose sicher von der Zytotoxizität abgegrenzt werden. Wie bei der Beeinflussung der Proliferation der Zellen geht der Mechanismus bei der Auslösung der Apoptose auf die Hemmung der Lipoxygenase durch FLM 5011 zurück. Entscheidend ist hierbei das Verhältnis der Konzentrationen von Arachidonsäure und deren entsprechende Lipoxygenaseprodukte [54]. Die sinkende Konzentration von 5(S)-HETE nach Lipoxygenasehemmung dürfte dabei den Ausschlag geben [39]. Wie für andere Lipoxygenasehemmer auch gezeigt wurde, nehmen unter dem Einfluß der Wirkstoffe die Konzentrationen der für die Signalauslösung verantwortlichen Proteine bcl-2 und bax ab, wodurch ein Überangebot von bax-Dimeren entsteht [104]. Letztere sind für die Aktivierung der Floppasen verantwortlich. Darüber hinaus kommt es zu einer [Seite 102↓] Aktivierung der Kaskade der ICE-verwandten Proteasen. Die Veränderung der bax/bcl-2-Konzentrationen wird durch das Protein p53 ausgelöst, das nach DNA-Schädigungen vermehrt exprimiert wird. Vermehrte DNA-Schäden treten vor allem nach Inaktivierung der DNA-reparierenden Enzyme, wie z. B. PARP auf. Diese werden wiederum durch die ICE-verwandten Proteasen zerstört, welche durch FLICE (Caspase-8) aktiviert werden. Durch externe Zugabe von 5(S)-HETE zur Kultur konnte die Auslösung von Apoptose durch FLM 5011 unterdrückt werden. Dies unterstreicht die Rolle der 5(S)-HETE-Konzentration bei der Entstehung der Apoptose. Die möglichen Zusammenhänge der Auslösung der Apoptose in Hep G2-Zellen durch FLM 5011 sind in Abbildung 5-1 zusammengefaßt.

Abbildung 5-1: Auslösung von Apoptose durch FLM 5011 in Hep G2 Zellen

Mit den vorliegenden Ergebnissen konnte gezeigt werden, daß die Hep G2-Zellkultur ein brauchbares in vitro-System darstellt. Der Einsatz ist auf sehr vielen Gebieten der Wirkstofforschung möglich. Insbesondere Fragen des Fremdstoffmetabolismus und der damit im Zusammenhang stehenden Toxizität können erfolgreich bearbeitet werden. Als in vitro-[Seite 103↓] Testsystem hat die Zellkultur zum Tierversuch sowohl alternativen als auch komplementären Charakter.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
10.09.2004